CN118574646A

CN118574646A - 环状rna及其用途

Info

Publication number: CN118574646A
Application number: CN202380017979.0A
Authority: CN
Inventors: 赵阳兵; 朱庚振; 吴长顺
Original assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2024-08-30
Also published as: WO2023138666A1

Abstract

本发明涉及一种含有内部核糖体进入位点(IRES)元件、蛋白质编码序列和poly A的环状RNA。本发明还涉及该前体RNA、载体以及制备该环状RNA的方法和使用该环状RNA的用途。

Description

环状RNA及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年1月19日提交的、名称为“Circular RNA and Use Thereof”的PCT专利申请PCT/CN2022/072823的优先权，该专利申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种环状RNA。

背景技术

信使RNA(mRNA)在生物系统中具有广泛的应用潜力。然而，其使用的一个根本限制是其在生物系统中相对较短的半衰期。最近，人们发现环状RNA(circular RNA)(circRNA)在蛋白质表达持续时间上比传统的线性mRNA更优越。环状RNA缺乏核酸外切酶介导的降解所需的游离末端，这使得它们能够抵抗多种RNA降解机制，并且与线性mRNA对应物相比，它们的寿命更长。最近，基于重组的第1类催化内含子的系统已被用于体外环化各种RNA序列，其环化效率据报道几乎达到100％。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种环状RNA，其依次包含内部核糖体进入位点(IRES)元件、蛋白质编码序列和poly A。

在一些实施方案中，所述蛋白质用于治疗用途。

在一些实施方案中，所述蛋白质是抗原、抗体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)；优选地，所述抗体是scFv。

在一些实施方案中，所述CAR的结合结构域是抗间皮素scFv。

在一些实施方案中，所述蛋白质包含抗体或包含该抗体作为结合结构域的CAR，其中该抗体特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40，例如本发明中提供和描述的那些抗体和CAR。

在一些实施方案中，该蛋白质包含如本发明所述的LACOSTIM，或包含第一蛋白质和第二蛋白质，其中第一蛋白质包含如本发明所述的抗体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，第二蛋白质包含如本发明所述的LACOSTIM。

在一些实施方案中，LACOSTIM包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中(i)第一结构域包含(a)结合APC激活受体的配体或其受体结合片段，(b)与APC的激活受体结合的抗体，或其抗原结合片段；(ii)第二结构域包含(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段，(c)与免疫效应细胞的共刺激受体结合的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，第一结构域与第二结构域的N末端或C末端连接。在一些实施例中，第一结构域和第二结构域通过连接子连接。

在一些实施方案中，polyA的长度至少为45个核苷酸。

在一些实施方案中，polyA的长度至少为70个核苷酸。

本发明的另一方面提供了一种用于产生上述任一种环状RNA的前体RNA，上述任一种前体RNA包含环化元件、内部核糖体进入位点(IRES)元件、蛋白质编码序列和poly A。

在一些实施方案中，环化元件包含内部核糖体进入位点(IRES)元件5′上的第一内含子序列和poly A 3′上的第二内含子序列。

在一些实施方案中，第一内含子序列和第二内含子序列源自I类或II类内含子自剪接序列。

在一些实施方案中，所述第一内含子元件包含含有3′剪接位点二核苷酸的3′I类内含子片段，第二内含子元件包含含有5′剪接位点二核苷酸的5′I类内含子片段。

在一些实施方案中，所述前体RNA进一步包含第一内含子元件和内部核糖体进入位点(IRES)元件之间的5′间隔序列，以及poly A和第二内含子元件之间的3′间隔序列。

在一些实施方案中，所述前体RNA进一步包含第一内含子元件外部的5′同源臂和第二内含子元件外部的3′同源臂。

本发明的另一方面提供了用于制备上述任一种前体RNA的载体，其中所述载体包含所述前体RNA的DNA模板。

在一些实施方案中，载体还包含RNA聚合酶启动子。

本发明的另一个方面提供了制备环状RNA的方法，该方法包括环化上述任一种前体RNA以制备环状RNA。

在一些实施方案中，该方法包括转录包含上述任一种前体RNA的DNA模板的载体，以获得环化前的前体RNA。

在一些实施方案中，转录步骤在细胞或无细胞系统中进行。

在一些实施方案中，该方法还包括纯化环状RNA。

在一些实施方案中，环状RNA通过基于oligo dT的捕获来纯化。

本发明的另一个方面提供了包含任意一种上述环状RNA的细胞或细胞群。

在一些实施方案中，所述细胞或细胞群包含第一环状RNA和第二环状RNA，其中第一环状RNA的蛋白质编码序列编码如本发明所述的抗体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其中第二环状RNA的蛋白质编码序列编码如本发明所述的LACOSTIM。本发明的另一方面提供了一种在细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括将上述任一种环状RNA、任一种前体RNA或任一种载体导入至宿主细胞中，并表达由环状RNA中的蛋白质编码序列编码的蛋白质。

本发明的另一个方面提供了一种制备蛋白质的方法，该方法包括：

(a)翻译上述任一环状RNA以产生由该环状RNA的蛋白质编码序列编码的蛋白质；和

(b)纯化该蛋白质。

在一些实施方案中，翻译步骤在细胞或无细胞系统中进行。

在一些实施方案中，步骤(a)包括将上述任一环状RNA、上述任一前体RNA或上述任一载体导入宿主细胞中，并在宿主细胞中翻译所述环状RNA以产生所述蛋白质。

本发明的另一个方面提供了药物组合物，其包含：

(a)上述任一环状RNA、上述任一前体RNA、上述任一载体或上述任一细胞或细胞群；和

(b)一种药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面提供了一种组合物，其包含：

(a)上述任一环状RNA、上述任一前体RNA、上述任一载体；和

(b)一种递送载体。

本发明的另一方面提供了一种纯化上述任一环状RNA的方法，该方法包括通过基于oligo dT的捕获来纯化环状RNA。

本发明的另一个方面提供了一种治疗需要治疗的受试者疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的上述任一环状RNA、上述任一前体RNA、上述任一载体或上述任一细胞或细胞群。

在一些实施方案中，所述疾病是肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，所述癌症表达间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2或B7H3。

在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤或血液癌。

在一些实施方案中，所述癌症是急性髓性白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)或母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食道癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺癌或神经胶质瘤。

本发明的另一个方面提供了上述任意一种环状RNA、上述任意一种前体RNA、上述任意一种载体或上述任意一种细胞或细胞群在制备用于治疗需要治疗的受试者疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，该疾病是肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，癌症表达间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2或B7H3。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液癌。

在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)或母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食道癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈癌，肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺癌或神经胶质瘤。

在本发明中，我们将poly A序列引入环状RNA分子中。含有poly A序列的环状RNA可以通过oligo dT树脂进行高效、可行的纯化，得到高纯度的产品。相比没有poly A序列的环状RNA，带有poly A序列的环状RNA在提高蛋白表达水平和生物功能方面表现出明显优势。

附图简要说明

图1显示M12.BBZ线性mRNA(源自pDA-M12.BBZ CAR质粒的体外转录(IVT))、M12.BBZ环状RNA(源自pCA-M12.BBZ CAR质粒的IVT)、M12.BBZ-45A环状RNA(源自pCA45-M12.BBZ CAR质粒的IVT)和M12.BBZ-70A环状RNA(源自pCA70-M12.BBZ CAR质粒的IVT)。

图2为CIMmultus Oligo-dT柱纯化M12.BBZ-45A 环状RNA的过程图(s3代表流通样品，s4代表柱洗样品，s5代表环状RNA洗脱样品)。

图3为CIMmultus Oligo-dT柱纯化M12.BBZ-45A 环状RNA过程中收集的不同样品条带的琼脂糖凝胶图片；其中s3代表流通样品，s4代表柱洗样品，s5代表M12.BBZ-45A环状RNA洗脱样品。

图4为CIMmultus Oligo-dT柱纯化M12.BBZ-70A环状RNA的过程图(s3代表流通样品，s4代表环状RNA洗脱样品)。

图5为CIMmultus Oligo-dT柱纯化M12.BBZ-70A环状RNA过程中收集的不同样品条带的琼脂糖凝胶图片；其中s3代表流通样品，s4代表M12.BBZ-70A 环状RNA洗脱样品。

图6是通过oligo-dT柱纯化的环状RNA的最终收率的统计分析。

图7显示T细胞分别用M12.BBZ CAR线性mRNA、M12.BBZ CAR环状RNA、M12.BBZ CAR-70A环状RNA电穿孔24小时后，间皮素-Fc重组蛋白质的FACS染色和平均荧光指数(MFI)分析。这些结果表明，将poly A序列引入环状RNA中可以提高M12.BBZ的蛋白质表达水平。

图8显示T细胞分别用M12.BBZ CAR线性mRNA、M12.BBZ CAR环状RNA、M12.BBZ CAR-70A环状RNA电穿孔48小时后，间皮素-Fc重组蛋白质的FACS染色和平均荧光指数(MFI)分析。这些结果表明，将poly A序列引入环状RNA中可以提高M12.BBZ的蛋白质表达水平。

图9显示了用M12.BBZ CAR线性mRNA、M12.BBZ CAR环状RNA、M12.BBZ CAR-70A环状RNA电穿孔的CAR-T细胞对A549细胞(E/T比＝3:1)的杀伤曲线，其中A549细胞电转了5μgMSLN mRNA。这些结果表明，带有70A的M12.BBZ环状RNA的杀伤效果优于不含poly A的M12.BBZ环状RNA。

图10显示pDA抗meso CAR-M12质粒(即pDA-M12.BBZ CAR质粒)的示意图。

图11显示pCA-M12.BBZ CAR质粒的示意图。

图12显示pCA45-M12.BBZ CAR质粒的示意图。

图13显示pCA70-M12.BBZ CAR质粒的示意图。

图14A-14B显示用BCMA或FMC63.BBZ CAR线性mRNA、环状RNA、70A环状RNA的CAR-T细胞的杀伤曲线。

图15A-15C显示用M12、BCMA或FMC63.BBZ CAR线性mRNA、环状RNA、70A-环状RNA电穿孔的表达或不表达LACOSTIM的CAR-T细胞的杀伤曲线。

图16A-16C提供了抗人间皮素(或BCMA和CD123)-Fc单克隆噬菌体ELISA的两个96孔板的读数。

图17A-17B提供了用CD19-Fc(图17A)或BCMA-Fc(图17B)染色的抗BCMA CAR-T细胞的流式细胞术数据。

图18提供了用于CAR mRNA产生的pDA-CAR载体的示例性示意图。

图19提供了FACS染色结果，显示在CART细胞中表达的抗间皮素scFv与间皮素-Fc蛋白的结合。

图20A提供了不同量间皮素mRNA电穿孔的A549细胞的抗间皮素抗体的FACS染色。

图20B提供了不同量间皮素mRNA电穿孔的A549细胞的抗间皮素抗体的流式细胞术。

图21提供了不同的基于mRNA的间皮素CART细胞在E/T＝10:1时针对A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

图22提供了不同的基于mRNA的间皮素CART细胞在E/T＝10:1时针对A549-GFP肿瘤细胞(用10μg间皮素mRNA电穿孔)的杀伤曲线。

图23A提供了不同的基于mRNA的间皮素CART细胞在E/T＝10:1时针对A549-GFP肿瘤细胞(用2μg间皮素mRNA电穿孔)的杀伤曲线。

图23B提供了不同的基于mRNA的间皮素CART细胞在E/T＝10:1或3：1时针对A549-GFP肿瘤细胞(用0μg、2μg或10μg间皮素mRNA电穿孔)第二轮筛选的杀伤曲线。

图23C提供了不同的基于mRNA的间皮素CART细胞在E/T比＝10:1时针对A549-GFP肿瘤细胞(用0μg、2μg或10μg间皮素mRNA电穿孔)的杀伤曲线。

图24提供了OVCAR3、H226、ASPC1、A549和HCC70与同种型对照和抗间皮素单克隆抗体的FACS染色。

图25A提供了用特定的BCMA CAR转导的T细胞的CAR+细胞的频率。

图25B提供了用特定的BCMA CAR转导的T细胞中CAR表达的平均荧光强度(“MFI”)。

图26提供了用特定的BCMA CAR转导的T细胞的CAR+CD8细胞的频率。

图27提供了特定CART细胞的表型特征，通过CCR7表达和CD45RO表达进行表征。

图28提供了显示CART细胞中表达的抗CD123 scFv与CD123-Fc蛋白质结合的FACS染色结果。

图29提供了用不同量的CD123 mRNA电穿孔的A549细胞与同种型和抗CD123抗体的FACS染色。

图30提供了不同的基于mRNA的CD123 CART细胞在E/T＝10:1时针对A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

图31提供了不同的基于mRNA的抗CD123 CART细胞在E/T＝3:1时针对A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

图32提供了不同的基于mRNA的抗CD123 CART细胞针对A549-GFP肿瘤细胞(用10μgCD123 mRNA电穿孔)的杀伤曲线，E/T＝10:1。

图33提供了不同的基于mRNA的抗CD123 CART细胞针对A549-GFP肿瘤细胞(用10μgCD123 mRNA电穿孔)的杀伤曲线，E/T＝3:1。

图34A-34C提供了慢病毒载体构建图(A)和用该载体转导的T细胞的CAR表达(B)。与MSLNCAR和LACOSTIM T细胞共培养的细胞因子产生(C)。慢病毒载体转导的T细胞与PC3共培养24小时，其中，PC3转入0.5μg MSLN RNA(PC3+Meso 0.5μg)或PC3转入10μg MSLN(PC3+Meso 10μg)(上图)，或MSLN阳性肿瘤细胞OVCAR3、H226或MSLN阴性肿瘤细胞A549(下图)，收集上清液用于细胞因子IFNg或IL-2的ELISA 检测。

图35提供了不同的基于mRNA 的抗间皮素CAR-T细胞的CD107a染色，包括mock T细胞(未电转)、具有LACO(A40C28)的T细胞、抗间皮素M12+/-A40C28CAR-T细胞和M32+/-A40C28 CAR-T细胞，与OVCAR3、H226、ASPC1、A549和HCC70肿瘤细胞系进行共培养和杀伤测定。

图36提供了不同的基于mRNA的抗间皮素CAR-T细胞针对A549-GFP肿瘤细胞(0、0.5μg或10μg间皮素mRNA电穿孔，E/T＝3:1)的杀伤曲线，CAR-T细胞包括mock T细胞(未电转)、具有A40C28的T细胞、抗间皮素M12+/-A40C28 CAR-T细胞和M32+/-A40C28 CAR-T细胞。

