CN118792358A - 一种提高包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白丰度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白丰度的方法，包含如下步骤：将编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因，以及编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因导入宿主细胞，培养宿主细胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒样颗粒。此方法在不影响跨膜蛋白构象的基础上，提高了包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白或其功能片段的丰度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种包膜病毒样颗粒高效展示跨膜蛋白的方法。
背景技术
跨膜蛋白是一类广泛存在于生物体内，能够跨越细胞膜一次或多次的蛋白质，以跨膜蛋白为靶点的创新药研发一直是医药领域的研究热点，其中离子通道、转运蛋白、G蛋白偶联受体和激酶是药物研发中最大的一类药物靶点。然而跨膜蛋白的制备面临着许多瓶颈，例如，跨膜蛋白通常嵌入到脂双层中，因此在溶液中的溶解度往往较低；此外，跨膜蛋白的结构复杂，包含多个跨膜区域、环状结构和糖基化修饰等，这些都增加了跨膜蛋白的制备难度。
病毒样颗粒（VLP，Virus-Like Particle）来源于病毒的外层衣壳蛋白，由一种或者多种衣壳蛋白组分自动组装形成的纳米结构的微小颗粒。VLP不含有病毒基因组，无感染性，同时还具有与天然病毒类似的结构，此特殊的空间结构能够引起强烈的免疫应答反应，包括产生抗体和细胞介导的免疫反应。这样的特性使得VLP具有广泛的应用价值。VLP主要分为包膜病毒样颗粒(eVLP)和非包膜病毒样颗粒(VLP)。当正确折叠的跨膜蛋白在细胞膜上表达时，包膜病毒的衣壳蛋白形成的病毒样颗粒通过出芽的方式被包裹上携带有跨膜蛋白的细胞膜，形成eVLP，将跨膜蛋白展示在eVLP的表面，使这些复杂的跨膜蛋白转变为可溶性的、高浓度的eVLP形式的蛋白用于免疫和抗体筛选。
然而，通过eVLP出芽的方式展示跨膜蛋白具有随机性，同时相较于其他类型蛋白，跨膜蛋白通常表达量较低，只有正确地折叠且嵌入细胞膜位点上跨膜蛋白才能通过eVLP展示，因此出芽形成的eVLP中通常存在未展示跨膜蛋白或展示丰度较低的eVLP，而后续eVLP富集工艺也无法去除此部分eVLP。低跨膜蛋白展示丰度的eVLP在免疫动物后产生大量非特异性抗体，使得特异性抗体的筛选效率低。
所以目前缺乏能够提高跨膜蛋白展示丰度的eVLP技术，而提高eVLP上跨膜蛋白的丰度，能够增强实验动物对跨膜蛋白免疫反应应答的效果和抗体筛选的效率，这将助力以跨膜蛋白为靶点的创新药的研发。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高包膜病毒样颗粒（eVLP）展示跨膜蛋白或其功能片段丰度的方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种eVLPs展示跨膜蛋白或其功能片段的方法，包含如下步骤：将编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因，以及编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因导入宿主细胞，培养宿主细胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒样颗粒。
所述编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞，和/或，所述编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞。
本发明还提供一种VLP疫苗或VLP制剂，所述VLP疫苗或VLP制剂包含由上述方法获得的已展示跨膜蛋白的病毒样颗粒。
本发明还提供上述VLP制剂在制备抗体或筛选抗体中的用途。
如上所述，本发明一种提高包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白或其功能片段丰度的方法，具有以下有益效果：基于eVLP骨架蛋白与gp41蛋白胞内区相互作用、目标跨膜蛋白与gp41蛋白胞内区融合提高目标跨膜蛋白的膜定位，进而提高包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白或其功能片段的效率；简单的操作步骤减少了生产过程中的复杂性和成本；增强跨膜蛋白免疫反应应答的效果和抗体筛选的效率，促进以跨膜蛋白为靶点的创新药的研发。
附图说明
图1显示为本发明富集到的eVLP动态光散射检测结果。
图2显示为本发明富集到的eVLP中无Claudin 6跨膜蛋白展示的蛋白质免疫印迹（WB）图。图注：预：预染蛋白Marker；阳：阳性对照；全：浓缩换液样品；LS：超离细胞上清液；20%：超离蔗糖层；R：eVLP复溶上清还原泳道；N：复溶上清非还原泳道。
图3显示为本发明富集到的eVLP中有Claudin 6跨膜蛋白展示的WB图。图注：Q：浓缩换液样品；LS：超离细胞上清层；20%：超离蔗糖层；P：复溶样品离心沉淀；预：预染蛋白Marker；阳：阳性对照；R1:复溶上清还原泳道；N1：复溶上清非还原泳道。
图4显示为Claudin 6-gp41-eVLP与其特异抗体的结合活性示意图。
具体实施方式
