CN118667006A - 靶向ror1的抗体、包含其的抗体偶联药物、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了靶向ROR1的抗体、包含其的抗体偶联药物、制备方法和用途。该靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段具有本文公开的重链可变区、轻链可变区和互补决定区(CDR)。本申请还提供了包含所述靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段的抗体偶联药物、其制备方法和用途。
Description
技术领域
本文涉及医药领域，尤指一种靶向ROR1的抗体偶联药物、其制备方法和用途。
背景技术
受体酪氨酸激酶样孤儿受体l(ROR1)是一种I型跨膜的受体酪氨酸激酶蛋白，在早期胚胎发育过程中高表达，并且在多种生理过程中发挥重要作用，包括调节细胞分裂、增殖、迁移等，参与神经，骨骼和血管等器官的生成。在随后的胎儿发育过程中，ROR1的表达量逐渐下降，正常的儿童和成人组织细胞表面基本没有ROR1的表达(Semin Cancer Biol2014Vol.29,21-31)。但在多种肿瘤细胞中，包括肺腺细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌(BMC Cancer.2021Nov 11；21(1):1199.)等实体瘤细胞以及某些血液恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)中ROR1的表达大幅提高，并且ROR1的表达和疾病的进展以及治疗效果密切相关(Clin Cancer Res.2017Jun 15；23(12):3061-3071；Front Oncol.2021May 28；11:680834)，例如在CLL患者中ROR+的比例超过90％(Blood.2021Jun 17；137(24):3365-3377.)。ROR1在侵袭性恶性肿瘤中的表达会启动类似胚胎发育的转录过程。ROR1可与wnt5a结合，参与wnt通路的信号转导，以及与EGFR、Met等信号通路相互作用，促进肿瘤细胞的生长、增殖和转移。ROR1在癌症干细胞的发育和上皮间充质转化(EMT)过程中起到重要作用。癌症干细胞是肿瘤中更具有干细胞特征的癌细胞，它们通常对化疗药物具有更高的耐药性。而EMT过程让细胞的形态从上皮细胞的形态转化为间质细胞的形态，让它们更具侵袭性，促进癌症的转移。
ROR1在肺癌中的作用包括抑制细胞凋亡，增强EGFR信号传导和诱导增殖，同时有多篇文献阐明ROR1在肺腺癌转移中的发挥重要作用。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)靶向治疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)综合治疗中非常重要作用，然而几乎所有患者应用一段时间后不可避免地出现耐药。而耐药病人中发现EGFR T790M突变与ROR1表达升高，提示采用ROR1靶向治疗有可能应用于EGFR突变及EGFRTKI耐药的肿瘤病人(Transl Lung Cancer Res.2014Jun；3(3):122-30.)。
综上，ROR1可作为一种特异性的肿瘤标志物及肿瘤治疗药物靶标进行药物开发。
发明内容
抗体偶联药物(Antibody-drug conjugates,ADC)可以由靶向肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗体(Antibody)与不同数目的细胞毒性药物(Payload)通过连接子(Linker)偶联组成，是近年来肿瘤学发展最快的药物类别之一。由于兼具单抗药物的高靶向性以及细胞毒性药物在肿瘤组织中高活性的双重优点，ADC药物可高效杀伤肿瘤细胞，较化疗药物副作用更低，较传统抗体类肿瘤药物具有更好的疗效，被称为肿瘤治疗领域的“生物导弹”。截至目前，据悉全球已有14款ADC药物获批上市，7款用于血液肿瘤，7款用于治疗实体瘤，靶点涉及CD33、CD30、CD22、CD79b、HER2、Nectin-4、Trop-2、BCMA、CD19和TF。其中，4款ADC药物在中国上市。
目前尚未有靶向ROR1的抗体偶联药物上市，处于临床阶段的ROR1 ADC药物包括：默沙东(MSD)公司和VelosBio公司联合开发的VLS-101(VLS101)，目前正分别在一项1期临床试验和一项2期临床试验中用于治疗血液癌症和实体瘤；基石药业与LegoChemBiosciences公司共同开发的ROR1的抗体偶联药物LCB71，LCB71携带肿瘤激活的吡咯并苯二氮(PBD)前毒素，而PBD由于其自身毒性，在实体瘤治疗过程中体现出安全窗口过窄(JThorac Oncol.2021Sep；16(9):1429-1433.)；此外，勃林格殷格翰/NBE Therapeutics公司开发的ROR1 iADC NBE-002，通过转肽酶Sortase A介导的特异性反应将PNU-159682定点、定量地偶联到抗体重链、轻链的C末端，PNU-159682与PBD类毒素存在同样的安全性隐患。ROR1与其他ADC抗原不同，如HER2在肿瘤细胞上有数十万个拷贝，ROR1在大多数肿瘤细胞中的表达水平并不很高，每个细胞不多于5000个拷贝。因此，本领域迫切需要开发一类新型靶向ROR1的抗体偶联药物，可以提高ADC药物在肿瘤细胞内的药物浓度，降低整体血浆中药物浓度，从而提高ADC药物对肿瘤的治疗效果和降低毒素分子带来的副作用。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的第一方面提供了一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1、17和33中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3、19和35中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:5、21和37中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7、23和39中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9、25和41中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11、27和43中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(2)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(2)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15-16、31-32或47-48所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fd、Fab、Fab'和F(ab')2。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段以2.0×10-9M或更小的KD结合人ROR1。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段，其不与小鼠ROR1交叉反应。
本发明的第二方面提供了编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在一些实施方案中，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸序列具有与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、18、20、22、24、26、28、34、36、38、40、42或44至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性。
本发明的第三方面提供了包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体或质粒。
本发明的第四方面提供了包含并表达上述核酸序列、质粒或载体的宿主细胞。
本发明的第五方面提供了一种具有式I所示结构的抗体偶联药物
Ab-(L-D)n(式I)，
其中Ab是上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
L是连接子；
D是细胞毒性药物；且
n是1-10之间的数，优选地1-8的值；优选地n是1、2、3、4、5、6、7、8，以及任何两个值之间的任何值。
进一步，L选自马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺(MAL)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯)(SMCC)接头与抗体部分连接、双取代马来酰亚胺，并包含缬氨酸-瓜氨酸(VC)、缬氨酸-丙氨酸(VA)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG)、丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸(AAA)、对氨基苄氧基羰基(PAB)、聚乙二醇(PEG)的一种或多种的连接子。
