CN118813506A - 一种鹤羽田戴尔福特菌及其增强捕食螨健康水平的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物防治领域，公开一种鹤羽田戴尔福特菌及其增强捕食螨天敌健康水平的处理方法。本发明筛选到的鹤羽田戴尔福特菌，其保藏号为CGMCC No.31402。利用本发明的戴尔福特菌喷施的方法可显著减少致病菌Acaricomes phytoseiuli对捕食螨的影响，提高捕食螨存活率，增加产卵量，提升捕食能力，该方法可促进产业化捕食螨的商品质量与合格产品数量。

Description

一种鹤羽田戴尔福特菌及其增强捕食螨健康水平的处理方法

技术领域

本发明属于微生物和生物防治领域，涉及一种鹤羽田戴尔福特菌及其增强捕食螨健康水平的处理方法，涉及捕食螨天敌的饲养方法，尤其涉及捕食螨规模化饲养中避免感染致病菌的方法。

背景技术

捕食螨是一类重要的生物防治天敌，也是在世界范围内商品化程度最高的天敌品类，在小型吸汁性害虫如叶螨、蓟马、粉虱、蚜虫的绿色防控中发挥了极其重要的作用。目前国内大量饲养和销售捕食螨的天敌工厂多达百余家，生产包括智利小植绥螨、加州新小绥螨、斯氏钝绥螨、胡瓜新小绥螨等十多种捕食螨，在农业生态环境中为害虫生物防治提供了重要技术手段。

然而，捕食螨商品在生产过程中会受微生物致病菌危害而影响捕食螨的健康水平。例如，致病菌不仅会缩短捕食螨寿命，降低对害虫的捕食量，还会减少可育后代的繁殖量，进而影响捕食螨天敌在田间使用中的定殖和长期防控作用。申请人曾在我国商业化捕食螨产品中发现Acaricomes phytoseuili是一种危害捕食螨的致病菌，可致捕食螨取食量减少，加速捕食螨死亡，最终导致捕食螨种群数量锐减，同时后代数量急剧减少，出现田间害螨防治效率降低下，使农户对生物防治丧失信心。经申请人前期研究发现，一旦在天敌工厂环境中存在A.phytoseuili，将对所有的捕食螨种类造成灭顶之灾，很难根除。因此，本专利创新性的提出增强捕食螨免疫力，提升其健康水平的技术方法，可极大提升天敌商品的生产效率和合格率。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强捕食螨健康水平的饲养方法，减少致病菌对捕食螨天敌的危害，适用于多种捕食螨在饲养车间的规模化生产。

本发明筛选分离到一种鹤羽田戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis），其保藏号为CGMCC No.31402。

因此，本发明首先提供一株鹤羽田戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis），其保藏号为CGMCC No.31042。

进而提供所述的鹤羽田戴尔福特菌在预防捕食螨感病，或在捕食螨的健康生产和/或质量稳定中的应用。

具体地，所述感病是指由致病菌Acaricomes phytoseuili引起。所述捕食螨是智利小植绥螨和加州新小绥螨。

本发明也提供一种预防捕食螨感病的方法，其包括如下步骤：

S1准备鹤羽田戴尔福特菌的菌液；

S2将所述菌液喷洒至捕食螨或携带捕食螨的植物。

优选地，所述捕食螨是智利小植绥螨或加州新小绥螨。

具体地，S1步的具体操作是：将鹤羽田戴尔福特菌单菌落置于LB液体培养基中，以28-32℃、160-200转/分的频率振荡培养至菌液OD₆₀₀=0.8-1.2时，停止培养；使用8000-12000转/分钟离心弃上清，使用PBS缓冲液将管底菌落沉淀悬浮后，菌液制备完毕待用。