图37提供了基于慢病毒的抗间皮素CAR-T细胞针对H226、OVCAR3和MOLM14细胞(0或10μg间皮素mRNA，E/T＝2:1)的杀伤曲线，细胞包括mock T细胞(UTD，未转导)和抗间皮素M12+/-A40C28 CAR-T细胞。

图38提供了不同的基于mRNA的抗间皮素CAR-T细胞针对A549-GFP肿瘤细胞(用0或2μg间皮素mRNA进行电穿孔，E/T＝10:1)的杀伤曲线，CAR-T细胞包括mock T细胞(未电转)、抗间皮素M12+/-1412-4D11 CAR-T细胞和M32+/-1412-4D11 CAR-T细胞。

图39提供了慢病毒转导的T细胞针对MSLN阴性肿瘤PC3、MOLM14的裂解活性。

图40提供了OVCAR3、H226、ASPC1、A549、HCC70、786-O和Jeko1细胞与同种型对照、抗间皮素单克隆抗体和抗CD40单克隆抗体的FACS染色。

图41提供了不同的基于mRNA的抗间皮素CAR-T细胞的CD107a染色，细胞包括mockT细胞(未电转)、仅具有A40C28的T细胞、仅具有1412-4D11的T细胞、抗间皮素M12+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞和M32+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞，上述细胞与OVCAR3、H226、ASPC1、A549、HCC70、786-O和Jeko1肿瘤细胞系进行共培养和杀伤测定。

图42提供了不同的基于mRNA的抗间皮素CAR-T细胞的杀伤曲线，细胞包括mock T细胞(未电转)、抗间皮素M12+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞和M32+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞，与OVCAR3-GFP，H226-GFP和ASPC1肿瘤细胞系共培养，E/T＝3:1。

图43提供了CART杀伤实验中，IFN-γ和IL2释放的ELISA测定结果。不同的基于mRNA的抗间皮素CAR-T细胞，包括mock T细胞(未电转)、抗间皮素M12+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞和M32+/-A40C28或1412-4D11 CAR-T细胞，与OVCAR3-GFP、H226-GFP和ASPC1肿瘤细胞以E/T比＝1:1共培养。

图44A-44B提供了不同肿瘤细胞系的MSLN和CD40表达(A)。如图所示，用一组表达不同水平MLSN的肿瘤细胞系刺激后，慢病毒转导T细胞的CD137表达(B)。

图45A-45D提供了A40C28-M12 LVV CART在H226异种移植NOG肿瘤模式中的抗肿瘤功效。H226异种移植NSG肿瘤模型中CART治疗的时间线(A)。通过使用流式细胞术分析测量表面CAR(用MSLN-Fc染色)和LACOSTIM(用CD40-Fc染色)表达水平，观察慢病毒转导T细胞的UTD、M12、CAR或LACOSTIM表达(B)。NSG小鼠被植入5E6个H226-CBG细胞，11天后用1E6或5E6个CAR阳性T细胞(M12、A40C28-M12)或未转导的T细胞(UTD)或仅转导A40C28的T细胞(A40C28)作为对照。如图所示，在输注后的多个时间点测量肿瘤大小(C)和生物发光(BLI)(D)。

图46A-46C提供了A40C28-M12处理的H226异种移植物模型中的TIL分析。在RPIM1640中用1mg/ml胶原酶和30U/ml DNase I进行酶消化，在37℃下旋转1.5小时来分离TIL(A)。多重免疫组织化学(mIHC)的示意图(B)。采用多重免疫组织化学(mIHC)检测肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、颗粒酶B+T细胞和MSLN+靶细胞的分布(C)。

图47A-47B提供了肿瘤系中BCMA的表达。图47A提供了FACS结果。图47B提供了与A549细胞相比的相对表达水平。

图48A-48B提供了CART细胞产生的INF-γ和IL-2的ELISA结果。图48A显示了INF-γ分泌。图48B显示IL-2分泌。

图49A-49D提供肿瘤杀伤结果，其显示特定CART细胞在不同E(T细胞):T(肿瘤细胞)比率下针对Jeko-1细胞的细胞溶解活性。图49A：E:T＝0.1:1；图49B：E:T＝0.5:1；图49C：E:T＝2:1；图49D：E:T＝2:1(放大图)。

图50A-50E提供肿瘤杀伤结果，其显示特定CART细胞针对RPMI-8226细胞的细胞溶解活性。图50A：E:T＝0.1:1；图50B：E:T＝0.5:1；图50C：E:T＝0.5:1(放大图)；图50D：E:T＝2:1；图50D：E:T＝2:1(放大图)。

图51A-51B提供了T细胞中CAR和LACO的表达水平的FACS结果(图51A)以及CAR的MFI(图51B)。

图52A-52B提供了培养期间CART细胞的数量(图52A)和尺寸(图52B)。

图53A-53B提供了与一组肿瘤细胞共培养后T细胞产生细胞因子的ELISA结果。图53A显示IL-2产生。图53B显示INF-γ产生。

图54A-54C提供了BCMA31、LACO-BCMA31、BCMA31-LACO和B38MCART细胞对Jeko-1肿瘤细胞杀伤作用的体内动物实验结果比较。图54A显示了Jeko-1肿瘤的生物发光成像。图54B显示了生物发光的平均辐射亮度。图54C显示小鼠的存活率。

图55提供了mRNA电穿孔后T细胞中CAR和LACO表达水平的FACS结果。

图56提供了与不同肿瘤细胞共培养后特定CART细胞中CD107a的表达。

图57A-57D提供了特定CART细胞针对不同肿瘤细胞的细胞毒性T细胞活性的Incucyte活细胞分析结果。图57A：Nalm6细胞；图57B：Jeko-1细胞；图57C：RPMI-8226细胞；图57D：Raji细胞。

图58显示了用PE同种型对照和PE-抗CD123单克隆抗体对A549、SK-OV3、Jeko-1、Molm-14、SupT-1、293T、Nalm-6和PC-3细胞的FACS染色。

图59显示了抗CD123-C5、抗CD123-C7、抗CD123-C11 CART细胞与不同肿瘤细胞系共培养后，进行杀伤测定中的CD107a染色。

图60提供了具有或不具有LACO(A40C.CD28)的不同的基于mRNA的抗CD123 CART细胞在E/T比＝10:1下针对MOLM-14、NALM6或JEKO-1肿瘤细胞的杀伤曲线。

图61提供了具有或不具有LACO(A40C.CD28)的不同的基于mRNA的抗CD123 CART细胞在E/T＝30：1下针对A549肿瘤细胞的杀伤曲线，所述A549肿瘤细胞用10μg、0.1μg或0CD123 mRNA电穿孔。

图62提供了具有或不具有LACO的不同CD123 CAR电穿孔的T细胞的IFN-γ分泌ELISA结果。

图63提供了抗人CD40-Fc单克隆噬菌体ELISA的五个代表性96孔板的结果。菌落18#、37#、38#、45#、47#和52#产生了被标记为40-18、40-37、40-38、40-45、40-47和40-52的scFv，这些被选择进行进一步研究。

图64提供了显示CAR-T细胞中表达的抗CD40 scFv与CD40-Fc蛋白质结合的FACS染色结果。

图65提供了不同的基于mRNA的CD40 scFv+抗Her2 CART细胞在不同E/T比下针对A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

图66A-66C提供了CART细胞在与A549细胞(图66A)、PC-3(图66B)和SK-OV3(图66C)的共培养和杀伤测定中的CD107a染色。

详细描述

应当理解，本发明不限于本文描述的特定实施例。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。本文提到的所有出版物都将公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

当提供具有一个或两个极限的数值范围时，应理解的是，在该规定范围内的任何规定中间值与该规定范围的任一极限之间的较小范围涵盖在本发明内。当所述范围包括一个或两个极限时，排除任一或两个极限的范围也包括在本发明中。

术语

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。

还应当注意的是，权利要求可被起草为排除任何可选元素。因此，该声明旨在作为使用“仅”、“唯一”等排他性术语或使用“否定”限定词来描述权利要求要素的先行依据。

除非另有说明，“包括(comprise)”、“包含(include)”、“含有(contain)”以及这些术语的变体(如comprising、comprises和comprised)并不意在排除进一步的成员、组件、成分或步骤。这些术语还包含“由...组成”或“由...组成”的含义。术语“由...组成”或“由...构成”是术语“包括”的特定实施例，其中排除任何其他未声明的成员、组件、成分或步骤。

术语“约”是指等于特定值加或减百分之十(+/-10％)的范围。

术语“和/或”指的是由该术语连接的任何一个、多个或全部元素。

如本文所用，术语“环状RNA(circRNA)”、“环状RNA(circular RNA)”或“cRNA”是指通过共价键形成环状结构的RNA分子。

如本文所用，术语“内部核糖体进入位点(IRES)”是指能够在不存在典型RNA帽结构的情况下启动多肽翻译的RNA序列。

如本文所用，术语“载体”是指合成的(例如，使用PCR))或取自病毒、质粒或高等生物体的细胞的一段DNA，外源DNA片段可以进入其中或已经被插入，用于克隆和/或表达目的。载体可用于将核酸诱导进入细胞。载体可以稳定地维持在细胞或生物体中。载体可以包含例如复制起点、选择性标记或报告基因，例如抗生素抗性或荧光蛋白质基因，和/或多克隆位点(MCS)。术语“载体”包括线性载体或环状载体，例如线性DNA片段(例如PCR产物、线性化质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，等等。

如本文所用，术语“元件”指某事物的单独或不同部分，例如，在较长核酸序列内具有单独功能的核酸序列。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)，则启动子与编码序列可操作地连接。在本发明中，术语“可操作地连接”是指载体的元件被定位成使得它们可以转录形成前体RNA，前体RNA的元件被定位成使得它们可以随后被环化成环状RNA和/或环状RNA的元件的定位使得它们可以被翻译成蛋白质。

本文使用的术语“相邻”及其语法上的同义词是指紧邻参照对象。例如，在核苷酸序列的上下文中，术语“相邻”可以意指其间没有任何核苷酸，即，两个核苷酸序列之间不存在插入序列。

如本文所用，术语“序列同一性”是指当比对序列以最大化序列匹配时，即考虑间隙和插入，两个或更多个序列中相应位置处相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。序列的比对和序列同一性百分比的计算可以用本领域已知的合适的计算机程序进行。这样的程序包括但不限于BLAST、ALIGN、ClustalW、EMBOSS Needle等。局部比对程序的一个例子是BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，其可从National Center for BiotechnologyInformation的网页获得，目前可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov//上找到，该工具最先在Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215；403-410.中进行了描述。全局比对程序的示例(其优化序列全长的比对)包括基于Needleman-Wunsch算法的EMBOSS Needle和EMBOSSStretcher程序(Needleman,Saul B.；and Wunsch,Christian D.(1970),"A generalmethod applicable to the search for similarities in the氨基酸序列of twoproteins",Journal of Molecular Biology 48(3):443-53)，它们都可在http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/找到。

本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白质、抗原结合片段或其衍生物，能够特异性结合并识别抗原、其抗原片段或抗原的二聚体或多聚体。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。抗体的非限制性实例包括完整的免疫球蛋白质及其保留对抗原的结合亲和力的变体和片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；单域抗体(VHH)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过完整抗体的修饰产生的抗原结合片段或使用重组DNA方法从头合成的抗原结合片段(参见例如Kontermann and Dubel(Ed),Antibody Engineering,Vols.1-2,2^nd Ed.,Springer Press,2010)。

经典的全长抗体分子是由4条多肽链组成的免疫球蛋白质分子(例如IgG)或其多聚体(例如IgA或IgM)。4条多肽链包括两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)，它们通过二硫键连接形成四聚体。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(CH，包括结构域CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。重链和轻链恒定区(CH和CL)不直接参与抗体-抗原结合，但表现出多种效应功能，例如介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统(C1q)的第一组分。重链和轻链的可变区(VH和VL)形成抗原结合位点。VH和VL各自具有高度可变的区域，称为互补决定区(CDR),其氨基酸组成和序列排列具有高度可变性，这是抗体-抗原结合的关键位点，这些互补决定区夹杂在称为框架区(FR)的较为保守的序列中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羟基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，这三个重链互补决定区也可分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。四个重链框架区分别称为HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；三个轻链互补决定区也可分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，四个轻链框架区分别称为LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。重链和轻链的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。

如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。CDR的精确边界可以根据本领域已知的各种编号系统来定义，例如，根据Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991))、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia et al:878-883)或如IMGT编号系统中的定义(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地识别根据相应编号系统定义的CDR，并且不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Lefranc etal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。本发明的抗体可以利用这些编号系统中的任何一个来定义CDR，但优选使用Kabat编号系统来定义CDR。

术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指融合蛋白质，其包含能够结合抗原的胞外结构域(即，结合结构域)、跨膜结构域和包含源自信号转导蛋白质的一个或多个细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。这些胞内信号传导结构域通常不同于胞外结构域所源自的多肽。胞外结构域可以是能够特异性结合预定抗原的任何蛋白质分子或其片段。在一些实施方案中，胞外结构域包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域可以是已知传递信号功能的任何寡肽或多肽结构域，所述信号引起细胞中生物过程的激活或抑制，例如免疫细胞如T细胞或NK细胞的激活。细胞内信号传导结构域通常包括免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，例如源自CD3ζ分子的信号传导结构域，其负责激活免疫效应细胞并产生杀伤作用。或者，嵌合抗原受体还可以包括位于氨基末端的信号肽，其负责新生蛋白质的细胞内定位，以及胞外结构域和跨膜结构域之间的铰链区。胞内信号传导结构域还可以包括源自例如4-1BB或CD28分子的共刺激结构域。

术语“纯化(purify,purifying,purification)”通常是指分离目标物质(例如，化合物、多核苷酸、蛋白质或多肽)，使得该物质构成纯化产物的主要成分，例如大于或等于70％、大于或等于80％、大于或等于90％、大于或等于91％、大于或等于92％、大于或等于93％、大于或等于94％、大于或等于95％、大于或等于96％、大于或等于97％、大于或等于98％、大于或等于99％或100％的纯化产物。

如本文所使用的术语“转录(transcribe,transcribing,transcription)”意指使用DNA分子作为模板通过RNA聚合酶形成或合成RNA分子。可用于本发明的RNA聚合酶包括但不限于T7型RNA聚合酶。

