CN118772273A - 一种睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于免疫检测技术领域，公开了一种兔单克隆抗体mAb1及其应用。本申请提供的睾酮夹心法单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1‑3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述轻链可变区包括LCDR1‑3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列为SAS，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本申请的兔单克隆抗体可与睾酮复合物高特异性结合，将其应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中，双抗体夹心化学发光平台检测睾酮标准抗原，检测灵敏度低于0.5ng/ml，磁化学发光法检测临床样本，在0.4‑16ng/mL样本范围内，和临床比对相关性良好。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1及其应用。
背景技术
睾酮(又称睾固酮、睾丸素或睾丸酮)是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮。它是主要的男性荷尔蒙及同化激素。血液中的绝大部分睾酮可与血浆蛋白结合，仅有少数以游离形式存在。游离的睾酮才具有生物活性。
睾酮的主要生理作用为促进生殖器官的发育和生长，刺激性欲，同时，促进和维持男性第二性征的发育，维持前列腺和精囊的功能和生精作用。此外，其还可促进蛋白质合成、骨骼生长以及红细胞生成。该指标可用于评估睾丸雄激素分泌功能，帮助排查男性性发育异常、睾丸肿瘤及不育症等疾病。睾酮含量反映人体内雄性激素的正常范围，临床上常用于诊断某些内分泌疾病，如男子性功能障碍、女子性征异常、性早熟、性幼稚等。睾酮水平测定的临床意义对于女性来说也非常重要，当女性血清睾酮水平降低时，通常没有明显的临床意义。然而，当睾酮水平升高时，可能与妇科疾病、肾上腺疾病、妊娠、外源性因素相关。
检测睾酮常用的方法是质谱法，但质谱法检测需要复杂且耗时的样品前处理流程以及临床对自动化高要求，难以规模应用。因此，临床上通常采用免疫检测法进行检测。免疫检测技术操作简单、检测快速，是小分子质谱检测切实可行的替代方法。由于小分子缺乏抗原表位，目前临床免疫检测普遍采用的是竞争法，竞争法检测灵敏度低，特异性不好，易出现假阳，工艺复杂。
因此，目前急需开发针对睾酮夹心法高特异性、高灵敏度的单克隆抗体，突破传统竞争法局限，实现睾酮检测的双抗夹心法，为睾酮的临床免疫检测提供新思路。
发明内容
为了克服上述技术问题，本申请提供了特异性好、亲和力高的睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1，及其在双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中的应用，为前列腺疾病提供临床管理。
第一方面，本申请提供了一种睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1，所述兔单克隆抗体mAb1包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1-3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，所述轻链可变区包括LCDR1-3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列为SAS，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，VH全长为112个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，HCDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和9，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-101aa，其氨基酸序列分别为GFSLSSHA(SEQ ID NO.1)、INTGGSA(SEQ ID NO.2)、VRGDSNDWT(SEQ ID NO.3)。
进一步地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，VL全长为106个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，LCDR的3个结构域氨基酸数分别为6、3和7，LCDR1、LCDR2和LCDR3的区域相应地分别为27aa-32aa，50aa-52aa和89aa-95aa，其氨基酸序列分别：ESIFSY(SEQ ID NO.4)、SAS、LGSYSSI(SEQ ID NO.5)。
采用上述技术方案，本申请的睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1可以与睾酮高特异性结合，并具有高亲和力，其亲和常数Ka可达6.05×108L/mol。
另一方面，本申请还提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码含有所述的兔单克隆抗体mAb1。
另一方面，本申请还提供了核酸构建体，所述核酸构建体含有所述的多核苷酸，优选地，所述多核苷酸可以操作地连接至少一个表达调控元件。
另一方面，本申请还提供了重组表达载体，所述重组表达载体含有所述的多核苷酸，或所述的核酸构建体。
另一方面，本申请还提供了宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的多核苷酸，或所述的核酸构建体，或所述的重组表达载体。
另一方面，本申请还提供了所述的兔单克隆抗体mAb1、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体和/或所述的重组表达载体在制备用于检测睾酮的检测试剂或试剂盒中的应用。
另一方面，本申请还提供了一种用于检测睾酮的检测试剂或检测试剂盒，所述检测试剂或检测试剂盒含有所述的兔单克隆抗体mAb1。
进一步地，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒，所述兔单克隆抗体mAb1为检测抗体。
另一方面，本申请还提供了一种制备所述兔单克隆抗体mAb1的方法，所述方法包括，在适合于所述兔单克隆抗体mAb1表达的条件下，使用含有所述的多核苷酸，或所述的核酸构建体，或所述的重组表达载体的宿主细胞表达所述兔单克隆抗体mAb1，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体。并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体。