S2步的具体操作是：每天喷施一次连续喷两天；优选地，所述菌液中活菌数是10⁴-10⁶cfu/ml。

本发明也提供一种培养捕食螨的方法，其在捕食螨的饲养过程中，如所述的鹤羽田戴尔福特菌的菌液。

具体地，每天喷施一次连续喷两天；优选地，所述菌液中活菌数是10⁴-10⁶cfu/ml。

优选地，所述捕食螨是智利小植绥螨或加州新小绥螨；

其中，所述的鹤羽田戴尔福特菌的菌液的制备方法如下：所述将鹤羽田戴尔福特菌单菌落置于LB液体培养基中，以28-32℃、160-200转/分的频率振荡培养至菌液OD₆₀₀=0.8-1.2时，停止培养；使用8000-12000转/分钟离心弃上清，使用PBS缓冲液将管底菌落沉淀悬浮后，菌液制备完毕待用。

利用本发明的鹤羽田戴尔福特菌喷施的方法可显著减少致病菌Acaricomes phytoseiuli对国内两种常用捕食螨的影响，不仅可以提高捕食螨存活率，也可助其恢复产卵效率，该方法可提升捕食螨的健康生产与质量稳定。

生物材料保护信息：本发明的鹤羽田戴尔福特菌于2024年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号为CGMCC No.31402。该菌株的分类命名为鹤羽田戴尔福特菌Delftia tsuruhatensis。

附图说明

图1. 鹤羽田戴尔福特菌对Acaricomes phytoseiuli致病菌的抑制作用。

图2. 智利小植绥螨在不同处理下的十天存活率。

图3. 智利小植绥螨在不同处理下一周的产卵量。

图4. 两种捕食螨在不同处理下的取食差异。

图5. 两种捕食螨在不同处理下一周的存活率及产卵量比较。其中，（A）显示益生菌处理对两种捕食螨的存活率；（B）显示益生菌处理对两种捕食螨的单蜂产卵量。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本明进行阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成本对本发明限制。

实施例一、鹤羽田戴尔福特菌的分离与鉴定

在北京市海淀区中国农业科学院科技实验园区称取实验土壤样品10g加入90ml灭菌水中振荡，直至土壤大颗粒被完全打碎，然后静置30分钟以上，使其澄清。在无菌的条件下，用移液器吸取1ml上清液加入装有9ml灭菌水中稀释为10^-1倍。用相同的方法，将菌液梯度稀释为原液的10^-2，10^-3，10^-4和10^-5五个梯度后，倒入LB培养基平板上，每梯度倒3个平板。将涂好的平板放入30℃恒温箱中培养24小时后，对不同梯度的平板进行观察。平板中均为白色圆形菌落，将其中一个菌落挑取后进行再次划线，直至菌种完全纯化。并制备试管斜面，将菌划斜面培养留种。

利用16S通用引物（27F和1492R）扩增该菌的部分序列，具体方法如下：使用25μlDNA片段扩增体系，加入12.5μl PCR缓冲液，2.5μl扩增酶，混合的特异性引物各0.5μl和9μl超纯水，使用牙签挑取单菌落作为该反应的模板，在PCR仪中设置如下程序：98℃30秒；35个循环的98℃10秒，55℃20秒和72℃ 30秒，最后使用72℃5分钟结束扩增。将PCR扩增产物在180V电压下完成1%琼脂糖凝胶电泳，使用D2000为长度标记，将1500bp的片段切胶回收，送测序公司测序。结果返回后，将序列提交至NCBI比对，获得同源性最高的可能的细菌种类。

经过分析得知，该菌为鹤羽田戴尔福特菌Delftia tsuruhatensis。鹤羽田戴尔福特菌为革兰氏阴性菌，在LB培养基上30℃培养1-2天可观察到白色圆形菌落，表面凸起，不光滑，易挑起，边缘不整齐。鹤羽田戴尔福特菌的生理生化特征见表1，它不能以麦芽糖，甘露糖，蔗糖等为碳源生长，以甘油为碳源进行生长，并且能够与组胺，柠檬酸，乳酸，天冬氨酸，谷氨酸等反应，在pH为5和6的环境下仍然可以生长，但无法在NaCl浓度为4%-8%的条件下生长。抗生素检测上发现其对利福霉素，硫酸四癸钠等敏感。

