CN118684759A - 用于治疗急性髓系白血病的成分和方法 - Google Patents

Abstract

描述了一种治疗癌症(如急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML))的精准编辑细胞抗原表位的成分和方法，尤其是复发和疑难AML。该方法指出，向患者输入靶向分子CD123、CD33、CD117或CLL‑1的抗体或表达嵌合抗原受体免疫细胞(CAR‑T,or CAR‑NK)的之前或同时，向患者移植具有相同分子表达，但破坏抗体或CAR所识别表位的精准编辑的干细胞。这种精准抗原表位突变的细胞可以逃逸免疫杀伤，但又不影响干细胞的正常分化和功能，成功实现特异靶向肿瘤的免疫治疗方法。

Description

用于治疗急性髓系白血病的成分和方法

本申请是申请号为202311057422.8、申请日为2023年8月22日、发明名称为“用于治疗急性髓系白血病的成分和方法”的发明专利申请的分案申请。

背景

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种由于髓系祖细胞发生突变，而导致细胞过度增殖且分化阻滞，致使髓系母细胞在造血组织中累积，从而引起的血液恶性肿瘤。常规治疗方法包括化学疗法和造血干细胞移植。尽管AML患者对高标准化疗初始反应较好，但复发现象普遍存在，并且大多数AML患者的预后较差。传统的化疗药物无法从根本上解决复发和药物耐药的高发生率。而造血干细胞移植后的复发率仍有40％，复发后2年存活率不到20％。因此，迫切需要开发新的和改进的治疗方法。

免疫细胞治疗，比如嵌合抗原受体T细胞疗法利用基因改造的T细胞，更具针对性且有效地靶向并杀死癌细胞。从血液中收集T细胞后，将其改造，使细胞表面表达识别肿瘤的嵌合抗原受体。可以利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR(Chimeric antigenreceptor,CAR)引入T细胞。当这些异体CAR-T细胞注射到患者体内时，识别肿瘤的CAR-T细胞可高效杀灭癌细胞。

CD33(也称为Siglec3、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素3、gp67或p67)是Siglec凝集素家族成员，其表达于正常的单核细胞、粒细胞、造血祖细胞以及干细胞群体中免疫表型定义的造血干细胞。在大多数AML患者的癌变细胞中，无论是初发还是复发，CD33皆表达，因此是一个经典的肿瘤表面分子。CD33通过与糖蛋白的唾液酸残基和糖脂的结合来发挥作用。靶向CD33的CAR-T细胞在临床上已经被证明可以杀肿瘤，然而由于CD33-CAR-T除了识别肿瘤细胞，也会识别表达CD33的健康髓系细胞群体，因此产生脱靶毒性，患者不耐受。

CD123是白介素-3受体的α链，CD123特异性识别并结合IL-3。IL-3主要由抗原刺激的辅助T细胞产生，它可以促进细胞生长和增殖。CD123与肿瘤的发生、过敏性炎症和自身免疫疾病有关。CD123在大多数AML患者的癌变细胞中表达。CD123也在正常造血干细胞中表达，并与造血干细胞的分化功能相关。靶向CD123-CAR-T细胞在临床上已经被证明可以杀肿瘤，然而由于CD123-CAR-T除了识别肿瘤细胞，也会识别表达CD123的健康髓系细胞群体，因此产生脱靶毒性，患者不耐受。

CD117，也称肥大/干细胞生长因子受体(Stem cell growth factor,SCFR)、原癌基因c-Kit、酪氨酸蛋白激酶Kit，是一种145-kd的跨膜糖蛋白。对于具有失活突变的c-kit或其配体——干细胞因子(Stem cell factor,SCF)——的小鼠研究表明，c-kit的正常功能活性对于维持正常造血、黑色素生成、生殖细胞生成以及细胞生长和分化至关重要。CD117在造血祖细胞、肥大细胞、生殖细胞、卡氏间质细胞上表达，并且在大多数AML患者的癌变细胞中高表达。因此，抗CD117CAR-T细胞代表着治疗CD117表达的恶性肿瘤的有效治疗方法。然而，由于正常造血干细胞也表达CD117,直接使用CD117-CAR-T免疫治疗会产生脱靶毒性。

C型凝集素样受体1也被称为MICL、CLEC12A、CLEC-1、树突状细胞相关凝集素和DCAL-2。CLL-1是一种糖蛋白受体，属于参与免疫调节的C型凝集素样受体家族成员。该家族的成员具有多种功能，如细胞黏附、胞间信号传导、糖蛋白代谢以及在炎症和免疫应答中的作用。CLL-1在造血细胞上表达，并主要在先天免疫细胞上表达，包括单核细胞、DCs、浆细胞样DCs以及粒细胞和髓系祖细胞。CLL-1也在大多数急性髓系白血病和骨髓增生异常综合症患者的癌细胞中表达。CLL-1是与白血病干细胞相关表面抗原。抗CLL-1CAR-T细胞代表着治疗CLL-1表达的恶性肿瘤的有效选择。然而，由于正常细胞也表达CLL-1,直接使用CLL-1-CAR-T免疫治疗会产生脱靶毒性。

摘要

本公开描述了一种治疗癌症(如急性髓系白血病)的成分和方法。该方法指出，向患者输入靶向分子CD33、CD123、CD117或CLL-1的抗体或表达嵌合抗原受体的免疫细胞的之前或同时，向患者移植具有相同分子表达，但破坏抗体或CAR所识别表位的突变工程干细胞。通过引入突变，工程干细胞表现与患者体内造血细胞不同，即不会受到治疗的影响，因此为患者提供功能性造血细胞和抗体。

本公开中的一种实施案例，提供了一种治疗癌症的方法，包括向患者输入含有CD33抗原表位突变的干细胞。由于突变位于CD33蛋白的抗原识别表位，相较于野生型CD33蛋白，突变的CD33蛋白与CD33-抗体的结合亲和力降低。其中，所述治疗包括抗体、抗体的抗原结合片段以及包含抗原结合片段的嵌合抗原受体或包含CAR的免疫细胞。

本公开中的另一种实施案例，提供了一种治疗癌症的方法，包括向患者输入含有CD123抗原表位突变的干细胞。由于突变位于CD123蛋白的抗原识别表位，相较于野生型CD123蛋白，突变的CD123蛋白与CD123-抗体的结合亲和力降低。其中，所述治疗包括抗体、抗体的抗原结合片段以及包含抗原结合片段的嵌合抗原受体或包含CAR的免疫细胞。

本公开中的另一种实施案例，提供了一种治疗癌症的方法，包括向患者输入含有CD117抗原表位突变的干细胞。由于突变位于CD117蛋白的抗原识别表位，相较于野生型CD117蛋白，突变的CD117蛋白与CD117-抗体的结合亲和力降低。其中，所述治疗包括抗体、抗体的抗原结合片段以及包含抗原结合片段的嵌合抗原受体或包含CAR的免疫细胞。

本公开中的另一种实施案例，提供了一种治疗癌症的方法，包括向患者输入含有CLL-1抗原表位突变的干细胞。由于突变位于CLL-1蛋白的抗原识别表位，相较于野生型CLL-1蛋白，突变的CLL-1蛋白与CLL-1-抗体的结合亲和力降低。其中，所述治疗包括抗体、抗体的抗原结合片段以及包含抗原结合片段的嵌合抗原受体或包含CAR的免疫细胞。