本发明提供一种包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白或其功能片段的方法，包含如下步骤：将编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因，以及编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白（gag蛋白）的基因导入宿主细胞，培养宿主细胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒样颗粒。
所述功能片段为跨膜蛋白的部分片段。
在本发明的某些实施方式中，所述编码目标蛋白与gp41蛋白融合蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞，和/或，所述编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞。
在本发明的某些实施方式中，所述目标蛋白为跨膜蛋白的胞内区或跨膜蛋白的功能片段的胞内区。
在本发明的某些实施方式中，所述跨膜蛋白为任意可作为药物靶点的跨膜蛋白，例如，四次跨膜蛋白、六次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白或十一次跨膜蛋白。具体地，上述跨膜蛋白选自紧密连接蛋白6（Claudin 6）、紧密连接蛋白9（Claudin 9）、G蛋白偶联受体（GPCRs）、B淋巴细胞表面抗原B1（CD20）、前列腺六段跨膜上皮抗原1(STEAP1)、2b型钠依赖性磷酸盐转运体（NaPi2b）中的一种或多种。
在本发明一优选实施方式中，所述跨膜蛋白为四次跨膜蛋白，更优选为Claudin 6蛋白。
在本发明的某些实施方式中，所述Claudin 6蛋白胞内区的氨基酸序列包含如SEQID NO.5所示的氨基酸序列。
在本发明的某些实施方式中，编码Claudin 6蛋白胞内区的核苷酸序列包含如SEQID NO.6所示的核苷酸序列。
在本发明的某些实施方式中，所述gp41蛋白为人源性的。
在本发明的某些实施方式中，所述gp41蛋白还包括gp41蛋白突变体。
在本发明的某些实施方式中，所述gp41蛋白胞内区的氨基酸序列包含如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸的序列，或与上述氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同源性。
在本发明的某些实施方式中，编码gp41蛋白胞内区的核苷酸序列包含如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。
在本发明的某些实施方式中，所述eVLP骨架蛋白为HIV-1 gag蛋白、 MLV gag蛋白、SIV gag蛋白、FIV gag蛋白、HTLV-1 gag蛋白或HTLV-1 gag蛋白中的一种或多种。
在本发明的某些实施方式中，所述gag蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在本发明的某些实施方式中，还包含对gag编码基因进行密码子优化。
在本发明的某些实施方式中，编码gag蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
在本发明的某些实施方式中，所述培养细胞的过程为使包膜病毒样颗粒在细胞内组装，并通过骨架蛋白与融合蛋白的相互作用，将跨膜蛋白展示在eVLPs的外表面的过程。
在本发明的某些实施方式中，所述核酸构建体包含编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核苷酸序列，或包含编码融合蛋白的核苷酸序列。
在本发明的某些实施方式中，所述包含编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核酸构建体通过将编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核苷酸序列构建到表达载体中得到。
在本发明的某些实施方式中，所述包含编码所述融合蛋白的核酸构建体通过将编码融合蛋白的核苷酸序列构建到表达载体中得到。
在本发明的某些实施方式中，所述表达载体为哺乳动物表达载体。所述哺乳动物表达载体选自如下任一种：pTT5载体、pCAG载体、pcDNA表达载体、pCMV表达载体。
在本发明一优选实施方式中，将编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因构建到pTT5载体中。
在本发明一优选实施方式中，将编码融合蛋白的基因构建到pcDNA3.4载体中。
在本发明的某些实施方式中，所述包含编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的某些实施方式中，所述包含编码融合蛋白的核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的某些实施方式中，还包含在融合蛋白的基因中插入标签序列，优选的，所述标签序列为Flag序列。
在本发明的某些实施方式中，所述包含编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核酸构建体与包含编码所述融合蛋白的核酸构建体导入宿主细胞的比例为1：（1~3）。所述导入宿主细胞的比例选自如下任一范围1：（1~1.5）、1：（1.5~2）、1：（2~2.5）、1：（2.5~3）。在本发明一优选实施方式中，所述包含编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核酸构建体与包含编码所述融合蛋白的核酸构建体的比例为1:2。
在本发明的某些实施方式中，所述宿主细胞选自HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、EXPI293细胞或昆虫细胞。在本发明一优选实施方式中，所述宿主细胞为EXPI293细胞。