表1. 鹤羽田戴尔福特菌的生理生化特征

其中，++为阳性，+为弱阳性，-为阴性。

实施例二、鹤羽田戴尔福特菌与Acaricomes phytoseuili的平板对峙验证

用无菌牙签将以上分离鉴定获得的鹤羽田戴尔福特菌3个单菌落接种LB培养基上，该培养皿预先涂布一层OD₆₀₀=1的Acaricomes phytoseuili致病菌50μl菌液。在30℃恒温无菌培养箱中培养48小时后停止培养。三个鹤羽田戴尔福特菌的菌落周围均具有明显抑菌圈（图1），培养皿其他区域为密集的A.phytoseuili菌落生长，没有抑菌圈存在。

实施例三、鹤羽田戴尔福特菌的培养与菌液制备

用无菌牙签将以上分离鉴定获得的鹤羽田戴尔福特菌的单菌落接种至2 mL LB培养基中，在30℃振荡培养箱中用180转/分钟培养8小时，随后取1 mL菌液至10 mL LB培养基中，再以30℃、180转/分的频率振荡培养至少24小时。当菌液OD₆₀₀=1时，停止培养。该菌液使用10，000转/分钟离心2分钟后，弃上清。使用5ml PBS缓冲液将管底菌落沉淀悬浮后，菌液制备完毕待用。

实施例四、鹤羽田戴尔福特菌处理后可减弱智利小植绥螨致病菌的危害

本发明人曾发现捕食螨中携带一种重要致病菌Acaricomes phytoseuili，该菌可极大减低捕食螨存活率和繁殖力，因此对捕食螨规模化生产及天敌商品质量存在巨大威胁。

利用“叶碟法”后，再喷洒致病菌可确认本发明提供鹤羽田戴尔福特益生菌对抑制智利小植绥螨发病的作用。

所述“叶碟法”进行鹤羽田戴尔福特益生菌的饲喂具体方法如下：在塑料盒（17.5×17.5×7cm）中放入一层海绵（13×13×4cm），海绵上为一层滤纸（d=9cm）和一层塑料薄膜（d=7cm），在塑料薄膜上放入带有叶螨的芸豆叶子，芸豆叶子修剪成圆形，周围用湿润脱脂棉进行包裹以保证其湿度。后使用移液枪将实施例二中获得的鹤羽田戴尔福特菌液均匀点在叶碟上。将捕食螨放置于叶碟上饲养。

如图2所示，使用该鹤羽田戴尔福特益生菌处理后，捕食螨的存活率与对照没有显著差别（p=0.86），但显著好于致病菌处理组（p=0.001）。捕食螨感染致病菌后五天后，存活个体仅为对照的一半，而使用益生菌处理过的捕食螨存活率可达80%以上，说明益生菌在捕食螨中有抑制致病菌危害的作用。此外，该益生菌还可提升智利小植绥螨受致病菌为害的产卵量（图3）。使用以上相同的方法，统计了对照，鹤羽田戴尔福特益生菌和致病菌三种处理下智利小植绥螨一周内的产卵量，发现致病菌处理后严重降低了捕食螨生殖力（p<0.001），平均产卵量仅为5粒；而对照和鹤羽田戴尔福特益生菌处理后的捕食螨产卵量之间没有显著性差异（p=0.85），分别为15粒。以上结果说明，筛选的鹤羽田戴尔福特菌具有减弱A. phytoseuili致病菌的作用，对智利小植绥螨健康水平有极大的提升。