相对于现有技术而言，本申请的睾酮夹心法兔单克隆抗体可以与睾酮高特异性结合，并具有高亲和力，其亲和常数Ka可达6.05×108L/mol。本申请的睾酮夹心法兔单克隆抗体还可以制备成检测睾酮的各种免疫检测试剂盒，尤其是，应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中。双抗体夹心化学发光平台检测睾酮标准抗原，检测灵敏度低于0.5ng/ml，磁化学发光法检测临床样本，在0.4-16ng/mL样本范围内，和R临床比对相关性良好。
附图说明
图1为兔单克隆抗体mAb1重链和轻链全长扩增产物的电泳图，M为DNA分子量Marker。
图2为间接夹心ELISA法检测交叉蛋白以及目的抗原样本，纵坐标为检测的OD值。
图3为磁微粒化学发光法检测睾酮标准抗原，横坐标为睾酮标准抗原浓度(ng/ml)，纵坐标为检测的发光值。标准曲线的R2＝0.9917，线性检测范围0.4-16n/mL，推出样品浓度计算公式：y＝59177x-1082.9。
图4为磁微粒化学发光法检测临床样本，横坐标为临床样本睾酮浓度(ng/ml)，纵坐标为检测的发光值。标准曲线的R2＝0.9641，线性检测范围0.4-16n/mL，推出样品浓度计算公式：y＝225180x+21742。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1睾酮夹心法兔单克隆抗体的制备
1)免疫原的制备
优化不同方案制备睾酮复合物，免疫原纯度在90％以上，达到了制备单抗的纯度要求。
2)动物免疫
上述制备的睾酮复合物以1:1的体积比用完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg左右的新西兰大白兔，免疫剂量为800μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂以1:1的体积比乳化，免疫剂量为400μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；依据ELISA效价128000时的OD450大于1.0为标准，根据结果判定是否收集PBMCs或是继续免疫，选取抗体效价最高的兔子进行PBMCs收集。
3)PBMCs分离、特异性B细胞分选、克隆重组
将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛减掉，用酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的PBS混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400×g离心30分钟，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层即单个核细胞层、分离液层及红细胞层，小心吸取单个核细胞层并用PBS洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔PBMCs。
从兔PBMCs中继续分选抗原特异性的B细胞进行培养，培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA板筛选阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA，天然配对的兔单克隆抗体轻链、重链全长序列从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列，扩增的全长PCR产物结果如图1。
4)单克隆抗体的制备和纯化
为了获得多株识别睾酮小分子的兔单克隆抗体，将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载在表达载体上，将质粒转染KEK293细胞，转染120-144小时获得培养上清中含有重组的识别睾酮小分子的兔单克隆抗体。收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化。以BCA法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻干，将纯化后的抗体命名为兔单克隆抗体mAb1。
实施例2睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1的鉴定
1)兔单克隆抗体的特异性鉴定
采用间接ELSA法检测。以交叉蛋白、睾酮复合物抗原包被酶标板，浓度为1μg/ml，4℃过夜，以含1％BSA的PBST封闭酶标板，加104倍稀释的纯化后兔单克隆抗体mAb1，37℃反应50min，PBST洗板3次，加HRP-羊抗兔Ig二抗，37℃反应50min，PBST洗板5次，加TMB显色10min，加终止液，酶标仪测A450。
图2结果显示，交叉蛋白与兔单克隆抗体mAb1抗体反应呈阴性，OD450均小于0.25；睾酮复合物与mAb1抗体反应呈阳性，OD值远高于交叉蛋白，说明本申请的睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1特异性识别睾酮复合物。
2)兔单克隆抗体的亲和常数测定
采用非竞争ELISA法测定亲和常数(Ka)。
包被：用碳酸盐缓冲液稀释抗原至浓度为1、0.5、0.1、0.05μg/mL，按照100μL/孔加到96孔酶标板分别包被，4℃孵育24h；
封闭：用PBST洗板4次，按照200μL/孔加入BSA溶液，37℃孵育2h；
加单抗：用PBST洗板4次，用碳酸盐缓冲液将单抗MAB1以100μg/mL开始倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h；
加酶标二抗：用PBST洗板4次，每孔加入100μL的l:10000倍稀释的HRP酶标记的羊抗兔Ig二抗，37℃放置30min；
显色及终止：用PBST洗板4次，每孔加底物显色液100μL，37℃避光反应15min；每孔加入50μL 1.0mol/L的H2SO4终止液，终止反应；
检测：测定波长为450nm处的吸光度值(A450nm)。
以抗体浓度的对数为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制S型曲线，经计算，睾酮夹心法单克隆抗体mAb1的亲和常数Ka＝6.05×108L/mol。
3)抗体配对
为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合，将睾酮复合物抗体包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，PBST洗涤一次，1％BSA溶液37℃封闭2小时，PBST洗涤3次；每孔加入睾酮复合物100μl，浓度为20ng/ml，37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板，PBST洗涤3次，分别加入HRP标记的兔单克隆抗体mAb1、mAb0作为检测抗体，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次，加入TMB底物，37℃显色10min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数。根据样品的OD值与阴性对照的背景值，选出最为理想的抗体对，配对筛选结果见表1。