如本文所使用的术语“翻译(translate,translating,translation)”意指核糖体基于RNA模板形成多肽分子。

如本文所使用的术语“治疗(treat,treating or treatment)”是指为疾病提供有益或期望的临床结果，例如消除疾病、减轻症状、减轻疾病的程度、稳定疾病，改善或减轻疾病的状态，或减缓疾病的进展。治疗结果的测量可以基于例如本领域已知的体检、病理学测试和/或诊断测试的结果。治疗还可能意味着与受试者未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。治疗还可以指与不采取措施时发生的情况相比，减少疾病的发生率或发作或其复发。临床上，这样的治疗也可以称为预防。

如本文所用，术语“药理学上可接受的载体”是指作为非活性成分包含在药物组合物中的任何载体，其允许药物组合物具有适合于施用的外观和性质。当给予受试者时，药理学上可接受的载体实质上不具有长期或永久的有害作用，例如稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂、赋形剂等。“药学上可接受的载体”应为药学上惰性的材料，基本上没有生物活性，并且构成配方的主要部分。

术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。如本文所用，术语“受试者”是指可施用本发明组合物活性剂的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔；非人类灵长类动物，如黑猩猩和其他猿类和猴种；以及人类)。受试者可以是哺乳动物，特别是人类，包括男性或女性，并且包括新生儿、婴儿、青少年、青少年、成人或老年人，还包括各种种族和民族。

本文所用的术语“治疗有效量”和“有效量”可以互换使用，并且是指在必要的剂量和时间段内有效，以实现期望的治疗结果。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望反应的能力等因素而变化。“有效量”可以指引起生物或化学活性可检测的变化的量。这些可检测的变化可以由本领域技术人员检测和/或进一步量化，以适用于相关的机制或过程。此外，“有效量”可以指维持期望的生理状态的量，即减少或防止病症的显着下降和/或促进病症的改善。

环状RNA、其制备和用途

人工构建的环状RNA(circRNA)可以表达蛋白质。此类环状RNA通常包含IRES和蛋白质编码序列。

在本发明中，我们将poly A序列引入环状RNA分子中。具有poly A序列的环状RNA可以通过oligo dT树脂有效且可行地纯化，并且具有高纯度。与不含Poly A序列的环状RNA相比，具有Poly A序列的环状RNA在提高蛋白质表达水平和生物学功能方面也具有优越性。

在一些实施方案中，本发明涉及环状RNA，所述环状RNA依次包括IRES元件、蛋白质编码序列和polyA。，即IRES元件位于蛋白质编码序列的5′，poly A位于蛋白质编码序列的3′。

IRES可能源自病毒。IRES的长度通常约为10个核苷酸(nt)至1000个核苷酸或更长，通常约为500个核苷酸至1000个核苷酸。在一些实施方案中，IRES序列是来自柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒A(CVB1/2)、脑心肌炎病毒(EMCV)、桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、泰勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1型、Rhopalosiphum padi病毒、网状内皮增生病毒、fuman脊髓灰质炎病毒1型、Plautia stali肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2型、Homalodisca coagulata病毒1型、人类免疫缺陷病毒1型、Homalodisca coagulata病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人类肠道病毒71型、马鼻炎病毒、Ectropis obliqua picorna样病毒、果蝇C病毒、十字花科多巴莫病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、黑色蜂王细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AMLURUNX1、Drosophila antennapedia、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAP1、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、唾液病毒、Cosavirus、Parechovirus、果蝇hairless，S.cerevisiae TFIID、S.cerevisiae YAP1、人c-src、人FGF-1、猿猴小核病毒、芜菁皱纹病毒、eIF4G适配体。在一些实施方案中，IRES是柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列。

所述蛋白质编码序列可以编码一种或多种蛋白质。蛋白质编码序列可以编码真核或原核来源的蛋白质。蛋白质编码序列可以编码人类蛋白质或非人类蛋白质。蛋白质编码序列可以编码用于治疗用途的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是抗体、抗原、细胞因子、酶、荧光蛋白质、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或包含抗体、抗原、细胞因子、酶或荧光蛋白质的融合蛋白质。

如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发期望的生物学和/或药理学作用的任何蛋白质。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合肿瘤抗原(例如间皮素)的结合结构域。结合结构域可包含针对肿瘤抗原或肿瘤表面受体的抗体或配体。在一些实施方案中，肿瘤抗原或肿瘤表面受体可以是间皮素。在一些实施方案中，所述结合结构域可以包含例如抗间皮素scFv。在一些实施方案中，所述抗间皮素抗体的轻链可变区分别包含如SEQ IDNO：576-578所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，所述抗间皮素抗体的重链可变区分别包含如SEQ ID NO：579-581所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述抗间皮素抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:574所示的序列。在一些实施方案中，所述抗间皮素抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:575所示的序列。在一些实施方案中，所述抗间皮素scFv包含如SEQ ID NO:598所示的序列。在一些实施方案中，所述CAR包含如SEQ IDNO:599所示的序列。

在一些实施方案中，由蛋白质编码序列编码的蛋白质包含抗体或包含该抗体作为结合结构域的CAR，其中该抗体特异性结合TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子1、CD33、表皮生长因子受体变体III、(EGFRvIII)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白质72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白质酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、受体酪氨酸-蛋白质激酶ERBB2(Her2/neu)、细胞表面相关粘蛋白质1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺素、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变(ELF2M)、肝配蛋白质B2、成纤维细胞激活蛋白质α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白质酶体(Prosome、Macropain)亚基Beta型9(LMP2)、糖蛋白质100(gplOO)、由断点簇区(BCR)和阿贝尔森鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因多肽((bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白质A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白质偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、X染色体开放阅读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、盘特异性蛋白质1(PLAC1)、GloboH糖脂(glycoceramide)的六糖部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿斑蛋白质2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、潘联蛋白质(pannexin)3(PANX3)、G蛋白质偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、TCRγ交替读码框蛋白质(TARP)、肾母细胞瘤蛋白质(WT1)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、ETS易位变异基因6，位于12p染色体上(ETV6-AML)、精子蛋白质17(SPA 17)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑色素瘤癌睾丸抗原2(MAD-CT-2)、Fos相关抗原1、肿瘤蛋白质p53(p53)、p53突变体、前列腺素、生存素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1、T细胞识别的黑色素瘤抗原1、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断点、黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白质酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)、配对盒蛋白质Pax3(PAX3)、雄激素受体(Androgen receptor)、细胞周期蛋白质Bl(CyclinBl)、小鸡髓样细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)、Ras同源家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白质2(TRP2)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白质)样，鳞状细胞癌抗原被T细胞识别3(SART3)、配对盒蛋白质Pax5(PAX5)、前顶体结合蛋白质sp32(OYTES1)、淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白质4(AKAP4)、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、高级糖基化终产物受体(RAGE1)、肾脏广泛表达蛋白质1(RU1)、肾脏广泛表达蛋白质2(RU2)、刀豆蛋白质(Legumain)、人乳头瘤病毒E6(HPVE6)、人乳头瘤病毒E7(HPVE7)、肠羧酸酯酶(Intestinalcarboxylesterase)、热休克蛋白质70-2突变体(muthsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白质样受体1(LAIR1)、IgAFc受体片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白质样受体A亚家族成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白质样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、硫酸乙酰肝素蛋白质聚糖3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)和免疫球蛋白质lambda样多肽1(IGLL1)。

在一些实施方案中，抗体特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40。在一些实施方案中，抗体是scFv。在一些实施方案中，scFv包含融合至轻链可变区(VL)的N端或C端的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，氨基酸接头可以位于scFv的VH和VL之间。

在一些实施方案中，抗体特异性结合间皮素，间皮素也称为抗间皮素(或抗MESO或抗MSLN)抗体，是PCT/CN2021/112855(其通过引用整体并入本文)中描述的抗体，包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自下组：

(1)如SEQ ID NO:1所示的LCDR1、如SEQ ID NO:16所示的LCDR2、如SEQ ID NO:30所示的LCDR3、如SEQ ID NO:45所示的HCDR1、如SEQ ID NO:58所示的HCDR2和如SEQ ID NO:71所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:2所示的LCDR1、如SEQ ID NO:17所示的LCDR2、如SEQ ID NO:31所示的LCDR3、如SEQ ID NO:46所示的HCDR1、如SEQ ID NO:59所示的HCDR2和如SEQ ID NO:72所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:3所示的LCDR1、如SEQ ID NO:18所示的LCDR2、如SEQ ID NO:32所示的LCDR3、如SEQ ID NO:47所示的HCDR1、如SEQ ID NO:60所示的HCDR2和如SEQ ID NO:73所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:19所示的LCDR2、如SEQ ID NO:33所示的LCDR3、如SEQ ID NO:48所示的HCDR1、如SEQ ID NO:61所示的HCDR2和如SEQ ID NO:74所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:5所示的LCDR1、如SEQ ID NO:20所示的LCDR2、如SEQ ID NO:34所示的LCDR3、如SEQ ID NO:49所示的HCDR1、如SEQ ID NO:62所示的HCDR2和如SEQ ID NO:75所示的HCDR3；

(6)如SEQ ID NO:6所示的LCDR1、如SEQ ID NO:21所示的LCDR2、如SEQ ID NO:35所示的LCDR3、如SEQ ID NO:50所示的HCDR1、如SEQ ID NO:63所示的HCDR2和如SEQ ID NO:76所示的HCDR3；

(7)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1、如SEQ ID NO:22所示的LCDR2、如SEQ ID NO:36所示的LCDR3、如SEQ ID NO:51所示的HCDR1、如SEQ ID NO:64所示的HCDR2和如SEQ ID NO:77所示的HCDR3；

(8)如SEQ ID NO:8所示的LCDR1、如SEQ ID NO:23所示的LCDR2、如SEQ ID NO:37所示的LCDR3、如SEQ ID NO:52所示的HCDR1、如SEQ ID NO:65所示的HCDR2和如SEQ ID NO:78所示的HCDR3；

(9)如SEQ ID NO:9所示的LCDR1、如SEQ ID NO:24所示的LCDR2、如SEQ ID NO:38所示的LCDR3、如SEQ ID NO:53所示的HCDR1、如SEQ ID NO:66所示的HCDR2和如SEQ ID NO:79所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:10所示的LCDR1、如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、如SEQ ID NO:39所示的LCDR3、如SEQ ID NO:48所示的HCDR1、如SEQ ID NO:61所示的HCDR2和如SEQ IDNO:80所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:11所示的LCDR1、如SEQ ID NO:26所示的LCDR2、如SEQ ID NO:40所示的LCDR3、如SEQ ID NO:54所示的HCDR1、如SEQ ID NO:67所示的HCDR2和如SEQ IDNO:81所示的HCDR3；

(12)如SEQ ID NO:12所示的LCDR1、如SEQ ID NO:27所示的LCDR2、如SEQ ID NO:41所示的LCDR3、如SEQ ID NO:53所示的HCDR1、如SEQ ID NO:66所示的HCDR2和如SEQ IDNO:82所示的HCDR3；

(13)如SEQ ID NO:13所示的LCDR1、如SEQ ID NO:28所示的LCDR2、如SEQ ID NO:42所示的LCDR3、如SEQ ID NO:55所示的HCDR1、如SEQ ID NO:68所示的HCDR2和如SEQ IDNO:83所示的HCDR3；

(14)如SEQ ID NO:14所示的LCDR1、如SEQ ID NO:29所示的LCDR2、如SEQ ID NO:43所示的LCDR3、如SEQ ID NO:56所示的HCDR1、如SEQ ID NO:69所示的HCDR2和如SEQ IDNO:84所示的HCDR3；和

(15)如SEQ ID NO:15所示的LCDR1、如SEQ ID NO:18所示的LCDR2、如SEQ ID NO:44所示的LCDR3、如SEQ ID NO:57所示的HCDR1、如SEQ ID NO:70所示的HCDR2和如SEQ IDNO:85所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗MESO抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

(1)如SEQ ID NO:86所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:101所示的重链可变区；

(2)如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:102所示的重链可变区；

(3)如SEQ ID NO:88所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:103所示的重链可变区；

(4)如SEQ ID NO:89所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:104所示的重链可变区；

(5)如SEQ ID NO:90所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:105所示的重链可变区；

(6)如SEQ ID NO:91所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:106所示的重链可变区；

(7)如SEQ ID NO:92所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:107所示的重链可变区；

(8)如SEQ ID NO:93所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:108所示的重链可变区；

(9)如SEQ ID NO:94所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:109所示的重链可变区；

(10)如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:100所示的重链可变区；

(11)如SEQ ID NO:96所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:111所示的重链可变区；

(12)如SEQ ID NO:97所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:112所示的重链可变区；

(13)如SEQ ID NO:98所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:113所示的重链可变区；

(14)如SEQ ID NO:99所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:114所示的重链可变区；和

(15)如SEQ ID NO:100所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:115所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗MESO抗体是抗MESO scFv，其可以包含选自SEQ ID NO：116-130的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合CD123，也称为抗CD123抗体，是PCT/CN2021/112814中描述的抗体(其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDRl、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自下组：

(1)如SEQ ID NO:263所示的LCDR1、如SEQ ID NO:293所示的LCDR2、如SEQ ID NO:321所示的LCDR3、如SEQ ID NO:351所示的HCDR1、如SEQ ID NO:372所示的HCDR2和如SEQID NO:396所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:277所示的LCDR1、如SEQ ID NO:305所示的LCDR2、如SEQ ID NO:335所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:382所示的HCDR2和如SEQID NO:409所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:267所示的LCDR1、如SEQ ID NO:297所示的LCDR2、如SEQ ID NO:326所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQID NO:400所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:278所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ ID NO:336所示的LCDR3、如SEQ ID NO:360所示的HCDR1、如SEQ ID NO:383所示的HCDR2和如SEQID NO:410所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:283所示的LCDR1、如SEQ ID NO:310所示的LCDR2、如SEQ ID NO:342所示的LCDR3、如SEQ ID NO:359所示的HCDR1、如SEQ ID NO:389所示的HCDR2和如SEQID NO:417所示的HCDR3；

(6)如SEQ ID NO:284所示的LCDR1、如SEQ ID NO:311所示的LCDR2、如SEQ ID NO:343所示的LCDR3、如SEQ ID NO:366所示的HCDR1、如SEQ ID NO:388所示的HCDR2和如SEQID NO:418所示的HCDR3；

(7)如SEQ ID NO:268所示的LCDR1、如SEQ ID NO:298所示的LCDR2、如SEQ ID NO:327所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ ID NO:377所示的HCDR2和如SEQID NO:401所示的HCDR3；