实施例五、鹤羽田戴尔福特菌对加州新小绥螨的保护作用

本发明人前期研究发现多种捕食螨均可被致病菌A.phytoseuili危害，因此继续使用“水盆法”探明本发明的鹤羽田戴尔福特菌对加州新小绥螨的保护作用。

所述采用“水盆法”进行鹤羽田戴尔福特益生菌的喷施的具体操作如下：将实施例二获得的鹤羽田戴尔福特菌菌液摇匀后倒入10 mL塑料喷壶中，该喷壶的出液量为200μl/喷。将携带捕食螨的叶片放在水盆中，使用喷壶喷洒菌液，每天喷施一次连续喷两天。

喷施鹤羽田戴尔福特菌后，再连续喷洒A.phytoseuili两天后，观察两种捕食螨对叶螨卵的捕食能力。发现鹤羽田戴尔福特菌处理后，可以显著恢复捕食螨的捕食能力（图4）：如，可将智利小植绥螨受害后的捕食量从4粒提升4倍，达到跟对照一样的捕食水平；对加州新小绥螨也有相同效果，从平均2粒的取食量提升至13粒，捕食能力增加了6.5倍。以上结果说明鹤羽田戴尔福特菌对两种捕食螨的健康水平均有提升作用。

喷施鹤羽田戴尔福特菌后，再连续喷洒A.phytoseuili两天，每日观察捕食螨产卵量和存活数量，统计七天总产卵量及存活的捕食螨头数。结果显示益生菌对两种捕食螨的存活率均有提升作用（图5A）。益生菌将智利小植绥螨的存活率从30%提升到80%，将加州新小绥螨的存活率从50%提升至88%，见图5中（A）图。在产卵能力修复上，益生菌最明显的作用仍旧体现在智利小植绥螨上，将其单雌每周产卵量从5粒提升至14粒，见图5中（B）图。益生菌处理对加州新小绥螨带病个体的生殖能力也有挽救作用，将其7日产卵量从6粒提升至11粒。综上，这些结果均体现出鹤羽田戴尔福特菌对致病菌的抵抗作用，对感病捕食螨的健康有修复作用。

Claims (10)

1.一株鹤羽田戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis），其保藏号为CGMCC No.31402。

2.如权利要求1所述的戴尔福特菌在预防捕食螨感病，或在捕食螨的健康生产和/或质量稳定中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述感病是指由致病菌Acaricomes phytoseuili引起。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述捕食螨是智利小植绥螨或加州新小绥螨。

5.一种预防捕食螨感病的方法，其包括如下步骤：

S1准备如权利要求1所述的鹤羽田戴尔福特菌的菌液；

S2将所述菌液喷洒至捕食螨或携带捕食螨的植物；

所述捕食螨是智利小植绥螨或加州新小绥螨。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，S1步的具体操作是：将鹤羽田戴尔福特菌单菌落置于LB液体培养基中，以28-32℃、160-200转/分的频率振荡培养至菌液OD₆₀₀=0.8-1.2时，停止培养；使用8000-12000转/分钟离心弃上清，使用PBS缓冲液将管底菌落沉淀悬浮后，菌液制备完毕待用。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，S2步的具体操作是：每天喷施一次连续喷两天；所述菌液中活菌数是10⁴-10⁶cfu/ml。

8.一种培养捕食螨的方法，其特征在于，在捕食螨的饲养过程中，喷施如权利要求1所述的鹤羽田戴尔福特菌的菌液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，每天喷施一次连续喷两天；且所述菌液中活菌数是10⁴-10⁶cfu/ml。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述捕食螨是智利小植绥螨或加州新小绥螨；且所述菌液的制备方法如下：所述将鹤羽田戴尔福特菌单菌落置于LB液体培养基中，以28-32℃、160-200转/分的频率振荡培养至菌液OD₆₀₀=0.8-1.2时，停止培养；使用8000-12000转/分钟离心弃上清，使用PBS缓冲液将管底菌落沉淀悬浮后，菌液制备完毕待用。