在一些实施案例中，癌症指白血病。在一些实施案例中，癌症指急性髓系白血病。

在一些实施案例中，干细胞指造血干细胞和祖细胞。

在一些实施案例中，突变CD33蛋白包括来自SEQ ID NO:1的C41、W60、I105、D112、Y116、F118、P132、W22、G34、R89、N100、N113和S131中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CD33抗体为my9.6或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变CD33蛋白包括来自SEQ ID NO:1的C41、W60、I105、Y116和F118中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CD33抗体为HM195或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变由包含一条向导RNA(guide RNA,gRNA)的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:19-144的间隔序列。在一些实施案例中，突变由包含一条pegRNA(prime editing guide RNA,pegRNA)的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:145-228的间隔序列。

在一些实施案例中，突变CD123蛋白包括来自SEQ ID NO:2的I27、L30、M32、W41、E51、C52、S59、P61、R84、P88、F90、S91和W93中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CD123抗体为CSL362或32716,或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变CD123蛋白包括来自SEQ ID NO:2的R84-R85组合突变，包括R84Q-V85I,R84Q-V85M,R84H-V85I,R84H-V85M。在一些实施案例中，抗CD123抗体为CSL362或32716,或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变由包含一条gRNA的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:229-516的间隔序列。在一些实施案例中，突变由包含一条pegRNA的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:517-541的间隔序列。

在一些实施案例中，突变CD117蛋白包括来自SEQ ID NO:3的T67、K69、T71、S81、Y83、T114、T119和K129中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CD117抗体为Ab85或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变CD117蛋白包括来自SEQ ID NO:3的S236、H238、Y244、S273、T277和T279中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CD117抗体为Ab85或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变由包含一条gRNA的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:542-758的间隔序列。在一些实施案例中，突变由包含一条pegRNA的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:759-801的间隔序列。

在一些实施案例中，突变CLL-1蛋白包括来自SEQ ID NO:4的氨基酸残基142-158中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变。在一些实施案例中，抗CLL-1抗体为Hu6E7.N54A或其抗原结合片段。

在一些实施案例中，突变由包含一条gRNA的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:802-897的间隔序列。在一些实施案例中，突变由包含一条pegRNA的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:880-893的间隔序列。

在一些实施案例中，治疗包括抗体、抗体中抗原结合片段、抗体药物偶联物。在一些实施案例中，免疫细胞指包含CAR的T细胞、NK细胞或巨噬细胞。

在一些实施案例中，进一步包括对患者进行治疗。在一些实施案例中，治疗在输入干细胞之后进行。

在一些实施案例中，干细胞对患者来说是自体或同种异体的。

在一些实施案例中，患者癌细胞内表达CD33、CD123、CD117或CLL-1。

在一种实施例中，提供了一种治疗急性髓系白血病的方法，包括：

(a)编辑干细胞的基因组，向CD33蛋白的抗原表位引入一个突变，该表位可被抗CD33抗体识别，相较于野生型CD33蛋白，突变的CD33蛋白与抗体的结合减少。其中，所述突变为来自SEQ ID NO:1的C41、W60、I105、D112、Y116、F118、P132、W22、G34、R89、N100、N113和S131中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变，

(b)将编辑过的干细胞移植给患者，且

(c)向患者输入抗体、抗体中抗原结合片段、抗体药物偶联物或包含CAR的免疫细胞。

在一种实施例中，提供了治疗急性髓系白血病的方法，包括：

(a)编辑干细胞的基因组，向CD123蛋白的表位引入一个突变，该表位可被CD123抗体识别，相较于野生型CD123蛋白，突变的CD123蛋白与抗体的结合减少。其中，所述突变为来自SEQ ID NO:2的I27、L30、M32、W41、E51、C52、S59、P61、R84、P88、F90、S91和W93中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变，

(b)编辑干细胞的基因组，向CD123蛋白的表位引入组合突变，该表位可被抗CD123抗体识别，相较于野生型CD123蛋白，突变CD123蛋白与抗体的结合减少。其中，所述突变为来自SEQ ID NO:2的R84-V85组合突变,包括R84Q-V85I,R84Q-V85M,R84H-V85I,R84H-V85M。

(c)将编辑过的干细胞移植给患者，且

(d)向患者输入抗体、抗体中抗原结合片段、抗体药物偶联物或包含CAR的免疫细胞。

在一种实施例中，提供了一种治疗急性髓系白血病的方法，包括：

(a)编辑干细胞的基因组，向CD117蛋白的表位引入一个突变，该表位可被抗CD117抗体识别，相较于野生型CD117蛋白，突变的CD117蛋白与抗体的结合减少。其中，所述突变为来自SEQ ID NO:3的T67、K69、T71、S81、Y83、T114、T119、K129、S236、H23、Y244、S273、T277和T279中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变，

(b)将编辑过的干细胞移植给患者，且

(c)向患者输入抗体、抗体中抗原结合片段、抗体药物偶联物或包含CAR的免疫细胞。

在一种实施例中，提供了一种治疗急性髓系白血病的方法，包括：

(a)编辑干细胞的基因组，向CLL-1蛋白的表位引入一个突变，该表位可被抗CLL-1抗体识别，相较于野生型CLL-1蛋白，突变的CLL-1蛋白与抗体的结合减少。其中，所述突变为来自SEQ ID NO:4的氨基酸残基142-158中一种或多种残基的突变，优先选择非保守突变，

(b)将编辑过的干细胞移植给患者，且

(c)向患者输入抗体、抗体中抗原结合片段、抗体药物偶联物或包含CAR的免疫细胞。

附图说明

图1.A-B一种治疗急性髓系白血病的方法示意图。(A)利用基因编辑工具精准编辑造血干细胞表达肿瘤标志物的抗原识别表位。精准编辑不影响蛋白的正常功能和细胞分化，但降低抗体的识别。(B)当对急性髓系白血病患者移植精准表位突变后的干细胞后，再给与CAR-T免疫细胞治疗，可以实现精准靶向肿瘤，避免正常细胞被免疫细胞攻击。这里举例CD123阳性的AML肿瘤,对于其他类型的肿瘤也类似。

图2.A-B确定介导与CD123单克隆抗体的单链可变区片段(single-chainvariable fragment,scFv)(克隆32716或CSL362)相互作用的抗原表位。(A)不同CD123突变体与CD123 scFv克隆32716(左图)和克隆CSL362(右图)的结合亲和力。在HEK 293T细胞中转染CD123野生型或不同突变体后，将其与CD123-scFv-荧光素酶融合蛋白共同孵育。(B)免疫共沉淀检测不同CD123突变体的表达量。向HEK 293T细胞转染带flag标签的CD123野生型或不同突变体。

图3.A-C CD123组合突变R84-V85可降低抗体CSL362亲和力，且不影响表达和CD123下游信号通路。(A)不同位点的组合突变与CSL362结合力。(B)免疫共沉淀检测不同组合突变体的表达量。(C)免疫共沉淀检测CD123下游信号通路pSTAT5。结果显示，组合突变不影响CD123正常功能。