(8)如SEQ ID NO:264所示的LCDR1、如SEQ ID NO:294所示的LCDR2、如SEQ ID NO:322所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQID NO:394所示的HCDR3；

(9)如SEQ ID NO:285所示的LCDR1、如SEQ ID NO:312所示的LCDR2、如SEQ ID NO:344所示的LCDR3、如SEQ ID NO:367所示的HCDR1、如SEQ ID NO:390所示的HCDR2和如SEQID NO:419所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:286所示的LCDR1、如SEQ ID NO:313所示的LCDR2、如SEQ IDNO:345所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ ID NO:420所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:262所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ IDNO:320所示的LCDR3、如SEQ ID NO:350所示的HCDR1、如SEQ ID NO:371所示的HCDR2和如SEQ ID NO:395所示的HCDR3；

(12)如SEQ ID NO:277所示的LCDR1、如SEQ ID NO:306所示的LCDR2、如SEQ IDNO:337所示的LCDR3、如SEQ ID NO:361所示的HCDR1、如SEQ ID NO:384所示的HCDR2和如SEQ ID NO:411所示的HCDR3；

(13)如SEQ ID NO:287所示的LCDR1、如SEQ ID NO:314所示的LCDR2、如SEQ IDNO:346所示的LCDR3、如SEQ ID NO:365所示的HCDR1、如SEQ ID NO:391所示的HCDR2和如SEQ ID NO:421所示的HCDR3；

(14)如SEQ ID NO:269所示的LCDR1、如SEQ ID NO:299所示的LCDR2、如SEQ IDNO:328所示的LCDR3、如SEQ ID NO:357所示的HCDR1、如SEQ ID NO:378所示的HCDR2和如SEQ ID NO:402所示的HCDR3；

(15)如SEQ ID NO:270所示的LCDR1、如SEQ ID NO:300所示的LCDR2、如SEQ IDNO:329所示的LCDR3、如SEQ ID NO:358所示的HCDR1、如SEQ ID NO:379所示的HCDR2和如SEQ ID NO:403所示的HCDR3；

(16)如SEQ ID NO:282所示的LCDR1、如SEQ ID NO:309所示的LCDR2、如SEQ IDNO:341所示的LCDR3、如SEQ ID NO:365所示的HCDR1、如SEQ ID NO:388所示的HCDR2和如SEQ ID NO:416所示的HCDR3；

(17)如SEQ ID NO:265所示的LCDR1、如SEQ ID NO:295所示的LCDR2、如SEQ IDNO:323所示的LCDR3、如SEQ ID NO:352所示的HCDR1、如SEQ ID NO:373所示的HCDR2和如SEQ ID NO:397所示的HCDR3；

(18)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ IDNO:324所示的LCDR3、如SEQ ID NO:353所示的HCDR1、如SEQ ID NO:374所示的HCDR2和如SEQ ID NO:398所示的HCDR3；

(19)如SEQ ID NO:271所示的LCDR1、如SEQ ID NO:301所示的LCDR2、如SEQ IDNO:330所示的LCDR3、如SEQ ID NO:351所示的HCDR1、如SEQ ID NO:380所示的HCDR2和如SEQ ID NO:404所示的HCDR3；

(20)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:291所示的LCDR2、如SEQ IDNO:319所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ ID NO:394所示的HCDR3；

(21)如SEQ ID NO:279所示的LCDR1、如SEQ ID NO:307所示的LCDR2、如SEQ IDNO:338所示的LCDR3、如SEQ ID NO:362所示的HCDR1、如SEQ ID NO:385所示的HCDR2和如SEQ ID NO:412所示的HCDR3；

(22)如SEQ ID NO:288所示的LCDR1、如SEQ ID NO:315所示的LCDR2、如SEQ IDNO:347所示的LCDR3、如SEQ ID NO:368所示的HCDR1、如SEQ ID NO:392所示的HCDR2和如SEQ ID NO:422所示的HCDR3；

(23)如SEQ ID NO:272所示的LCDR1、如SEQ ID NO:299所示的LCDR2、如SEQ IDNO:331所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ ID NO:377所示的HCDR2和如SEQ ID NO:405所示的HCDR3；

(24)如SEQ ID NO:273所示的LCDR1、如SEQ ID NO:302所示的LCDR2、如SEQ IDNO:332所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ ID NO:406所示的HCDR3；

(25)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ IDNO:317所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ ID NO:394所示的HCDR3；

(26)如SEQ ID NO:280所示的LCDR1、如SEQ ID NO:308所示的LCDR2、如SEQ IDNO:339所示的LCDR3、如SEQ ID NO:363所示的HCDR1、如SEQ ID NO:386所示的HCDR2和如SEQ ID NO:413所示的HCDR3；

(27)如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、如SEQ ID NO:303所示的LCDR2、如SEQ IDNO:327所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ ID NO:377所示的HCDR2和如SEQ ID NO:401所示的HCDR3；

(28)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ IDNO:318所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ IDNO:370所示的HCDR2和如SEQID NO:394所示的HCDR3；

(29)如SEQ ID NO:262所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ IDNO:320所示的LCDR3、如SEQ ID NO:350所示的HCDR1、如SEQ ID NO:371所示的HCDR2和如SEQ ID NO:395所示的HCDR3；

(30)如SEQ ID NO:275所示的LCDR1、如SEQ ID NO:304所示的LCDR2、如SEQ IDNO:333所示的LCDR3、如SEQ ID NO:359所示的HCDR1、如SEQ ID NO:381所示的HCDR2和如SEQ ID NO:407所示的HCDR3；

(31)如SEQ ID NO:289所示的LCDR1、如SEQ ID NO:316所示的LCDR2、如SEQ IDNO:348所示的LCDR3、如SEQ ID NO:369所示的HCDR1、如SEQ ID NO:393所示的HCDR2和如SEQ ID NO:423所示的HCDR3；

(32)如SEQ ID NO:282所示的LCDR1、如SEQ ID NO:309所示的LCDR2、如SEQ IDNO:341所示的LCDR3、如SEQ ID NO:364所示的HCDR1、如SEQ ID NO:387所示的HCDR2和如SEQ ID NO:415所示的HCDR3；

(33)如SEQ ID NO:276所示的LCDR1、如SEQ ID NO:302所示的LCDR2、如SEQ IDNO:334所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ ID NO:408所示的HCDR3；

(34)如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、如SEQ ID NO:296所示的LCDR2、如SEQ IDNO:325所示的LCDR3、如SEQ ID NO:354所示的HCDR1、如SEQ ID NO:375所示的HCDR2和如SEQ ID NO:399所示的HCDR3；和

(35)如SEQ ID NO:281所示的LCDR1、如SEQ ID NO:305所示的LCDR2、如SEQ IDNO:340所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:382所示的HCDR2和如SEQ ID NO:414所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗CD123抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

(1)如SEQ ID NO:424所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:459所示的重链可变区；

(2)如SEQ ID NO:425所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:460所示的重链可变区；

(3)如SEQ ID NO:426所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:461所示的重链可变区；

(4)如SEQ ID NO:427所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:462所示的重链可变区；

(5)如SEQ ID NO:428所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:463所示的重链可变区；

(6)如SEQ ID NO:429所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:464所示的重链可变区；

(7)如SEQ ID NO:430所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:465所示的重链可变区；

(8)如SEQ ID NO:431所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:466所示的重链可变区；

(9)如SEQ ID NO:432所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:467所示的重链可变区；

(10)如SEQ ID NO:433所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:468所示的重链可变区；

(11)如SEQ ID NO:434所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:469所示的重链可变区；

(12)如SEQ ID NO:435所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:470所示的重链可变区；

(13)如SEQ ID NO:436所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:471所示的重链可变区；

(14)如SEQ ID NO:437所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:472所示的重链可变区；

(15)如SEQ ID NO:438所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:473所示的重链可变区；

(16)如SEQ ID NO:439所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:474所示的重链可变区；

(17)如SEQ ID NO:440所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:475所示的重链可变区；

(18)如SEQ ID NO:441所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:476所示的重链可变区；

(19)如SEQ ID NO:442所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:477所示的重链可变区；

(20)如SEQ ID NO:443所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:478所示的重链可变区；

(21)如SEQ ID NO:444所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:479所示的重链可变区；

(22)如SEQ ID NO:445所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:480所示的重链可变区；

(23)如SEQ ID NO:446所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:481所示的重链可变区；

(24)如SEQ ID NO:447所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:482所示的重链可变区；

(25)如SEQ ID NO:448所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:483所示的重链可变区；

(26)如SEQ ID NO:449所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:484所示的重链可变区；

(27)如SEQ ID NO:450所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:485所示的重链可变区；

(28)如SEQ ID NO:451所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:486所示的重链可变区；

(29)如SEQ ID NO:452所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:487所示的重链可变区；

(30)如SEQ ID NO:453所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:488所示的重链可变区；

(31)如SEQ ID NO:454所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:489所示的重链可变区；

(32)如SEQ ID NO:455所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:490所示的重链可变区；

(33)如SEQ ID NO:456所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:491所示的重链可变区；

(34)如SEQ ID NO:457所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:492所示的重链可变区；和

(35)如SEQ ID NO:458所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:493所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗CD123抗体是抗CD123 scFv，其可包含选自SEQ ID NO:497-531的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合BCMA，也称为抗BCMA抗体，是PCT/CN2021/112858中描述的抗体(其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自下组：

(1)如SEQ ID NO:146所示的LCDR1、如SEQ ID NO:156所示的LCDR2、如SEQ ID NO:167所示的LCDR3、如SEQ ID NO:178所示的HCDR1、如SEQ ID NO:189所示的HCDR2和如SEQID NO:201所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:157所示的LCDR2、如SEQ ID NO:168所示的LCDR3、如SEQ ID NO:179所示的HCDR1、如SEQ ID NO:190所示的HCDR2和如SEQID NO:202所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:148所示的LCDR1、如SEQ ID NO:158所示的LCDR2、如SEQ ID NO:169所示的LCDR3、如SEQ ID NO:180所示的HCDR1、如SEQ ID NO:191所示的HCDR2和如SEQID NO:203所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:149所示的LCDR1、如SEQ ID NO:159所示的LCDR2、如SEQ ID NO:169所示的LCDR3、如SEQ ID NO:181所示的HCDR1、如SEQ ID NO:192所示的HCDR2和如SEQID NO:204所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:150所示的LCDR1、如SEQ ID NO:160所示的LCDR2、如SEQ ID NO:170所示的LCDR3、如SEQ ID NO:182所示的HCDR1、如SEQ ID NO:193所示的HCDR2和如SEQID NO:205所示的HCDR3；

(6)如SEQ ID NO:151所示的LCDR1、如SEQ ID NO:161所示的LCDR2、如SEQ ID NO:171所示的LCDR3、如SEQ ID NO:183所示的HCDR1、如SEQ ID NO:194所示的HCDR2和如SEQID NO:206所示的HCDR3；

(7)如SEQ ID NO:152所示的LCDR1、如SEQ ID NO:162所示的LCDR2、如SEQ ID NO:172所示的LCDR3、如SEQ ID NO:180所示的HCDR1、如SEQ ID NO:195所示的HCDR2和如SEQID NO:207所示的HCDR3；

(8)如SEQ ID NO:153所示的LCDR1、如SEQ ID NO:163所示的LCDR2、如SEQ ID NO:173所示的LCDR3、如SEQ ID NO:184所示的HCDR1、如SEQ ID NO:196所示的HCDR2和如SEQID NO:208所示的HCDR3；

(9)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:164所示的LCDR2、如SEQ ID NO:174所示的LCDR3、如SEQ ID NO:185所示的HCDR1、如SEQ ID NO:197所示的HCDR2和如SEQID NO:209所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:165所示的LCDR2、如SEQ IDNO:175所示的LCDR3、如SEQ ID NO:186所示的HCDR1、如SEQ ID NO:198所示的HCDR2和如SEQ ID NO:210所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:154所示的LCDR1、如SEQ ID NO:166所示的LCDR2、如SEQ IDNO:176所示的LCDR3、如SEQ ID NO:187所示的HCDR1、如SEQ ID NO:199所示的HCDR2和如SEQ ID NO:211所示的HCDR3；和

(12)如SEQ ID NO:155所示的LCDR1、如SEQ ID NO:159所示的LCDR2、如SEQ IDNO:177所示的LCDR3、如SEQ ID NO:188所示的HCDR1、如SEQ ID NO:200所示的HCDR2和如SEQ ID NO:212所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗BCMA抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

(1)如SEQ ID NO:213所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:225所示的重链可变区；

(2)如SEQ ID NO:214所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:226所示的重链可变区；

(3)如SEQ ID NO:215所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:227所示的重链可变区；

(4)如SEQ ID NO:216所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:228所示的重链可变区；

(5)如SEQ ID NO:217所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:229所示的重链可变区；

(6)如SEQ ID NO:218所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:230所示的重链可变区；

(7)如SEQ ID NO:219所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:231所示的重链可变区；

(8)如SEQ ID NO:220所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:232所示的重链可变区；

(9)如SEQ ID NO:221所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:233所示的重链可变区；

(10)如SEQ ID NO:222所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:234所示的重链可变区；

(11)如SEQ ID NO:223所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:235所示的重链可变区；和

(12)如SEQ ID NO:224所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:236所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗BCMA抗体是抗BCMA scFv，其可包含选自SEQ ID NO:237-248的氨基酸序列。

