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CN118647400A - 持续性hsv基因递送系统 - Google Patents

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CN118647400A
CN118647400A CN202380020181.1A CN202380020181A CN118647400A CN 118647400 A CN118647400 A CN 118647400A CN 202380020181 A CN202380020181 A CN 202380020181A CN 118647400 A CN118647400 A CN 118647400A
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hsv
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fuson
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glycoprotein
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肖恩·张
傅新平
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University of Houston System
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Abstract

本发明涉及用于递送转基因(例如，治疗性基因)的基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体，所述载体对免疫系统的中和作用、吞噬作用和NK细胞更具抗性，以及用于制备所述载体的方法和用于利用所述载体治疗病症和疾病(如与基因表达相关的病症和疾病)的方法。在一个实施例中，所述HSV载体是通过在含有高水平的抗HSV抗体的免疫血清中进行处理来制备的。所述HSV载体可以包含插入到糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域，以便抑制吞噬细胞活性，并且不含用于逃避NK细胞的gE。

Description

持续性HSV基因递送系统
本申请要求于2022年3月16日提交的美国临时申请第63/269,440号的权益，所述美国临时申请特此通过引用并入。
技术领域
本发明涉及用于递送转基因(例如，治疗性基因)的非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体，所述载体对免疫系统的中和作用和吞噬作用更具抗性，以及用于制备所述载体的方法和用于利用所述载体治疗病症和疾病(如与基因表达相关的病症和疾病)的方法。
背景技术
基因疗法在治疗各种疾病如遗传性疾病、自身免疫性疾病和癌症方面具有许多潜在临床应用。基因疗法的成功在很大程度上依赖于基因递送载体如病毒载体的可用性。理想的基因递送载体可以将治疗性基因高效地递送到身体组织中，并且确保所递送的治疗性基因可以长期停留在组织中。然而，病毒载体的功效通常会因宿主体内的各种防御机制而减弱。
例如，抗HSV中和抗体与引入的病毒颗粒如单纯疱疹病毒(HSV)颗粒结合。这些抗体可以是由于患者先前暴露于病毒而预先存在的，也可以是在治疗期间反复施用病毒而新产生的。中和抗体可以通过若干种机制降低基因转导效率。首先，所述中和抗体防止病毒感染细胞。其次，所述中和抗体可以与经转导的细胞结合，通过宿主的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或通过激活补体系统以形成膜攻击复合物(MAC)而导致细胞被破坏(Huber等人,2001；Tay,Wiehe和Pollara,2019；Xie,Jane-Wit和Pober,2020)。事实上，动物研究已经表明预先存在的体液免疫对HSV的感染性是有害的(Fu和Zhang,2001)。
发现抗HSV中和抗体主要靶向两种病毒编码的糖蛋白——糖蛋白D(gD)和gB(Cairns等人,2015；Cairns等人,2014)。gD和gB两者均含有许多中和表位，在不同个体中以不同的免疫显性层级顺序呈现(Bender等人,2007)。总的来说，这些表位在受感染的个体和/或不同物种中是非常保守的(Eing,Kühn和Braun,1989)。研究还表明，HSV-2比HSV-1更难以中和(Silke Heilingloh等人,2020)。强表位的存在表现为全身施用基于HSV的病毒的主要障碍，因为中和抗体可以容易地识别它们并消除它们的治疗活性。
降低全身递送的病毒载体得有效性的另一个重要限制性因素是宿主的单核吞噬细胞系统(MPS)。已经表明，在全身递送后，病毒颗粒可以被MPS快速清除(Ellermann-Eriksen,2005；Hume,2006；Van Strijp等人,1989)。具体地，Fulci等人的研究已经表明，耗竭巨噬细胞可以极大地改善HSV的组织分布(Fulci等人,2007)。
又另一个可以降低利用HSV进行的病毒递送的有效性的重要抗病毒机制是自然杀伤(NK)细胞(Alvarez-Breckenridge等人,2012a；Alvarez-Breckenridge等人,2012b)。已知病毒糖蛋白E(gE)与IgG结合(Dubin等人,1994)。最近的研究已经表明，NK细胞可以通过表面CD16激活受体与和gE结合的IgG中的Fc区结合来识别HSV或HSV感染的细胞(Dai和Caligiuri,2018)。
限制中和抗体对病毒的感染性的作用的一种方式是诱变每个主要表位。事实上，最近的研究已经表明，从HSV的gD中诱变这些表位中的两个表位确实可以消除对应单克隆抗体(mAb)的中和作用(Tuzmen等人,2020)。然而，HSV-1和HSV-2的gB和gD两者均是中和抗体的主要靶标，并且它们中的每一个含有近十几个中和表位。在超过150kb长的病毒基因组的上下文中使用诱变来自两个糖蛋白的这些表位中的每个表位的传统方法是不实际的。此外，这种方法仅解决了病毒疗法的全身递送所面临的三大障碍之一——中和抗体，而没有触及MPS。
美国专利公开第2012/0301506号和美国专利第8,986,672号和第10,039,796号公开了经修饰的HSV-2及其在治疗恶性肿瘤中的用途。
Fu等人,《肿瘤靶标(Oncotarget)》,2018,9(77):34543-34553描述了将CD47基因移植到HSV的膜包膜上，以使其能够从MPS中逃逸。
美国专利公开第2019/0267845号描述了一种HSV载体，其在非互补细胞中不表达HSV基因并且包括包含一种或多种转基因的基因组，其中所述载体能够在非互补细胞中表达转基因至少28天。
美国专利公开第2018/0148711号公开了基于HSV的基因组编辑载体。
Verlengia等人,《科学报告(Sci Rep.)》,2017年5月4日,7(1):1507,doi:10.1038/s41598-017-01635-1描述了用于在中枢神经系统中进行转基因表达的工程化HSV载体。
仍然需要适于基因疗法的可以抵抗来自宿主的先天抗病毒免疫机制和获得性抗病毒免疫机制的限制性作用的持续性病毒载体。
发明内容
本发明人发现，通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使HSV载体传代和/或通过在膜包膜中包含胞外CD47结构域(如胞外人CD47结构域)，HSV载体可以更高效地递送转基因，并且所递送的转基因可以持续更长时间。出乎意料地发现，含CD47病毒的传代导致病毒颗粒中几乎完全没有gE。这允许病毒从NK细胞介导的抗病毒机制中逃逸。还发现CD47的胞外结构域插入到gC的N末端能够使病毒逃避抗HSV抗体的中和作用，甚至无需传代。本文所描述的HSV载体可以是非溶瘤性的，并且是无毒的。
本发明的一个实施例是一种组合物，其包括非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体，其中(i)所述基于HSV的载体包括转基因，并且(ii)所述基于HSV的载体是通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使所述基于HSV的载体传代至少两次来制备的。在一个实施例中，在所述免疫血清中的所述传代使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。所述载体优选地还包含与所述转基因可操作地连接的启动子。在一个实施例中，所述基于HSV的载体是非溶瘤性的。在另一个实施例中，所述基于HSV的载体是持续性的。
所述基于HSV的载体可以是HSV-1或HSV-2。优选的基于HSV的载体是HSV-2。
所述基于HSV的载体可以是包装到HSV-1或HSV-2颗粒中的扩增子。
在一个实施例中，所述基于HSV的载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。所述糖蛋白可以选自糖蛋白C、糖蛋白B、糖蛋白D、糖蛋白H和糖蛋白L。在一个优选的实施例中，所述膜包膜包含糖蛋白C，所述糖蛋白C具有插入到其N末端中的胞外CD47结构域。所述胞外CD47结构域可以是鼠源性或人源性的。所述胞外CD47结构域可以包括鼠CD47的氨基酸19-141(SEQ IDNO:1)。可替代地，所述胞外CD47结构域可以包括人CD47的氨基酸55-423(SEQ ID NO:3)。所述载体包含编码CD47结构域的基因组。
在另一个实施例中，所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。
所述免疫血清可以是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。
在一个实施例中，所述基于HSV的载体是通过在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使所述基于HSV的载体传代至少两次(例如，至少五次或七次)，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少两次(例如，至少五次或十次，或十七或二十三次)来制备的。
在一个实施例中，所述组合物包括脑脊液。
另一个实施例是一种非复制型基于HSV的载体，其包括转基因，其中所述基于HSV的载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。在一个实施例中，所述基于HSV的载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。所述糖蛋白可以选自糖蛋白C、糖蛋白B、糖蛋白D、糖蛋白H和糖蛋白L。在一个优选的实施例中，所述膜包膜包含糖蛋白C，所述糖蛋白C具有插入到其N末端中的胞外CD47结构域。所述胞外CD47结构域可以包括CD47的氨基酸19-141(SEQ ID NO:1)。可替代地，所述胞外CD47结构域可以包括人CD47的氨基酸55-423(SEQ ID NO:3)。在另一个实施例中，所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。在一个优选的实施例中，使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。所述载体优选地还包含与所述转基因可操作地连接的启动子。在一个实施例中，所述基于HSV的载体是非溶瘤性的。在另一个实施例中，所述基于HSV的载体是持续性的。所述载体包含编码所述胞外CD47结构域(例如，其可以是鼠源性或人源性的)的基因组。