图4.A-H通过碱基编辑器和先导编辑器在HEK 293T细胞中突变内源性CD123表位。(A-B)对BE靶向的HEK 293T细胞的CD123-R84(A)或L30(B)。箭头指示所需的突变位点。(C-E)在人造血干祖深度测序检测编辑效率(C,E)和编辑产物(D,F)。(E-F)ABE8.8m介导的单碱基编辑产物纯度超过90％，而CBE具有较多的副产物(C-D)。(G)利用先导编辑器对CD123-R84位点进行精准编辑。示意图显示pegRNA的设计。(H)一代测序显示两条pegRNA均可以有效编辑R84位点。箭头指向编辑位点。

图5.A-D抗原表位精准编辑后的造血干细胞具有正常髓系分化和增殖能力。(A)髓系细胞计数。相较于CD123敲除的细胞，CD123 R84Q或L30P抗原表位精准编辑的细胞具有更好的细胞活力。(B)髓系细胞形态。CD123 R84Q或L30P精准编辑的细胞和对照形态一致，而直接敲除CD123会影响细胞形态变化。(C-D)髓系分化比例。将编辑后的造血干祖进行体外髓系分化，分别用髓系表面分子CD11b(C)和CD14(D)去验证分化能力。精准编辑的细胞并不影响髓系分化。

图6.A-C抗原表位精准编辑后的造血干细胞可正常分化成浆细胞样树突状细胞。(A)浆细胞样树突状细胞数。相较于CD123敲除的细胞，CD123 R84Q或L30P抗原表位精准编辑的细胞具有更多的浆细胞样树突状细胞。(B)浆细胞样树突状细胞分化比例。将编辑后的造血干祖进行体外浆细胞样树突状细胞分化，用CD303表面分子去验证分化能力。(C)浆细胞样树突状细胞形态。pDC:plasmacytoid dendritic cell,浆细胞样树突状细胞。

图7.A-B CD123-CAR-T靶向杀细胞实验。(A)制备含有CSL362单抗的CAR-T细胞，并将CAR-T细胞与野生型AML肿瘤细胞,敲出了CD123的AML细胞，或含有CD123-R84Q突变的细胞进行共孵育。CAR-T可高效杀死表达CD123的野生型肿瘤细胞，而对于含有CD123-R84Q突变的细胞,其杀伤力显著降低。

图8.A-D确定介导与CD33单克隆抗体的单链可变区片段(single-chain variablefragment,scFv)(克隆my9.6或HM195)相互作用的抗原表位。(A)不同CD33突变体与CD33-scFv(克隆my9.6)的结合亲和力。向HEK 293T细胞转染CD33野生型或不同突变体后，将其与抗CD33 scFv-荧光素酶融合蛋白共同孵育。(B)免疫共沉淀检测CD33的表达量。向HEK 293T细胞转染带标签的CD33野生型或各个突变体。(C)其他CD33突变体的结合亲和力。RLU(Relative luminescence units)指相对荧光单位。(D)免疫共沉淀检测CD33的表达量。向HEK 293T细胞转染带flag标签的CD33野生型或各个突变体。

图9.A-G通过碱基编辑器和先导编辑器在HEK 293T细胞中精准编辑CD33的抗原表位。(A)利用碱基编辑器对CD33-W60R进行精选编辑。编辑结果进行一代测序，箭头指示所需的突变位点。(B)深度测序检测编辑效率和编辑产物。(C)利用先导编辑器对CD33-P132位点进行精准编辑。示意图显示pegRNA的设计。(D-F)通过筛选不同的nick位点(D)、pegRNA上PBS序列长度(E)和pegRNA上RTT模板长度(F)对先导编辑器进行细胞优化。(G)优化后的先导编辑器可精准编辑CD33-P132A，效率达50％。

详细描述

定义

术语“同种异体”指从一个体中获得的任何物质，然后引入到同一物种的另一个体中，例如同种异体T细胞移植。

术语“自体”指从同一个体中获得的任何物质，之后再将其重新引入到该个体中。例如，本文所描述的工程自体细胞治疗(eACT^TM)方法涉及到从患者中收集淋巴细胞后，对其进行工程改造令其表达例如CAR，之后再次回输给此患者。

术语“抗体”(Antibody,Ab)包括但不限于与抗原特异性结合的糖蛋白免疫球蛋白。一般情况下，抗体至少由两个重链(H链)和两个轻链(L链)组成，通过二硫键或抗原结合分子相互连接。每个H链包括一个重链可变区(Heavy chain variable区域,VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个恒定结构域，即CH1、CH2和CH3。每个L链包括一个轻链可变区(Light chain variable区域,VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个恒定结构域(Light chain constant区域,CL)。VH和VL区域可以进一步分为高度可变区，称为互补决定区(Complementarity determining区域,CDR)，夹杂着相对保守的区域，称为骨架区(Framework,FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端到羧基末端的顺序排列为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。H链和L链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。Ab的恒定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞，例如效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。一般而言，人类抗体是约150kD的四聚体，由两个相同的H链多肽(每个约50kD)和两个相同的L链多肽(每个约25kD)组成，它们相互结合形成了通常被称为“Y形”的结构。H链和L链通过单一的二硫键连接；另外两个二硫键连接H链铰链区，使二聚体相互连接，从而形成四聚体。自然产生的抗体也是糖基化的，例如在CH2结构域上。

术语“可变区”与“可变结构域”可互换使用。可变区通常指的是抗体的一部分，一般来说，是轻链或重链的一部分，在成熟重链中通常在氨基末端约为110到120个氨基酸，在成熟轻链中约为90到115个氨基酸。这些区域的序列在抗体之间差异很大，用于保证特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。序列上的可变性主要集中在称为互补决定区(Complementarity determining区域,CDR)的区域，而可变区中保守性更高的区域被称为骨架区(Framework,FR)。不希望受限于任何特定的机制或理论，通常认为轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施案例中，可变区为人类的可变区。在某些实施案例中，可变区由啮齿类或鼠源性CDR和人类的FR组成。在特定实施案例中，可变区为灵长类(例如非人类灵长类)的可变区。在某些实施案例中，可变区由啮齿类或鼠源性CDR和灵长类(例如非人类灵长类)的FR组成。

术语“VL”与“VL结构域”可互换使用，指抗体或抗原结合分子的轻链可变区。

术语“VH”与“VH结构域”可互换使用，指抗体或抗原结合分子的重链可变区。

“嵌合抗原受体”或“CAR”是一种经过工程改造的分子，包括结合基序(motif)，且与抗原结合后，CAR提供一种激活免疫细胞(例如T细胞，则为原始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或以上细胞组合)的方式。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在某些实施案例中，CAR包括结合基序、胞外域、跨膜域、一个或多个共刺激结构域和一个细胞内信号传导结构域。被基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞称为CAR T细胞。“胞外域(Extracellular domain,ECD)”指多肽的一部分，当该多肽定位于细胞膜中时，则认为位于细胞膜外，即胞外间隙。

术语“胞外配体结合域”，如本文所述，指的是能够结合配体(例如细胞表面分子)的寡肽或多肽。例如，可选择胞外配体结合域识别某种配体，此配体可以是特定疾病程度(例如癌症)下相关靶细胞的细胞表面标志物。例如与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关的那些细胞表面标志物也可作为配体。

