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CN118792276A - T7 rna聚合酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

T7 rna聚合酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118792276A
CN118792276A CN202410925241.0A CN202410925241A CN118792276A CN 118792276 A CN118792276 A CN 118792276A CN 202410925241 A CN202410925241 A CN 202410925241A CN 118792276 A CN118792276 A CN 118792276A
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CN
China
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rna polymerase
polymerase mutant
mutant
seq
nucleotide sequence
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Application number
CN202410925241.0A
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Inventor
朱益波
寇振龙
徐秦
缪湘
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Hunan Ackery Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Hunan Ackery Bioengineering Co ltd
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了T7RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。本发明的T7RNA聚合酶突变体相比于野生型T7RNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：H161E、V185K、M226L、K412P、I581K、N671E；其中，所述野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的T7RNA聚合酶突变体相对于野生型T7RNA聚合酶表现出高转录产量，即在相同的转录条件下其获得的更高的转录产物。此外，本发明提供的T7RNA聚合酶突变体相较于野生型T7RNA聚合酶具有更高的耐热性，可广泛应用于RNA的体外合成。

Description

T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白工程技术领域，尤其是涉及T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
RNA聚合酶(RNA polymerase)是以一条DNA链或RNA为模板、三磷酸核糖核苷为底物，通过催化磷酸二酯键聚合并合成RNA的酶，其由于在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也被称为转录酶。
相关技术中，噬菌体T7 RNA聚合酶是催化RNA合成的最简单的酶之一，是从噬菌体T7感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，其一共有883个氨基酸，蛋白质分子量为99kDa。噬菌体T7 RNA聚合酶可催化从5’到3’方向的RNA合成，对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，通过识别特定的T7启动子序列并启动转录过程，利用ATP、CTP、GTP与UTP这四种天然核苷酸作为底物，通过与DNA模板碱基配对，按照碱基互补配对原则合成RNA。T7 RNA聚合酶需要DNA模板和镁离子(Mg2+)作为辅因子共同参与RNA的合成过程。在mRNA疫苗和药物领域，T7 RNA聚合酶常用于生产mRNA。然而，虽然T7 RNA聚合酶广泛应用于RNA的体外合成、体内蛋白表达(细菌高表达系统)等，但作为体外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺点，如热稳定性不理想，在合成RNA的过程中可能会产生许多的副产物，包括转录起始过程中产生的寡核苷酸、终止信号造成的中断RNA产物、依赖RNA的RNA聚合酶活性造成的3’末端延伸产物等。
基于此，亟需寻求一种具有高热稳定性、且能维持高效转录的T7 RNA聚合酶。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了T7RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用，该T7 RNA聚合酶突变体相对于野生型T7 RNA聚合酶表现出高转录产量，即在相同的转录条件下其获得的条带亮度更高。此外，本发明提供的T7 RNA聚合酶突变体相较于野生型T7 RNA聚合酶具有更高的耐热性。
本发明还提出了一种与T7 RNA聚合酶突变体相关的生物材料。
本发明还提出了一种酶制剂。
本发明还提出了一种T7 RNA聚合酶突变体的制备方法。
本发明还提出了一种体外扩增RNA分子的方法。
本发明还提出了一种T7 RNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。
本发明还提出了一种T7 RNA聚合酶突变体或上述酶制剂在核酸扩增中的应用。
本发明还提出了一种用于核酸扩增的试剂盒。
本发明的第一方面，提供了T7 RNA聚合酶突变体，所述T7 RNA聚合酶突变体相比于野生型T7 RNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：H161E、V185K、M226L、K412P、I581K、N671E；其中，所述野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明实施例的T7 RNA聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：本发明的T7RNA聚合酶突变体相对于野生型T7 RNA聚合酶表现出高转录产量，即在相同的转录条件下其获得的条带亮度更高。此外，本发明提供的T7 RNA聚合酶突变体相较于野生型T7 RNA聚合酶具有更高的耐热性。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体包含至少一个以下位点取代集：H161E/V185K、H161E/K412P、H161E/M226L、H161E/I581K、H161E/N671E、V185K/K412P、V185K/M226L、V185K/I581K、V185K/N671E、K412P/M226L、K412P/I581K、K412P/N671E、M226L/I581K、M226L/N671E、I581K/N671E，其中氨基酸位置参考野生型T7 RNA聚合酶氨基酸(SEQ ID NO.1)编号。