又另一个实施例是一种制备包括非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体(如本文所描述的基于HSV的载体)的组合物的方法，所述方法包括利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使包括转基因的所述基于HSV的载体传代至少两次。在一个实施例中，所述免疫血清包括哺乳动物抗HSV抗体。在另一个实施例中，所述免疫血清是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。在又另一个实施例中，所述方法包括在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使所述基于HSV的载体传代至少两次(例如，至少五次或七次)，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少一次(例如，至少两次、五次或十次，或十七或二十三次)。
又另一个实施例是一种治疗有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所描述的组合物或本文所描述的非复制型基于HSV的载体。所述疾病或病症可以是神经系统疾病或病症。在一个实施例中，所述疾病或病症不是肿瘤疾病或病症(例如，所述疾病或病症不是癌症)。所述组合物或所述基于HSV的载体可以全身、肌内、皮内、皮下或肠胃外施用或者通过脑室内或腹膜内注射施用。在一个实施例中，所述患者已经暴露于HSV-1和/或HSV-2或针对HSV-1和/或HSV-2进行了疫苗接种，或者具有HSV-1和/或HSV-2。
又另一个实施例是一种针对恶性或感染性疾病对患者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所描述的组合物或本文所描述的非复制型基于HSV的载体。在一个实施例中，所述转基因是用于对患者进行疫苗接种的转基因。
附图说明
为了更全面地理解本发明，包含特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图。
图1是示出了经训练和未经训练FusOn-H2对抗HSV血清的不同敏感性的条形图。将1×104个未经训练Fuson-H2或经训练FusOn-SS9与人或大鼠抗HSV-2血清以1:5的最终浓度混合。在37℃下进行1小时温育后，将溶液施加于12孔板的Vero单层。在结晶紫染色后48小时后对蚀斑进行计数。
图2A是将CD47编码序列插入到HSV载体中的示意性图示。所述图示出了通过同源重组进行的将EGFP-Luc基因盒(转基因，其可以是任何治疗性基因)和CMVp-HAtag-CD47ECD插入到HSV载体(FusOn-H2)的骨架中，所述骨架具有左侧侧接(LF)序列和作为右侧侧接序列的gC的3'区(从跨膜结构域到polyA)。基因盒中的单独组分的细节在图中描绘并相应地标记。缩写词是：CMVp，巨细胞病毒立即早期启动子；LTR，含有此病毒的启动子区的劳斯肉瘤长末端重复序列；GFP-Luc，EGFP-荧光素酶融合基因；HA，HA标签；CD47，鼠CD47胞外结构域；gC，完整的gC编码区。LF，gC的左侧侧接区。通过GFP表达鉴定重组病毒并将其纯化至均质。
图2B是FusOn-Luc构建策略的示意性图示。所述图示出了仅含有转基因而不含CD47的FusOn-Luc(作为对照病毒)是以类似的方式构建的，除了它不含有CD47胞外结构域。
图3是示出了在存在吞噬细胞的情况下FusOn-CD47和FusOn-Luc转导细胞和进行复制的能力的比较的图。所述图是在有或没有吞噬细胞存在的情况下病毒产量的比较。在没有或有200,000个脾细胞存在的情况下，用0.1pfu/细胞的病毒感染12孔板中的Vero细胞。48小时后采集细胞，并且通过蚀斑测定确定病毒产量。★与其它三个孔相比，p<0.05。
图4A是示出了来自每日IVIS成像测量的平均光子读数(即，Luc转基因表达的数量)的图，证明了通过全身递送途径(在这种情况下，递送到肿瘤组织)，FusOn-CD47可以更高效地递送并且转基因比FusOn-Luc持续更长时间。通过皮下植入CT26细胞在Balb/c小鼠的右侧胁腹处建立肿瘤。一旦肿瘤达到直径大约8mm的大小，全身给予2×106pfu的FusOn-CD47或FusOn-Luc。
图4B是全身递送FusOn-CD47后几天典型小鼠中转基因表达的时间推移图像。所述图示出了通过全身途径，转基因可以通过FusOn-CD47比通过FusOn-Luc更高效地递送。通过皮下植入CT26细胞在Balb/c小鼠的右侧胁腹处建立肿瘤。一旦肿瘤达到直径大约8mm的大小，全身给予2×106pfu的FusOn-CD47或FusOn-Luc。从第2天开始每天对动物进行荧光素酶表达成像。
图5是示出了训练后FusOn-CD47对抗HSV血清的中和作用的抗性增强的图。将1×104个未经训练FusOn-CD47或经训练FusOn-CD47-SS24(在存在大鼠血清的情况下7次传代，并且在存在大鼠血清加一种人血清的情况下17次传代)与人或大鼠抗HSV-2血清以1:5的最终浓度混合。在37℃下进行1小时温育后，将溶液施加于12孔板的Vero单层。在结晶紫染色后48小时后对蚀斑进行计数。
图6是示出了经训练FusOn-CD47获得对抗HSV免疫血清的另外抗性的图。将5×103个未训练Fuson-CD47或在不同阶段训练的相同病毒[系列选择24(FusOn-CD47-SS24)、系列选择49(HR49、N2-N5和N7-N8)]与不同稀释度的八人血清混合物混合。经训练FusOn-H2(FusOn-SS9)也包含在此实验中。在37℃下进行1小时温育后，将溶液施加于12孔板的Vero单层。在结晶紫染色后48小时后对蚀斑进行计数。
图7是示出了CD47的插入可以增强HSV载体逃避中和抗体的能力的条形图。在将五百pfu的FusOn-CD47和FusOn-Luc用于感染6孔板中的Vero细胞之前，将它们与指定稀释度(1:40或1:160)的抗HSV-2血清在37℃下温育1小时。同样数量的病毒仅与培养基一起温育作为对照。48小时后用结晶紫对细胞进行染色，用于病毒蚀斑的计数。通过将含有抗HSV血清的孔中的蚀斑数量与含有相同病毒但没有抗HSV血清的孔中的蚀斑数量(对照)相除来计算蚀斑的百分比。★指示与FusOn-Luc相比，p<0.05。
图8是关于全身递送FusOn-CD47、FusOn-Luc或FusOn-SD后几天典型小鼠中转基因表达的时间推移图像。所述图示出了，FusOn-CD47，而不是FusOn-Luc，可以通过全身途径充分地递送到已经预先存在抗HSV免疫的小鼠，并且FusOn-CD47在含有抗HSV抗体的血清中的传代(产生FusOn-SD)进一步增强了病毒在这些小鼠中被全身递送的能力。将Balb/c小鼠用FusOn-H2进行疫苗接种，并且然后在右侧胁腹处植入有CT26肿瘤细胞。通过尾静脉以1×107pfu的剂量向不同组中的小鼠给予这三种病毒中的每种病毒。在病毒注射后的指定日期，使用IVIS成像仪对小鼠进行成像。
图9A是示出了在将病毒最初与小鼠抗HSV-2gE(1:1000稀释度)并且然后与HPR缀合的兔抗小鼠IgG(1:10,000稀释度)一起温育后，对FusOn-H2、FusOn-SD和PBS(阴性对照)上的gE表达(通过450nm处的吸光度)的酶联免疫吸附测定(ELISA)的条形图。
图9B是蛋白质印迹，示出了在FusOn-SD中没有gE，但在FusOn-H2中有。将病毒首先与小鼠抗HSV-2gE(1:1000稀释度)并且然后与HPR缀合的兔抗小鼠IgG(1:10,000稀释度)一起温育，用于蛋白质印迹检测。
图9C是关于NK细胞通过gE识别HSV或HSV感染的细胞的机制的示意性图示。
具体实施方式
引言
基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体具有一些独特的特征，对某些临床应用具有吸引力。例如，由于HSV基因组可以终生留在神经元组织中，因此基于HSV的基因递送载体可以特别用于针对神经系统病症的基因疗法。然而，由于它们是基于病毒的载体，宿主的抗病毒免疫机制通常可以清除病毒载体，从而限制了它们在基因递送中的效率。宿主的先天抗病毒免疫和获得性抗病毒免疫两者均可以清除基于HSV的载体。主要的先天抗病毒免疫组分是巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)，并且主要的获得性抗病毒免疫组分是中和抗体。在本文中，报告了本发明，关于对基于HSV的基因递送载体进行了一系列修饰，所述修饰使病毒能够逃避这些抗病毒机制，从而提高基因递送效率。对于巨噬细胞的吞噬作用，CD47的胞外结构域(一种含有“别吃我(don't eat me)”信号的分子)被插入到糖蛋白C(gC)的N末端中。所述修饰用CD47涂覆病毒载体，这防止巨噬细胞和其它吞噬细胞“吃掉”病毒载体。对于中和抗体，病毒载体在存在抗HSV免疫血清的情况下进行一系列传代。这不仅选择了具有耐受中和抗体能力的载体候选物，还将病毒颗粒中gE并入最小化。由于gE可以与IgG结合，IgG随后可以被NK细胞识别以杀死由基于HSV的载体转导的细胞，因此病毒颗粒中gE的缺失通过使细胞能够逃避NK细胞介导的杀伤效应而允许更高效的基因转导。
由于在神经组织中长期存在的独特特性，基于HSV的基因递送载体在治疗神经系统病症的基因疗法应用中特别有用。然而，先天抗病毒机制和获得性抗病毒机制是基于HSV的基因递送载体的主要障碍，包括其基因递送效率。本文公开的发明解决了这些障碍，允许更有效地使用病毒载体，例如，用于其针对基因疗法的临床应用。
定义
如本文所使用的，术语“单纯疱疹病毒”或“HSV”是指感染哺乳动物包含人类的有包膜的二十面体双链DNA病毒。野生型HSV在终末分化的非分裂细胞和分裂细胞两者中感染并且复制。HSV载体可以是基于HSV的基因组编辑载体，如美国专利公开第2018/0148711号中所描述。HSV载体也可以是在非互补细胞中不表达毒性HSV基因并且包括包含一个或多个转基因的基因组的HSV载体，如美国专利公开第2019/0276845号中所描述。
术语“HSV-2持续性病毒”和“HSV-2突变体”在本文中可互换使用。
如本文所使用的，术语“细胞膜融合”和“融合”是指至少两个细胞如例如两个相邻细胞的外膜的融合。
如本文所使用的，术语“增强的促融合活性”是指细胞膜融合的增强、增加、强化、论证、扩增或其组合。
如本文所使用的，术语“持续性”是指特征在于病毒未被清除而是残留在受感染个体的特定细胞中的病毒感染。持续性感染可能涉及无症状感染和产生性感染两个阶段，但不会迅速杀死宿主细胞，或者甚至不会对宿主细胞产生损害。