CAR的结合域后面可能跟着一个“间隔区”或“铰链区”，它用于将抗原结合域与效应细胞表面分离，以便实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活((Patel et al.,GeneTherapy,1999；6:412-419)。在CAR中，铰链区通常位于跨膜(Transmembrane,TM)域和结合域之间。在特定实施案例中，铰链区指免疫球蛋白铰链区，可以是野生型免疫球蛋白铰链区或经过改造的野生型免疫球蛋白铰链区。其他符合上述CAR的示例铰链区包括来自CD8α、CD4、CD28和CD7等1型膜蛋白胞外域的铰链区，可以是这些分子中的野生型铰链区，也可以是经过改造的铰链区。

“跨膜”区或“跨膜”域是CAR的一部分，它将胞外结合部分锚定在免疫效应细胞的质膜上，并促进结合域与目标抗原的结合。跨膜域可以是CD3ζ跨膜域，然而其他可能被用作跨膜域的的结构域可来自CD8α、CD4、CD28、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在某实验案例中，跨膜域是CD137的跨膜域。在特定实施案例中，跨膜域是合成的，在这种情况下，它主要由疏水性氨基酸残基如亮氨酸和缬氨酸组成。

“胞内信号传导区”或“信号传导区”是CAR蛋白的一部分，它参与将CAR与目标抗原的有效结合信息传导到免疫效应细胞的内部，从而激活效应细胞功能，如细胞活化、细胞因子的产生、细胞增殖和细胞毒活性，包括将细胞毒性因子释放至与CAR结合的靶细胞，或其他因抗原与CAR胞外域结合而引发的细胞应答。术语“效应功能”指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可能是细胞溶解活性、辅助功能或一些诸如细胞因子的分泌的功能。因此，“胞内信号传导区”或“信号传导区”这两个术语在此可互换使用，指蛋白质的一部分，用于传导效应功能信号并引导细胞执行特定功能。通常情况下，整个胞内信号传导区都可以使用，但在许多情况下，并不需要使用整个区域。只要截短部分的细胞内信号传导区可以传导效应功能信号，在这种情况下，截短部分就可以代替整个区域。术语“胞内信号传导区”包括足以传导效应功能信号的任何胞内信号传导区的截短部分。胞内信号传导区也被称作“信号转导区”，通常是从人类CD3或FcRy链中衍生而来。

众所周知，仅通过T细胞受体产生的信号对T细胞的完全激活是不足够的，还需要一个次级的、或者称为共刺激信号。因此，T细胞的激活可说是通过两种不同的胞质信号序列来介导的：一类是通过T细胞受体(称为初级胞质信号序列)引发抗原依赖性的初级激活，另一类则是以不依赖抗原的方式提供次级或共刺激信号(称为次级胞质信号序列)。以共刺激方式中起作用的胞质信号序列可能包含被称作基于免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的信号基序。

本公开中，ITAM范例包含作特殊使用的初级胞质信号序列，其中包括来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的序列。

在此使用的术语“共刺激信号传导区”或“共刺激结构域”指包含共刺激分子胞内区的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其在与抗原结合后为T淋巴细胞提供有效激活和功能所需的第二信号。这些共刺激分子的案例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、B7-H2和特异性结合CD83的配体。因此，虽然本披露提供了源自CD3ζ和4-1BB的共刺激结构域示例，但其他共刺激结构域也可被考虑与本文描述的CAR一起使用。一个或多个共刺激信号传导区可能增强表达CAR受体的T细胞的效率和扩增。这些胞内信号传导和共刺激信号传导区可以按任意顺序串联至跨膜结构域的羧基端。

经过工程改造的、基于scFv的CAR，含有来自CD3或FcRγ的信号传导区，且已被证明能够为T细胞提供强效的信号，促进其激活和效应功能。然而，在缺乏共刺激信号伴随的情况下，它们并不足以引发促进T细胞存活和扩增所需的信号。其他包含结合域、铰链区、跨膜区和来自CD3ζ或FcRγ的信号传导区的CAR，与一个或多个共刺激信号传导区(例如来自CD28、CD137、CD134和CD278的胞内共刺激结构域)一同，可能可以更有效地在体外、动物模型和癌症患者体内引导表达CAR的T细胞的抗肿瘤活性、增加细胞因子分泌、细胞溶解活性、存活和增殖。

“保守性氨基酸替代”指用具有类似侧链的氨基酸残基替代原有氨基酸残基。本领域中，已经定义了一些具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括：基础性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬酰胺酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香性侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在免疫球蛋白多肽中，非必需氨基酸残基最好用同一侧链家族中的其他氨基酸残基替代。在另一个实施案例中，一串氨基酸可以被具有类似结构但顺序和/或组成有所不同的侧链家族成员替代。

下表中提供了保守氨基酸取代的非限制性实例，其中相似性分数大于或等于0表示两个氨基酸之间的保守性替代。

在某些情况下，不被视为保守性氨基酸替代/突变的替代/突变称为非保守性替代/突变。

“患者”包括任何患有癌症(例如白血病)的人类。本文中术语“受试者”和“患者”可以互换使用。

一种治疗剂(例如工程改造的CAR T细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”指当单独使用或与其他治疗剂联合使用时，能够保护受试者免受疾病发作或促进疾病恢复的某个剂量，表现为疾病症状严重程度减轻、疾病症状无症状期的频率升高和持续时间增加，或对疾病导致的损害或残疾的预防。可通过多种方法对治疗剂促进疾病恢复的能力进行评估，例如在临床试验中对人体受试者进行评估，或者在动物模型系统中进行评估以预测其对人体有效性，或者在体外实验中通过对此治疗剂的活性进行分析，以上方法皆为专业人员所熟知。

“治疗”受试者指对受试者进行的任何类型的干预或过程，或向受试者输入活性药物，旨在逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防疾病症状、并发症或病况的发作、进程、发展、严重程度或复发，或降低生化相关指标。在一种实施案例中，“治疗”指部分缓解。在另一种实施案例中，“治疗”指完全缓解。在某些实施案例中，治疗可以针对没有表现出相关疾病、紊乱和/或病况迹象的受试者，或者仅表现出早期疾病、紊乱和/或病况迹象的受试者。在某些实施案例中，这样的治疗可能针对表现出一个或多个已确诊的相关疾病、紊乱和/或病况迹象的受试者。在某些实施案例中，治疗可能针对被诊断为患有相关疾病、紊乱和/或病况的受试者。在某些实施案例中，治疗可以针对具有一种或多种易感因素的受试者，所述易感因素与相关疾病、紊乱和/或病况风险的增加在统计学上相关。