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体包含至少一个以下位点取代集：H161E/V185K/M226L、H161E/V185K/K412P、H161E/V185K/I581K、H161E/V185K/N671E、H161E/M226L/K412P、H161E/M226L/I581K、H161E/M226L/N671E、H161E/K412P/I581K、H161E/K412P/N671E、H161E/I581K/N671E、V185K/M226L/K412P、V185K/M226L/I581K、V185K/M226L/N671E、V185K/K412P/I581K、V185K/K412P/N671E、V185K/I581K/N671E、M226L/K412P/I581K、M226L/K412P/N671E、M226L/I581K/N671E、K412P/I581K/N671E，其中氨基酸位置参考野生型T7 RNA聚合酶氨基酸(SEQ ID NO.1)编号。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体包含至少一个以下位点取代集：H161E/V185K/M226L/K412P、H161E/V185K/M226L/I581K、H161E/V185K/M226L/N671E、H161E/V185K/K412P/I581K、H161E/V185K/K412P/N671E、H161E/V185K/I581K/N671E、H161E/M226L/K412P/I581K、H161E/M226L/K412P/N671E、H161E/M226L/I581K/N671E、H161E/K412P/I581K/N671E、V185K/M226L/K412P/I581K、V185K/M226L/K412P/N671E、V185K/M226L/I581K/N671E、V185K/K412P/I581K/N671E、M226L/K412P/I581K/N671E，其中氨基酸位置参考野生型T7 RNA聚合酶氨基酸(SEQ ID NO.1)编号。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体包含至少一个以下位点取代集：H161E/V185K/M226L/K412P/I581K 、 H161E/V185K/M226L/K412P/N671E 、H161E/V185K/M226L/I581K/N671E 、 H161E/V185K/K412P/I581K/N671E 、H161E/M226L/K412P/I581K/N671E、V185K/M226L/K412P/I581K/N671E，其中氨基酸位置参考野生型T7RNA聚合酶氨基酸(SEQ ID NO.1)编号。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体的突变位点包含H161E、V185K、M226L、K412P、I581K、N671E。
在本发明的一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶突变体还包含标签序列。
在本发明的一些实施方式中，所述标签连接在所述T7 RNA聚合酶突变体的中间和/或N端或/和C端。
在本发明的一些实施方式中，所述标签序列包括利于T7 RNA聚合酶突变体的溶解、纯化和检测的标签序列中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述标签序列为组氨酸标签序列。
可以理解的是，本发明的T7 RNA聚合酶突变体可以包含一个或多个标签序列；多个标签序列可以包含多个相同标签序列的组合，也可以为多个不同标签序列的组合。例如：利于T7 RNA聚合酶突变体溶解的标签包括但不限于nus标签序列或麦芽糖结合蛋白标签序列；利于T7 RNA聚合酶突变体纯化的标签包括但不限于strep标签序列、His标签序列、GST标签序列、pelB信号标签序列或ompA信号标签序列；利于T7 RNA聚合酶突变体检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)标签序列、β-半乳糖苷酶标签序列、萤光素酶标签序列、绿色荧光蛋白(GFP)标签序列、HcRed标签序列、DsRed标签序列或青色荧光蛋白(CFP)标签序列。所述标签具体可以为His标签序列。
本发明的第二方面，提供了与第一方面所述的T7 RNA聚合酶突变体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子具有B11)至B18)中任一种：
B11)、如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子；
B15)、如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的DNA分子；
B16)、如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的DNA分子；
B17)、与B11)至B16)任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述T7 RNA聚合酶突变体的DNA分子；
B18)、在严格条件下与B11)至B16)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述T7RNA聚合酶突变体的DNA分子。
在本发明的一些实施方式中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述T7 RNA聚合酶突变体的DNA。该DNA不但可包括启动所述T7 RNA聚合酶突变体基因转录的启动子，还可包括终止所述T7 RNA聚合酶突变体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
在本发明的一些实施方式中，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。例如：可以为PET-28a载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述T7 RNA聚合酶突变体的DNA分子得到的重组载体。
在本发明的一些实施方式中，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如E.coli DH5α或E.coli BL21。所述重组生物不包含生殖材料。
在本发明的一些实施方式中，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向E.coliDH5α或E.coli BL21中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