其中D选自下组：
(i)微管蛋白抑制剂，如美登素衍生物(DM1、DM4)，单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)；
(ii)用于DNA的毒素，如倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯二氮卓(PBD)；
(iii)拓扑异构酶抑制剂，喜树碱、SN38、依喜替康、Dxd。
本发明还提供了一种用于诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。
本发明还提供了包含上文所述的抗体偶联药物的组合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的抗ROR1抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途。
本发明还提供了本文所述的抗体偶联药物或包含其的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，包括向有相应需要的受试者施用本文所述的抗体偶联药物或组合物。
本发明还提供了一种用于诊断疾病的方法，包括应用本发明的抗ROR1抗体或其抗原结合片段或上文所述的试剂盒。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得明显，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书所描述的方案来实现和获得。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确并入本文。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1示出了抗ROR1抗体结合人类ROR1的EC50和代表性结合曲线，表明这些克隆特异性地结合人类ROR1；
图2示出了抗ROR1抗体与小鼠ROR1的代表性结合曲线，表明这些克隆没有与小鼠ROR1结合。
图3示出了抗ROR1抗体与人ROR2的代表性结合曲线，表明ROR1-14和ROR1-1与人ROR2结合。
图4-图6示出了人源化抗体ROR1-4的质谱脱糖后图谱(图4)与其抗体偶联物ROR1-4-BL20MMAE(简称ROR1-4-BL20E)的HIC(图5)和质谱脱糖后图谱(图6)。
图7-图9示出了人源化抗体ROR1-12的质谱脱糖后图谱(图7)与其抗体偶联物ROR1-12-BL20MMAE的HIC(图8)和质谱脱糖后图谱(图9)。
图10-图12示出了人源化抗体ROR1-12的质谱脱糖后图谱(图10)与其抗体偶联物ROR1-12-GGFG-Dxd(简称ROR1-12-DX)的HIC(图11)和质谱脱糖后图谱(图12)。
图13示出了ROR1-12-BL20E、ROR1-12-DX对人套细胞淋巴瘤JeKo-1皮下移植瘤生长的影响。
图14示出了ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人乳腺癌MDA-MB-231皮下移植瘤生长的影响。
图15示出了ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人乳腺癌MDA-MB-231皮下移植小鼠体重的影响。
图16示出了ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人肺癌H1975皮下移植瘤生长的影响。
图17示出了ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人肺癌H1975皮下移植小鼠体重的影响。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
在本文中使用的术语“和/或”应被认为是两个或更多个指定特征或部件中的每一个的具体公开，其具有或不具有其他特征或部件。因此，在短语中使用的术语“和/或”，例如本文的“A和/或B”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。
应理解，无论在何处用语言“包括”或“包含”描述各方面，也提供了用术语“由组成”和/或“基本上由组成”描述的类似方面。
术语“约”意指在本领域中以可接受的水平变化的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸(dimension)、大小(size)、量、重量或长度。在一些实施方案中，这样的变化可以多达参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将所述数值的上方和下方的边界延伸来修改该范围。
术语“ROR1”是指受体酪氨酸激酶样孤儿受体1，也称为神经营养性酪氨酸激酶受体相关1(NTRKR1)。术语“ROR1”包括变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人ROR1蛋白特异的抗体可能会与来自非人物种(例如食蟹猴)的ROR1蛋白发生交叉反应。在其他实施方案中，对人ROR1蛋白特异的抗体可以对人ROR1蛋白完全特异并且对其他物种或其他类型没有表现出交叉反应性，或者可以与来自某些其他物种但不是所有其他物种的ROR1发生交叉反应。
术语“人ROR1”是指人的ROR1序列，例如具有NCBI参考序列号NP_005003.2的人ROR1的氨基酸序列。
术语“抗体”在此使用了本领域普通技术人员理解的广义含义，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。抗体可以是任何型和亚型(例如，IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)。“抗体”还可以指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为框架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端至羧基端按如下顺序排列：FR-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，所述一个或多个片段保留了特异性结合由整个抗体结合的抗原的能力。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过能够使它们形成一条蛋白质链的合成接头连接在一起，其中VL和VH区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv))。
术语“单克隆抗体”指的是来自基本上均质抗体群体的抗体，即，除了可以以少量存在的可能天然发生的突变以外，构成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。相比之下，多克隆抗体一般包括针对不同表位(或对其特异性)的许多抗体。“单克隆”指的是来自基本上均质的抗体群体的抗体特征，并且并不应被解释为需要通过任何具体方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA法制备。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库中分离。
术语“多特异性抗体”指对相同抗原或不同抗原上的至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。术语“双特异性抗体”意指对两种不同的表位具有结合特异性的抗体。
本文使用的术语“人源化抗体”指包含来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此种抗体包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度的序列。一般而言，人源化抗体基本上包含所有的至少一个且通常是2个可变结构与，其中所有的或基本上所有的高变环均对应于非人免疫球蛋白的那些。
术语“人抗体”或“完全人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括源自另一哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列被嫁接到人框架序列的抗体(即人源化抗体)。完全人抗体或人抗体可以源自携带人抗体基因的转基因小鼠或源自人细胞。
术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如该抗体和其他试剂或其他抗体的偶联物。
如本文所用，术语“抗ROR1抗体”、“抗ROR1”、“ROR1抗体”或“结合ROR1的抗体”是指能够以足够亲和力结合ROR1蛋白或其片段的抗体，使得该抗体可用作靶向ROR1的诊断剂和/或治疗剂。