“锌指DNA结合蛋白(Zinc finger DNAbinding protein,ZFP)”(或结合结构域)指一种蛋白质，或者一个较大蛋白质内的一个结构域，其通过一个或多个锌指结构以序列特异的方式结合DNA，其中锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，通过与锌离子配位使结构稳定。因此，多指ZFP的每个锌指都包含一个螺旋识别区，用于与骨架DNA结合。术语“锌指DNA结合蛋白”通常简写为锌指蛋白或ZFP。术语“锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)”包括一个ZFN，以及成对的ZFNs(该对中的成员被称为“左和右”或“第一和第二”或“成对”)，它们二聚化以切割目标基因。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”指包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。每个重复结构域包含一个重复可变二残基(Repeat variable diresidue,RVD)，参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复”)通常长度为33-35个氨基酸，并且在天然存在的TALE蛋白内，与其他TALE重复序列至少表现出一些序列同源性。TALE蛋白可被设计为使用重复单元内的天然或非天然的RVD与靶位点结合(参照美国专利U.S.Pat.Nos.8,586,526与9,458,205)。因此，锌指与TALE DNA结合蛋白可以通过“工程改造”结合预定的核苷酸序列，例如通过工程改造(改变一个或多个氨基)天然存在的锌指蛋白的螺旋识别区，或通过改造参与DNA结合的氨基酸(重复可变残基或RVD区)。因此，改造后的锌指蛋白或TALE蛋白是非天然存在的蛋白质。非限定性的工程改造锌指蛋白和TALE的方法案例包括设计和选择。设计的蛋白质是一种在非天然存在的蛋白质，其设计/组成主要来自理性准则。设计的理性准则包括应用替代规则和计算机算法来处理数据库中现有的ZFP或TALE(天然与非天然RVD)设计和结合数据的存储信息。参照美国专利U.S.Pat.Nos.9,458,205；8,586,526；6,140,081；6,453,242和6,534,261；还可参照国际专利Nos.WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。术语“TALEN”包含一个TALEN以及成对的TALEN(该对中的成员被称为“左和右”或“第一和第二”或“成对”)，它们二聚化以切割目标基因。

规律成簇的间隔短回文重复序列/规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociatedprotein),CRISPR/Cas)系统因其无与伦比的编辑效率、便捷性以及在生物体内的潜在应用而受到广泛关注，是自从其诞生以来，最强大的基因组编辑工具。在由引导RNA(guide RNA,gRNA)指导下，Cas核酸酶在各种细胞(包括细胞系和原代细胞)中在目标基因组位点产生DNA双链断裂(DNAdouble strand break,DSB)。之后这些DSB将被内源性DNA修复系统修复，从而实现所需的基因组编辑。

碱基编辑器是最近开发的一种技术，它将CRISPR/Cas系统与载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽类似物(Apolipoprotein B mRNAediting enzyme,catalytic polypeptide-like,APOBEC)胞嘧啶脱氨酶家族相结合，极大地提高了CRISPR/Cas9介导的基因修复效率。通过与Cas9切口酶(Cas9 nickase,nCas9)或催化失活的Cas9(Dead Cas9,dCas9)融合，大鼠APOBEC1(Rat A1,rA1)的胞嘧啶(C)脱氨酶活性可以被目的性地定向到基因组中目标碱基，并在这些碱基上实现C到胸腺嘧啶(T)的置换。

先导编辑器(Prime editor,PE)是一种可以修改生物体基因组的基因编辑技术。PE直接在目标DNA位点写入新的遗传信息。其利用由工程改造的反转录酶和催化失活的内切酶(例如Cas9)组成的融合蛋白，以及PE向导RNA(Prime editing guide RNA,pegRNA)一同，能够识别目标位点，提供新的遗传信息以替代目标DNA核苷酸。PE在无需DNA双链断裂(DNAdouble strand break,DSB)或供体DNA模板的情况下实现了有针对性的插入、缺失和碱基对碱基的转换。移植工程改造肿瘤抗原表达细胞

肿瘤相关抗原常成为癌症治疗的目标。理想情况下，非癌细胞不表达这些抗原，因此不会被治疗杀死。然而，其他组织有时也会表达这些抗原，尽管表达较低。因此，这些细胞可能会成为治疗的目标，导致不良反应。

以肿瘤相关抗原为靶点的示例疗法包括抗体，可以直接作用，也可以通过抗体依赖的细胞毒性作用(Antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)或抗体依赖的细胞吞噬作用(Antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)。另一个例子是嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法，利用基因改造的T细胞靶向并杀死癌细胞。

本公开提供了一种治疗癌症的组合物和方法，同时减少了治疗中，靶向表达肿瘤相关抗原的非癌细胞相关的不良反应。在一个说明案例中，利用基因编辑工具编辑造血干细胞和祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)中的目标表位，使其保留正常的生物学功能的同时，无法与治疗抗体或CAR细胞结合。当将改造后HSPC移植到接受治疗的患者体内时，即使患者自身的HSPC受到治疗的靶向作用，移植的改造后HSPC可以补充所需的HSPC活性，从而减少或避免相关的毒性。

根据本公开的一个实施案例，提供了一种为癌症(例如白血病，尤其是AML)患者进行治疗的方法。该治疗是专门针对癌细胞表达的抗原设计的，可能包括抗体、抗原结合片段、嵌合抗原受体或免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞)或它们的相关编码序列。例如已知的一些肿瘤相关抗原。在一些实施案例中，癌症为白血病。在一些实施案例中，白血病是AML，尤其是复发和疑难AML。对于急性髓系白血病，抗原可能是CD33、CD123、CD117或CLL-1等，无任何限制。在一些实施案例中，癌症患者体内存在表达CD33的癌细胞。在一些实施案例中，癌症患者体内存在表达CD133的癌细胞。在一些实施案例中，癌症患者体内存在表达CD117的癌细胞。在一些实施案例中，癌症患者体内存在表达CLL-1癌细胞。

在一些实施案例中，该方法指向患者输入表达一种突变形式抗原的干细胞。在一些实施案例中，这种突变位于治疗靶向的抗原表位内的一个或多个氨基酸残基，或者位于影响该结合的一个或多个氨基酸残基，例如通过决定表位构象实现。在一些实施案例中，这种突变不影响，或至少不显著改变抗原的活性。

已在CD33、CD123、CD117或CLL-1鉴定对结合各种常用抗体重要的氨基酸残基。

例如对于CD33，结合抗体my9.6的重要残基包括C41、W60、I105、D112、Y116、F118、P132、W22、G34、R89、N100、N113和S131(根据SEQ ID NO:1所示的CD33蛋白质序列中的残基位点)。如众所周知，抗体my9.6具有SEQ ID NO:5所示的VH序列和SEQ ID NO:6所示的VL序列。可理解的是，my9.6的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

同样对于CD33，结合抗体HM195的重要残基包括C41、W60、I105、Y116和F118(根据SEQ ID NO:1所示的CD33蛋白质序列中的残基位点)。如众所周知，抗体HM195具有SEQ IDNO:7所示的VH序列和SEQ ID NO:8所示的VL序列。可理解的是，HM195的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

对于CD123，结合抗体CSL362或32716的重要残基包括I27、L30、M32、W41、E51、C52、S59、P61、R84、P88、F90、S91和W93(根据SEQ ID NO:2所示的CD123蛋白质序列中的残基位点)。如众所周知，抗体CSL362具有SEQ ID NO:9所示的VH序列和SEQ ID NO:10所示的VL序列；抗体32716具有所示的SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:12所示的VL序列。可理解的是，CSL362或32716的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

对于CD117，结合抗体Ab85的重要残基包括T67、K69、T71、S81、Y83、T114、T119和K129(根据SEQ ID NO:3所示的CD117蛋白质序列中的残基位点)。如众所周知，抗体Ab85具有SEQ ID NO:13所示的VH序列和SEQ ID NO:14所示的VL序列。可理解的是，Ab85的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