本发明的第三方面，提供一种酶制剂，包括第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述酶制剂还包括反应预混液或酶保存液。
在本发明的一些实施方式中，所述反应预混液包括Tris-HCl、DTT、NTPs、Mg2+中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述酶保存液包含KPB、NaCl、DTT、EDTA、glycerol中的至少一种。
可以理解的是，所述反应预混液以不影响所述T7 RNA聚合酶突变体的活性为宜。
本发明的第四方面，提供一种第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体的制备方法，包括：
将第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，经纯化后得到所述T7 RNA聚合酶突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌(如：E.coli BL21)。
在本发明的一些实施方式中，所述真核细胞包括真菌(如酵母)、哺乳动物细胞(如HEK293细胞)或昆虫细胞。
本发明的第五方面，提供一种体外扩增RNA分子的方法，包括：
采用第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体或第三方面所述的酶制剂进行RNA分子扩增。
本发明的第六方面，提供C1)至C3)任一项在制备核酸扩增产品中的应用；
C1)、第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体；
C2)、第二方面所述的生物材料；
C3)、第三方面所述的酶制剂。
本发明的第七方面，提供第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体或第三方面所述的酶制剂在核酸扩增中的应用。
本发明的第八方面，提供一种用于核酸扩增或测序的试剂盒，包括第一方面任一项所述的T7 RNA聚合酶突变体或第三方面所述的酶制剂。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明野生型T7 RNA聚合酶的SDS-PAGE电泳结果。
图2为本发明T7 RNA聚合酶突变体m1～m6的SDS-PAGE电泳结果，其中A为T7 RNA聚合酶突变体m1，B为T7 RNA聚合酶突变体m2，C为T7 RNA聚合酶突变体m3，D为T7 RNA聚合酶突变体m4，E为T7 RNA聚合酶突变体m5，F为T7 RNA聚合酶突变体m6。
图3为本发明T7 RNA聚合酶的解折叠温度统计图。
图4为本发明T7 RNA 聚合酶在37℃条件下的转录性能检测结果统计图。
图5为本发明T7 RNA聚合酶在50℃条件下的转录性能检测结果统计图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明的描述中，术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的所有的和任意的组合。
本发明的描述中，术语“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物。例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
本发明的描述中，术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。氨基酸序列中的“*”为终止密码子。
本发明的描述中，序列表是指“ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表”。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
发明构思：
为获得具有高热稳定性、且能维持高效转录的T7 RNA聚合酶，本发明对野生型T7RNA聚合酶进行了突变和大量筛选，共筛选到6个具有优异热稳定性和高效转录的T7 RNA聚合酶突变体，其分别为T7RNA聚合酶突变体m1(H161E)、T7 RNA聚合酶突变体m2(V185K)、T7RNA聚合酶突变体m3(M226L)、T7 RNA聚合酶突变体m4(K412P)、T7 RNA聚合酶突变体m5(I581K)和T7 RNA聚合酶突变体m6(N671E)。
其中野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列信息如下：
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPPKPW TGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITKWKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLAYGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA(SEQ ID.NO.1)。
T7 RNA聚合酶突变体m1是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第161位组氨酸突变为谷氨酸(H161E)；T7 RNA聚合酶突变体m2是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第185位缬氨酸突变为赖氨酸(V185K)；
T7 RNA聚合酶突变体m3是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第226位甲硫氨酸突变为亮氨酸(M226L)；
T7 RNA聚合酶突变体m4是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第412位赖氨酸突变为脯氨酸(K412P)；
T7 RNA聚合酶突变体m5是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第581位异亮氨酸突变为赖氨酸(I581K)；T7 RNA聚合酶突变体m6是在野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列的基础上将第671位天冬酰胺突变为谷氨酸(N671E)。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件(例如文献、书本中所述的条件)或制造商建议的条件进行。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：T7 RNA聚合酶突变体的获取
1、表达载体的构建
基于筛选出来的T7 RNA聚合酶突变体的氨基酸序列信息，经密码子优化后获得编码核苷酸序列信息，同时在其3’端设计含编码组氨酸标签(HHHHHH)和连接肽(GS)的核苷酸序列，即ATGCATCATCATCATCATCATGGCAGC(SEQ ID NO.2)，采用基因合成方法合成相应DNA分子，其中：