如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，ROR1)中与抗体分子特异性相互作用的部分。该部分(本文中称为表位决定簇)通常包含诸如氨基酸侧链或糖侧链或其组分的元件。表位决定簇可以用本领域已知的方法限定。一些表位是线性表位，而另一些是构象表位。
如本文所述，“分离的抗体”是指已经与其天然环境的组分分离的抗体分子。
术语“特异性”、“特异性结合”或“对…特异性”是指特定抗体或其抗原结合片段可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。因此，与第二靶物或抗原相比，如本文所定义的抗体或其抗原结合片段在其以下述亲和力(如本文中所述并且适当地例如以KD值表示)结合第一抗原时被说成对第一靶物或抗原是“特异性的”，所述亲和力比所述氨基酸序列或多肽结合另一种靶物或多肽的亲和力好至少50倍，如至少100倍，优选至少1000倍，并且高达10,000倍或更高。优选的，当抗体或其抗原结合片段对靶标或抗原“特异性”时，与另一靶标或抗原相比，其能够结合所述靶标或抗原，但不结合其他靶标或抗原。
本文使用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语“Kdis”或“Kd”是指抗体-抗原相互作用的解离速率。
本文所用的术语“KD”是指解离常数，它是由Kd与Ka的比值获得的(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以用本领域建立的方法测定。测定抗体KD的一种优选方法是使用表面等离子共振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore系统。KD是衡量抗体与抗原的亲和力的度量。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。
本文使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中但存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处的核酸分子。
如本文所用，术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及整合到已将其引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”指其中已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包括突变。本文中包括与在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。IC50可以衡量抗体灵敏度，IC50越低，说明抗体的灵敏度越高。
EC50(concentration for 50％of maximal effect)是指能引起50％最大效应的浓度。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，该个体或受试者是人。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。
相对于参比序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在将候选序列与参比序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比序列中的残基相同的百分比。用于确定序列同一性百分比的比对可以本领域的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。当在本申请中提及序列同一性的百分比时，除非另有明确说明，否则这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。相对于较长序列的全长的计算适用于核酸序列和多肽序列两者。
术语“药物组合物”是指这样一种制剂，其形式使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效，并且不含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
术语“药学上可接受的载体”包括如本领域已知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣等。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。每种载体都应在与其他成分相容方面是药学上和生理学上可接受的，且对受试者无害。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的施用是被设想了的。
应理解，如本文使用的术语“治疗”意指使疾病或状况的有害影响减少、预防、治愈、逆转、改善、减弱、减轻、最小化、抑制或使疾病或状况的一种或更多种临床适应症的发作停止或者延迟。
如本文定义的术语“免疫缀合物”是指与另外的剂缀合或连接的根据本公开内容的抗体或其任何抗原结合片段。免疫缀合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备，例如，通过将另外的剂与根据本公开内容的抗体交联或通过重组DNA方法制备。
抗ROR1抗体或其抗原结合片段
本发明的第一方面提供了一种抗ROR1抗体或其抗原结合片段，
重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1、17和33中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3、19和35中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:5、21和37中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7、23和39中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9、25和41中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11、27和43中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(2)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(2)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15-16、31-32或47-48所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fd、Fab、Fab'和F(ab')2。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段以2.0×10-9M或更小的KD结合人ROR1。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段，其不与小鼠ROR1交叉反应。
表1抗体的序列组成
蛋白质表达
适于在细胞中产生本发明的多肽或蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)的分子生物学技术是本领域普通技术人员熟知的。
多肽或蛋白质可以由多核苷酸序列表达。多核苷酸序列可以包含在细胞中存在的载体中，或者可以掺入细胞的基因组中。
本文使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。
本文使用的术语“载体”是用作载体以将外源遗传物质转移到细胞中的寡核苷酸分子(DNA或RNA)。载体可以是用于在细胞中表达遗传物质的表达载体。此类载体可以包括于编码待表达基因序列的多核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域一直的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于由本发明的载体表达多肽。合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统。细胞可以是原核生物或真核生物细胞。合适的原核生物细胞包括大肠杆菌细胞。合适的真核生物细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在一些情况下，细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许与真核生物相同的翻译后修饰。此外，在真核生物中可能具有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。还可以使用特定的质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