同样对于CD117，结合抗体Ab67的重要残基包括S236、H238、Y244、S273、T277和T279(根据SEQ ID NO:3所示的CD117蛋白质序列中的残基位点)。如众所周知，抗体Ab67具有SEQ ID NO:15所示的VH序列和SEQ ID NO:16所示的VL序列。可理解的是，Ab67的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

对于CLL-1，结合抗体Hu6E7.N54A的重要残基包括根据SEQ ID NO:4所示的CLL-1蛋白质序列中的142到158残基(DSCYFLSDDVQTWQESK)。如众所周知，抗体Hu6E7.N54A具有SEQ ID NO:17所示的VH序列和SEQ ID NO:18所示的VL序列。可理解的是，Hu6E7.N54A的抗原结合片段或包含该抗原结合片段的CAR分子也具有相同的结合特性。

在某些实施案例中，该突变消除或减少了抗体、抗原结合片段或CAR与抗原的结合。在某些实施案例中，该突变是非保守性突变。非保守性突变的示例在表A中展示，用负数(<0)的相似性得分表示。在某些实施案例中，仅使用具有<-1的相似性得分的氨基酸残基。在某些实施案例中，仅使用具有<-2、<-3或<-4的相似性得分的氨基酸残基。在某些实施案例中，将突变为(非丙氨酸的残基)丙氨酸。在某些实施例中，不突变为丙氨酸。在某些实施例中，不突变为半胱氨酸。表B中展示了示例突变。

被工程改造和移植的干细胞可以是任何能够取代被靶向治疗的内源细胞的干细胞。例如，对于AML，干细胞可以是造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem andprogenitor cell,HSPC)或诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)，无任何限制。在移植之前，干细胞可能会被培养和/或分化。干细胞可以获取或来自赠者或来自患者。

在某些实施案例中，治疗包括相应的抗体、抗体的抗原结合片段、包含抗原结合片段的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)，或包含CAR的免疫细胞。制备抗体、片段和CAR的方法在技术上是已知的，例如DNA合成、转导和表达。

在某些实施案例中，CAR在免疫细胞中表达并组装成CAR免疫细胞。在某些实施案例中，免疫细胞可以是T细胞、NK细胞或巨噬细胞，无任何限制。

治疗时给药最好在干细胞移植后进行。在另一实施案例中，可以同时进行。在某些实施案例中，治疗时给药至少一次、两次或多次在干细胞移植之前进行。

在相关技术领域众所周知，可能需要多次输入本公开的治疗成分来实现所需的治疗。例如，一种成分可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间内进行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次的给药。

本公开描述的细胞成分的给药方法包括有效回输离体遗传修饰的免疫效应细胞的任何方法，这些免疫效应细胞在患者体内直接表达CAR，或者在再次引入基因改造的免疫效应细胞的祖细胞时，分化为表达CAR的成熟免疫效应细胞。一种方法包括在体外用本披露的核酸编辑产物转导入外周血T细胞，之后将转导后的细胞返回到患者体内。

尽管上述公开已经通过举例和说明进行了详细描述，以便清楚地理解。但在本公开的指导下，对于技术领域的普通技术人员来说，在不背离附加权利要求的精神或范围的情况下，可以很容易地对其进行某些变更和修改。以下实例仅供说明，不作限制。本领域技术人员可以认识到，更改或修改一系列非关键参数能够获得类似的结果。

基因编辑方法与编辑细胞

这些突变可以通过技术领域已知的方法引入至干细胞中，例如锌指DNA结合蛋白、TALEN技术、转座子、逆转座子或基于CRISPR的技术，例如碱基编辑器和先导编辑器。

众所周知，碱基编辑器和先导编辑器对目标序列的要求，给设计合适的向导RNA序列带来挑战性。通过尝试与失误，本发明者能够设计并确认多个可引入所需突变的gRNA序列。

碱基编辑器将CRISPR/Cas系统与载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽类似物(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide-like,APOBEC)激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID)家族集成在一起。通过与Cas9切割酶(Cas9 nickase,nCas9)或一个催化失活的Cpf1(dCpf1，也称为dCas12a)融合，APOBEC/AID家族成员的碱基脱氨酶活性可以定向至基因组中的目标碱基，并催化碱基替换。

本文中，术语“核碱基脱氨酶”指的是一组催化核碱基(如胞嘧啶、脱氧胞嘧啶、腺嘌呤和脱氧腺嘌呤)水解脱氨的酶。核碱基脱氨酶的非限定性例子包括胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶。

“胞嘧啶脱氨酶”指催化胞嘧啶和脱氧胞嘧啶不可逆水解脱氨，分别生成尿嘧啶和脱氧尿嘧啶的酶。胞嘧啶脱氨酶维持细胞嘧啶池。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽类似物(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide-like,APOBEC)家族是胞嘧啶脱氨酶的一个家族。该家族的成员为C至U的编辑酶。一些APOBEC家族成员具有两个结构域，其中一个结构域是催化域，而另一个结构域是假催化性域。具体而言，催化域指锌依赖的胞嘧啶脱氨酶结构域，对胞嘧啶脱氨反应很重要。APOBEC-1的RNA编辑需要同源二聚化，并且该复合物与RNA结合蛋白相互作用形成编辑体。

APOBEC蛋白的非限定性例子包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4和激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID)。

“腺苷脱氨酶”，也称为腺苷氨水解酶(Adenosine aminohydrolase,ADA)，参与嘌呤代谢(EC 3.5.4.4)。它在食物中的腺苷分解以及组织中核酸代谢中起作用。

腺苷脱氨酶的非限定性例子包括tRNA特异性腺苷脱氨酶(tRNA-specificadenosine deaminase,TadA)、腺苷脱氨酶tRNA 1特异性(Adenosine deaminase tRNAspecific 1,ADAT1)、腺苷脱氨酶tRNA 2特异性(Adenosine deaminase tRNA specific 2,ADAT2)、腺苷脱氨酶tRNA 3特异性(Adenosine deaminase tRNA specific1,ADAT3)、腺苷脱氨酶RNA特异性B1(Adenosine deaminase RNA specific B1,ADARB1)、腺苷脱氨酶RNA特异性B2(Adenosine deaminase RNA specific B1,ADARB2)、腺苷单磷酸脱氨酶1(Adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)、腺苷单磷酸脱氨酶2(Adenosinemonophosphate deaminase 1,AMPD2)、腺苷单磷酸脱氨酶3(Adenosine monophosphatedeaminase 1,AMPD3)、腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase,ADA)、腺苷脱氨酶2(Adenosinedeaminase,ADA2)、类腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase like,ADAL)、含腺苷脱氨酶结构域1(Adenosine deaminase domain containing 1,ADAD1)、含腺苷脱氨酶结构域2(Adenosine deaminase domain containing 1,ADAD2)、腺苷脱氨酶RNA特异性(Adenosinedeaminase RNA specific,ADAR)和腺苷脱氨酶RNA特异性B1(Adenosine deaminase RNAspecific B1,ADARB1)。