在一些实施方案中，特异性结合CD19，也称为抗CD19抗体，是CN202210274255.1中描述的抗体(公布号为CN114349863A，其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1，HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是如SEQ ID NO:542所示的LCDR1，如SEQ ID NO:543所示的LCDR2，如SEQ ID NO:544所示的LCDR3、如SEQ ID NO:545所示的HCDR1、如SEQ ID NO:546所示的HCDR2以及如SEQ ID NO:547所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗CD19抗体包含如SEQ ID NO:549所示的轻链可变区和如SEQID NO:548所示的重链可变区。在一些实施方案中，抗CD19抗体是抗CD19scFv，其可包含如SEQ ID NO：550所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合HER2，也称为抗HER2抗体，是CN202210750853.1中描述的抗体(公布号为CN114805584A，其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是如SEQ ID NO:532所示的LCDR1，如SEQ ID NO:533所示的LCDR2，如SEQ ID NO:534所示的LCDR3、如SEQ ID NO:535所示的HCDR1、如SEQ IDNO:536所示的HCDR2以及如SEQ ID NO:537所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗HER2抗体包含如SEQ ID NO:538所示的轻链可变区和如SEQID NO:539所示的重链可变区。在一些实施方案中，抗HER2抗体是抗HER2scFv，其可包含如SEQ ID NO：540所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合IL13Ra2，也称为抗IL13Ra2抗体，为CN202210743595.4中描述的抗体(公布号为CN114805581A，其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1，LCDR2和LCDR3的轻链可变区以及包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是如SEQ ID NO:552所示的LCDR1，如SEQ IDNO:553所示的LCDR2、如SEQ ID NO:554所示的LCDR3、如SEQ ID NO:555所示的HCDR1、如SEQID NO:556所示的HCDR2以及如SEQ ID NO:557所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗IL13Ra2抗体包含如SEQ ID NO:558所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:559所示的重链可变区。在一些实施方案中，抗IL13Ra2抗体是抗IL13Ra2 scFv，其可包含如SEQ ID NO：560所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合B7H3，也称为抗B7H3抗体，为CN202210714289.8中描述的抗体(公布号为CN114773477A，其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区以及包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是如SEQ ID NO:562所示的LCDR1，如SEQ IDNO:563所示的LCDR2、如SEQ ID NO:564所示的LCDR3、如SEQ ID NO:565所示的HCDR1、如SEQID NO:566所示的HCDR2以及如SEQ ID NO:567所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗B7H3抗体包含如SEQ ID NO:568所示的轻链可变区和如SEQID NO:569所示的重链可变区。在一些实施方案中，抗B7H3抗体是抗B7H3scFv，其可包含如SEQ ID NO：570所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体特异性结合CD40，也称为抗CD40抗体，是PCT/CN2022/112730中描述的抗体(其通过引用整体并入本文)，包括包含LCDR1，LCDR2和LCDR3的轻链可变区以及包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自下组：

(1)如SEQ ID NO:828所示的LCDR1、如SEQ ID NO:834所示的LCDR2、如SEQ ID NO:840所示的LCDR3、如SEQ ID NO:846所示的HCDR1、如SEQ ID NO:852所示的HCDR2和如SEQID NO:858所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:829所示的LCDR1、如SEQ ID NO:835所示的LCDR2、如SEQ ID NO:841所示的LCDR3、如SEQ ID NO:847所示的HCDR1、如SEQ ID NO:853所示的HCDR2和如SEQID NO:859所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:830所示的LCDR1、如SEQ ID NO:836所示的LCDR2、如SEQ ID NO:842所示的LCDR3、如SEQ ID NO:848所示的HCDR1、如SEQ ID NO:854所示的HCDR2和如SEQID NO:860所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:831所示的LCDR1、如SEQ ID NO:837所示的LCDR2、如SEQ ID NO:843所示的LCDR3、如SEQ ID NO:849所示的HCDR1、如SEQ ID NO:855所示的HCDR2和如SEQID NO:861所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:832所示的LCDR1、如SEQ ID NO:838所示的LCDR2、如SEQ ID NO:844所示的LCDR3、如SEQ ID NO:850所示的HCDR1、如SEQ ID NO:856所示的HCDR2和如SEQID NO:862所示的HCDR3；和

(6)如SEQ ID NO:833所示的LCDR1、如SEQ ID NO:839所示的LCDR2、如SEQ ID NO:845所示的LCDR3、如SEQ ID NO:851所示的HCDR1、如SEQ ID NO:857所示的HCDR2和如SEQID NO:863所示的HCDR3。

在一些实施方案中，抗CD40抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

(1)如SEQ ID NO:864所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:870所示的重链可变区；

(2)如SEQ ID NO:865所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:971所示的重链可变区；

(3)如SEQ ID NO:866所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:872所示的重链可变区；

(4)如SEQ ID NO:867所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:873所示的重链可变区；

(5)如SEQ ID NO:868所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:874所示的重链可变区；和

(6)如SEQ ID NO:869所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:875所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗CD40抗体是抗CD40 scFv，其可包含选自SEQ ID NO:888-893的氨基酸序列。

在一些实施方案中，蛋白质编码序列可以编码CAR。在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40的结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域可包含特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40的抗体。在一些实施方案中，结合结构域可以是特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40的scFv。

CAR还可以包含信号肽、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域可以进一步包含共刺激结构域。在一些实施方案中，信号肽可包含CD8信号肽或GM-CSF信号肽。在一些实施方案中，CAR的铰链区可包含CD28、CD8、IgGl、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30或LIGHT的铰链结构域，优选地，为CD8铰链结构域。在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域可包含CD8、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC，CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12、CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64或SLAM的跨膜结构域，优选地，为CD8跨膜(TM)结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域可包含CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、DAP10或DAP-12的胞内信号传导结构域，优选地，为CD3ζ胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域可以进一步包含共刺激结构域，例如CD28、4-1BB(CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40或MyD88的共刺激结构域，优选地，为4-1BB共刺激结构域。

在一些实施方案中，具有“BBZ”的CAR是指具有4-1BB共刺激分子的CAR，其通常包含CD8铰链结构域、CD8跨膜(TM)结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述CAR包含可以特异性结合间皮素的结合结构域(例如，针对间皮素的抗体，例如抗间皮素scFv)，其可以被称为靶向间皮素的CAR。在一些实施方案中，靶向间皮素的CAR可以是PCT/CN2021/112855中描述的CAR(其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，所述靶向间皮素的CAR可以包含如上所述的任何一种抗间皮素抗体。在一些实施方案中，所述靶向间皮素的CAR可包含选自SEQ ID NO:131-145的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合CD123的结合结构域(例如，针对CD123的抗体，例如抗CD123 scFv)，其可以被称为靶向CD123的CAR。在一些实施方案中，靶向CD123的CAR可以是PCT/CN2021/112814中描述的CAR(其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，靶向CD123的CAR可以包含如上所述的抗CD123抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向CD123的CAR可以包含选自SEQ ID NO:494-496的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合BCMA的结合结构域(例如，针对BCMA的抗体，例如抗BCM scFv)，其可以被称为靶向BCMA的CAR。在一些实施方案中，靶向BCMA的CAR可以是PCT/CN2021/112858中描述的CAR(其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，靶向BCMA的CAR可以包含如上所述的抗BCMA抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向BCMA的CAR可包含选自SEQ IDNO:249-260的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合CD19的结合结构域(例如，针对CD19的抗体，例如抗CD19 scFv)，其可以被称为靶向CD19的CAR。在一些实施方案中，靶向CD19的CAR可以是CN202210274255.1(公开号CN114349863A)中描述的CAR。在一些实施方案中，靶向CD19的CAR可以包含如上所述的抗CD19抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向CD19的CAR可以包含如SEQ ID NO:551所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合HER2的结合结构域(例如，针对HER2的抗体，例如抗HER2 scFv)，其可以被称为靶向HER2的CAR。在一些实施方案中，靶向HER2的CAR可以是CN202210750853.1(公开号为CN114805584A，其全部内容通过引用并入本文)中描述的CAR。在一些实施方案中，靶向HER2的CAR可以包含如上所述的抗HER2抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向HER2的CAR可以包含如SEQ ID NO:541所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合IL13Ra2的结合结构域(例如，针对IL13Ra2的抗体，例如抗IL13Ra2 scFv)，其可以被称为靶向IL13Ra2的CAR。在一些实施例中，靶向IL13Ra2的CAR可以是CN202210743595.4中描述的CAR(公开号为CN114805581A，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，靶向IL13Ra2的CAR可以包含如上所述的抗IL13Ra2抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向IL13Ra2的CAR可以包含如SEQ ID NO:561所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR包含可以特异性结合B7H3的结合结构域(例如，针对B7H3的抗体，例如抗B7H3 scFv)，其可以被称为靶向B7H3的CAR。在一些实施方案中，靶向B7H3的CAR可以是CN202210714289.8中描述的CAR(公开号为CN114773477A，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，靶向B7H3的CAR可包含如上所述的抗B7H3抗体中的任一种。在一些实施方案中，靶向B7H3的CAR可包含如SEQ ID NO:571所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，蛋白质编码序列可以编码融合蛋白质，其被称为淋巴细胞-抗原呈递细胞共刺激分子(“LACOSTIMs”，在本文中也称为LACO或LACO-Stim)，例如，如PCT/CN2021/112742和PCT/CN2022/112730(其通过引用整体并入本文中)中所描述。本文提供的融合蛋白质包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中(i)第一结构域包含(a)与APC激活受体结合的配体或其受体结合片段，或(b)与APC的激活受体结合的抗体或其抗原结合片段；(ii)第二结构域包含(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段，(c)与免疫效应细胞的共刺激受体结合的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，APC选自由树突细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞、单核细胞、B细胞、T细胞和朗格汉斯细胞组成的组。在一些实施方案中，APC的激活受体选自由CD40、CD80、CD86、CD91、DEC-205和DC-SIGN组成的组。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第一结构域包含结合APC的激活受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第一结构域是抗CD40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域是单克隆抗体。在一些实施方案中，第一结构域是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，第一结构域是Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv、(scFv)₂、单链抗体、双可变区抗体、双抗体、纳米抗体或单可变区抗体。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第一结构域是抗CD40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第一结构域是抗CD40scFv。在一些实施方案中，抗CD40抗体是本文列出的任何一种抗CD40抗体。在一些实施方案中，融合蛋白质包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述免疫效应细胞选自由T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的组。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第二结构域包含共刺激受体的细胞质结构域。在一些实施方案中，共刺激受体选自由CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、DAP10、2B4、CD30、CD2、LIGHT、GITR、TLR、DR3和CD43组成的组。在一些实施方案中，共刺激受体是CD28。在一些实施方案中，共刺激受体是4-1BB。在一些实施方案中，第二结构域进一步包含共刺激受体的跨膜结构域。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第二结构域是免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，共刺激配体选自CD58、CD70、CD83、CD80、CD86、CD137L、CD252、CD275、CD54、CD49a、CD112、CD150、CD155、CD265、CD270、TL1A、CD127、IL-4R、GITR-L、TIM-4、CD153、CD48、CD160、CD200R和CD44。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第二结构域是结合共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，共刺激受体选自由CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、DAP10、2B4、CD30、CD2、LIGHT、GITR、TLR、DR3和CD43组成的组。在一些实施方案中，共刺激受体是CD28。在一些实施方案中，共刺激受体是4-1BB。在一些实施方案中，第二结构域是单克隆抗体。在一些实施方案中，第二结构域是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，第二结构域是Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv、(scFv)₂、单链抗体、双可变区抗体、双抗体、纳米抗体或单可变区抗体。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第二结构域是结合CD28的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质，第一结构域的N末端连接至第二结构域的C末端。在一些实施方案中，第二结构域的N末端连接至第一结构域的C末端。在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白质的第一结构域和第二结构域通过接头连接。在一些实施方案中，接头是三聚化基序。在一些实施方案中，接头是T4纤维蛋白质三聚化基序。

在本文提供的融合蛋白质的一些实施方案中，第一结构域包含CD40L或其受体结合片段，并且第二结构域包含CD28胞质结构域。在一些实施方案中，第一结构域包含CD40L。在一些实施方案中，第一结构域的N末端连接至第二结构域的C末端。

在本文提供的融合蛋白质的一些实施方案中，第一结构域包含CD40L或其受体结合片段，并且第二结构域包含抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的N末端连接至第二结构域的C末端。在一些实施方案中，两个结构域通过T4纤维蛋白质三聚化基序连接。

在本文提供的融合蛋白质的一些实施方案中，第一结构域包含抗CD40抗体或其抗原结合片段，并且第二结构域包含抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的N末端连接至第二结构域的C末端。

在本文提供的融合蛋白质的一些实施方案中，第一结构域包含抗CD40抗体或其抗原结合片段，并且第二结构域包含CD28跨膜区和CD28胞质结构域。在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域经由CD8铰链、CD28铰链或IgG Fc区连接。在一些实施方案中，第二结构域的N末端连接至第一结构域的C末端。

在一些实施方案中，LACOSTIM包含选自SEQ ID NO:600、SEQ ID NO:695-708、801、803、813、894-899的序列。

在一些实施方案中，蛋白质编码序列可以编码第一蛋白质和第二蛋白质。第一蛋白质可以是抗体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，并且第二蛋白质可以是本文描述的LACOSTIM分子。第一蛋白质和第二蛋白质可以融合在一起作为融合蛋白质。第一蛋白质可以连接至第二蛋白质的N末端或C末端。第一蛋白质和第二蛋白质可以通过连接子(接头)连接。连接子可以是自切割连接子，例如2A肽(例如，P2A、F2A、T2A等)。

本文所用的术语“poly A”是polyadenylation(聚腺苷酸化)的缩写，是指包含长度至少为30的连续腺嘌呤核苷酸的序列。polyA序列可以是核糖核酸序列或脱氧核糖核酸序列。PolyA序列中连续腺嘌呤核苷酸的长度可以是至少30个核苷酸，例如至少45个核苷酸、至少50个核苷酸、至少55个核苷酸、至少60个核苷酸、至少65个核苷酸、至少70个核苷酸、至少75个核苷酸、至少80个核苷酸、至少85个核苷酸、至少90个核苷酸、至少95个核苷酸、至少100个核苷酸、至少105个核苷酸、至少110个核苷酸、至少115个核苷酸、至少120个核苷酸、至少125个核苷酸、至少130个核苷酸、至少135个核苷酸、至少140个核苷酸、至少145个核苷酸、至少150个核苷酸、至少155个核苷酸、至少160个核苷酸、至少165个核苷酸、至少170个核苷酸，至少175个核苷酸、至少180个核苷酸、至少185个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少205个核苷酸、至少210个核苷酸、至少215个核苷酸、至少220个核苷酸，至少225个核苷酸、至少230个核苷酸、至少235个核苷酸、至少240个核苷酸。Poly A序列中连续腺嘌呤核苷酸的长度可以在30-240个核苷酸的范围内，例如40-230个核苷酸、45-220个核苷酸、50-210个核苷酸、60-200个核苷酸、70-190个核苷酸、80-180个核苷酸、90-170个核苷酸、100-160个核苷酸、110-150个核苷酸、120-140个核苷酸。在一些实施方案中，polyA序列可以仅由连续的腺嘌呤核苷酸组成。

环状RNA可以在约500至约10,000个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，环状RNA可以是至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000个核苷酸。在一些实施方案中，环状RNA的大小不超过10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000或4,000个核苷酸。

本发明的环状RNA是可翻译的，即，它可以翻译成蛋白质，例如在体外系统中或在细胞中。该细胞可以是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，环状RNA是mRNA。