在本发明的某些实施方式中，培养宿主细胞的温度为30~42℃。所述温度选自如下任一范围：30~32℃、32~34℃、34~36℃、36~38℃、38~40℃、40~42℃。在本发明一优选实施方式中，所述培养温度为37℃。
在本发明的某些实施方式中，培养宿主细胞的CO2浓度为5%~10%。所述CO2浓度选自如下任一范围：5%~6%、6%~7%、7%~8%、8%~9%、9%~10%。在本发明一优选实施方式中，所述CO2浓度为8%。
在本发明的某些实施方式中，培养宿主细胞的时间为60~80小时。所述时间选自如下任一范围：60~65小时、65~70小时、70~75小时、75~80小时。在本发明一优选实施方式中，所述细胞培养的时间为72小时。
在本发明的某些实施方式中，培养宿主细胞的转速为80~150rpm。所述转速选自如下任一范围：80~90rpm、90~100rpm、100~110rpm、110~120rpm、120~130rpm、130~140rpm、140~150rpm。在本发明一优选实施方式中，所述转速为110rpm。
在本发明的某些实施方式中，包含收集上清液为通过离心收集。
分离纯化的步骤包含将收集的上清液经去除细胞碎片、浓缩、去除小分子杂质、离心后重悬。
在本发明的某些实施方式中，浓缩的方式为将上述处理后的上清用中空纤维柱浓缩。
在本发明的某些实施方式中，去除小分子杂质的方式为稀释换液。所述换液的倍数为200~500。
在本发明的某些实施方式中，离心的步骤为将浓缩换液样品进行蔗糖梯度密度离心，上清经20%蔗糖密度超速离心。所述超速离心的转速为80000~120000g/min，优选为100000g/min。所述超速离心的时间为80~160min，优选为120min。
在本发明的某些实施方式中，所述制备方法还包含将上述粗纯样品经透析换液获得高纯度样品。
本发明还提供一种VLP制剂，所述VLP制剂包含由上述方法获得的已展示跨膜病毒的包膜病毒样颗粒。所述VLP制剂为VLP疫苗。
本发明还提供一种产生免疫反应的方法，所述方法包含向动物施用上述VLP疫苗或VLP制剂。
本发明还提供上述VLP制剂在制备抗体或筛选抗体中的用途。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包含复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本实施例中使用的eVLP骨架为HIV-1 gag蛋白，单独的Gag蛋白具备可以自组装成eVLP纳米颗粒的能力。
首先，构建含有gag编码基因的核酸构建体，即重组质粒一（SEQ ID NO.7）。本申请对gag编码基因进行哺乳表达密码子优化，在5’末端添加限制性内切酶EcoR I酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶Hind III酶切位点。将目的基因构建在pTT5载体中，即重组质粒一。然后，将重组质粒一转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃过夜培养后挑取单菌落，37℃摇菌后进行菌落PCR，选择阳性克隆进行质粒提取，将提取后的质粒送至第三方进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。
首先，分别构建含有Claudin 6编码基因的核酸构建体即重组质粒二和Claudin6-gp41融合蛋白编码基因的核酸构建体即重组质粒三（SEQ ID NO.8）。编码Claudin 6蛋白的核酸构建体的序列为编码Claudin 6-gp41融合蛋白的核酸构建体的核苷酸序列去除编码gp41蛋白的核苷酸序列。本申请对Claudin 6编码基因进行哺乳表达密码子优化，在5’末端添加限制性内切酶KpnI酶切位点、Kozak序列；3’末端添加Flag序列、终止密码子TAA和限制性内切酶XhoI酶切位点。将目的基因构建在pcDNA3.4载体中，即重组质粒二。并对Claudin 6-gp41融合蛋白编码基因进行哺乳表达密码子优化，在5’末端添加限制性内切酶KpnI酶切位点、Kozak序列；Claudin 6和gp41融合蛋白编码基因直接插入Flag序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶XhoI酶切位点。将目的基因构建在pcDNA3.4载体中，即重组质粒三。然后，将重组质粒二和三转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃过夜培养后挑取单菌落，37℃摇菌后进行菌落PCR，选择阳性克隆进行质粒提取，将提取后的质粒送至第三方进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。
使用PEI转染试剂将构建好的重组质粒按照比例质粒一:质粒二＝1:2、质粒一:质粒三＝1:2分别转染EXPI293细胞，进行eVLP的表达和组装。转染前一天将EXPI293细胞按照1×10^6个细胞/mL传代，37℃培养。转染当天进行计数，调整细胞密度为2×10^6个细胞/mL，活率95％以上。将335μL浓度为0.8μg/mL的重组质粒一和340μL浓度为1.56μg/mL的重组质粒二(或445μL浓度为1.2μg/mL的重组质粒三)加入EXPI293培养基至20mL(A液)，3.6mg浓度为1mg/mL的PEI转染试剂加入EXPI293培养基至20mL(B液)，分别混匀后，将B液缓慢加入至A液中，混匀室温静置20min后，将转染混合液缓慢滴加入800mL EXPI293细胞中。37℃，8％CO2，110rpm培养72h后，4℃下，4200rpm离心30min分别收集质粒一&质粒二和质粒一&质粒三的培养上清。