如本文所使用的，术语“载体”是指一种载剂核酸分子，核酸序列可以被插入到所述载剂核酸分子中以引入到细胞中，在所述细胞中可以复制核酸序列。当插入的核酸序列对于载体被引入到其中的细胞来说是外源性的，或者当它与细胞中的序列同源但位于宿主细胞核酸中的通常找不到死亡序列的位置中时，插入的核酸序列被称为“外源性的”。病毒载体被包封在病毒蛋白中，并且能够感染细胞。可以通过标准重组技术构建载体。通常，标准重组技术包含Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》,第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)和其中引用的参考文献。也在以下中综述了病毒学考虑：Coen D.M,《病毒学中的动物病毒分子遗传学(Molecular Genetics of Animal Viruses in Virology)》,第2版,B.N.Fields(编辑),纽约的雷文出版社(Raven Press,N.Y.)(1990)和其中引用的参考文献。
术语“表达载体”是指包括编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的基因构建体。在一些情况下，RNA分子然后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况下，这些序列不被翻译，例如在反义分子或核酶的生产中。表达载体可以含有多种“控制序列”，其是指特定宿主细胞中的可操作地连接的编码序列的转录和可能翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可以含有具有其它功能的核酸序列，并且在下文中进行描述。
“启动子”是一种控制序列，是核酸序列中转录起始和速率的区。它可以含有调节蛋白和分子可以结合的遗传元件，如RNA聚合酶和其它转录因子，以便启动或调节核酸序列的时间和空间转录。短语“操作性地定位”、“可操作地连接”，“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或朝向，以控制所述序列的转录启动和/或表达。示例性非限制性启动子包含：在外源性诱导型元件控制下的组成型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子或内源性启动子。
如本文所使用的，术语“组成型启动子”是指在整个细胞周期中以连续时间方式驱动基因或多核苷酸的表达的启动子。组成型启动子可以是细胞或组织类型特异性的，只要它在整个细胞周期中以连续的方式操作以驱动与其相关联的基因或多核苷酸的表达。示例性非限制性组成型启动子包含：立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子、RSVLTR、β鸡肌动蛋白启动子和HSV TK启动子。
术语“增强子”是指涉及控制核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
如本文所使用的，术语“有效的”或“治疗有效的”是指遏制或抑制症状加重、抑制、遏制或预防疾病发作、抑制、遏制或预防疾病蔓延、改善疾病的至少一种症状或其组合。
术语“患者”或“受试者”是指哺乳动物，如人或家畜(例如，狗或猫)。在优选的实施例中，所述受试者或患者是人。
术语“血清”是指去除血细胞和凝血蛋白后剩余的血液流体。
如本文所使用的，短语“药学上”或“药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物或人时不会产生不良反应、过敏反应或其它不良反应的分子实体和组合物。短语“药学上可接受的载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。
术语“单位剂量”是指适合在受试者中使用的物理上离散单位，各单位含有预定量的治疗性组合物，所述治疗性组合物经计算产生与其施用(即，适当的途径和治疗方案)相关联的期望应答。
本发明可以用作独立的疗法或与另一种疗法方式(包含药物治疗和外科手术)结合使用。
载体构建
HSV载体包括编码期望蛋白质的转基因，并且在具体实施例中，进一步包括调节序列，如启动子。重组病毒可以进一步包含一些或所有以下组分。
载体
载体包含但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。用于构建工程化病毒和DNA载体的方法是本领域已知的。通常，标准重组技术包含Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第2版,冷泉港实验室出版社(1989)和其中引用的参考文献。也在以下中综述了病毒学考虑：Coen D.M,《病毒学中的动物病毒分子遗传学》,第2版,B.N.Fields(编辑),纽约的雷文出版社(1990)和其中引用的参考文献。
表达载体可以含有多种“控制序列”，其是指特定宿主细胞中的可操作地连接的编码序列(如转基因)的转录和可能翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，DNA载体、表达载体和病毒还可以含有具有其它功能的核酸序列。
在一个实施例中，基于HSV的载体不表达作为立即早期基因的ICP0、ICP4、ICP22和ICP27。此类载体可以如美国专利公开第2019/0276845号中所描述制备，所述美国专利公开特此通过引用并入。
HSV载体可以是包装到HSV-1或HSV-2颗粒中的扩增子。HSV扩增子是独特的基因递送载体。它们是基于质粒的构建体，所述构建体除了含有治疗性基因外，还含有HSV复制起点的拷贝和包装信号。当与作为辅助病毒的HSV病毒一起共递送到细胞中时，扩增子构建体将被复制(由于复制起点的存在)，并且然后所复制的扩增子序列将被包装到病毒颗粒中(由于包装信号的存在)。所包装的扩增子具有与辅助病毒相同的基因转导特性。本公开中描述的所有HSV病毒都可以作为辅助病毒施加，用于HSV扩增子包装，以进行基因递送。
1.启动子和增强子
启动子通常包括用于定位RNA合成的起始位点的序列。此序列的最知名实例是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的启动子(例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖在起始位点本身上的离散元件有助于固定起始位点。另外的启动子元件调节转录起始的频率。典型地，这些启动子元件位于起始位点上游30至110bp的区中，尽管已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5'端定位于所选启动子的“下游”(即，3'端)。“上游”启动子刺激DNA的转录，并且促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔往往是灵活的，使得当元件相对于彼此反转或移动时启动子功能得以保留。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。启动子可以与增强子结合使用，也可以不与增强子结合使用。
启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5'非编码序列来获得。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于所述序列的下游或上游。可替代地，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可以包含其它基因的启动子或增强子，以及从任何其它病毒或原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”(即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变)的启动子或增强子。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包含β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，还可以结合本文公开的组合物，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包含PCR来产生序列(参见美国专利第4,683,202号和第5,928,906号)。此外，经考虑也可以采用指导序列在例如线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
自然地，重要的是采用启动子和/或增强子来有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的，和/或在适当的条件下可用于指导引入的DNA片段的高水平表达，如有利于重组蛋白和/或肽的大规模生产。启动子可以是异源性的或内源性的。
另外，任何启动子/增强子组合都可以用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一个可能的实施例。如果提供了适当的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体，则真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
本领域的技术人员熟知组织特异性启动子或元件的身份以及用于表征其活性的测定。此类区的非限制性实例包含人LIMK2基因(Nomoto等人(1999)《基因(Gene)》236(2):259-271)、生长抑素受体2基因(Kraus等人,(1998)《欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)》428(3):165-170)、鼠附睾维甲酸结合基因(Lareyre等人,(1999)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》274(12):8282-8290)、人CD4(Zhao-Emonet等人,(1998)《生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)》,1442(2-3):109-119)、小鼠α-2(XI)胶原蛋白(Tsumaki等人,(1998),《生物化学杂志》273(36):22861-4)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人,(1997),《DNA与细胞生物学(DNA Cell Biol.)》16(11):1267-1275)、胰岛素样生长因子II(Vu等人,(1997)《生物化学与生物物理研究通讯(Biophys Biochem Res.Comm.)》233(1):221-226)和人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等人,(1996)《免疫学杂志(J.Immunol.)》157(12):5411-5421)。
2.起始信号和内部核糖体结合位点
编码序列的高效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包含ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包含ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。本领域的普通技术人员将容易地能够确定此需求并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所期望的编码序列的阅读框在“框内”，以确保整个插入物的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件来增强表达效率。