先导编辑器是一种可以修改生物体基因组的基因编辑技术。PE直接在目标DNA位点写入新的遗传信息。其利用由工程改造的逆转录酶和催化失活的内切酶(例如Cas9)组成的融合蛋白，以及pegRNA(Prime editing guide RNA,pegRNA)一同，能够识别目标位点，提供新的遗传信息以替代目标DNA核苷酸。PE在无需DNA双链断裂(DNA double strandbreak,DSB)或供体DNA模板的情况下实现了有针对性的插入、缺失和碱基对碱基的转换。

pegRNA是一种能够识别目标核苷酸序列以进行编辑的RNA分子，它编码用于替换目标序列的新遗传信息。pegRNA由一个延伸的单链向导RNA(single suide RNA,sgRNA)组成，其中包含一个引物结合位点(Primer binding site,PBS)和一个反转录(Reversetranscriptase,RT)模板序列。在基因组编辑过程中，PBS使得被切割的DNA链的3’端与pegRNA杂交，而RT模板作为编辑遗传信息合成的模板。

融合蛋白在一些实施案例中包含一个与反转录酶融合的切口酶。切口酶的一个示例为Cas9 H840A。Cas9包含两个可切割DNA序列的核酸酶结构域，一个为用于切割非靶标链的RuvC结构域，另一个为用于切割靶标链的HNH结构域。通过在Cas9中引入H840A替换，即用丙氨酸替换840位的组氨酸，使得HNH结构域失活。由于仅RuvC结构域起作用，导致催化失活的Cas9引入单链切口，因此是一种切口酶。

反转录酶的非限定性示例包括人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirusHIV)反转录酶、Moloney小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,M-MLV)反转录酶和鸟类骨髓母细胞病毒(Avian myeloblastosis,virusAMV)反转录酶。

在一些实施案例中，先导编辑器系统还包括一个单链指导RNA(Single guideRNA,sgRNA)，它指导融合蛋白中的Cas9 H840A切口酶部分切割未编辑的DNA链。

用于碱基编辑器的示例gRNA和用于先导编辑器的示例pegRNA，详见表1-4。例如，对于CD33，gRNA可以包含来自SEQ ID NO:19-144的间隔序列，而pegRNA可以包含来自SEQID NO:145-228的间隔序列。对于CD123，gRNA可以包含来自SEQ ID NO:229-516的间隔序列，而pegRNA可以包含来自SEQ ID NO:517-541的间隔序列。对于CD117，gRNA可以包含来自SEQ ID NO:542-758的间隔序列，而pegRNA可以包含来自SEQ ID NO:759-801的间隔序列。对于CLL-1，gRNA可以包含来自SEQ ID NO:802-879的间隔序列，而pegRNA可以包含来自SEQID NO:880-893的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD33的C41位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ IDNO:19-33的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的W60位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:34-46的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的I105位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:47-58的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的D112位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:59-65的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的Y116位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:66-72的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD33的F118位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:73-80的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的P132位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:81-89的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的W22位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:90-99的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的G34位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:101-110的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的R89位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:111-118的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD33的N100位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:119-128的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的N113位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:129-133的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的S131位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:134-144的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD33的W22、G34或C41位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:145-180的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的W60位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:181-186的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的R89、N100或I105位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:187-212的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的D112、N113、Y116或F118位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:213-216的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD33的S131或P132位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:217-228的间隔序列。

在一些实施案例中，引入的CD33的突变(相对于SEQ ID NO:1)包括W60R。在一些实施案例中，引入的CD33的突变(相对于SEQ ID NO:1)包括Y59H/W60R/F61L、Y59H/W60R/F61P、W60R/F61P、W60R/F61S、W60R/F61L、Y59H/F61L、Y59H/F61L、Y69H/W60R、或者F61P和W60R。

在某些实施案例中，要在CD123的I27位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:229-263的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的L30位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:264-298的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的M32位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:299-330的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的W41位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:331-345的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD123的E51位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:346-376的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的C52位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:377-391的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的S59位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:392-420的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的R84位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:421-435的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD123的P88位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:436-450的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的F90位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:451-466的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的S91位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:467-497的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的W93位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:498-516的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD123的R84、P88、F90、S91或W93位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:517-533的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的E51、C52、S59或P61位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:534-537的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD123的I27、L30、M32或W41位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:538-539的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的I27、L30或M32位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:540的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD123的I27或L30位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:541的间隔序列。

在一些实施案例中，引入的CD123的突变(相对于SEQ ID NO:2)包括R84和R85组合突变，比如R84Q-V85I,R84Q-V85M,R84H-V85I,或者R84H-V85M。他们的相应序列见表A(SEQID NO:894-897)。

表A.突变的CD123序列

在一些实施案例中，突变由包含一条gRNA的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:229-516的间隔序列。在一些实施案例中，突变由包含一条pegRNA的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:517-541的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD117的T67位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:542-554的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的K69位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:555-561的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T71位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:562-566的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的S81位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:567-583的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD117的Y83位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:584-595的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T114位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:596-610的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T119位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:611-623的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的K129位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:624-641的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD117的S236位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQID NO:642-661的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的H238位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:662-666的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的Y244位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:667-701的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的S273位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:702-738的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T277位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:739-751的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T279位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:752-758的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD117的T67、K69、T71、S81或Y83位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:759-769的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的T114、T119或K129位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:770-791的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CD117的S236、H238或Y244位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:792-796的间隔序列。在某些实施案例中，要在CD117的S273、T277或T279位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:797-801的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CLL-1的142至158残基(DSCYFLSDDVQTWQESK)中，例如来自SEQ ID NO:4中D142、S143、C144、Y145、F146、L147、S148、D149、D150、V151、Q152、T153、W154、Q155、E156、S157或K158位点引入突变，gRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:802-879的间隔序列。

在某些实施案例中，要在CLL-1的142至158残基(DSCYFLSDDVQTWQESK)中，例如来自SEQ ID NO:4中D142、S143、C144、Y145、F146、L147、S148、D149、D150、V151、Q152、T153、W154、Q155、E156、S157或K158位点引入突变，pegRNA序列可以包含来自SEQ ID NO:880-893的间隔序列。

实例1：CD123表位的识别和编辑

类似于实例1，确定了介导CD123蛋白与单克隆抗体32716或CSL362的scFv的结合表位。在HEK 293T细胞转染野生型CD123或位于抗原表位的突变体，之后与CD123-scFv-荧光素酶融合蛋白进行孵育。图2A展示了不同CD123突变体与抗CD123 scFv克隆32716(左图)或克隆CSL362(右图)的结合亲和力。这些突变体的表达通过免疫印迹实验进行了验证(图2B)。

进一步通过组合突变，如R84Q-V85I或R84Q-V85M,均有效降低与scFv亲和力，达100倍(图3A)。引入组合突变并不影响CD123的正常折叠和表达(图3B)。在对CD123蛋白下游功能进行验证发现，组合突变和单点表位突变均不影响下游信号通路的激活(图3C)，提示精准突变可以在不影响蛋白正常功能的情况下特异性降低与抗体的互作。

利用碱基编辑器和先导编辑器分别在HEK 293T细胞和人源造血干祖细胞中对CD123抗原表位进行精准编辑。通过Sanger测序验证了编辑效率(图4A中的R84或图4B中的L30)。深度测序结果显示了每个编辑产物的编辑效率(图4C-F)。如图4G-H所示，先导编辑器在CD123-R84位点也可以进行高效精准编辑。箭头指向编辑位点。