产生目标多肽的方法可以包括培养或发酵经修饰的细胞以表达多肽。培养或发酵可以在生物反应器中进行，所述生物反应器具有适当的营养物供应，空气/氧气和/或生长因子。可以通过从细胞中分配培养基/发酵液、提取蛋白质并分离单个蛋白质来分离分泌的多肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域普通技术人员熟知的。
生物反应器包括一个或更多个可以培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，反应物持续不断地流入，并且来自反应器的培养细胞连续流动。或者，培养可以分批进行。生物反应器检测和控制环境条件，例如pH、氧气、流入和流出的速率以及容器内的搅拌，从而为培养的细胞提供最佳条件。
在培养表达目的多肽/蛋白质的细胞后，优选地分离该多肽/蛋白质。可以使用本领域普通技术人员熟知的从细胞培养物中分离多肽/蛋白质的任何合适的方法。为了从培养物中分离目标多肽/蛋白质，可能需要首先将培养的细胞与含有目标多肽/蛋白质的培养基分离。如果目标多肽/蛋白质是从细胞分泌的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的多肽/蛋白质的培养基分离。如果目标多肽/蛋白质聚集在细胞内，则必须在离心之前破坏细胞，例如使用超声处理、快速冻融或渗透裂解。离心将产生含有培养细胞或培养细胞的细胞碎片的沉淀以及含有培养基和目标多肽/蛋白质的上清液。
然后可能需要从上清液或培养基中分离目标多肽/蛋白质，其可含有其他蛋白质和非蛋白质组分。从上清液和培养基中分离多肽/蛋白质组分的常用方法是通过沉淀。不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵中沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下，提取水溶性多肽/蛋白质。因此，通过添加增加浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的多肽/蛋白质。随后可以使用层析从分离的多肽/蛋白质中除去硫酸铵。
用于区分不同多肽/蛋白质的其他方法是本领域普通技术人员已知的，例如离子交换色谱法和尺寸色谱法。这些可以用作沉淀的替代方案，或者可以在沉淀之后进行。
一旦从培养物中分理出目的多肽/蛋白质，就可能需要进行浓缩。许多浓缩目的多肽/蛋白质的方法是本领域普通技术人员熟知的，例如超滤或冷冻干燥。
免疫偶联物
免疫偶联物的一个实例是抗体偶联药物也被称为抗体药物偶联物、抗体药物缀合物。抗体偶联药物是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成，兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。
本发明提供了一类新型抗体偶联药物，其具有式Ab-(L-D)n，其中：Ab是与人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段；L是连接子；D是细胞毒性药物；和n是从1至10的数。
连接子
按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。
对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应，bystandereffect)。
可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。
对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。
酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括Val-Cit(VC)，Phe-Lys等。
自释放连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自释放连接子的作用机制是：当可断裂连接子在适宜的条件下断裂后，自释放连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类(β-Glucuronide)等。
本发明提供了连接子或偶联试剂，包含二芳硫基马来酰亚胺单元和一个偶联基团。二芳硫基马来酰亚胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)，而偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联。由于该二芳硫基马来酰亚胺单元与抗体中的开放半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的两个硫原子的二齿结合(bidentate binding)，因此这些ADC是均质的并比含有单齿接头的ADC具有更强的稳定性。因此它们将具有增长的体内半衰期，减少全身性释放的细胞毒素的量，并且比具有单齿接头的ADC更加安全的药物性质。
在另一个方面，所产生的药物-连接子单元通过该连接子与抗体偶联，生成部分链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的药物/抗体比值(DAR)分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。该抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。“药物”是高活性药物(见定义部分)，在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。
在一个实施方案中，连接子L可以是可断裂连接子或不可断裂连接子。在一个实施方案中，连接子是化学接头。在一个实施方案中，连接子包含共价键，例如酯键、醚键、胺键、酰胺键、二硫键、酰亚胺键、砜键、磷酸酯键(phosphorus ester bond)、肽键、腙键或其组合。在一个实施方案中，连接子包含疏水性聚(乙二醇)接头。在一个实施方案中，连接子包含肽键。
在一个实施方案中，细胞毒性药物D可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的细胞毒性药物D类别可以包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物D类别的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如毗咯并[1，4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁哇烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在一个实施方案中，细胞毒性药物D可以选自化疗剂、生长抑制剂、卡利奇霉素类药物单元、抗有丝分裂剂、放射性同位素或其组合。在一个实施方案中，细胞毒性药物D包含卡利奇霉素、奥佐米星、单甲基澳瑞他汀E、美坦新(emtansine)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、依沙替康其衍生物或组合。在一个实施方案中，细胞毒性药物D包含单甲基澳瑞他汀E、美坦新(emtansine)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、依沙替康、α-鹅膏蕈碱、倍癌霉素、吡咯并苯二氮(PBD)、PNU-159682及其药学上可接受的盐、酯和类似物。
其他常见的常见的抗体偶联药物的L-D部分是例如
在一些优选实施方案中，连接子L是马来酰亚胺类连接子，优选地，L是双取代马来酰亚胺类连接子。该连接子可以全部/部分交叉偶联在抗体的轻链-重链及重链-重链二硫键还原的半胱氨酸巯基上，且应用此种偶联方法得到的靶向ROR1抗体药物偶联物，与传统抗体药物偶联物相比，具有相对更均一的药物/抗体比值(DAR)分布。具有该双取代马来酰亚胺类连接子的ROR1抗体偶联药物的结构如式Ia、Ib所示：
其中，
Ar'选自下组：取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；
L1为连接于Ar'基团上的-O(CH2CH2O)n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为1-10中任一整数；
L2为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为2-4个氨基酸组成的多肽片断，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；
CTD为通过酰胺键键合于L2的细胞毒性药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物；
m为1.0-5.0，优选为3.0-4.2；更优选为3.5-4.5；又更优选为3.8-4.2，又更优选为3.9-4.1，最优选为4.0；
Ab为本发明所述的靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选实施方案中，所述的式Ib为式Ia中N-苯基马来酰亚胺开环后产物。