在本发明的某些实施例中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5'甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并且在内部位点处开始翻译。IRES元件可以与异源性开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个开放阅读框由IRES分开，从而产生多顺反子信使。借助于IRES元件，每个开放阅读框可以与核糖体接近以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信使可以高效地表达多个基因(参见美国专利第5,925,565号和第5,935,819号)。
3.终止信号
本发明的载体或构建体通常将包括至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含涉及RNA聚合酶特异性终止RNA转录物的DNA序列。因此，在某些实施例中，考虑了终止RNA转录物产生的终止信号。体内可能需要终止子来实现期望的信使水平。
在真核系统中，终止子区也可以包括特定的DNA序列，所述序列允许新转录物的位点特异性切割，从而暴露聚腺苷酸化位点。这表明一种专门的内源性聚合酶在转录物的3'端添加了约200个A残基(polyA)的区段。用这种polyA尾部修饰的RNA分子似乎更稳定，并且翻译效率更高。因此，在涉及真核生物的其它实施例中，考虑了终止子包括用于切割RNA的信号，并且终止子信号促进信使的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以用于提高信使水平，并且使从盒到其它序列的通读最小化。
预期用于本发明的终止子包含本文所描述的或本领域普通技术人员已知的任何已知转录终止子，包含但不限于，例如基因的终止序列，如例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，如例如SV40终止子。在某些实施例中，终止信号可能缺乏可转录或可翻译的序列，如由于序列截短。
4.聚腺苷酸化信号
在表达中，特别是真核表达中，典型地包含聚腺苷酸化信号以实现转录物的正确聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的性质被认为对本发明的成功实施并不重要，并且任何此类序列都可以采用。优选的实施例包含SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号，这两种信号都是方便的，并且已知在各种靶细胞中功能良好。聚腺苷酸化可能增加转录物的稳定性或可能促进细胞质运输。
5.可选择和可筛选的标志物
在本发明的某些实施例中，含有本发明的核酸构建体的细胞可以通过在表达载体中包含标志物而在体外或体内进行鉴定。此类标志物将赋予细胞可鉴定的变化，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，可选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性可选择标志物是标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性可选择标志物是标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性可选择标志物的实例是药物抗性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其它类型的标志物，包含可筛选标志物如GFP，其基础是比色分析。可替代地，可以使用可筛选的酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域的技术人员也知道如何采用免疫标志物，可能与荧光激活细胞分选(FACS)分析结合采用。据信，所使用的标志物并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。可选择和可筛选标志物的另外实例是本领域的技术人员熟知的。
通过合适的方法将载体引入到最初感染的细胞。用于与本发明一起使用的用于转化细胞器、细胞、组织或生物体的此类核酸递送方法被认为实际上包含可以将核酸(例如，HSV载体)引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文所描述或本领域的普通技术人员所知。非限制性示例性方法包含：通过离体转染直接递送DNA；注射(美国专利第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号和第5,580,859号)；显微注射(美国专利第5,789,215号)；电穿孔(美国专利第5,384,253号)；磷酸钙沉淀；DEAE葡聚糖，随后是聚乙二醇；直接声波加载；脂质体介导的转染；受体介导的转染；微粒轰击(PCT公开号WO 94/09699和95/06128；美国专利第5,610,042号；第5,322,783号；第5,563,055号；第5,550,318号；第5,538,877号和第5,538,880号)；用碳化硅纤维搅拌(美国专利第5,302,523号和第5,464,765号)；农杆菌介导的转化(美国专利第5,591,616号和第5,563,055号)；PEG介导的原生质体转化(美国专利第4,684,611号和第4,952,500号)；干燥/抑制介导的DNA摄取；以及这些方法的任何组合，或本领域的技术人员已知的其它方法。所述组合物还可以在药学上可接受的赋形剂中通过全身施用如静脉内施用而递送到哺乳动物体内的细胞中。
DNA载体递送到细胞中的方法
1.离体转导
用于在离体环境中转染从生物体中取出的细胞和组织的方法对于本领域的技术人员而言是已知。因此，在本发明中考虑了可以使用本文所描述的核酸和组合物离体取出和转染细胞或组织。在特定方面，移植的细胞或组织可以被置于生物体中。在一些实施例中，核酸在移植的细胞或组织中表达。
2.注射
在某些实施例中，可以通过如例如皮下、皮内、肌内、静脉内、腹膜内等一次或多次注射(即，针注射)将核酸递送到细胞器、细胞、组织或生物体。注射方法对于本领域的普通技术人员而言是熟知的(例如，注射包括盐溶液的组合物)。本发明的另外实施例包含通过直接显微注射引入核酸。本发明的组合物的量可以根据受影响的细胞、组织或生物体的性质而变化。
3.电穿孔
在本发明的某些实施例中，通过电穿孔将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和DNA悬浮液暴露于高压放电中。在此方法的一些变型中，使用某些细胞壁降解酶，如果胶降解酶，以使靶接受者细胞比未经处理的细胞更容易通过电穿孔转化(美国专利第5,384,253号)。可替代地，可以通过机械损伤使接受者细胞更容易转化。
4.脂质体介导的转染
在本发明的另外实施例中，如本文所描述的组合物(如载体)可以被截留在脂质复合物如例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有由水性介质分隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，磷脂会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质。还考虑了与Lipofectamine(吉博科公司(Gibco BRL))或Superfect(凯杰公司(Qiagen))复合的核酸。
在本发明的某些实施例中，脂质体可以与血球凝集病毒(HVJ)复合。已经证明这促进与细胞膜融合并促使脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等人,(1989)《科学(Science)》20；243(4889):375-8)。在其它实施例中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG1)复合或与其结合采用(Kato等人,(1991)《生物化学杂志》(1991)2月25日；266(6):3361-4)。在又另外的实施例中，脂质体可以与HVJ和HMG 1两者复合或结合采用。在其它实施例中，递送媒剂可以包括配体和脂质体。
5.受体介导的转染
可以通过受体介导的递送媒剂将核酸递送到靶细胞。此方法利用了受体介导的胞吞作用对大分子的选择性摄取。鉴于各种受体的细胞类型特异性分布，此递送方法为本发明增加了另一种程度的特异性。
在某些实施例中，受体介导的基因靶向媒剂包括受体特异性配体和核酸结合剂。其它实施例包括受体特异性配体，要递送的核酸已经操作性地附着于所述受体特异性配体。若干种配体已被用于受体介导的基因转移，包含表皮生长因子(EGF)，如欧洲专利第EPO0 273 085号所描述，表皮生长因子已被用于向鳞状细胞癌细胞递送基因。
在其它实施例中，细胞特异性核酸靶向媒剂的核酸递送媒剂组分可以包括与脂质体结合的特异性结合配体。要递送的核酸被包裹在脂质体中，并且特异性结合配体被功能性地并入到脂质体膜中。因此，脂质体将与靶细胞的受体特异性地结合并且将内含物递送到细胞。
在仍另外的实施例中，靶向递送媒剂的核酸递送媒剂组分可以是脂质体本身，其优选地包括一种或多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如，乳糖基神经酰胺(一种半乳糖末端去唾液酸神经节苷脂)已被并入脂质体中，并且已经观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加(Nicolau等人,(1987)《酶学方法(Methods Enzymol.)》149:157-76)。考虑了本发明的组织特异性转化构建体可以以类似方式特异性地递送到靶细胞中。
6.微粒轰击
微粒轰击技术可以用于将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的至少一种(美国专利第5,550,318号；美国专利第5,538,880号；美国专利第5,610,042号；以及PCT申请号WO 94/09699)。此方法依赖于将涂覆有DNA或含有DNA的微粒加速到高速的能力，允许它们穿透细胞膜并进入细胞而不杀死它们。微粒可以包含任何生物惰性物质，如钨、铂或金。对于轰击，将悬浮液中的细胞浓缩在过滤器或固体培养基上。可替代地，可以将未成熟胚胎或其它靶细胞排列在固体培养基上。要轰击的细胞定位于挡板上的微粒轰击装置下方适当距离处。用于与本发明一起实施的各种微粒轰击技术对于本领域的技术人员而言是已知的。
宿主细胞
如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。所有这些术语也包含其子代，即任何和所有的后代。应理解的是，由于有意或无意的突变，所有子代可能不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且所述宿主细胞包含任何能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的可转化生物体。宿主细胞可以并且已经被用作载体的接受者。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指外源性核酸被转移或引入到宿主细胞中的过程。经转化的细胞包含原代受试者细胞和其子代。如本文所使用的，术语“工程化的”和“重组的”细胞或宿主细胞旨在是指外源性核酸序列如例如载体已经引入其中的细胞。因此，重组细胞与不含重组引入的核酸的天然细胞是有区别的。