在一些实施方案中，本发明的环状RNA不包含UTR，例如5′UTR和/或3′UTR。

环状RNA可包含不会阻碍蛋白质从环状RNA翻译的附加元件。在一些实施方案中，附加元件可以促进环状RNA的产生或环状RNA蛋白质的翻译。

本发明的环状RNA可以通过RNA环化方法的通用策略来制备，例如使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法、使用RNA或DNA连接酶的酶促方法以及使用自剪接内含子的核酶促方法(Petkovic,S.&Muller,S.,“RNA circularization strategies in vivo and invitro”,Nucleic Acids Research,43(4):2454-2465(2015)；Beadudry,D.&Perreault,J.,“An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules”,NucleicAcids Research,23(15):3064-3066(1995)；Micura,R.,“Cyclic Oligoribonucleotides(RNA)by Solid-Phase Synthesis",Chemistry A European Journal,5(7):2077-2082(1999))。

在一些实施方案中，本发明的环状RNA可以通过环化前体RNA分子来制备。前体RNA分子的环化可以通过使用自剪接内含子的核酶方法进行。

如本文所用，术语“前体RNA”是指被环化以形成本发明的环状RNA的RNA序列。

前体RNA可以是线性的。前体RNA可包含环化单元和至少一种环化元件。如本文所用，术语“环化单元”是指将要被环化的序列以及环化前体RNA后将包含在环状RNA中的序列。如本文所用，术语“环化元件”是指可以在合适的条件下操作或自发剪接和连接，以环化与环化元件相邻的核酸序列。

环化单元至少依次包含以下结构：IRES元件、蛋白质编码序列和polyA，以及任选的附加元件。

环化元件可定位在环化单元的任一侧或两侧。

在一些实施方案中，环化元件可包含来自I类或II类的内含子自剪接序列。

在一些实施方案中，内含子自剪接序列包含环化单元5′上的第一内含子序列和环化单元3′上的第二内含子序列。

在一些实施方案中，内含子自剪接序列可以来源于I类重组内含子-外显子(PIE)序列，其中第一个内含子序列可以包含3′I类内含子片段，第二个内含子序列可以包含5′I类内含子片段。I类重组内含子-外显子(PIE)序列可能来源于T4噬菌体的td基因或蓝细菌(Cyanobacterium)Anabaena sp.的pre-tRNA-Leu基因。在一个实施方案中，3′I类内含子片段和/或5′I类内含子片段来源于蓝细菌(Cyanobacterium)Anabaena sp.的pre-tRNA-Leu基因或T4噬菌体的Td基因。

在一些实施方案中，“3′I类内含子片段”与天然I类内含子3′末端的序列同一性为75％或更高(例如80％、85％、90％、95％或100％)，包括剪接位点二核苷酸，并且可选地包括相邻的外显子序列。相邻的外显子序列至少包含1个核苷酸的长度(例如，至少包含5个核苷酸的长度、至少包含10个核苷酸的长度、至少包含15个核苷酸的长度、至少包含20个核苷酸的长度、至少包含25个核苷酸的长度或至少包含30个核苷酸的长度)。在一些实施方案中，3′I类内含子片段如SEQ ID NO:588所示。

在一些实施方案中，“5′I类内含子片段”与天然I类内含子3′末端的序列同一性为75％或更高(例如80％、85％、90％、95％或100％)，包括剪接位点二核苷酸，并且可选地包括相邻的外显子序列。相邻的外显子序列至少包含1个核苷酸的长度(例如，至少包含5个核苷酸的长度、至少包含10个核苷酸的长度、至少包含15个核苷酸的长度、至少包含20个核苷酸的长度、至少包含25个核苷酸的长度或至少包含30个核苷酸的长度)。在一些实施方案中，5′I类内含子片段如SEQ ID NO:592所示。

如本文所用，术语“剪接位点”指的是包含在I类内含子中的一个二核苷酸，在RNA环化过程中在其之间的磷酸二酯键被切割。

在包含I类内含子自剪接序列的前体RNA环化过程中，前体RNA经历了I类催化内含子特有的双酯交换反应。首先，游离鸟苷核苷(或位于内含子中的一个鸟苷核苷)或核苷酸辅因子(GMP、GDP、GTP)的3′OH攻击5′I类内含子片段剪接位点的磷酸，从而导致断裂。然后，断裂处的3′OH攻击3′I类内含子片段剪接位点的磷酸，触发第二次酯交换反应，从而将环化单元连接在一起。

前体RNA还可包含额外的元件，例如可促进前体RNA环化和/或蛋白质编码区翻译的元件，例如间隔区和/或同源臂。

如本文所用，术语“间隔区”指的是沿多核苷酸序列分隔两个其他元件的任何连续核苷酸序列。间隔区预计或可避免干扰近端结构的构造，例如来自IRES、蛋白质编码区、polyA或环化元件的结构。间隔区序列可用于使这些结构能够独立且正确地折叠，促进前体RNA的环化。间隔区可位于环化元件、IRES、蛋白质编码区和/或polyA的相邻位置。例如，间隔区可位于第一个内含子序列的下游和相邻位置和/或第二个内含子序列的上游和相邻位置。间隔区通常是非编码的。

前体RNA还可包含一个或多个，例如两个间隔区。在一些实施方案中，前体RNA可以包含第一内含子序列和内部核糖体进入位点(IRES)序列之间的5′间隔区序列，和/或polyA和第二内含子序列之间的3′间隔区序列。

5′间隔区序列的长度可以是至少10个核苷酸。在一些实施方案中，5′间隔区序列的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，5′间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，5′间隔区序列的长度在20至50个核苷酸之间。在一些实施方案中，5′间隔区序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，5′间隔区序列含有少于30个连续腺苷。在一些实施方案中，5′间隔区如SEQ ID NO:589所示。

3′间隔区序列的长度可以是至少10个核苷酸。在一些实施方案中，3′间隔区序列的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，3′间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，3′间隔区序列的长度在20至50个核苷酸之间。在一些实施方案中，3′间隔区序列是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，3′间隔区序列含有少于30个连续腺苷。在一些实施方案中，3′间隔区如SEQ ID NO:591所示。

同源臂通常成对使用，且通常位于第一内含子序列(即其5′)和第二个内含子序列(即其3′)的外部。在一些实施方案中，前体RNA可以在第一内含子序列的5′包含一个5′同源臂，并在第二个内含子序列的3′包含一个3′同源臂。

如本文所用，术语“同源臂”指任何用于与RNA中的另一序列(如另一个同源臂)形成至少约75％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、约100％)碱基配对的连续序列。同源臂通常位于环化元件的相邻位置，可以通过碱基配对使第一内含子序列和第二内含子序列在空间上靠近，从而促进内含子的剪接并促进前体RNA的环化。同源臂通常不会与RNA中非预期序列(例如，同源臂以外的序列)形成碱基配对。同源臂与RNA中非预期序列的序列同一性一般小于50％(例如，小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％)。

5′同源臂的长度可以是约5-50个核苷酸。在一些实施方案中，5′同源臂的长度可以是约20-40个核苷酸。在一些实施方案中，5′同源臂的长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，5′同源臂的长度不超过50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个核苷酸。在一些实施方案中，5′同源臂的长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，5′同源臂如SEQ ID NO:587所示。

3′同源臂的长度可以是约5-50个核苷酸。在一些实施方案中，3′同源臂的长度可以是约20-40个核苷酸。在一些实施方案中，3′同源臂的长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，3′同源臂的长度不超过50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个核苷酸。在一些实施方案中，3′同源臂的长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，3′同源臂如SEQ ID NO:593所示。

在一些实施方案中，前体RNA或环状RNA中的一个或多个元件与天然序列的序列同一性至少为75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)，包括例如IRES和内含子片段。在一些实施方案中，蛋白质编码序列不是天然存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，蛋白质编码区编码天然或合成蛋白质。

前体RNA可以在适当的条件下进行环化，这些条件取决于具体的环化策略，并为本领域技术人员所知。例如，包含I类内含子自剪接序列的前体RNA的环化条件可能是在存在镁离子和鸟苷核苷酸或核苷的情况下，在RNA环化发生的温度下(例如，约20℃至约60℃)进行。

前体RNA的环化可以在体外进行。或者，前体RNA的环化可以在细胞内进行，其中前体RNA可以被引入细胞，或者前体RNA的DNA模板可以被引入细胞中进行转录，然后前体RNA在细胞内环化。

本发明的前体RNA可以通过人工合成或通过从DNA模板转录获得。

DNA模板可以包含在载体中。

本发明的载体可以是表达载体。术语“表达载体”指的是一种设计用于使插入的核酸序列表达的载体。

载体可通过本领域已知的方法引入所需宿主细胞，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白质(参见，例如,Wu et al.,J.Biol.Chem.267:963(1992)；Wu et al.,J.Biol.Chem.263:14621(1988)；和Hartmut et al.,Canadian Patent ApplicationNo.2,012,311)。

本发明的载体可以是DNA构建体，例如质粒，或病毒载体。

本发明的载体包含转录单位，其是可以转录为前体RNA的多核苷酸序列。载体还可包含启动转录单元转录的启动子。启动子可以位于转录单元的上游并邻近转录单元。启动子可以是RNA聚合酶启动子。RNA聚合酶启动子的实例包括但不限于T7RNA聚合酶启动子、T6RNA聚合酶启动子、SP6 RNA聚合酶启动子、T3 RNA聚合酶启动子或T4 RNA聚合酶启动子。

本发明的环状RNA、前体RNA或载体中的元件彼此可操作地连接。

在一些实施方案中，本发明涉及产生环状RNA的方法，该方法包括通过使用本文提供的载体作为模板进行转录来产生前体RNA，并将前体RNA环化以获得环状RNA。

转录步骤可以在体外(即，在无细胞系统中)或在细胞中进行。环化步骤可以在体外或在细胞中进行。体外转录方法是本领域技术人员已知的。例如，有许多市售的体外转录试剂盒。

在一些实施方案中，将人工合成的前体RNA引入宿主细胞中，并且将前体RNA在细胞中环化以获得环状RNA。在一些实施方案中，将本文提供的载体引入宿主细胞中并在细胞中转录为前体RNA，并且将前体RNA在细胞中环化以获得环状RNA。

本发明的环状RNA可以通过多种方法纯化，例如使用分子筛柱。在优选的实施方案中，环状RNA中包含的poly A允许通过基于oligo-dT的捕获方法进行纯化，例如使用oligo-dT珠或oligo-dT树脂，如oligo-dT亲和色谱法。

本文所用的术语“oligo-dT”是指仅由胸苷组成的均聚物。Oligo-dT珠是指与Oligo-dT偶联的磁珠。Oligo-dT树脂是指与Oligo-dT共价偶联的树脂(例如Sepharose树脂)。

在一些实施方案中，本发明涉及纯化环状RNA的方法，该方法包括产生本文提供的环状RNA，并通过基于oligo-dT的捕获来纯化环状RNA。

在一些实施方案中，本发明涉及在细胞中表达蛋白质的方法。所述方法可以包括将本文提供的环状RNA、载体或前体RNA引入宿主细胞并在环状RNA中表达由蛋白质编码序列编码的蛋白质。

环状RNA、载体或前体RNA可以通过本领域已知的方法引入宿主细胞，例如电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)或使用基因枪。

在一些实施方案中，为了在细胞中表达蛋白质，可以使用例如脂转染或电穿孔将环状RNA引入细胞中。在一些实施方案中，可以使用纳米载体将环状RNA引入细胞中，所述纳米载体可以是例如脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物，例如脂质纳米颗粒(LNP)。

宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞，优选地，为人细胞，例如T细胞、NK细胞或A549细胞。

可以进一步纯化由环状RNA表达的蛋白质。纯化蛋白质的方法是本领域技术人员众所周知的。

在一些实施方案中，本发明涉及产生蛋白质的方法，该方法包括从本文提供的环状RNA表达蛋白质，并纯化蛋白质。环状RNA可以通过本文提供的任何方法产生。

在一些实施方案中，本发明涉及包含本文提供的环状RNA、前体RNA或载体的细胞或细胞群。细胞可以是哺乳动物细胞，优选地，为人细胞，更优选地，为T细胞或NK细胞。

环状RNA、前体RNA、载体、细胞或细胞群可用于表达目的蛋白质、产生目的蛋白质或通过表达的治疗性蛋白质治疗疾病。环状RNA、前体RNA、载体、细胞或细胞群也可以用作疫苗。

细胞或细胞群可以是免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞，或包含这些细胞的群。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助T细胞、γδT、CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、CD3+T细胞、初始T细胞、效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、Th0细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th3(Treg)细胞、Th9细胞、Th17细胞、Thαβ辅助细胞、Tfh细胞、干记忆TSCM细胞，中央记忆TCM细胞、效应记忆TEM细胞或效应记忆TEMRA细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了一种细胞或细胞群，其包含编码CAR的第一多核苷酸和编码融合蛋白质的第二多核苷酸，所述融合蛋白质包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸位于细胞中相同或不同的环状RNA上，其中(i)第一结构域包含(a)与APC的激活受体结合的配体或其受体结合片段，或(b)与APC的激活受体结合的抗体或其抗原结合片段；和(ii)第二结构域包含(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段，(c)与免疫效应细胞的共刺激受体结合的抗体或其抗原结合片段。

第一多核苷酸和第二多核苷酸在环状RNA中作为蛋白质编码序列发挥作用。第一多核苷酸可以编码本发明中描述的第一蛋白质。第二多核苷酸可以编码本发明中描述的第二蛋白质。

当第一多核苷酸和第二多核苷酸位于同一环状RNA上时，第一多核苷酸可以位于第二多核苷酸的5′端或3′端。第一多核苷酸和第二多核苷酸可以通过编码连接子的核苷酸序列连接。连接子可以是自剪切连接子，例如2A肽(例如，P2A、F2A、T2A等)。

由第一多核苷酸编码的CAR可以是本文描述的任何CAR。由第二多核苷酸编码的融合蛋白质可以是本文上下文中描述的任何LACOSTIM融合蛋白质。

本发明还涉及组合物，例如药物组合物，其包含本文提供的环状RNA、前体RNA、载体或细胞以及任选的载体。载体可以是递送载体或药学上可接受的载体(例如药学上可接受的递送载体)。药物组合物可以是疫苗组合物。疫苗组合物可包含环状RNA、前体RNA、载体、细胞或细胞群以及佐剂(例如氢氧化铝、BCG等)。