将获得的eVLP细胞上清液进行4000rpm，4℃离心20min去除细胞碎片并用0.22µm滤膜过滤，处理后上清用750KD中空纤维柱进行浓缩，用PBS,pH7.4进行稀释换液,换液200倍以上，去除小分子杂质，将浓缩换液样品进行蔗糖密度梯度离心，上清经20%蔗糖密度超速离心(100000g/min,4℃,2h)，沉淀用PBS重悬，12000rpm离心5min，去除沉淀得到eVLP粗纯样品，将超离获得粗纯样品进行透析换液，去除残留蔗糖及小分子杂质，获得较高纯度样品。留样进行动态光散射检测富集eVLP颗粒均一性(图1)和蛋白免疫印迹分析跨膜蛋白的展示（图2和图3），由图1可知，eVLP测得直径为158.59 nm，多分散性为8%，富集到的eVLP均一性较高。
本实施例中采用蛋白质免疫印迹(WB)方法检测Claudin 6 eVLP和Claudin 6-gp41-eVLP上蛋白表达，以此证明Claudin 6四次跨膜蛋白成功展示在eVLP上。具体步骤如下：
1）配胶：分别配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）的10％分离胶和5％浓缩胶；
2）电泳：每个孔加20μL样品，180V，50min进行电泳；
3）电转(湿转)：按如下顺序放置：透明孔板，黑色海绵，滤纸，PVDF膜，蛋白胶(按镜面对称的方式放置)，滤纸(加上这层滤纸后，用移液管赶走其中的气泡)，黑色海绵，黑色孔板，80V(电流保持于0.18-0.2A)转膜1小时；
4）封闭：5％脱脂牛奶，水平摇床上缓慢封闭1小时；
5）抗Flag一抗孵育：4℃孵育过夜；
6）洗膜：1×TBS洗3次，每次5min；
7）HRP荧光二抗孵育：室温下孵育1小时；
8）洗膜：1×TBS洗6次，每次5min；
9）显影：ECL 底物(A\B液等量混匀)，吸取适量 ECL 混合液滴在成像仪载物台上的PVDF膜上，设置曝光时间进行图片采集。
如图所示，通过蛋白质免疫印迹法检测 Claudin 6 eVLP和Claudin 6-gp41 eVLP中融合Flag标签的Claudin 6蛋白。结果表明：富集到的Claudin 6 eVLP中没有Claudin 6跨膜蛋白的展示（图2）；富集到的Claudin 6-gp41 eVLP中有Claudin 6跨膜蛋白的展示，分子量在45kDa左右，同时检测到有断裂条带，分子量在35kDa左右，可能为gp41被细胞自身蛋白酶切导致（图3）。
本实施例中采用酶联免疫吸附测定方法检测Claudin 6-gp41-eVLP与其特异抗体的结合活性，以此证明Claudin 6-gp41四次跨膜蛋白以正确的构象成功展示在eVLP上。具体步骤如下：
1）包被：5μg/mL的Claudin 6-gp41 eVLP包被96孔板(美国康宁公司，货号：42592)，在4℃包被过夜(或16小时)。Claudin 6-gp41 eVLP稀释所用的包被缓冲液为15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，7.7mM NaN3，pH 9.6；
2）洗涤：用每孔300μL的洗涤缓冲液(TBS，0.05％吐温-20，pH7.4)洗涤孔4次，洗完之后通过抽吸除去残留的溶液，并确保其完全干燥；
3）封闭：每孔用200μL封闭缓冲液(TBS，2％BSA，pH7.4)封闭1.5小时；
4）洗涤：重复步骤2；
5）添加样品：每孔加入100μL Claudin 6阳参抗体 (近案蛋白，Cat#NC202)，37℃孵育1小时；
6）洗涤：重复步骤2；
7）添加检测抗体：向每个孔中加入100μL 抗人免疫球蛋白G抗体，37℃孵育1小时；
8）洗涤：重复步骤2；
9）加入 100μL/well TMB 溶液，37℃孵育 20-30 分钟，避免强光直接照射；
10）终止反应：向各孔中加入100μL终止液；
11）在450nm分光光度计上读取每个微孔的吸光度。
酶联免疫吸附测定检测结果如图4所示，Claudin 6-gp41 eVLP与Claudin 6抗体结合的EC50值为2.33ng/mL，表明Claudin 6-gp41 eVLP与Claudin 6抗体具有很好的结合活性，从而证明Claudin 6四次跨膜蛋白以正确的构象成功展示在eVLP上。
本申请中涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1
NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERILL
SEQ ID NO.2
MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLAEAMSQVTNPATIMIQKGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPEESFRFGEETTTPSQKQEPIDKELYPLASLRSLFGSDPSSQ
SEQ ID NO.3
AATAGAGTGCGGCAGGGCTACAGCCCCCTGTCTTTCCAGACCCACCTGCCTATCCCCAGAGGCCCTGATCGGCCTGAGGGAATCGAGGAAGAGGGCGGCGAGAGAGACCGGGACAGAAGCATCCGGCTGGTGAACGGCAGCCTCGCCCTGATCTGGGACGACCTGAGATCTCTGTGCCTGTTCAGCTACCACAGACTGAGAGATCTGCTGCTGATCGTGACCAGAATTGTGGAACTGCTGGGCAGACGGGGCTGGGAAGCCCTGAAGTACTGGTGGAACCTGCTTCAATACTGGAGCCAGGAGCTGAAGAACAGCGCCGTGTCCCTGCTGAACGCCACCGCCATCGCTGTGGCCGAGGGAACAGACCGCGTCATCGAGGTGGTGCAGGGCGCTTATAGAGCCATCCGGCACATCCCAAGAAGGATCAGACAGGGCCTGGAAAGAATCCTGCTG
SEQ ID NO.4
ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGACCAGGAGCGACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTGGGGGGACCCGGCCATAAAGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAACAAATCCAGCTACCATAATGATACAGAAAGGCAATTTTAGGAACCAAAGAAAGACTGTTAAGTGTTTCAATTGTGGCAAAGAAGGGCACATAGCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCCACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAGAGAGCTTCAGGTTTGGGGAAGAGACAACAACTCCCTCTCAGAAGCAGGAGCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAGCTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTCGTCACAATAA
SEQ ID NO.5
CCTCPSGGSQGPSHYMARYSTSAPAISRGPSEYPTKNYV
SEQ ID NO.6
TGCTGCACCTGTCCTTCCGGCGGATCTCAGGGCCCAAGCCACTATATGGCCAGATACAGCACCAGCGCCCCTGCTATCAGCCGGGGCCCTAGCGAGTACCCCACAAAGAACTACGTG
SEQ ID NO.7
GTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCGCCACCATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGACCAGGAGCGACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTGGGGGGACCCGGCCATAAAGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAACAAATCCAGCTACCATAATGATACAGAAAGGCAATTTTAGGAACCAAAGAAAGACTGTTAAGTGTTTCAATTGTGGCAAAGAAGGGCACATAGCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCCACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAGAGAGCTTCAGGTTTGGGGAAGAGACAACAACTCCCTCTCAGAAGCAGGAGCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAGCTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTCGTCACAATAAGCTTGCTAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA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SEQ ID NO.8
GCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTATCGATCCGGAGGTACCGCCGCCACCATGGCCTCCGCAGGAATGCAGATCCTCGGGGTCGTTCTCACGTTGCTGGGATGGGTTAACGGCCTCGTAAGTTGTGCATTGCCTATGTGGAAAGTCACGGCTTTTATAGGTAACAGTATAGTAGTGGCACAAGTGGTGTGGGAAGGTCTTTGGATGTCCTGTGTAGTACAGTCCACGGGTCAGATGCAGTGTAAAGTATATGATTCCCTTCTGGCTCTTCCACAGGACCTTCAGGCGGCAAGGGCGCTCTGTGTGATTGCCCTCTTGGTTGCTTTGTTCGGCTTGCTTGTTTATCTTGCTGGGGCTAAATGCACGACTTGCGTTGAGGAAAAAGACTCTAAGGCACGGTTGGTTCTCACATCAGGAATCGTTTTCGTCATATCAGGTGTTTTGACGCTCATTCCGGTATGCTGGACGGCACACGCAATAATCCGCGACTTCTACAATCCCCTGGTAGCAGAGGCACAGAAGCGAGAACTCGGGGCAAGTCTTTACCTTGGGTGGGCTGCATCCGGATTGCTTCTGCTGGGAGGAGGTCTGCTCTGCTGCACCTGTCCTTCCGGCGGATCTCAGGGCCCAAGCCACTATATGGCCAGATACAGCACCAGCGCCCCTGCTATCAGCCGGGGCCCTAGCGAGTACCCCACAAAGAACTACGTGGATTACAAGGATGACGATGACAAGAATAGAGTGCGGCAGGGCTACAGCCCCCTGTCTTTCCAGACCCACCTGCCTATCCCCAGAGGCCCTGATCGGCCTGAGGGAATCGAGGAAGAGGGCGGCGAGAGAGACCGGGACAGAAGCATCCGGCTGGTGAACGGCAGCCTCGCCCTGATCTGGGACGACCTGAGATCTCTGTGCCTGTTCAGCTACCACAGACTGAGAGATCTGCTGCTGATCGTGACCAGAATTGTGGAACTGCTGGGCAGACGGGGCTGGGAAGCCCTGAAGTACTGGTGGAACCTGCTTCAATACTGGAGCCAGGAGCTGAAGAACAGCGCCGTGTCCCTGCTGAACGCCACCGCCATCGCTGTGGCCGAGGGAACAGACCGCGTCATCGAGGTGGTGCAGGGCGCTTATAGAGCCATCCGGCACATCCCAAGAAGGATCAGACAGGGCCTGGAAAGAATCCTGCTGTAACTCGAGGATTACAAGGATGACGATGACAAGTGATAAGTCGAGAAGCTTGCTAGCAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGAT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以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包含在本发明的范围内。
Claims (14)
1.一种包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白或其功能片段的方法，其特征在于，包含如下步骤：将编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因，以及编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因导入宿主细胞，培养宿主细胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述跨膜蛋白为作为药物靶点的跨膜蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述作为药物靶点的跨膜蛋白为四次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白或十一次跨膜蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述四次跨膜蛋白为Claudin 6蛋白或CD20，或所述七次跨膜蛋白为GPCRs，或所述十一次跨膜蛋白为NaPi2b。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白为HIV-1 gag蛋白、MLV gag蛋白、SIV gag蛋白、FIV gag蛋白、HTLV-1 gag蛋白或HTLV-1 gag蛋白中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为跨膜蛋白的胞内区或跨膜蛋白的功能片段的胞内区。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述gp41蛋白胞内区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，编码gp41蛋白胞内区的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒样颗粒骨架蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码目标蛋白与gp41蛋白胞内区的融合蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞，和/或，所述编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的基因以核酸构建体的形式导入宿主细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下条件中的任一项或多项：
1）编码包膜病毒样颗粒骨架蛋白的核酸构建体与编码所述融合蛋白的核酸构建体的导入宿主细胞的比例为1：（1~3）；
2）所述宿主细胞选自HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、EXPI293细胞或昆虫细胞；
3）培养宿主细胞的温度为30~42℃；
4）培养宿主细胞的CO2浓度为5%~10%；
5）培养宿主细胞的时间为60~80小时；
6）培养细胞的转速为80~150rpm。
13.一种VLP制剂，其特征在于，所述VLP制剂包含如权利要求1~12任一所述方法获得的已展示跨膜蛋白的包膜病毒样颗粒。
14.如权利要求13所述的VLP制剂在制备抗体或筛选抗体中的用途。
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| CN202411288086.2A Pending CN118792358A (zh) | 2024-09-14 | 2024-09-14 | 一种提高包膜病毒样颗粒展示跨膜蛋白丰度的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US20230097374A1 (en) * | 2020-02-03 | 2023-03-30 | Premas Biotech Pvt Ltd | Recombinant expression platform, constructs and methods for expression of Difficult to Express Proteins (DTE-Ps) |
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-
2024
- 2024-09-14 CN CN202411288086.2A patent/CN118792358A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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