组织可以包括要用产生细胞膜融合的HSV-2突变体转化的宿主细胞或细胞。所述组织可以是生物体的一部分或从生物体中分离出来。在某些实施例中，组织可以包括但不限于脂肪细胞、肺泡细胞、成釉细胞、神经细胞、基底细胞、血液(例如，淋巴细胞)、血管、骨、骨髓、神经胶质细胞、乳腺、软骨、子宫颈、结肠、角膜、胚胎、子宫内膜、内皮细胞、上皮细胞、食管、面部、纤维母细胞、滤泡细胞、神经节细胞、神经胶质细胞、杯状细胞、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮肤、小肠、脾、干细胞、胃和睾丸。
在某些实施例中，宿主细胞或组织可以包括在至少一种生物体中。在某些实施例中，生物体可以是但不限于原核生物(例如，真细菌、古菌)或真核生物，如本领域的普通技术人员将理解的。
许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，并且可通过如美国典型培养物保藏中心(ATCC)等机构商购获得。本领域的技术人员可以基于载体骨架和期望结果确定适当的宿主。可用于载体复制和/或表达的示例性非限制性细胞类型包含细菌，如大肠杆菌(例如，大肠杆菌菌株RR1、LE392、B、X 1776(ATCC编号31537)、W3110、F、λ、DH5α、JM109和KC8)；杆菌，例如枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)；其它肠杆菌科，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；以及许多可商购获得的细菌宿主和感受态细胞，如感受态细胞和SOLOPACKTM金细胞(加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla,Calif.))。用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的非限制性实例包含HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。
一些载体可以采用允许在原核和真核细胞中对其进行复制和/或表达的控制序列。本领域的技术人员应进一步理解温育上文所描述的所有宿主细胞以使其维持并且允许载体复制的条件。还理解和已知将允许大规模生产载体，以及生产由载体和其同源多肽、蛋白质或肽编码的核酸的技术和条件。
病毒载体包装和繁殖
1.病毒包装
在本发明的具体实施例中，转基因可以通过同源重组插入到病毒中。典型地，这是通过使用Lipofectamine将含有转基因的质粒DNA与纯化的HSV(例如，HSV-2)基因组DNA共转染到Vero细胞中来完成的。然后鉴定重组病毒(典型地通过筛选病毒蚀斑中可选择标志物的存在)并选择含有转基因的蚀斑。然后在体外表征所选的重组病毒，以确认转基因已经被正确插入到HSV基因组中。
2.病毒原液的制备
一旦选择了重组HSV(例如，HSV-2)突变病毒，可以如下制备病毒原液。将Vero细胞在10％胎牛血清(FBS)中生长，并且每个细胞感染0.01个蚀斑形成单位(pfu)。2天后，通过反复冻融和超声处理从细胞中采集病毒。然后如所述纯化采集的病毒(Nakamori等人,(2003)《临床癌症研究(Clinical Cancer Res.)》9(7):2727-2733)。然后对纯化的病毒进行滴定、等分并储存在80℃下直至使用。
蛋白质表达系统
蛋白质表达系统可以用于产生本发明的DNA载体组合物，例如以表达用于功能研究的转基因所编码的多肽。存在包括上文讨论的组合物的至少一部分或全部的许多表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以用于与本发明一起使用以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质和肽。许多此类系统是可在商业上和广泛获得的。
昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生高水平的异源核酸片段的蛋白质表达，如美国专利第5,871,986号和第4,879,236号中所描述，并且是可商购获得的(例如，加利福尼亚州山景城的CLONTECH公司(CLONTECH,Inc.Mountain View,Calif.))。
可商购获得的表达系统的其它实例包含诱导型哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体；或pET表达系统；或大肠杆菌表达系统(加利福尼亚州拉荷亚的STRATAGENE公司(STRATAGENE,LaJolla,Calif.))；四环素调节的表达系统；使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统；或为在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(INVITROGEN,Carlsbad,Calif.))中高水平生产重组蛋白而设计的酵母表达系统。
考虑了通过本发明的方法产生的蛋白质、多肽或肽可以是“过表达的”，即，相对于其在细胞中的天然表达，以增加的水平表达。此类过表达可以通过多种方法进行评估，所述方法包含放射性标记和/或蛋白质纯化。然而，简单和直接的方法是优选的，例如涉及SDS/PAGE和蛋白质染色或蛋白质印迹的方法，随后是定量分析，如所得凝胶或印迹的光密度扫描。与天然细胞中的水平相比，重组蛋白、多肽或肽水平的特定增加表明过表达，相对于宿主细胞产生的其它蛋白，特定蛋白、多肽或肽的相对丰度也是如此，例如在凝胶上可见。
药物组合物和施用途径
如本文所描述的，本发明的组合物可以作为包括含有一个或多个治疗性基因拷贝的经修饰的基于HSV的载体的药物组合物施用。本发明的组合物可以包含经典的药物制剂。一般而言，本发明的组合物可以通过将组合物溶解或分散在药学上可接受的载剂或水性介质中而作为药剂施用。此类培养基和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。除了在任何常规介质或药剂与本发明的组合物不相容的范围内，考虑了其在治疗性组合物中的使用。补充活性成分，如其它抗疾病剂，也可以并入到药物组合物中。组合物的施用将通过任何常规途径进行，只要通过所述途径可获得靶细胞。示例性施用途径包含口服、鼻腔、口腔、直肠、阴道或局部施用。可替代地，可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或直接瘤内注射施用。本文描述了本发明的组合物的药物调配物、剂量和施用途径。施用可以通过全身施用或通过脑室内或腹膜内注射进行。
HSV载体的药物调配物
本发明的组合物或HSV载体可以制备成药理学上可接受的调配物。典型地，组合物或载体与药学上可接受且与病毒相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要的话，制剂可以含有少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂或免疫增强剂，所述辅助物质可以增强病毒突变体的有效性(参见《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,Gennaro,A.R.等人,编辑,马克出版公司(Mack Publishing Co.)出版,第18版,1990)。例如，用于注射目的的典型药学上可接受的载剂可以包括每毫升磷酸盐缓冲盐水50mg至约100mg的人血清白蛋白。适用于药学上可接受的组合物的调配物的另外的非限制性示例性非水溶剂包含丙二醇、聚乙二醇、植物油、芝麻油、花生油和可注射的有机酯如油酸乙酯。示例性非限制性水性载剂包含水、水溶液、盐溶液、肠胃外媒剂如氯化钠、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)等。静脉内媒剂包含流体和营养补充剂。确定药物组合物的各种组分的pH和精确浓度是常规的，并且在本领域的普通技术人员的知识范围内(参见Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis for Therapeutics)》,Gilman,A.G.等人,编辑,培格曼出版公司(Pergamon Press)出版,第8版,1990)。
通过将活性化合物以所需量与上文所描述的所需的各种其它无菌成分并入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种经灭菌的活性成分并入到无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和如上文所描述的所需的其它成分。
在某些实施例中，在本发明用于治疗神经系统病状的情况下，可以利用对流增强递送(CED)。对流增强递送(CED)涉及使用细导管和精确控制的输注速率来通过可能沿着神经胶质瘤细胞能够迁移的相同胞外通路直接进入脑胞外空间的大量流动来分配治疗剂。与依赖扩散实现充分药物分布的药物递送技术(如卡莫司汀浸渍的可生物降解聚合物)相比，使用CED可以将药物均匀分布在潜在的大体积的脑中，而与治疗剂的分子大小无关。因此，它是向患者的脑施用病毒载体介导的基因疗法的理想技术。
在一些实施例中，基于HSV的基因递送载体可以是进一步包括脑脊液(CSF)尤其是人工脑脊液的组合物。人工脑脊液在本领域是众所周知的，并且是一种模拟天然CSF的流体，特别是在其盐含量方面。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的NaCl，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的NaHCO3，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的KCl，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的NaH2PO4，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的MgCl2，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。优选地，所述组合物包括与天然CSF中发现的浓度相似的葡萄糖，也就是说，所述浓度优选地在天然CSF中浓度的15％以内，更优选地在10％以内。可替代地，人工CSF可以不含葡萄糖，以降低用于向受试者施用组合物的任何导管中细菌生长的可能性。
所述组合物可以进一步包括其它活性剂。本发明的药物组合物还可以包括任何药学上可接受的载剂、佐剂或赋形剂。可以在药物组合物中使用的药学上可接受的载剂、佐剂和媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇。
本发明的药物组合物可以通过任何适当的途径施用，但优选地通过注射施用，尤其是通过神经导管施用，具体是通过对流增强递送施用。药物组合物可以含有任何常规无毒的药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂。
用于施用HSV载体的途径和剂量