本发明的药物组合物可以根据已知技术配制成各种给药方式。参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy(9th Ed.1995)。在制备药物组合物时，活性剂通常与包括药物可接受载体在内的其他成分混合。药学上可接受的载体当然必须在与配方中任何其他成分兼容的意义上是可接受的，并且不得对受试者有害。药学上可接受的载体可以包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、润湿剂、表面活性剂、乳化剂或它们的组合。缓冲剂的例子包括但不限于乙酸、柠檬酸、组氨酸、硼酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、苹果酸、天冬氨酸、Tris缓冲液、HEPPSO、HEPES、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等。

如本文所用，术语“递送载体”是指用于将DNA或RNA分子递送至表达目的蛋白质的靶细胞或靶组织的载体。递送载体的实例包括但不限于脂质纳米颗粒或聚合物。

本发明还涉及一种组合物，例如药物组合物，其包含含有本发明的环状RNA的细胞。该细胞可以是免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞。

本发明的药物组合物可用于治疗或预防受试者的疾病，例如肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液癌症(例如白血病)。在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)或母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)。在一些实施方案中，疾病(例如癌症)的特征在于疾病细胞表达间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3。在一些实施方案中，癌症是表达CD123的癌症。在一些实施方案中，癌症是表达CD123的AML。在一些实施方案中，癌症是间皮瘤。在一些实施方案中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤或心包间皮瘤。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是胰腺导管癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢上皮癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食道癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症是神经胶质瘤或头颈癌。

本发明还涉及治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的组合物。在一些实施方案中，受试者是人类。

该疾病可以是肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。该疾病可能涉及由环状RNA中的蛋白质编码序列编码的功能性蛋白质的丢失或缺失或蛋白质的高表达。在一些实施方案中，所述疾病可以是具有高表达间皮素的肿瘤，例如间皮瘤、胰腺腺癌、卵巢癌和/或肺腺癌。“高表达”是指所述肿瘤细胞上的肿瘤抗原或肿瘤表面受体的表达水平高于正常细胞，例如比正常细胞高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病和受试者的任何方式施用。在某些实施方案中，施用方式可以包括但不限于肠胃外或非肠胃外途径，包括口服、舌下、颊、经皮、直肠、阴道、皮内、鼻内途径或肠胃外途径，例如静脉内(i.v.)、腹膜内、皮内、皮下、肌内、颅内、鞘内、瘤内、经皮、经粘膜关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内或颅内注射或输注。药物组合物可以例如直接注射到肿瘤、淋巴结、组织、器官或感染部位。

适合口服施用的剂型包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、溶液或溶液预浓缩物、乳液或乳液预浓缩物。可以用于口服剂型的药学上可接受载体包括水、乙二醇、油类、酒精、香料、防腐剂、着色剂等。载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、填充剂、助流剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、稳定剂、崩解剂等可用于制备口服固体制剂如粉剂、胶囊或片剂。

适合肠胃外给药的剂型包括但不限于无菌液体制剂，例如等渗水溶液、乳剂、悬浮液、分散液或粘性组合物，这些制剂可以被缓冲到理想的pH值。肠胃外剂型可以是即用型或干燥产品，准备成溶解或悬浮在药学上可接受的载体中。肠胃外剂型可以配制成无菌制剂，也可以在给受试者使用前进行灭菌。可用于提供肠胃外剂型的药物可接受载体包括但不限于注射用水；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液；水混溶性载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯；以及溶解剂，例如环糊精。

施用的量和频率将由诸如受试者的状况(例如，受试者的年龄、体重、性别和受试者对药物的反应)以及受试者疾病的类型和严重程度等因素来确定，尽管可以通过临床试验确定适当的剂量。

药物组合物可以约为0.5至约250mg/kg的治疗有效量的剂量给予受试者，例如，约1至约250mg/kg，约2至约200mg/kg，约3至约120mg/kg，约5至约250mg/kg，约10至约200mg/kg，或约20至约120mg/kg。

药物组合物可以一天给药一次或两次；或每2、3、4、5、6、7、8、9或10天一次，每1、2、3、4、5或6周一次或每1、2、3、4、5或6个月或更长时间一次。药物组合物也可以每周多次(例如，1、2、3、4或5次)或每月多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)给药。例如，在每周五次的方案中，药物组合物可以连续五天每天施用一次，随后连续两天休息。

环状RNA、前体RNA或载体可用于提高蛋白质表达水平。因此，本发明还涉及一种提高环状RNA蛋白质表达水平的方法，该方法包括将polyA插入环状RNA中。PolyA的定义如上所述。包含插入polyA序列的环状RNA相比于不含polyA序列的环状RNA(即，如本文所述不包含polyA序列的环状RNA)，具有更高的蛋白质表达水平。

具体实施方案

实施例1

方法

1.抗MSLN M12 CAR线性mRNA的体外转录(IVT)

1.1通过BspQ1酶切割pDA-M12.BBZ CAR质粒(图10)使其线性化。

1.2使用PCR Cleanup kit(Qiagen)纯化线性化载体，并用无核酸酶水洗脱。

1.3使用NanoDrop测量DNA浓度，并通过琼脂糖DNA凝胶检测。

1.4按照制造商的操作规程(Thermofisher，目录号：AMB13455)进行IVT。简要步骤：将20μl体积的1μg模板DNA、NTP/ARCA缓冲液、T7缓冲液、GTP、T7酶和无核酸酶水加入0.2ml PCR管中，在37℃孵育4小时。

1.5 4小时后，每个反应加入2μl DNase I，在37℃孵育15分钟。

1.6按照制造商建议进行加尾步骤。

1.7使用RNasy kit(Qiagen)纯化IVT mRNA。

1.8使用NanoDrop测量RNA浓度，并通过PAGE凝胶检测。

2.抗MSLN M12 CAR环状RNA的体外转录(IVT)

2.1通过BspQ1酶切割pCA-M12.BBZ、pCA45-M12.BBZ、pCA70-M12.BBZ CAR质粒(图11-13)使其线性化。

2.2使用PCR Cleanup kit(Qiagen)纯化线性化载体，并用无核酸酶水洗脱。

2.3使用NanoDrop测量DNA浓度，并通过琼脂糖DNA凝胶检测。

2.4按照制造商操作规程(Thermofisher，目录号：AMB13345)进行IVT。简要步骤：将20μl体积的1μg模板DNA、NTP混合物、T7缓冲液、GTP、T7酶和无核酸酶水加入0.2ml PCR管中，在37℃孵育4小时。

2.5 4小时后，每个反应加入2μl DNase I，在37℃孵育15分钟。

2.6 DNase处理后，加入额外的GTP，使最终浓度达到2mM，然后在55℃加热15分钟。

2.7通过柱或AKTA系统纯化环状RNA。

2.8使用NanoDrop测量RNA浓度，并通过PAGE凝胶检测。

3.使用CIMmultusOligodT柱纯化环状RNA

3.1缓冲液制备：缓冲液A：平衡/洗涤缓冲液。50mM磷酸钠，250mM氯化钠，5mMEDTA，pH 7.0；缓冲液B：第二洗涤缓冲液。50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH7.0；缓冲液C：洗脱缓冲液。10mM Tris，pH 8.0；缓冲液D：清洗缓冲液。3M盐酸胍，5mM EDTA，pH 7.0。

3.2用缓冲液A平衡柱：将平衡缓冲液(A)泵入CIMmultus Oligo dT柱，直到输出pH和电导率与输入缓冲液相同。流速：5柱体积/分钟(CV/min)。

3.3注入样品。按照制造商操作规程进行样品注入。

3.4用缓冲液A进行洗涤1：10CV平衡缓冲液。

3.5用缓冲液B进行洗涤2：10CV第二洗涤缓冲液。

3.6用缓冲液C洗脱：洗脱并收集环状RNA样品，直到UV吸光度恢复到基线。

3.7用缓冲液D清洗：使用至少10CV的清洗缓冲液清洗柱系统。

4.RNA电穿孔至A549-GFP和T细胞

4.1收集A549-GFP肿瘤细胞和T细胞，并用Opti-MEM培养基洗涤3次。

4.2用Opti-MEM培养基重悬细胞沉淀，将细胞浓度调整为1×10e7/ml。

4.3分装5μg MSLN mRNA至1.5ml EP管中，然后加入100μl A549细胞，混合均匀。对于T细胞电穿孔，分装10μg M12.BBZ mRNA或环状RNA至1.5ml EP管中，然后加入100μl A549细胞，混合均匀。

4.4在BTX机器上设置参数：

a)T细胞：500伏特，0.7毫秒

b)A549肿瘤细胞：300伏特，0.5毫秒；

4.5将混合RNA的100μl细胞加入BTX电穿孔杯中，轻拍以避免气泡。

4.6进行电穿孔，然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃培养。

5.抗MSLN M12 CAR-T细胞的体外细胞毒性实验

5.1共培养前12小时，将电穿孔了5μg MSLN mRNA的A549-EGFP细胞接种到平底96孔板中，3000个细胞/100μl/孔。

5.2电穿孔后约12至24小时，计数并稀释CAR-T细胞至适当浓度，以不同的E/T比例(如3:1和1:1)将细胞接种到肿瘤细胞中，每孔100μl。

5.3将共培养板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。

5.4扫描4天后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)，以计算杀伤效率。

在上述实施例中使用的元件：

T7启动子:SEQ ID NO:586.

M12:抗间皮素(抗-MSLN)scFv。

M12.BBZ:包括M12的嵌合抗原受体(CAR)、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域，如SEQ ID NO:572所示。

3′UTR:SEQ ID NO:597

HA-1:同源臂-1，如SEQ ID NO:587所示。

内含子-1:Anabaena内含子-1，如SEQ ID NO:588所示。

间隔区-1:SEQ ID NO:589.

IRES:CVB3 IRES，如SEQ ID NO:590所示。

间隔区-2:SEQ ID NO:591.

内含子-2:Anabaena内含子-2，如SEQ ID NO:592所示。

HA-2:同源臂-2，如SEQ ID NO:593所示。

结论

首先，我们构建了没有polyA、poly 45A和poly 70A的环状RNA载体(图1)，并使用这些载体进行了IVT。然后，我们测试了是否可以通过oligo dT树脂纯化带有45A和70A的环状RNA，这是常用于线性mRNA纯化的方法。结果表明，带有45A和70A的环状RNA可以通过oligo dT树脂进行高纯度的成功纯化(图2-5)。此外，环状RNA-70A的产量比环状RNA-45A高(图6)。为了测试带有poly A序列的环状RNA的功能，我们将相同量的M12.BBZ线性mRNA、没有polyA的环状RNA和poly70A的环状RNA转导到活化的T细胞中。我们通过流式细胞术检测转导后24小时(图7)和48小时(图8)M12 CAR与间皮素-Fc重组蛋白的染色来测试每种RNA的表达水平，结果显示，环状RNA-70A组的M12 CAR表达水平高于线性mRNA组和环状RNA-45A组。使用这些CAR-T细胞与表达间皮素的肿瘤细胞的共培养实验还表明，环状RNA-70A CAR-T组的杀伤能力比线性mRNA CAR-T组和环状RNA CAR-T组更高(图9)。

在实施例1中使用的序列：

抗-MSLN M12.BBZ CAR氨基酸序列(SEQ ID NO:572):

(其中，下划线标记的氨基酸序列依次分别是LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3；斜体氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)是抗-MSLN scFv中VL和VH之间的连接子；既有下划线又有斜体的氨基酸序列是CD8信号肽)

抗-MSLN M12.BBZ CAR核苷酸序列(SEQ ID NO:573):

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccggttgacccagtctccatccctcctgtctgcatctgtaggagacagggtcaccgtcacttgtcgggccagtcagggcggtggcaattatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagccccgaaactcctgatctatggtgcatccaagttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctgtcacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggaggtggtggatccgaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtagtggtagcactacctacacacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacattgaactgagcggcctgagatctgaagacacggccgtgtattactgtgcccgaggggagacgcttcggggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcttcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

M12 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:574):

AIRLTQSPSLLSASVGDRVTVTCRASQGGGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASKLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPVTFGQGTKVDIK

M12 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:575):

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSSGSTTYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYIELSGLRSEDTAVYYCARGETLRGYFDYWGQGTLVTVSS

M12 LCDR1(SEQ ID NO:576):

RASQGGGNYLA

M12 LCDR2(SEQ ID NO:577):

GASKLQS

M12 LCDR3(SEQ ID NO:578):

QQLNSYPVT

M12 HCDR1(SEQ ID NO:579):

TYYIH

M12 HCDR2(SEQ ID NO:580):

IINPSSGSTTYTQKFQG

M12 HCDR3(SEQ ID NO:581):

GETLRGYFDY

M12.BBZ线性mRNA的DNA模板(SEQ ID NO:582):

taatacgactcactataggatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccggttgacccagtctccatccctcctgtctgcatctgtaggagacagggtcaccgtcacttgtcgggccagtcagggcggtggcaattatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagccccgaaactcctgatctatggtgcatccaagttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctgtcacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggaggtggtggatccgaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtagtggtagcactacctacacacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacattgaactgagcggcctgagatctgaagacacggccgtgtattactgtgcccgaggggagacgcttcggggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcttcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaagtcgacagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgctgcgtcgagagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgctgcctcgacgaattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

M12.BBZ环状RNA的DNA模板(SEQ ID NO:583)

taatacgactcactataggggagaccctcgaccgtcgattgtccactggtcaacaatagatgacttacaactaatcggaaggtgcagagactcgacgggagctaccctaacgtcaagacgagggtaaagagagagtccaattctcaaagccaataggcagtagcgaaagctgcaagagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtgggttcaagtccctccacccccacgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaa

aaacaaaaaaaacaaaaaaaaaaccaaaaaaacaaaacacattaaaacagcctgtgggttgatcccacccacaggcccattgggcg

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cagcgtggcacaccagccacgttttgatcaagcacttctgttaccccggactgagtatcaatagactgctcacgcggttgaaggagaaa

gcgttcgttatccggccaactacttcgaaaaacctagtaacaccgtggaagttgcagagtgtttcgctcagcactaccccagtgtagatc

aggtcgatgagtcaccgcattccccacgggcgaccgtggcggtggctgcgttggcggcctgcccatggggaaacccatgggacgc

tctaatacagacatggtgcgaagagtctattgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacac

accctcaagccagagggcagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcattttattcctatac

tggctgcttatggtgacaattgagagatcgttaccatatagctattggattggccatccggtgactaatagagctattatatatccctttgttg

ggtttataccacttagcttgaaagaggttaaaacattacaattcattgttaagttgaatacagcaaatctagagccaccatggccttaccag

tgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccggttgacccagtctccatccctcctgtctgca

tctgtaggagacagggtcaccgtcacttgtcgggccagtcagggcggtggcaattatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaa

gccccgaaactcctgatctatggtgcatccaagttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattca

ctctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctgtcacttttggccaggggacc

aaagtggatatcaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggaggtggtggatccgaggtgcagctggtggagtctggggc

tgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatacactgggtgcgac

aggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtagtggtagcactacctacacacagaagttccagggcagag