在另一优选实施方案中，所述的偶联物共价连接有一个或多个药物组分。
在另一优选实施方案中，所述的偶联物中，抗体和药物是通过共价方式(如通过分别共价连接于连接子上)进行偶联。
在另一优选实施方案中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于抗体铰链区的二硫链还原后的巯基上。
在另一优选实施方案中，所述的抗体-药物偶联物是通过所述抗体或抗体片断铰链区的二硫链还原生成一对半胱氨酸残基，并通过所述半胱氨酸残基中巯基与式Ic表示的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物中的芳基硫醚发生取代反应，从而获得抗体-药物偶联物Ia和/或Ib。
在另一优选实施方案中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于完全还原后的抗体上，即铰链区的4对二硫链完全打开，优选m为3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。
在另一优选实施方案中，所述靶向ROR的抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fd、Fab、Fab'和F(ab')2。
在另一优选实施方案中，所述抗体片段为抗体Fab片段。
在另一优选实施方案中，所述抗体是能够与ROR结合的抗体。
在另一优选实施方案中，所述靶向ROR的抗体或抗体片段为本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选实施方案中，所述Ar’选自下组：苯基、卤代苯、C1-C4烷基苯基、C1-C4烷氧基苯基、2-吡啶基、2-嘧啶基、1-甲基咪唑-2-基，其中：C1-C4烷基苯基进一步优选为4-甲基苯基；C1-C4烷氧基苯基进一步优选为4-甲氧基苯基。
在另一优选实施方案中，Ar’选自取代或未取代的亚苯基或吡啶基，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲基、腈基、酰胺基。
在另一优选实施方案中，所述的AA选自下组：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)。
在一些优选实施方案中，将细胞毒性药物通过马来酰亚胺连接子偶联到靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段的方法是本领域技术人员已知的，例如参见中国专利申请CN201611093699.6和CN201711169847.2。
本发明提供的抗体药物偶联物，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，抗体药物偶联物极少含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒性杀伤不起作用。同时，抗体药物偶联物也不含有重度偶联物(DAR＝8)，相对于低DAR的组分而言，这一组分在体内的清除速度很快。因此，本发明提供的抗体药物偶联物在非均一性方面得到很大的改善。
ROR1抗体偶联药物的制备
抗体药物偶联物制备路线如下所示。抗体链间二硫键被还原，产生2n个(n为1-4间的数)巯基基团。本发明的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物(式Ic化合物)与还原后的抗体巯基交联，生成相应的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物存在如下所示中的一种或二种形式。
其中，所述的式Ic化合物选自为：
等。
一种典型的制备方法包括：将抗体原液用反应缓冲液稀释至2-10mg/mL，加入140-200倍过量摩尔比的二硫苏糖醇(DTT)，或加入6.0-20倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10-35℃搅动2-48小时。上述反应缓冲液可以是按以下比例制备的缓冲液：50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH2PO4-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM磷酸氢二钠-柠檬酸/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM硼酸-硼砂/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM组氨酸-氢氧化钠/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9和PBS//1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9。
将上述反应液冷至0-10℃，若采用DTT还原，需在还原反应完成后过脱盐柱或超滤除去过量的DTT，再加入取代马来酰亚胺类化合物(预先10mg/ml溶在乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二乙基乙酰胺(DMA)中)，并保证总反应液中有机溶剂的体积占比不超过15％，偶联反应于0-37℃搅动2-4小时。若采用TCEP还原，也可不需除去剩余TCEP，直接加入取代马来酰亚胺类化合物进行偶联。
采用脱盐柱将偶联反应混合物用琥珀酸钠/NaCl缓冲液或组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品，或超滤数遍。然后过滤除菌，所得产物低温保存。优选温度为-100℃至-20℃，过滤装置的孔径优选0.15-0.3微米。
所得抗体药物偶联物的DAR值较为均一。采用本发明不同取代马来酰亚胺连接头(连接子片段)时，ADC产物均一性非常高(通常DAR优势产物(如DAR值约为4)，占所有ADC的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更高)。对于DAR有一定差别的ADC，如需要获得均一性更好的样品，可进一步利用但不限于以下方法进行分离纯化：疏水作用层析方法(HIC)、分子排阻色谱法(SEC)、离子交换层析(IEC)。
本发明的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。
试剂盒
本发明还提供了一种用于诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。
这样的测试试剂盒可以例如包含一次性测试装置，所述测试装置被配置为产生与生物样品中ROR1的存在或量相关的可检测信号。或者，可以配制这样的测试试剂盒以在不利用一次性测试装置的临床分析仪中进行测定。优选地，所述测试试剂盒是体外诊断剂。如本文所用，术语“体外诊断”是指医疗器械，其是试剂、试剂产品、校准品、对照材料、试剂盒、仪器、装置、设备或系统，无论是单独使用还是组合使用，制造商意图用于体外检查来自人体的标本(包括血液和组织捐赠)，专门提供或注意用于提供有关生理或病理状态或有关先天性异常的信息或确定安全性与潜在接受者的相容性，或监测治疗措施。
组合物
本发明还提供了包含本发明的抗体药物缀合物以及药学上可接受的载体的组合物。
术语“药学上可接受的载体”包括如本领域已知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣等。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。每种载体都应在与其他成分相容方面是药学上和生理学上可接受的，且对受试者无害。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的施用是被设想了的。
在一些实施方案中，本发明的抗体药物缀合物，可以作为单一的药物活性成分来施用，或可以其他的抗癌药物联合施用。
在一些实施方案中，本发明的抗体药物缀合物或包含其的组合物以有效量或有效剂量施用，例如每日1ng/kg至约20-100mg/kg体重的范围。本发明的抗体偶联药物可以每日一次、两次、三次或多次施用，持续1-4周或更长的时间。
在本申请中，所述“有效量”或“有效剂量”是指足以影响疾病、其并发症、或者疾病发展过程中中间的病理性指标的有益的或期望的症状的量。
本发明的抗体药物缀合物或包含其的组合物可以通过任一种常规途径施用，例如静脉内、动脉内、肌内、腹膜内施用，等等。
治疗和诊断方法