突变病毒组合物可以通过任何能够到达靶组织的途径递送。示例性非限制性施用途径可以包含口服、鼻内、口腔、直肠、阴道局部或通过注射(包含原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或脑室内注射)。典型地，病毒突变体将被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适于注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。
药物组合物可以呈无菌可注射制剂形式，例如呈一种无菌可注射水性或油性悬浮液形式。此悬浮液可以根据本领域中已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(例如，Tween80)和悬浮剂进行调配。无菌可注射制剂还可以是非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1.3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒剂和溶剂有甘露醇、水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用包含合成的甘油单酯或甘油二酯的任何温和的不挥发性油。如油酸等脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射物，天然的药学上可接受的油类(如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化的形式)也是如此。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如瑞士药典(Ph.Helv)或类似醇。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，所述溶液应当被适当地缓冲，并且首先使液体稀释剂与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此方面，鉴于本公开，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且添加到1000ml皮下输液用流体中或注射在建议的输注部位处(参见例如，“雷明顿氏药物科学”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。剂量的某种变化必然会根据正在治疗的受试者的病状而发生。负责施用的人员将在任何情况下确定用于个体受试者的适当剂量。
本领域的技术人员将认识到，可以直接确定使用本发明的组合物提供疗法的最佳治疗方案。这不是一个实验问题，而是一个优化问题，这是医学领域的常规做法。例如，小鼠体内研究提供了开始优化剂量和递送方案的起点。注射频率最初可以是每周一次。然而，根据从初始临床试验获得的结果和特定患者的需求，此频率可以从一天调整为每两周一次或每月一次。人的给药量最初可以通过从用于小鼠的组合物的量推断来确定。
剂量
递送的病毒载体的量将取决于若干因素，包含治疗次数、要治疗的受试者、受试者免疫系统合成抗病毒抗体的能力、要破坏的靶组织和期望的保护程度。要施用的病毒组合物的精确量取决于医生的判断，并且因每一个体而异。然而，合适的剂量在105个蚀斑形成单位(pfu)至1010pfu的范围内。在某些实施例中，病毒DNA的剂量可以是约105、106、107、108、109pfu，直至并包含1010pfu。
非病毒DNA载体调配物
除了上文描述用于病毒药物调配物的调配物外，非病毒DNA载体也可以被制备成无菌粉末，以制备药理学上可接受的无菌溶液。用于制备无菌粉末的典型方法包含真空-干燥和冷冻-干燥技术，所述真空-干燥和冷冻-干燥技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
用于施用非病毒DNA载体的途径和剂量
考虑了若干种用于递送非病毒载体以将本发明的多核苷酸转移到哺乳动物细胞中的方法。这些方法包含如先前所描述的磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、直接显微注射、加载DNA的脂质体和lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理、使用高速微粒的基因轰击和受体介导的转染。这些技术中的一些可以成功地适用于体内或离体使用。
在本发明的一些实施例中，表达载体可以仅由包括多核苷酸的裸重组DNA或质粒组成。构建体的转移可以通过本文提到的物理或化学透化细胞膜的任何方法进行。这特别适于体外转移，但也可用于体内使用。
在其它实施例中，递送媒剂可以包括配体和脂质体。例如，Nicolau等人采用乳糖基神经酰胺(一种半乳糖末端去唾液酸神经节苷脂)，其并入到脂质体中，并且观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加(Nicolau等人,(1987)《酶学方法》149:157-76)。因此，可行的是，编码特定基因的核酸也可以通过任何数量的有或没有脂质体的受体-配体系统特异性地递送到细胞类型中。例如，表皮生长因子(EGF)可以用作受体，用于将核酸介导递送到展示出EGF受体上调的细胞中(如欧洲专利第EP 0 273 085号中所描述)，并且甘露糖可以用于靶向肝细胞上的甘露糖受体。
在某些实施例中，在离体条件下可以更容易地进行DNA转移。离体基因疗法是指从动物中分离细胞，在体外将核酸递送到细胞中，并且然后将经修饰的细胞放回动物体内。这可能涉及外科手术切除动物的组织/器官或细胞和组织的原代培养。
剂量
在某些实施例中，设想了剂量可以在约103pfu/kg体重至约108pfu/kg体重之间变化。在某些实施例中，剂量可以是约103、104、105、106、107pfu/kg体重，直至并包含108pfu/kg体重。当然，根据初始临床试验的结果和特定患者的需要，此剂量可以向上或向下调整，如在此类治疗方案中常规进行的那样。
治疗方法
又另一个实施例是一种治疗有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所描述的组合物或本文所描述的非复制型基于HSV的载体。所述疾病或病症可以是神经系统疾病或病症。在一个实施例中，所述疾病或病症不是肿瘤疾病或病症(例如，所述疾病或病症不是癌症)。所述组合物或所述基于HSV的载体可以全身、肌内、皮内、皮下或肠胃外施用或者通过脑室内或腹膜内注射施用。在一个实施例中，所述患者已经暴露于HSV-1和/或HSV-2或针对HSV-1和/或HSV-2进行了疫苗接种，或者具有HSV-1和/或HSV-2。
又另一个实施例是一种针对恶性或感染性疾病对患者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所描述的组合物或本文所描述的非复制型基于HSV的载体。在一个实施例中，所述转基因是用于对患者进行疫苗接种的转基因。
组合治疗
其它基因疗法也可以与本文所描述的组合物和方法结合使用，作为用于治疗疾病或病症的组合疗法。作为组合治疗的基因疗法依赖于治疗性基因的递送和表达，与本文所描述的HSV载体不同。基因疗法可以在本文所描述的HSV载体之前、之后施用或与其同时施用。基因疗法的示例性非限制性靶标包含免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP接合的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、或细胞粘附抑制剂。可以用作与本发明组合的基因疗法的一部分的示例性非限制性免疫调节基因包含肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。
激素疗法也可以与本发明结合使用。激素可以用于治疗各种疾病，以降低某些激素如睾酮或雌激素的水平或阻断其作用。
实例
包含了以下实例以说明本发明的各方面。虽然实例是针对溶瘤病毒显示的，但本领域的技术人员将理解传代和包含胞外CD47结构域的有益效果也适用于如本文所描述的任何基于HSV的基因递送载体。
本领域的技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，本领域的技术人员应根据本公开理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且所述改变仍然获得相同或相似的结果。
实例1：构建FusOn-H2
如美国专利第10,039,796号的实例1中所描述构建FusOn-H2。为了使gB和gD两者上的大多数中和表位系统性地突变，以及增强gC的补体拮抗能力，在存在抗HSV-2血清的情况下，使FusOn-H2经受一系列选择。在存在从5只已经用HSV进行疫苗接种并且血液中具有高抗HSV抗体的大鼠收集的血清混合物的情况下，使FusOn-H2最初在细胞培养物中经受选择。利用大鼠血清开始这种选择的主要原因之一是因为它们含有可以激活针对HSV的补体的天然免疫球蛋白和甘露聚糖结合凝集素(MBL)两者，而小鼠血清和人血清仅含有这两种激活机制之一(分别为小鼠的MBL和人的天然免疫球蛋白)(Wakimoto等人,2002)。在此大鼠血清混合物下进行连续7轮选择后，将一种含有高水平的抗HSV-2抗体的人血清添加到大鼠血清中并继续选择。
在选择过程期间，定期监测在存在抗HSV血清的情况下的病毒感染性，并且结果表明在对中和抗体的抗性方面，与未选择的FusOn-H2相比有持续的改善。图1示出了测试结果之一，所述测试是在病毒经历了总共9轮选择后进行的(即，用大鼠血清进行的7轮选择和用大鼠血清和人血清的混合物进行的2轮选择)。结果显示，经训练病毒(命名为FusOn-SS9)对人和大鼠抗HSV-2血清的中和作用的抗性分别超过28.5倍和27.2倍。
为了使FusOn-H2在全身递送期间能够逃脱血液中单核吞噬细胞系统(MPS)对宿主的清除，探索了将CD47(一种“别吃我”信号分子)遗传移植到病毒的膜包膜上的可能性。巨噬细胞是负责快速清除HSV颗粒的主要吞噬细胞，并且据报告，耗竭巨噬细胞可以显著提高溶瘤HSV的治疗效果(Fulci等人,2007)。巨噬细胞的吞噬活性由正调节机制和负调节机制两者控制。CD47与其受体SIRPα之间的相互作用为巨噬细胞提供了强烈的负调节信号(“别吃我信号”)(Kinchen和Ravichandran,2008)。
HSV编码若干种组装在病毒包膜的表面上的糖蛋白。所述糖蛋白包含糖蛋白C(gC)、gB、gD、gH和gL。所述糖蛋白中的每种糖蛋白都可以用作用于并入鼠CD47(mCD47)的胞外结构域(ECD)的候选分子，以便将其移植到病毒包膜的表面。本文选择了糖蛋白C(gC)，因为与提到的其它糖蛋白不同，它对病毒的感染性不是必需的。因此，对其进行修饰以并入mCD47将不会有改变溶瘤病毒的天然嗜性的风险。mCD47的ECD(aa 19-141)(SEQ ID NO:1)(如下表所示)最初被插入到gC的N末端以产生gC的嵌合形式(cgC)，并且其表达由CMV IE启动子驱动。下表提供了全长鼠CD47(SEQ ID NO:2)和人CD47(SEQ ID NO:4)的序列。
cgC中包含HA(血凝素)标签，以允许方便地检测嵌合分子。为了便于鉴定重组病毒和体内成像，将cgC与另一个含有EGFP-荧光素酶基因的基因盒连接。将这两个基因盒一起插入到通过从病毒中缺失GFP基因而衍生自基于HSV-2的溶瘤病毒(FusOn-H2)的FusOn-H3的骨架中。通过缺失和用GFP替代ICP10基因的N末端区来构建FusOn-H2，以使其能够选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞。通过拾取GFP阳性蚀斑来鉴定重组病毒。通过多轮蚀斑纯化，每个单独挑选的病毒都富集到同质的GFP阳性。新产生的病毒被命名为FusOn-CD47-Luc(图2A)。还构建了对照病毒，其中仅将EGFP-Luc基因盒单独插入到FusOn-H3、FusOn-Luc的骨架中(图2B)。所有选择的病毒都维持了亲本FusOn-H2的促融合特性。