进一步在造血干祖细胞中验证精准编辑CD123抗原表位不影响干细胞分化和功能。相较于CD123敲除的细胞，CD123 R84Q或L30P抗原表位精准编辑的细胞具有更好的细胞活力(图5A),且细胞形态和未编辑的对照一致(图5B)。流式细胞仪分析髓系分化比例和浆细胞样树突状细胞分化比例均和对照一致(图5C和图6)。

在进一步在造血干祖细胞中验证精准编辑CD123抗原表位不影响干细胞分化和功能。相较于CD123敲除的细胞，CD123 R84Q或L30P抗原表位精准编辑的细胞具有更好的细胞活力(图5A),且细胞形态和未编辑的对照一致(图5B)。流式细胞仪分析髓系分化比例和浆细胞样树突状细胞分化比例均和对照一致(图5C和图6)。

在CD123-CAR-T靶向杀细胞实验中，精准突变的细胞可以规避CAR-T杀伤。(A)制备含有CSL362单抗的CAR-T细胞，并将CAR-T细胞与野生型AML肿瘤细胞,敲出了CD123的AML细胞，或含有CD123-R84Q突变的细胞进行共孵育。CAR-T可高效杀死表达CD123的野生型肿瘤细胞，而对于含有CD123-R84Q突变的细胞,其杀伤力显著降低。

实例2：CD33表位的识别和编辑

本实例确定了CD33蛋白质与抗体my9.6或HM195结合的潜在表位，并设计了能够消除抗体结合的突变体。

向HEK 293T细胞转染野生型或特定CD33突变体，并与抗CD33 scFV-荧光素酶融合蛋白进行孵育。被测试的突变位点包括W22、C41、W60、I105、D112、Y116、F118、S131和P132。测试的抗体包括my9.6和HM195。图8A和8C展示了各CD33突变体与抗体my9.6的结合亲和力(RLU指相对荧光素单位)。图8B和8D展示了转染细胞中CD33表达的免疫印迹图。这些图清楚地显示，一些突变显著减少了结合，因此这些位点属于结合表位。

利用碱基编辑器和先导编辑器对抗原表位进行精准编辑。Sanger测序验证了在造血干祖细胞中W60R精准编辑效率达80％。在图9A中，红色箭头指向目标突变位点。图9B展示了编辑产物的编辑效率，包括Y59H/W60R/F61L、Y59H/W60R/F61P、W60R/F61P、W60R/F61S、W60R/F61L、Y59H/F61L、Y59H/F61L、Y69H/W60R、F61P和W60R。很明显，绝大多数产物包含了所需的W60R突变。

图9C展示了先导编辑器的设计示意图(PE4的spacer定位用于将P132突变为A)及其在HEK293T细胞中的编辑效率。进一步通过不同的切割位点(图9D)、PBS长度(图9E)或RT模板长度(图9F)优化编辑。在图9G中，对PE4、PE4max和PEmax在CD33的P132到A132的编辑效率进行比较，所有的编辑效率都很高。

进一步对CD33和CD123的其他表位残基进行了类似的实验，对CD117和CLL-1也进行了实验。在表1中总结了用于BE gRNA或PE pegRNA中的目标残基及其相应的间隔序列。

表1A.CD33表位的残基

表1B.CD33蛋白序列(SEQ ID NO:1)

表1C.my9.6的VH/VL

表1D.HM195的VH/VL

表1E.可用于编辑CD33表位的gRNA spacer(间隔区)序列*以DNA序列表达RNA序 列，T代表RNA中的U(下同)

表1F.可用于编辑CD33表位的pegRNA spacer(间隔区)序列

表2A.CD123表位的残基

抗体	表位中的靶向残基
		CSL362or 32716	I27,L30,M32,W41,E51,C52,S59,P61,R84,V85,P88,F90,S91,W93

表2B.CD123蛋白序列(SEQ ID NO:2)

表2C.CSL362的VH/VL

表2D.32716的VH/VL

表2E.可用于编辑CD123表位的gRNA spacer(间隔区)序列

表2F.可用于编辑CD123表位的pegRNA spacer(间隔区)序列

表3A.CD117表位的残基

抗体	表位中的靶向残基
		Ab85	T67,K69,T71,S81,Y83,T114,T119,K129
Ab65	S236,H238,Y244,S273,T277,T279

表3B.CD117蛋白序列(SEQ ID NO:3)

表3C.Ab85的VH/VL

表3D.Ab67的VH/VL

表3E.可用于编辑CD117表位的gRNA spacer(间隔区)序列

表3F.可用于编辑CD117表位的pegRNA spacer(间隔区)序列

表4A.CLL-1表位的残基

表4B.CLL-1蛋白序列(SEQ ID NO:4)

表4C.Hu6E7.N54A的VH/VL

表4D.可用于编辑CLL-1表位的gRNA spacer(间隔区)序列

表4F.可用于编辑CLL-1表位的pegRNA spacer(间隔区)序列

Claims (18)

1.一种含有突变的突变CD33蛋白，其突变为在SEQ ID NO:1上含有选自P132、C41、W60、I105、D112、Y116、F118、W22、G34、R89、N100、N113和S131中一种或多种残基的突变，或组合突变。

2.权利要求1所述的突变CD33蛋白中，其突变为非保守突变。

3.权利要求1所述的突变CD33蛋白中，其突变为P132上的突变。

4.权利要求1所述的突变CD33蛋白中，其突变为P132A。

5.一种含有根据权利要求1所述的突变CD33蛋白的细胞在制造用于治疗白血病患者的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，该癌症患者为接受抗CD33抗体治疗的患者，其中该抗CD33抗体选自抗体药物，含有该抗体的抗体药物偶联物，或者表达含有该抗体的嵌合抗原受体的免疫细胞。

7.根据权利要求5所述的应用，该抗CD33抗体为单克隆HM195或其抗原结合片段。

8.根据权利要求5所述的应用，该突变由包含一条gRNA(guide RNA)的碱基编辑器引入干细胞，其中gRNA包含一段来自SEQ ID NO:19-144的间隔序列。

9.根据权利要求5或者8所述的应用，该突变由包含一条peg RNA(prime editingguide RNA)的先导编辑器引入干细胞，其中pegRNA包含一段来自SEQ ID NO:145-228的间隔序列。

10.根据权利要求5所述的应用，该癌症为急性髓系白血病。

11.根据权利要求5所述的应用，该细胞为干细胞。

12.根据权利要求11所述的应用，干细胞指造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stemand progenitor cell,HSPC)。

13.根据权利要求5所述的应用，该抗CD33治疗包括含嵌合抗原受体的免疫细胞。

14.根据权利要求13所述的应用，该免疫细胞为T细胞、NK细胞和巨噬细胞。

15.一种编码根据权利要求1所述的突变CD33蛋白的核酸序列。

16.一种包含根据权利要求1所述的突变CD33蛋白或者根据权利要求15所述的核酸序列的细胞。

17.一种含有突变的突变CD117蛋白，其突变为在SEQ ID NO:3上含有选自T67、K69、T71、S81、Y83、T114、T119和K129中一种或多种残基的突变，或组合突变。

18.一种含有突变的突变CLL-1蛋白，其突变为在SEQ ID NO:4上选自氨基酸残基142-158中一种或多种残基的突变，或组合突变。