在另一方面，本发明提供了治疗或改善受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。癌症可以是血液癌症或实体瘤，选自淋巴瘤、CLL、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘细胞B-细胞淋巴瘤、伯克特淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌症、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。在一些实施方案中，至少一种额外的抗癌抗体可以与本发明的抗体或其抗原结合片段一起施用，例如抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体和/或抗CTLA-4抗体。在又一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如，IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如，抗CD137和/或抗GITR抗体)。本发明的抗体可以是例如小鼠、人、嵌合或人源化抗体。
在另一方面，本发明提供了一种用于诊断或预后受试者癌症的方法，包括从受试者收集感兴趣的组织样品，并且使组织样品与抗体或其抗原结合部分接触,本发明。如果检测到一定量的ROR1，受试者可能被诊断患有癌症，并且ROR1表达的增加/减少表明癌症发展/改善。癌症可以是血液癌症或实体瘤，选自淋巴瘤、CLL、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘细胞B-细胞淋巴瘤、伯克特淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌症、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。
实施例
实施例1：ROR1单克隆抗体的噬菌体库淘选和筛选
通过克隆轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的谱库产生了抗体单链噬菌体展示文库。通过从主要从外周血和新生儿脐带血中收集的人类淋巴细胞进行PCR扩增而产生所述重链谱库和轻链谱库。将VL谱库和VH谱库混合并且使用重叠引物进行PCR。抗体的最终形式是单链Fv(scFv)，其中VH片段和VL片段由柔性接头肽(SGGSTITSYNVYYTKLSSSGT(SEQ IDNO:46))连接。通过LoxP-cre系统进一步扩大主文库。
在Immuno 96MicroWellTM板(丹麦的Nunc公司)上进行对展示特异性scFv片段的噬菌体粒子的选择。首先，在4℃将于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中50μg/ml的人ROR1重组蛋白(目录号：RO1-H522y，Acrobiosystems公司)包被在板上过夜。在用于PBS(2％ MPBS)中2％(w/v)的奶粉封闭之后，添加含有约1011个噬菌体粒子的文库并且将板在室温(RT；25℃-28℃)下孵育2小时。通过用含有0.1％ Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤10次-20次，继而用PBS洗涤10次-20次来消除未结合的噬菌体。通过与50μl的1μg/μl胰蛋白酶一起孵育10分钟，继而与50μl的50mM盐酸甘氨酸(pH 2.0)一起孵育(在10分钟之后立即用50μl的200mM Na2HPO4(pH 7.5)中和)来洗脱结合的噬菌体。使用洗脱的噬菌体，通过在37℃孵育30分钟来感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞。将受感染的细胞铺在含有氨苄西林(ampicillin)(100μg/mL)和葡萄糖(1％w/v)的TYE板上，然后将该板在37℃孵育过夜。挑选单个噬菌体感染的菌落并且使其在96孔板中生长以产生噬菌粒粒子。使用M13KO7或KM13辅助噬菌体拯救培养物。使用拯救的噬菌体粒子以使用相似的条件引发后续轮次的选择。对于ROR1蛋白进行了三轮选择。
为了在酶联免疫吸附测定(ELISA)中测试ROR1结合，挑选来自最后一次淘选的单个克隆并且使其在37℃生长并且用M13K07辅助噬菌体拯救。在37℃用于PBS中5％的脱脂乳将扩增的噬菌体制品封闭1小时并且添加到包被有ROR1(目录号：RO1-H522y，Acrobiosystems公司)(0.5μg/ml)的96孔微孔板(Nunc公司)中。在37℃再孵育1小时之后，将板用PBST洗涤3次并且与小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗M13噬菌体抗体(阿默舍姆公司(Amersham))一起孵育。在仔细洗涤之后，添加3,30,5,50-四甲基联苯胺(TMB，西格玛公司(Sigma))作为底物。用Thermo multiskan ELISA读数器(美国的马萨诸塞州(MA,USA))在450nm测量显色反应。
进一步的测试中，筛选出3个克隆：ROR1-4、ROR1-12、和ROR1-14。
实施例2全长抗体的表达和纯化
建立了从scFv产生全长人类IgG1抗体的方法。将编码抗ROR1抗体的VH区和VL区的基因依次插入含有hIgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的基因的表达载体pIgG中。为了在哺乳动物细胞中表达可溶性抗体，使用脂质转染胺将重组pIgG瞬时转染到人类293T细胞中。将转染的细胞在37℃在293SFM中维持8天。在此期间，更换培养基2次并且收集培养上清液。使用蛋白A亲和色谱法(法玛西亚公司(Pharmacia))纯化分泌到培养基中的全长抗体。将纯化的抗体浓缩到1mg/ml，无菌过滤，并且通过SDS-PAGE、ELISA和等温滴定量热法(ITC)进行表征。
实施例3物理和化学分析
在尺寸排阻色谱中进一步测试了克隆ROR1-4,ROR1-12,ROR1-14。具体而言，使用100mM磷酸钠+100mM Na2SO4(pH 7.0)作为运行缓冲液，将20μg样品注入到TSK G3000SWXL柱上。运行时间是29分钟。在Agilent 1220HPLC上进行所有测量。使用OpenLAB软件分析数据。ROR1-12的主峰在SEC中高于95％，这表明了纯化的抗体具有高纯度和完整性。
实施例4抗ROR1抗体与人ROR1特异性结合
使用ELISA测定来确定抗体对重组人ROR1的相对结合活性。
通过在4℃孵育过夜将人ROR1蛋白(目录号：RO1-H522y，Acrobiosystems公司)固定到96孔板上。然后将所述板通过在37℃与于PBS中1％的BSA一起孵育1小时来封闭。在封闭之后，将所述板用PBST(含有0.05％ Tween20的PBS)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％ BSA的PBS)中制备连续稀释的抗ROR1抗体并且在37℃将其与固定的蛋白质一起孵育1小时。在结合之后，将所述板用PBST洗涤3次，在37℃与在结合缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶标记的驴抗人IgG(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))一起孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色并且使用1M H2SO4终止。测定450nm-620nm处的吸光度。
抗ROR1抗体结合人类ROR1的EC50和代表性结合曲线如图1所示(图1、下文以及其中所涉及附图中的VLS101是指VLS101 ADC中的ROR1抗体)表明这些克隆特异性地结合人类ROR1。
实施例5抗ROR1抗体对人ROR1的亲和力
5.1
在预湿盘中加入缓冲液，将AHC传感器进行预平衡10min。在加样前，用1X PBS，0.02％ Tween-20平衡基线100s。ROR1抗体偶联AHC传感器：用1X PBS，0.02％ Tween-20稀释ROR1抗体至5μg/mL，固化时间200s停止，制备ROR1抗体结合传感器。Running buffer(1XPBS，0.02％ Tween-20)平衡基线150s。分析物ROR1 Protein(ARCO，货号RO1-H522y)用Running buffer稀释100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和1.56nM。分析物结合200s，解离600s。再生液再生30s。得到的数据使用Octet software拟合1:1结合模型并使用Global fitting来计算。
表2 ROR1-4及ROR1-14的亲和力参数
| 名称 | Ka(M-1S-1) | Kd(S-1) | KD(M) |
| ROR1-4 | 3.28E+05 | 3.15E-04 | 9.62E-10 |
| ROR1-14 | 2.57E+05 | 1.75E-04 | 6.81E-10 |
5.2
使用Biacore T200系统(Biacore,GE Healthcare)通过表面等离子体共振测量抗ROR1抗体对人ROR1(Acro biosystems)的动力学结合活性。
大约7000RU的山羊抗人Fcγ抗体(Jackson ImmunoReaserch，货号109-005-098)通过氨基酸偶联化学固定在CM5传感器芯片上。ROR1抗体在固定的山羊抗人IgG抗体表面结合。使用HBS-EP+缓冲液作为运行缓冲液。将不同浓度的人ROR1蛋白(从6.25nM到200nM)注入抗体表面。在每个循环后，通过注射10mM甘氨酸(pH1.5)再生CM5芯片表面。采用背景减法结合感测图分析结合速率Ka和解离Kd，以及平衡解离常数KD。使用Biacore T200评估软件对所得数据集进行1:1Langmuir结合模型拟合。