编码野生型T7 RNA聚合酶的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.3所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m1的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.4所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m2的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.5所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m3的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.6所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m4的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.7所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m5的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.8所示。
编码T7 RNA聚合酶突变体m6的核苷酸序列信息如序列表中的SEQ ID NO.9所示。
然后分别将上述DNA分子通过重叠PCR与PET-28a载体连接，得到重组表达载体PET-28a/T7-wt、PET-28a/T7-m1、PET-28a/T7-m2、PET-28a/T7-m3、PET-28a/T7-m4、PET-28a/T7-m5和PET-28a/T7-m6。将重组表达载体分别转化至DH5α感受态细胞中，并筛选阳性单克隆进行测序验证，获取验证结果无误的单菌落。
2、表达
将上述步骤1验证后的重组表达载体转化至宿主细胞E.coli BL21中，挑取单菌落，接种至含50μg/mL氨苄西林的100mL LB培养基中，放置于37℃摇床中震荡培养过夜后，取过夜培养的种子液，按体积比1:100接种至2L含有50μg/mL氨苄西林的LB培养基中，37℃摇床中震荡培养至0D600为0.6～0.8；加入10％ IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃继续震荡诱导6h～8h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于-80℃。
3、纯化
分别提取上述含重组表达载体PET-28a/T7-wt、PET-28a/T7-m1、PET-28a/T7-m2、PET-28a/T7-m3、PET-28a/T7-m4、PET-28a/T7-m5或PET-28a/T7-m6的菌体中的表达蛋白，具体步骤如下：
(1)诱导表达菌体高压破碎：
分别取诱导表达后-80℃冻存的菌体，根据上述记录的菌体湿重，每克菌体加入5mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.8 at 25℃，300mM NaCl，50mM Imidazole，5％Glycerol)重悬菌体，用高压破碎仪裂解菌体，高压破碎条件为650bar，循环破碎三轮。将裂解后菌体在4℃下12000rpm离心30min，分离上清(样本1)和沉淀(样本2)，并取上清液至200mL灭菌烧杯中。
(2)镍离子亲和层析纯化：
选用的层析柱是Ni-NTA Purose 6Fast Flow(购自嘉兴千纯生物科技有限公司)，结合缓冲液为缓冲液A：50mM Tris-HCl、pH7.8 at 25℃，100mM NaCl，80mM Imidazole，5％Glycerol；洗脱缓冲液为缓冲液B:50mM Tris-HCl、pH7.8 at 25℃，100mM NaCl，500mMImidazole，5％ Glycerol。将步骤1所述溶解后的蛋白液上样至已用缓冲液A平衡好的层析柱中。上样完成后，先用平衡液A冲洗柱子，再用缓冲液B进行0％-100％的梯度洗脱，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集洗脱液(样本3)，并将洗脱液透析至缓冲液A中，收集透析液备用(样本4)。
(3)二次镍离子亲和层析纯化：
重复步骤(2)，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集洗脱液(样本5)，并将洗脱液透析至缓冲液C中，收集透析液备用(样本6)。
(4)强阴离子交换层析纯化：
选用的层析柱是Q Purose 6Fast Flow(购自嘉兴千纯生物科技有限公司)，结合缓冲液为缓冲液C；洗脱缓冲液为缓冲液D:50mM Tris-HCl pH7.8 at 25℃，800mM NaCl，1mMDTT，0.1mM EDTA。将步骤3获得的透析液加样至已用缓冲液C平衡好的层析柱中。加样完成后，先用缓冲液C冲洗柱子，再用缓冲液D进行0％-100％的梯度洗脱，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集洗脱液(样本7)，并透析至保存液(20mM KPB(pH7.9)、100mM NaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％glycerol)中备用(样本8)。
对上述样本进行SDS-PAGE电泳，结果如图1和图2所示，其中图1为T7 RNA聚合酶野生型，图2中的A～F分别对应T7 RNA聚合酶突变体T7-m1至T7-m6；另图1和图2中的泳道M为蛋白Marker，第1泳道对应样本1，依次类推。上述电泳结果显示采用本发明的方法成功获得了目标蛋白酶(即野生型T7RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶突变体m1～m6)。通过电泳条带可看出，该方法纯化处的T7 RNA聚合酶的杂带很少，产物纯度较高，其纯度能达到90％。
检测例1：解链温度(Tm值)测量
本检测例分别检测了上述获得的野生型T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶突变体m1～m6的解折叠温度，具体方法如下：
首先分别将野生型T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶突变体m1～m6用保存液(含20mMKPB(pH7.9)、100mM NaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA和50％glycerol)统一稀释至1mg/ml。然后配制反应体系，具体地，在每个反应体系中加入缓冲液(终浓度为1×SYPRO Orange)，以及对应的稀释后的T7 RNA聚合酶，制成20μL反应体系。最后使用ABIQuantStudio测量解折叠温度，每组三个平行实验，取平均值。