最近一项有趣的研究发现，用CD47模拟肽涂覆纳米颗粒可以帮助它们逃避MPS的吞噬清除(Rodriguez等人,2013)。探索了将CD47分子的胞外结构域遗传移植到FusOn-H2的膜包膜的可能性，以使其能够从MPS中逃逸用于全身递送。病毒构建策略如图2所示。体外测定表明，通过重组的gC用CD47胞外结构域涂覆病毒颗粒使病毒对吞噬作用更具抗性(图3)。当在小鼠结肠癌模型中进行体内测试时，结果显示FusOn-CD47比FusOn-Luc通过全身途径递送到肿瘤部位的效率高15倍。此外，数据还显示，在全身递送后，FusOn-CD47在肿瘤部位的持续时间显著长于FusOn-Luc。
最初通过流式细胞术或蛋白质印迹分析检测转基因的表达。对于流式细胞术分析，用1pfu/细胞的FusOn-CD47-Luc或FusOn-Luc感染293细胞。二十四小时后，将细胞用PE缀合的抗mCD47抗体或兔抗HA标签抗体标记。添加与FITC缀合的山羊抗兔抗体以进行HA标签检测。对CD47和HA标签标记的细胞两者进行流式细胞术分析。图2A中的结果显示抗mCD47和抗HA标签抗体两者均能够容易地检测到已经用FusOn-CD47-Luc感染的细胞，但不能检测到用FusOn-Luc感染的细胞。对于蛋白质印迹分析，将293细胞类似地用这两种病毒感染，或者用表达cgC或不含HA标签的野生型gC的质粒转染。24小时后制备细胞裂解物，并且进行蛋白质印迹分析。图2B中的结果显示cgC由FusOn-CD47-Luc而非FusOn-Luc大量表达。
接下来，比较这两种病毒的Luc基因表达的定量。用1pfu/细胞的FusOn-CD47-Luc或FusOn-Luc感染Vero、CT26和4T1细胞。24小时后采集细胞用于测量荧光素酶活性。图3A中的结果显示用这两种病毒感染的细胞的荧光素酶活性水平几乎相同。然后进行了另一项实验，以确定在体外环境中，移植具有mCD47的ECD的溶瘤HSV是否允许病毒逃避吞噬细胞的吞噬和清除。小鼠脾细胞被用作新鲜吞噬细胞的来源，因为脾是单核吞噬细胞系统的最大单位。在存在或不存在小鼠脾细胞的情况下，将Vero细胞用FusOn-CD47-Luc或FusOn-Luc感染。48小时后收集细胞，以通过蚀斑测定来定量测量病毒产量。图3B中的结果显示，在没有脾细胞的孔中，FusOn-CD47-Luc和FusOn-Luc两者均复制良好，并且这两个孔中的病毒产量相似。然而，在具有脾细胞的孔中，FusOn-Luc产量显著降低，而FusOn-CD47-Luc的复制仅受到轻微影响。这些结果表明，病毒颗粒上mCD47 ECD的存在使病毒能够在病毒感染期间抵抗来自巨噬细胞和可能一些其它免疫细胞的影响。
为了确定并入的mCD47 ECD使病毒能够全身递送的能力，将CD26鼠结肠癌细胞植入免疫活性Balb/c小鼠的右侧胁腹。一旦肿瘤达到直径大约8mm的大小，对每只小鼠全身注射2×106pfu的FusOn-CD47-Luc或FusOn-Luc。从第2天开始通过IVIS光谱系统监测小鼠的荧光素酶活性，并且然后每天监测直至信号完全消失。图4中的结果显示，在病毒施用后的第2天，来自FusOn-CD47-Luc的成像信号的强度比来自FusOn-Luc的成像信号的强度大了大约1.5个log。这表明前者比后者通过全身途径更高效地递送到肿瘤部位。此外，FusOn-CD47-Luc似乎比FusOn-Luc在肿瘤组织中停留的时间大体上更长。到第5天，在接受FusOn-Luc的小鼠的肿瘤中几乎检测不到成像信号，而在FusOn-CD47-Luc的肿瘤中的信号直到第7天仍可检测到。然而，两种病毒都没有在肿瘤组织中显示出任何显著的扩增，因为这种基于HSV-2的溶瘤病毒在CT26肿瘤细胞中生长很差。有趣的是，在一种情况下，当一些小鼠在病毒递送后第1天成像时，在肝脏中瞬时检测到显著的成像信号。这些信号到第2天完全消失。
为了确定在其它肿瘤模型中FusOn-CD47-Luc的全身递送是否也优于FusOn-Luc，重复了上述实验，但在植入4T1小鼠乳腺肿瘤细胞后在右侧胁腹处携带肿瘤的小鼠中进行，其中发现FusOn-H2能够适度生长。另外，4T1肿瘤细胞分泌巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其可以增强巨噬细胞的浸润和吞噬作用。这将允许CD47介导的逃避策略得到更有力的测试。图5A中的IVIS成像结果确实显示，4T1肿瘤中的信号通常低于CT26肿瘤中检测到的信号(如图4所示)。然而，结果再次显示，FusOn-CD47-Luc可以比FusOn-Luc通过全身途径更高效地递送到局部肿瘤。到第2天，这两种病毒之间的图像信号强度的差异为约1.5个log。最大的差异记录在第4天，此时FusOn-Luc的图像信号降低到接近背景水平，而FusOn-CD47-Luc的图像信号达到最高。这些数据再次表明，CD47修饰允许病毒能够更高效地通过全身途径递送，并且在到达肿瘤组织后比对照病毒在肿瘤组织中持续更长时间。
为了产生一种可以抵抗血流中所有三种主要限制因子——中和抗体、补体和吞噬细胞——的FusOn-H2产物，如上文所描述对FusOn-CD47进行了抗HSV-2血清选择。如上文所描述，用抗HSV大鼠血清对其进行7次连续切片，并且然后在存在大鼠血清加一种具有极高水平的抗HSV-2抗体的人血清的情况下进行23次连续传代。再次，在选择期间进行了若干次测试以确定病毒是否获得了抵抗免疫血清的中和作用的能力。此类测试的结果之一显示在图5中，所述测试是在FusOn-CD47首先用大鼠血清进行7轮切片和用大鼠血清加人血清进行17轮切片后进行的。结果清楚地表明，与FusOn-SS9相似，经训练FusOn-CD47(命名为FusOn-CD47-SS24)在存在免疫抗HSV-2血清的情况下获得了保持感染性的显著能力。
为了确保人对中和抗体有更强的抵抗力，用从12个个体中获得的HSV-2阳性血清混合物对病毒进行了三轮以上的切片，每次4个混合在一起。选择轮次为：第1批8轮，第2批6轮，并且第3批4轮。在这些广泛的选择后，对获得的病毒进行蚀斑纯化，并扩增6个蚀斑挑选物用于进一步分析。它们被命名为HR49-N2-5、HR49-N7和HR49-N8。首先，测试它们抵抗在选择中使用的八种人血清混合物的中和的能力，这是已经进行的最严格的中和测试。FusOn-SS9和FusOn-CD47-SS24两者均包含在此实验中用于比较。使用不同稀释度的抗HSV血清混合物来与指定的病毒一起温育，然后确定病毒感染性。图6中的结果显示，在这种严格的中和条件下(含有来自多个个体的抗病毒血清混合物)，所选的病毒仍可以产生大量的蚀斑，而未选择的病毒直到血清混合物稀释80倍后才产生任何蚀斑。数据还显示，在人血清混合物中进行的随后另外三轮选择已经进一步增强了所选病毒抵抗中和作用的能力。此外，数据显示，一些挑选的病毒在抵抗混合的人抗病毒血清的中和作用方面比其它病毒具有更好的能力。
实例2
评估了溶瘤病毒FusOn-H2在gC的N末端插入和不插入CD47胞外结构域的情况下逃脱抗HSV抗体中和的能力。在此体外实验中，将500个FusOn-CD47或FusOn-Luc的蚀斑形成单位(pfu)在有或没有稀释的抗HSV-2血清(稀释度为1:40或1:160)存在的情况下混合，并在37℃下温育，然后将其施加于Vero细胞单层以测定感染性和对蚀斑形成进行定量。图7中的结果显示，在1:40的稀释度下，血清可以几乎完全中和FusOn-Luc的病毒感染性。即使在1:160的稀释度下，血清仍然可以显著减少FusOn-Luc的感染(并且因此减少蚀斑形成的数量)。相比之下，在存在同样稀释的抗HSV血清的情况下，FusOn-CD47的中和作用要小得多。在存在1:40稀释血清的情况下，FusOn-CD47产生了大量的蚀斑(为未添加抗HSV血清的孔的大约15％)，而FusOn-Luc几乎不显示任何病毒蚀斑。
在用HSV-2进行疫苗接种并在其右侧胁腹植入了CT26鼠结肠癌细胞的Balb/c小鼠中，评估了FusOn-CD47、FusOn-Luc和FusOn-SD通过全身途径的体内递送。通过尾静脉注射，将1×107的FusOn-CD47、FusOn-Luc或FusOn-SD全身性递送到不同组的小鼠中。在图8所示的日期用IVIS成像仪对小鼠进行成像。结果表明，在存在抗HSV免疫的情况下，FusOn-Luc不能通过全身途径递送到肿瘤。相比之下，通过相同的递送途径并在存在抗HSV免疫的情况下，在肿瘤组织中容易检测到FusOn-CD47。此外，尽管存在抗病毒免疫，FusOn-CD47在到达肿瘤部位后在肿瘤组织中持续了近八天。CD47出乎意料地帮助溶瘤病毒逃避抗HSV抗体的中和作用，有助于FusOn-SD逃避中和抗体以进行全身递送的整体能力。因此，FusOn-SD在全身递送到肿瘤部位方面表现最佳。因此，FusOn-SD可用于具有HSV-1和/或HSV-2抗体的患者，如针对HSV-1和/或HSV-2进行疫苗接种或具有HSV-1和/或HSV-2的患者。
意外地发现gE在FusOn-SD病毒颗粒中不存在。这由图9A至9C示出。
图9A是示出了在用小鼠抗HSV-2gE(1:1000稀释度)和HPR缀合的兔抗小鼠IgG(1:10,000稀释度)处理后FusOn-H2、FusOn-SD和PBS(阴性对照)的吸光度的条形图。更具体地，在图9A中，将1×106pfu的病毒(亲本FusOn-H2和FusOn-SD)涂覆到96孔板以进行ELISA测定。涂覆有PBS的孔用作阴性对照。所使用的第一抗体是小鼠抗HSV-2gE(1:1000稀释度)，并且第二抗体是HPR缀合的兔抗小鼠IgG(1:10,000稀释度)。在FusOn-H2中检测到显著的读数，但在FusOn-SD中未检测到，这表明gE存在于FusOn-H2病毒颗粒中，但不存在于FusOn-SD中。
图9B是蛋白质印迹，示出了FusOn-SD和FusOn-H2的gE检测。将蛋白质从1×106pfu的病毒(FusOn-H2和FusOn-SD)中减去，并且在丙烯酰胺凝胶上运行以进行蛋白质印迹分析。将关于图9A使用的小鼠抗HSV-2gE和HPR缀合的兔抗小鼠IgG的相同抗体用于蛋白质印迹。结果显示了FusOn-H2的清晰的gE条带，而在加载了来自FusOn-SD的蛋白质的泳道中没有所述条带。此结果确认了图9A中的发现。
图9C是关于NK细胞通过gE识别HSV或HSV感染的细胞的机制的示意性图示。所述图示出了gE与IgG结合(病毒特异性或非病毒特异性)。CD16a是最重要的NK细胞激活受体之一，然后与IgG的Fc区结合，导致NK细胞的激活和病毒颗粒或病毒感染的细胞的清除。这导致溶瘤病毒递送以及复制减少，因此使病毒疗法的治疗效果最小化。因为FusOn-SD不能被这种机制识别，所以NK细胞不能清除它们，并且FusOn-SD的治疗功效持续存在。
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本文所引用的所有出版物、专利和专利申请特此通过引用并入，如同它们在本文中被完整地阐述一样。尽管已经参考说明性实施例描述了本发明，但是此描述并非旨在以限制性的意义来解释。在参考描述时，说明性实施例以及本发明的其它实施例的各种修改和组合对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。因此，所附权利要求旨在涵盖此类修改和增强。