表3 ROR1-12及ROR1-14的亲和力参数
| 名称 | Ka(M-1S-1) | Kd(S-1) | KD(M) |
| ROR1-12 | 7.75E+5 | 1.37E-3 | 1.76E-9 |
| ROR1-14 | 3.58E+5 | 3.68E-4 | 1.02E-9 |
实施例6 抗ROR1抗体与小鼠ROR1没有交叉反应
ELISA检测用于测定抗体与小鼠ROR1的相对结合活性。
通过在4℃孵育过夜将小鼠ROR1蛋白(目录号：RO1-M5221，Acrobiosystems公司)固定到96孔板上。然后将所述板通过在37℃与于PBS中1％的BSA一起孵育1小时来封闭。在封闭之后，将所述板用PBST(含有0.05％ Tween20的PBS)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ Tween20和0.5％ BSA的PBS)中制备连续稀释的抗ROR1抗体并且在37℃将其与固定的蛋白质一起孵育1小时。在结合之后，将所述板用PBST洗涤3次，在37℃与在结合缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶标记的驴抗人IgG(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))一起孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色并且使用1M H2SO4终止。测定450nm-620nm处的吸光度。
这些抗体的代表性结合曲线如图2所示，表明这些克隆没有与小鼠ROR1结合。
实施例7 抗ROR1抗体与人ROR2交叉反应实验
ELISA测定用于测定抗体与人ROR2的相对结合活性。
通过在4℃孵育过夜将人ROR2(目录号：RO2-H52E5，Acrobiosystems)固定在96孔板上。通过在PBS中与1％ BSA在37℃孵育1小时来封闭非特异性结合位点。封闭后，将板用PBST(含有0.05％ Tween20的PBS)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ Tween20和0.5％BSA的PBS)中制备连续稀释的抗ROR1抗体和人IgG对照，并在37℃下与固定化的蛋白一起孵育1小时。结合后，将板用PBST洗涤3次，在37℃下与在结合缓冲液中稀释1/15,000的过氧化物酶标记的驴抗人IgG(Jackson Immuno Research)孵育1小时，再次洗涤，用TMB显色并用1M H2SO4。测定450nm-620nm处的吸光度。
这些抗体的代表性结合曲线如图3所示，表明ROR1-14与人ROR2结合，ROR1-12不与人ROR2结合。
实施例8抗体药物缀合物ROR1-4-BL20MMAE、ROR1-12-BL20MMAE的制备
将分别将靶向ROR1的抗体ROR1-4、ROR1-12原液置换至50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(NaH2PO4-Na2HPO4)/150mM氯化钠(NaCl)/2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.4的反应缓冲液中，使其浓度为10mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于28℃搅动4小时。将上述反应液冷却至20℃，加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入5倍过量摩尔比的化合物Ic-4(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动1.0小时进行偶联。采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 7.4的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠/蔗糖缓冲液凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为ROR1-4-BL20MMAE、ROR1-12-BL20MMAE。
结果如图4-9所示，人源化抗体ROR1-4的质谱脱糖后图谱(图4)与其抗体偶联物ROR1-4-BL20MMAE(简称ROR1-4-BL20E)的HIC和质谱脱糖后图谱(图5、图6)均表明，抗体ROR1-4经偶联反应后，形成了抗体偶联物ROR1-4-BL20MMAE，偶联物的分子量与预期值相符，DAR约为4.0。人源化抗体ROR1-12的质谱脱糖后图谱(图7)与其抗体偶联物ROR1-12-BL20MMAE的HIC和质谱脱糖后图谱(图8、图9)均表明，抗体ROR1-12经偶联反应后，形成了抗体偶联物ROR1-12-BL20MMAE(简称ROR1-12-BL20E)，偶联物的分子量与预期值相符，DAR约为4.0。
实施例9ROR1-4-GGFG-Dxd、ROR1-12-GGFG-Dxd的制备
将靶向ROR1的抗体ROR1-12原液置换至50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(NaH2PO4-Na2HPO4)/150mM氯化钠(NaCl)/2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH7.0的反应缓冲液中，使其浓度为10mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于28℃搅动4小时。将上述反应液冷却至室温，加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入12倍过量摩尔比的化合物GGFG-DXd(购自上海皓元化学，10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动1.0小时进行偶联。采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.6的4-吗啉乙磺酸(MES)-Tris/蔗糖缓冲液凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为ROR1-12-GGFG-Dxd。
结果如图10、11、12所示，人源化抗体ROR1-12的质谱脱糖后图谱(图10)与其抗体偶联物ROR1-12-GGFG-Dxd(简称ROR1-12-DX)的HIC和质谱脱糖后图谱(图11、图12)均表明，抗体ROR1-12经偶联反应后，形成了抗体偶联物ROR1-12-DX，偶联物的分子量与预期值相符，DAR约为8.0。
实施例10ROR1抗体偶联药物(ROR1-ADCs)针对人套细胞淋巴瘤JeKo-1的体内抗肿瘤活性
通过体内实验，测定ROR1抗体偶联药物(ROR1-ADCs)针对人套细胞淋巴瘤JeKo-1、三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞NCI-H1975(均购自中国科学院细胞库)的体外抗肿瘤活性，即在啮齿类动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物，并用所述组合处理肿瘤。将受试小鼠用药物或对照处理，并监测数周或更长时间以测量到达肿瘤倍增的时间，对数细胞杀伤，和肿瘤抑制。
ROR1-12-BL20E、ROR1-12-DX对人套细胞淋巴瘤JeKo-1小鼠皮下移植瘤的疗效。
每只NOD-Scid小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)皮下接种JeKo-1细胞，待肿瘤长到约100mm3，根据肿瘤体积分组，静脉注射(IV)药物，每4天1次(Q4D)，共2次(D0,D4)，注射体积10mL/Kg；给药剂量和给药方案见表4。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2(其中a、b分别表示长、宽)。
表4
T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。肿瘤生长抑制率％(TGI％)＝100-T/C(％)。
当肿瘤出现消退时，肿瘤生长抑制率％(TGI％)＝100-(T-T0)/T0×100
除非特别说明，二组肿瘤体积或肿瘤重量之间的比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。
ROR1-12-BL20E(5mg/kg，IV，D0,4)对人套细胞淋巴瘤JeKo-1小鼠皮下移植瘤生长有明显抑制作用，抑瘤率为92％，有1/6肿瘤部分消退；ROR1-12-DX(5mg/kg，IV，D0,4)对JeKo-1小鼠皮下移植瘤的抑瘤率为81％；荷瘤小鼠对以上药物均能够较好耐受，没有明显体重下降等症状发生。相比较，ROR1-12-BL20E对JeKo-1皮下移植瘤的疗效显著强于ROR1-12-DX(P<0.05,等剂量组比较)，结果如图13(ROR1-12-BL20E、ROR1-12-DX对人套细胞淋巴瘤JeKo-1皮下移植瘤生长的影响)所示。