检测结果如图3所示，显示野生型T7 RNA聚合酶的解折叠温度为45.58℃，而突变后的T7 RNA聚合酶的解折叠温度明显高于野生型，其中T7 RNA聚合酶突变体m1的Tm值为46.65℃，T7 RNA聚合酶突变体m2的Tm值为46.80℃，T7 RNA聚合酶突变体m3的Tm值为47.47℃，T7 RNA聚合酶突变体m4的Tm值为47.47℃，T7 RNA聚合酶突变体m5的Tm值为46.80℃，T7RNA聚合酶突变体m6的Tm值为46.35℃。特别地，T7 RNA聚合酶突变体m3和T7 RNA聚合酶突变体m4相对于野生型的Tm值均提高了4.14％。在DSF实验中，其解链温度改变1℃，则认为其有明显差异，耐热性有显著提升，而m3和m4对比野生型，解链温度相差1.89℃，可认为m3、m4的耐热性强于野生型。
检测例2：不同温度下的转录性能检测
本检测例分别检测了上述获得的野生型T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶突变体m1～m6在不同反应温度(37℃和50℃)下的转录性能，具体方法如下：
首先，以pUC18质粒为模板，设计特异性引物组进行常规PCR扩增，并纯化得到约1.5k bp的DNA模板，其中特异性引物组序列如下：
PCR-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGACTATCGTCTTGAGT-3’(SEQ ID NO.10)；
PCR-R：5’-GACGAAAGGGCCTCGTGATA-3’(SEQ ID NO.11)；
然后以上述获得的野生型T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶突变体m1～m6为转录酶进行体外转录，其中转录的反应体系如表1所示：
表1：转录体系
组分 含量
反应缓冲液 1×
RNase抑制剂 1U
DTT(二硫苏糖醇) 5mM
NTPs混合物 0.5mM
DNA模板 200ng
T7 RNA聚合酶 50U
总体积 20μL
其中，10×反应缓冲液中包含400mM Tris-HCl(pH 8.0)、80mM MgCl2和20mMspermidine。反应体系配制完成后将其分别置于50℃/37℃条件下进行转录反应30min，然后于70℃下灭活处理10min，最后使用Qubit RNA HS检测试剂盒(Thermo Fisher)，进行转录产物定量分析。
37℃转录30min的产物荧光定量分析结果如图4和表2所示，具体如下：
表2：37℃条件下的荧光定量分析结果
样品编号 样本 突变位点 RNA产量(ng) 标准差
1 T7-m1 H161E 648.03 0.1
2 T7-m2 V185K 573.65 0.23
3 T7-m3 M226L 631.39 1.35
4 T7-m4 K412P 715.52 1.68
5 T7-m5 I581K 582.89 1.32
6 T7-m6 N671E 649.90 0.89
7 T7-wt WT 464.21 3.45
检测结果显示，在37℃反应条件下，T7 RNA聚合酶突变体m1～m6的转录性能相对于野生型T7 RNA聚合酶显著提高，其中相同反应条件下，使用T7 RNA聚合酶突变体4(K412P)作为转录酶，其转录得到的RNA产物产量是野生型的1.54倍。
50℃转录30min的产物荧光定量分析结果如图5和表3所示，具体如下：
表3：50℃条件下的荧光定量分析结果
检测结果显示，在50℃反应条件下，使用T7 RNA聚合酶突变体4(K412P)作为转录酶时产生的RNA产量是使用野生型T7 RNA聚合酶的4.54倍。
综上所述，本发明提供了T7 RNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。本发明的T7RNA聚合酶突变体共包含6种，分别为T7-m1～T7-m6，其对应的突变点分别为H161E、V185K、M226L、K412P、I581K和N671E。该T7 RNA聚合酶突变体相对于野生型T7 RNA聚合酶表现出转录产量的提升，即在相同的转录条件下其获得的条带亮度更高。此外，本发明提供的T7 RNA聚合酶突变体热稳定性进一步增强，相较于野生型T7 RNA聚合酶而言具有更高的耐热性。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.T7 RNA聚合酶突变体，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶突变体相比于野生型T7 RNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：H161E、V185K、M226L、K412P、I581K、N671E；其中，所述野生型T7 RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶突变体还包含标签序列；
优选地，所述标签序列为组氨酸标签序列。
3.与权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子具有B11)至B18)中任一种：
B11)、如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子；
B15)、如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的DNA分子；
B16)、如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的DNA分子；
B17)、与B11)至B16)任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述T7 RNA聚合酶突变体的DNA分子；
B18)、在严格条件下与B11)至B16)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述T7 RNA聚合酶突变体的DNA分子。
5.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体。
6.一种权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，经纯化后得到所述T7 RNA聚合酶突变体。
7.一种体外扩增RNA分子的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂进行RNA分子扩增。
8.C1)至C3)任一项在制备核酸扩增产品中的应用；
C1)、权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体；
C2)、权利要求3或4所述的生物材料；
C3)、权利要求5任一项所述的酶制剂。
9.权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂在核酸扩增中的应用。
10.一种用于核酸扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的T7 RNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂。
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