除了本文所描述的各个实施例之外，本公开还包含以下编号为E1至E39的实施例。实施例的此列表被呈现为示例性列表并且本申请不限于这些实施例。
E1.一种非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体，其中(i)所述HSV载体包括转基因，并且(ii)所述HSV载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到所述糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。
E2.根据实施例E1所述的基于HSV的载体，其中所述HSV载体是HSV-1或HSV-2载体。
E3.根据实施例E1或E2所述的基于HSV的载体，其中所述基于HSV的载体是包装到病毒颗粒中的HSV扩增子。
E4.根据前述实施例中任一项所述的基于HSV的载体，其中所述糖蛋白选自糖蛋白C、糖蛋白B、糖蛋白D、糖蛋白H和糖蛋白L。
E5.根据实施例E4所述的基于HSV的载体，其中所述糖蛋白是糖蛋白C。
E6.根据前述实施例中任一项所述的基于HSV的载体，其中所述转基因是治疗性基因。
E7.根据前述实施例中任一项所述的基于HSV的载体，其中所述胞外CD47结构域是胞外人CD47结构域。
E8.一种组合物，其包括根据前述实施例中任一项所述的基于HSV的载体，其中所述HSV载体是通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使所述HSV载体传代至少两次来制备的。
E9.根据实施例E8所述的组合物，其中在所述免疫血清中的所述传代使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。
E10.根据实施例E8或E9所述的组合物，其中所述胞外CD47结构域包括鼠CD47的氨基酸19-141。
E11.根据实施例E8或E9所述的组合物，其中所述胞外CD47结构域是胞外人CD47结构域。
E12.根据实施例E8至E11中任一项所述的组合物，其中所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。
E13.根据实施例E8至E12中任一项所述的组合物，其中所述免疫血清是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。
E14.根据实施例E8至E13中任一项所述的组合物，其中所述基于HSV的载体是通过在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使HSV载体传代至少两次，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少两次来制备的。
E15.一种组合物，其包括非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体，其中(i)所述基于HSV的载体包括转基因，并且(ii)所述基于HSV的载体是通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使所述基于HSV的载体传代至少两次来制备的。
E16.根据实施例E15所述的组合物，其中所述基于HSV的载体是HSV-1或HSV-2载体。
E17.根据实施例E15或E16所述的组合物，其中在所述免疫血清中的所述传代使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。
E18.根据实施例E15至E17中任一项所述的组合物，其中所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。
E19.根据实施例E15至E18中任一项所述的组合物，其中所述免疫血清是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。
E20.根据实施例E15至E19中任一项所述的组合物，其中所述基于HSV的载体是通过在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使所述基于HSV的载体传代至少两次，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少两次来制备的。
E21.根据实施例E15至E20中任一项所述的组合物，其中所述转基因是治疗性基因。
E22.一种制备包括非复制型基于HSV的载体的组合物的方法，所述方法包括利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使包括转基因的基于HSV的载体传代至少两次。
E23.根据实施例E22所述的方法，其中所述基于HSV的载体是HSV-1或HSV-2载体。
E24.根据实施例E22或E23所述的方法，其中所述基于HSV的载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。
E25.根据实施例E24所述的方法，其中所述糖蛋白选自糖蛋白C、糖蛋白B、糖蛋白D、糖蛋白H和糖蛋白L。
E26.根据实施例E25所述的方法，其中所述糖蛋白是糖蛋白C。
E27.根据实施例E22至E26中任一项所述的方法，其中在所述免疫血清中的所述传代使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。
E28.根据实施例E24至E27中任一项所述的方法，其中所述胞外结构域包括鼠CD47的氨基酸19-141。
E29.根据实施例E24至E27中任一项所述的方法，其中所述胞外CD47结构域是胞外人CD47结构域。
E30.根据实施例E24至E29中任一项所述的方法，其中所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。
E31.根据实施例E22至E30中任一项所述的方法，其中所述免疫血清包括哺乳动物抗HSV抗体。
E32.根据实施例E22至E31中任一项所述的方法，其中所述免疫血清是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。
E33.根据实施例E22至E32中任一项所述的方法，其中所述方法包括在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使所述基于HSV的载体传代至少两次，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少一次。
E34.一种治疗有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用根据实施例E1至E7中任一项所述的基于HSV的载体或根据实施例E8至E21中任一项所述的组合物。
E35.根据实施例E34所述的方法，其中所述组合物或所述HSV载体被全身、肌内、皮内或皮下施用或者通过脑室内或腹膜内注射施用。
E36.根据实施例E34或E35所述的方法，其中所述组合物包括脑脊液。
E37.根据实施例E34至E36中任一项所述的方法，其中所述疾病是神经系统疾病。
E38.根据实施例E34至E37中任一项所述的方法，其中所述患者已经暴露于HSV-1和/或HSV-2或针对HSV-1和/或HSV-2进行了疫苗接种，或者具有HSV-1和/或HSV-2。
E39.一种针对恶性或感染性疾病对患者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述患者施用根据实施例E1至E7中任一项所述的基于HSV的载体或根据实施例E8至E21中任一项所述的组合物。

Claims (15)

1.一种组合物，其包括非复制型基于单纯疱疹病毒(HSV)的基因递送载体，其中所述HSV载体包括转基因，并且其中(a)所述HSV载体具有包括糖蛋白的膜包膜，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到所述糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域，(b)所述基于HSV的载体是通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使所述基于HSV的载体传代至少两次来制备的，或者(c)两者。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述HSV载体是HSV-1或HSV-2载体。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基于HSV的载体是包装到病毒颗粒中的HSV扩增子。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述糖蛋白中的至少一种糖蛋白包括插入到所述糖蛋白的N末端中的胞外CD47结构域。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述胞外CD47结构域是胞外人CD47结构域。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述糖蛋白选自糖蛋白C、糖蛋白B、糖蛋白D、糖蛋白H和糖蛋白L。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述糖蛋白是糖蛋白C。
8.根据权利要求1所述的基于HSV的载体，其中所述转基因是治疗性基因。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述HSV载体是通过利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使所述HSV载体传代至少两次来制备的。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中在所述免疫血清中的所述传代使所述基于HSV的载体的糖蛋白B和糖蛋白D上的中和表位突变。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述基于HSV的载体不含或基本上不含gE。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述免疫血清是包括大鼠血清和人血清的混合物，所述混合物具有升高水平的抗HSV抗体。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述基于HSV的载体是通过在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清的情况下使HSV载体传代至少两次，随后在存在具有升高水平的抗HSV抗体的大鼠血清和至少一种人血清的混合物的情况下传代至少两次来制备的。
14.一种制备根据权利要求1所述的组合物的方法，所述方法包括利用具有升高水平的抗HSV抗体的免疫血清使包括转基因的基于HSV的载体传代至少两次。
15.一种治疗有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1所述的组合物。
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