实施例11ROR1抗体偶联药物(ROR1-ADCs)ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠皮下移植瘤药效
ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE(5mg/kg，IV，QW×3)对人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤生长有抑制作用，抑瘤率分别为49％、39％和24％(图14ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人乳腺癌MDA-MB-231皮下移植瘤生长的影响)；荷瘤小鼠对以上药物均能够较好耐受，没有明显体重下降等症状发生(图15ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对荷瘤小鼠体重的影响)。相比较，ROR1-12-BL20E对MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的药效相对较好。
实施例12ROR1抗体偶联药物(ROR1-ADCs)ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人肺癌H1975小鼠皮下移植瘤药效
每只BALB/c裸鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)皮下接种5×106H1975细胞，待肿瘤长到100～150mm3，根据肿瘤体积分组，静脉注射(IV)药物，共3次，注射体积10mL/Kg。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径。
ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE(5mg/kg，IV，每周1次，共3次)对人肺癌H1975小鼠皮下移植瘤生长有抑制作用，肿瘤生长抑瘤率(TGI％)分别为69％、43％和19％(图16ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对人肺癌H1975皮下移植瘤生长的影响)；荷瘤小鼠对以上药物均能够较好耐受，没有明显体重下降等症状发生(图17ROR1-12-BL20E、ROR1-4-BL20E、VLS101-MMAE对荷瘤小鼠体重的影响)。相比较，ROR1-12-BL20E对H1975小鼠皮下移植瘤药效最好(P>0.05，等剂量组比较)。
本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管本文示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征或要素可以与任何其它实施例中的任何其他特征或要素结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或要素。
Claims (19)
1.一种靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1、17和33中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3、19和35中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；
和
c)包含SEQ ID NO:5、21和37中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7、23和39中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9、25和41中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11、27和43中任一个所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(2)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含：
a)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR1；
b)包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VH CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR1；
e)包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的互补决定区VL CDR3。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(2)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或
(3)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:15-16、31-32或47-48所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fv、单链Fv(scFv)、Fd、Fab、Fab'和F(ab')2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以2.0×10-9M或更小的KD结合人ROR1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其不与小鼠ROR1交叉反应。
8.核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.质粒或载体，所述质粒或载体包含根据权利要求8所述的核酸序列。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含并表达根据权利要求8所述的核酸序列或根据权利要求9所述的质粒或载体。
11.一种具有式I所示结构的抗体偶联药物
Ab-(L-D)n(式I)，
其中Ab是根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
L是连接子；
D是细胞毒性药物；且
n是1-10之间的数，优选地1-8的值；优选地n是1、2、3、4、5、6、7、8，以及任何两个值之间的任何值。
12.如权利要求11所述的抗体偶联药物，其特征在于，L选自马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺(MAL)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯)(SMCC)接头与抗体部分连接、双取代马来酰亚胺，并包含缬氨酸-瓜氨酸(VC)、缬氨酸-丙氨酸(VA)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG)、丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸(AAA)、对氨基苄氧基羰基(PAB)、聚乙二醇(PEG)的一种或多种的连接子。
13.如权利要求11所述的抗体偶联药物，其特征在于，其中D选自下组中的一种或多种：
(i)微管蛋白抑制剂，如美登素衍生物(DM1、DM4)，单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)；
(ii)用于DNA的毒素，如倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯二氮卓(PBD)；
(iii)拓扑异构酶抑制剂，喜树碱、SN38、依喜替康、Dxd。
14.一种用于诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。
15.一种包含根据权利要求11所述的抗体偶联药物的组合物。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途。
17.根据权利要求11所述的抗体偶联药物或根据权利要求15所述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
18.一种治疗疾病的方法，包括向有相应需要的受试者施用根据权利要求11所示的抗体偶联药物或根据权利要求15所述的组合物。
19.一种用于诊断疾病的方法，包括应用根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求14所述的试剂盒。
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