表1抗体配对实验筛选结果
可见，本申请涉及的抗体mAb1用于夹心法检测最佳。
实施例3兔单克隆抗体mAb1可变区基因与氨基酸序列分析以mAb1抗体的重组质粒为DNA模板，根据模板上轻链及重链5'端载体序列设计轻链可变区及重链可变区测序引物，采用测序仪ABI 3730进行测序。经测序获得兔单克隆抗体mAb1轻链及重链可变区核苷酸序列。
利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链可变区与重链可变区的核苷酸序列进行测序结果数据分析，兔单克隆抗体mAb1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。VH全长为112个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，HCDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和9，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-101aa，其氨基酸序列分别为GFSLSSHA(SEQ ID NO.1)、INTGGSA(SEQ ID NO.2)、VRGDSNDWT(SEQ ID NO.3)。VL全长为106个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，LCDR的3个结构域氨基酸数分别为6、3和7，LCDR1、LCDR2和LCDR3的区域相应地分别为27aa-32aa，50aa-52aa和89aa-95aa，其氨基酸序列分别：ESIFSY(SEQ ID NO.4)、SAS、LGSYSSI(SEQ ID NO.5)。
实施例4睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1用于磁微粒化学发光免疫检测
一、检测原理与方法
采用基于双抗体夹心法原理的磁微粒化学发光免疫检测技术。生物素标记睾酮抗体，将生物素化的抗体与SA磁珠进行固定，ALP偶联睾酮复合物兔单克隆抗体mAb1，同时将睾酮、ALP底物及相应buffer组分放置到科斯迈全自动磁微粒化学发光仪上，设置仪器程序进行检测。依据发光值信噪比大于2.0判读结果为阳性。发光值的大小反映了结合的酶标抗体的量，它与标本中睾酮的浓度成正比。根据所测定的标准品的发光值绘制标准曲线，待测标本中的睾酮浓度值即可从标准曲线上获得。
二、检测睾酮的磁微粒化学发光检测试剂盒组成
1.SA磁珠结合生物素-睾酮抗体：取50μl磁珠到0.5ml离心管中，置于磁力架上，1min后移除上清液；用0.5ml抗体稀释液洗涤磁珠3次；加入一定量的生物素标记的睾酮抗体室温旋转混合60min；进行磁性分离后重悬于磁性保存缓冲液，工作浓度0.5mg/ml。
2.mAb1偶联ALP：首先使用2-IT还原抗体mAb1；其次进行ALP-SMCC中间物形成，最后进行ALP-SMCC与还原抗体偶联。偶联结束后使用ALP保存缓冲液稀释到工作浓度。
3.洗涤缓冲液为常规的pH7.4的PBST，含0.05％ Proclin300，配制成20倍浓缩液。
4.化学发光显色液购于爱维德生物。
5.样本稀释液含1％BSA、0.05％Proclin 300的PBST，过滤除菌。
6.标准品睾酮小分子，以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％ Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为5μg/ml，过滤除菌，无菌分装。
三、对睾酮临床样本的检测
处理不同睾酮浓度的临床样本，以睾酮抗体为包被抗体、mAb1抗体为检测抗体，用上述检测方法检测不同浓度的临床样本。
图3为磁微粒化学发光法检测睾酮标准抗原，图4为磁微粒化学发光法检测临床样本。从图中可知，双抗体夹心化学发光平台检测睾酮标准抗原，检测灵敏度低于0.5ng/ml。同时，将本申请的睾酮夹心法兔单克隆抗体应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中，磁化学发光法检测临床样本，在0.4-16ng/mL样本范围内，其临床复合率＞0.95，明显高于传统竞争检测方法，突破了传统竞争法的限制。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种睾酮夹心法兔单克隆抗体mAb1，其特征在于，所述兔单克隆抗体mAb1包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1-3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
2.根据权利要求1所述的兔单克隆抗体mAb1，其特征在于，所述轻链可变区包括LCDR1-3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列为SAS，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的兔单克隆抗体mAb1，其特征在于，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
4.分离的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-3中任一所述的兔单克隆抗体mAb1。
5.核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求4所述的多核苷酸，优选地，所述多核苷酸可以操作地连接至少一个表达调控元件。
6.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的核酸构建体。
7.权利要求1-3任一所述的兔单克隆抗体mAb1、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建体和/或权利要求6所述的重组表达载体在制备用于检测睾酮的检测试剂或试剂盒中的应用。
8.一种用于检测睾酮的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒含有权利要求1-3任一所述的兔单克隆抗体mAb1。
9.根据权利要求8所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒，所述兔单克隆抗体mAb1为检测抗体。
10.一种制备权利要求1-3任一所述的兔单克隆抗体mAb1的方法，其特征在于，所述方法包括，在适合于所述兔单克隆抗体mAb1表达的条件下，使用含有权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的核酸构建体，或权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞表达所述兔单克隆抗体mAb1，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体。
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