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ccgaggggagacgcttcggggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcttcaaccacgacgccagcgccgc

gaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgca

gtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggtt

atcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaa

gatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccg

cgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggc

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gaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagcca

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ttaccggcgagacgctacggacttaaataattgagccttaaagaagaaattctttaagtggatgctctcaaactcagggaaacctaaatct

agttatagacaaggcaatcctgagccaagccgaagtagtaattagtaagaccagtggacaatcgacggataacagcatatctag

M12.BBZ-45A环状RNA的DNA模板(SEQ ID NO:584)

taatacgactcactataggggagaccctcgaccgtcgattgtccactggtcaacaatagatgacttacaactaatcggaaggtgcagag

actcgacgggagctaccctaacgtcaagacgagggtaaagagagagtccaattctcaaagccaataggcagtagcgaaagctgcaa

gagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtgggttcaagtccctccacccccacgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaa

tctgtaggagacagggtcaccgtcacttgtcgggccagtcagggcggtggcaattatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagccccgaaactcctgatctatggtgcatccaagttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctgtcacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggaggtggtggatccgaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtagtggtagcactacctacacacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacattgaactgagcggcctgagatctgaagacacggccgtgtattactgtgcccgaggggagacgcttcggggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcttcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaagtcgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacaaaaaacaaaacggctattatgcgttaccggcgagacgctacggacttaaataattgagccttaaagaagaaattctttaagtggatgctctcaaactcagggaaacctaaatctagttatagacaaggcaatcctgagccaagccgaagtagtaattagtaagaccagtggacaatcgacggataacagcatatctag

M12.BBZ-70A环状RNA的DNA模板(SEQ ID NO:585):

taatacgactcactataggggagaccctcgaccgtcgattgtccactggtcaacaatagatgacttacaactaatcggaaggtgcagagactcgacgggagctaccctaacgtcaagacgagggtaaagagagagtccaattctcaaagccaataggcagtagcgaaagctgcaagagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtgggttcaagtccctccacccccacgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaaaaacaaaaaaaacaaaaaaaaaaccaaaaaaacaaaacacattaaaacagcctgtgggttgatcccacccacaggcccattgggcgctagcactctggtatcacggtacctttgtgcgcctgttttataccccctcccccaactgtaacttagaagtaacacacaccgatcaacagtcagcgtggcacaccagccacgttttgatcaagcacttctgttaccccggactgagtatcaatagactgctcacgcggttgaaggagaaagcgttcgttatccggccaactacttcgaaaaacctagtaacaccgtggaagttgcagagtgtttcgctcagcactaccccagtgtagatcaggtcgatgagtcaccgcattccccacgggcgaccgtggcggtggctgcgttggcggcctgcccatggggaaacccatgggacgctctaatacagacatggtgcgaagagtctattgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacacaccctcaagccagagggcagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcattttattcctatactggctgcttatggtgacaattgagagatcgttaccatatagctattggattggccatccggtgactaatagagctattatatatccctttgttgggtttataccacttagcttgaaagaggttaaaacattacaattcattgttaagttgaatacagcaaatctagagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggccatccggttgacccagtctccatccctcctgtctgcatctgtaggagacagggtcaccgtcacttgtcgggccagtcagggcggtggcaattatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagccccgaaactcctgatctatggtgcatccaagttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctgtcacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaaggtggtggtggttctggcggcggcggctccggaggtggtggatccgaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatacactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtagtggtagcactacctacacacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacattgaactgagcggcctgagatctgaagacacggccgtgtattactgtgcccgaggggagacgcttcggggctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcttcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaagtcgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaacaaaaaacaaaacggctattatgcgttaccggcgagacgctacggacttaaataattgagccttaaagaagaaattctttaagtggatgctctcaaactcagggaaacctaaatctagttatagacaaggcaatcctgagccaagccgaagtagtaattagtaagaccagtggacaatcgacggataacagcatatctag

T7启动子(SEQ ID NO:586)

taatacgactcactatag

同源臂-1(SEQ ID NO:587)

gggagaccctcgaccgtcgattgtccactggtc

Anabaena内含子-1(SEQ ID NO:588)

aacaatagatgacttacaactaatcggaaggtgcagagactcgacgggagctaccctaacgtcaagacgagggtaaagagagagtccaattctcaaagccaataggcagtagcgaaagctgcaagagaatgaaaatccgttgaccttaaacggtcgtgtgggttcaagtccctccaccccca

间隔区-1(SEQ ID NO:589)

cgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaaaaacaaaaaaa

CVB3 IRES(SEQ ID NO:590)

ttaaaacagcctgtgggttgatcccacccacaggcccattgggcgctagcactctggtatcacggtacctttgtgcgcctgttttataccccctcccccaactgtaacttagaagtaacacacaccgatcaacagtcagcgtggcacaccagccacgttttgatcaagcacttctgttaccccggactgagtatcaatagactgctcacgcggttgaaggagaaagcgttcgttatccggccaactacttcgaaaaacctagtaacaccgtggaagttgcagagtgtttcgctcagcactaccccagtgtagatcaggtcgatgagtcaccgcattccccacgggcgaccgtggcggtggctgcgttggcggcctgcccatggggaaacccatgggacgctctaatacagacatggtgcgaagagtctattgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacacaccctcaagccagagggcagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcattttattcctatactggctgcttatggtgacaattgagagatcgttaccatatagctattggattggccatccggtgactaatagagctattatatatccctttgttgggtttataccacttagcttgaaagaggttaaaacattacaattcattgttaagttgaatacagcaaa

间隔区-2(SEQ ID NO:591)

aaaaaacaaaaaacaaaacggctattatgcgttaccggcg

Anabaena内含子-2(SEQ ID NO:592)

agacgctacggacttaaataattgagccttaaagaagaaattctttaagtggatgctctcaaactcagggaaacctaaatctagttatagacaaggcaatcctgagccaagccgaagtagtaattagtaag

同源臂-2(SEQ ID NO:593)

accagtggacaatcgacggataacagcatatctag

45A(SEQ ID NO:594)

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

70A(SEQ ID NO:595)

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

150A(SEQ ID NO:596)

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

3′UTR(SEQ ID NO:597)

agctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgctgcgtcgagagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgctgcctcgacgaattc

抗-MSLN M12.BBZ CAR的抗-MSLN scFv(SEQ ID NO:598)

AIRLTQSPSLLSASVGDRVTVTCRASQGGGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASKLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPVTFGQGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSSGSTTYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYIELSGLRSEDTAVYYCARGET LRGYFDYWGQGTLVTVSS

没有信号肽的抗-MSLN M12.BBZ CAR(SEQ ID NO:599)

AIRLTQSPSLLSASVGDRVTVTCRASQGGGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASKLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPVTFGQGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINPSSGSTTYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYIELSGLRSEDTAVYYCARGET LRGYFDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

参考文献

1.R.Alexander Wesselhoeft,Pi otr S.Kowalski&Daniel G.Anderson,Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryoticcells,Nature Communications,2629(2018).

实施例2

1.抗BCMA或抗CD19 CAR-T细胞的体外细胞毒性检测

1.1分别制备包含抗BCMA CAR线性mRNA、抗BCMA CAR环状RNA、抗CD19 CAR线性mRNA和抗CD19 CAR环状RNA的CAR-T细胞。具体来说，将pDA-M12.BBZ、pCA-M12.BBZ和pCA70-M12.BBZ CAR质粒中的M12.BBZ替换为BCMA CAR-31或FMC63 CAR，从而生成pDA-BCMA CAR-31、pCA-BCMA CAR-31和pCA70-BCMA CAR-31。将pDA-M12.BBZ、pCA-M12.BBZ和pCA70-M12.BBZ CAR质粒中的M12.BBZ替换为FMC63 CAR，从而生成pDA-FMC63 CAR、pCA-FMC63 CAR和pCA70-FMC63 CAR。按照实施例1所述方法进行体外转录并纯化这些质粒，得到BCMA CAR-31线性mRNA、BCMA CAR-31环状RNA、BCMA CAR-31环状RNA-70A、FMC63 CAR线性mRNA、FMC63CAR环状RNA和FMC63 CAR环状RNA-70A，并分别通过电转移到T细胞中，得到抗BCMA CAR-T和抗CD19 CAR-T细胞，其中线性mRNA源自pDA-CAR质粒，环状RNA源自pCA-CAR质粒，环状RNA-70A源自pCA70-CAR质粒。BCMA CAR-31是一种包含GM-CSF信号肽、BCMA31 scFv(SEQ ID NO:244)、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域(TM)、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域的CAR。BCMACAR-31的氨基酸序列如SEQ ID NO:256所示，其核酸序列如SEQ ID NO:1003所示。FMC63CAR是一种商业可得的抗CD19 CAR，包括CD8信号肽、抗FMC63 scFv、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域(TM)、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:997所示，其核酸序列如SEQ ID NO:998所示。

1.2在共培养前12小时，将RPMI-8226-CBG和Raji-CBG细胞接种到平底96孔板中，3000个细胞/100μl/孔。

1.3电转后大约12到24小时，计数并将CAR-T细胞稀释至适当浓度，以E/T比为2:1将细胞接种到肿瘤细胞中，每孔100μl。

1.4将共培养板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。

1.5扫描4天后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)以计算杀伤效率。

使用这些CAR-T细胞与表达BCMA或CD19的肿瘤细胞进行的共培养实验还显示，环状RNA-70A CAR-T组的杀伤能力比线性mRNA CAR-T组和环状RNA CAR-T组更高(图14A-14B)。

2.检测LACOSTIM表达的M12 CAR-T细胞、LACOSTIM表达的BCMA CAR-T细胞、 LACOSTIM表达的FMC63 CAR-T细胞的体外细胞毒性。

2.1通过电转LACOSTIM和M12 CAR线性mRNA或环状RNA生成LACOSTIM表达的M12CAR-T细胞。具体来说，将pDA-M12.BBZ和pCA70-M12.BBZ CAR质粒中的M12.BBZ替换为A40C28(SEQ ID NO:600)，生成pDA-A40C28和pCA70-A40C28质粒。按照实施例1的方法制备M12.BBZ线性mRNA和M12.BBZ环状RNA-70A。按照本例所述的方法制备BCMA CAR-31线性mRNA、BCMA CAR-31环状RNA-70A、FMC63 CAR线性mRNA和FMC63 CAR环状RNA-70A。按照实施例1的方法对pDA-A40C28和pCA70-A40C28质粒进行体外转录并纯化，得到A40C28线性mRNA和A40C28环状RNA-70A。

2.2 5E6 T细胞电转10μg M12.BBZ线性RNA和10μg A40C28线性RNA，或10μgM12.BBZ环状RNA-70A和10μg A40C28环状RNA，生成LACOSTIM表达的M12CAR-T细胞。LACOSTIM表达的BCMA31 CAR-T细胞和LACOSTIM表达的CD19CAR-T细胞以相同的方法制备，只是将M12.BBZ线性RNA和M12.BBZ环状RNA-70A替换为BCMA CAR-31线性mRNA和BCMA CAR-31环状RNA-70A，或FMC63CAR线性mRNA和FMC63 CAR环状RNA-70A。

2.3在共培养前12小时，将OVCAR3-CBG、RPMI-8226-CBG和Raji-CBG细胞接种到平底96孔板中，3000个细胞/100μl/孔。

2.4电转后大约12到24小时，计数并将三组CAR-T细胞(详见表1)稀释至适当浓度，以E/T比为2:1将细胞接种到肿瘤细胞中，每孔100μl。

2.5表1：

2.6将共培养板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。

2.7扫描4天后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)以计算杀伤效率。

如图15A-15C所示，使用这些CAR-T细胞进行的共培养实验(有或没有LACOSTIM表达)表明，环状RNA-70A CAR-T组的杀伤能力比线性mRNA CAR-T组更高，LACOSTIM表达的CAR-T细胞比仅有CAR的细胞具有更高的杀伤能力，并且环状RNA中LACOSTIM表达的CAR-T细胞的杀伤能力也高于线性LACOSTIM表达的CAR-T细胞。

实施例3：靶向MESO、CD123抗体和BCMA抗体、CAR的制备。

抗体的制备

抗体的制备使用了全人源抗体噬菌体展示库，已在专利申请号PCT/CN2022/112724、PCT/CN2022/112728和PCT/CN2022/112726中描述，这些抗体能够特异性识别间皮素(MESO)(共37种抗体，分别为M1-M37)、CD123(共35种抗体，分别为C1-C35)和BCMA(共15种抗体，分别为BCMA21-BCMA35)。图16A-16C提供了抗人间皮素(或BCMA、CD123)-Fc单克隆噬菌体ELISA的两块96孔板的读数。

克隆和序列分析：根据ELISA结果选择阳性克隆，并将其作为模板进行scFv序列的PCR克隆。通过abysis网站(http://abysis.org/)按照Kabat编号方案分析scFv的CDR区。在T细胞中筛选功能性抗BCMAscFv：将抗BCMAscFv构建到含有IRES-截短EGFR(tEGFR)表达盒的双顺反子慢病毒CAR表达载体中。通过瞬时转染293T细胞生成慢病毒，然后通过超速离心进行纯化和浓缩。将T细胞转导CAR慢病毒以生成CAR-T细胞，并再培养10天。慢病毒转导10天后，收集CAR-T细胞并用5μg/ml的CD19-Fc蛋白质(对照Fc蛋白质)或BCMA-Fc重组蛋白质在4℃下染色30分钟。洗涤后，用抗人IgG Fc和抗EGFR单抗对CAR-T细胞进行染色。样品通过流式细胞术进行分析。结果显示，表达以下抗BCMAscFv的CAR-T细胞对BCMA-Fc具有结合能力(图17B)，并被选用于进一步研究：BCMA21(SEQ ID NO:237)、BCMA22(SEQ ID NO:238)、BCMA23(SEQ ID NO:239)、BCMA24(SEQ ID NO:240)、BCMA27(SEQ ID NO:241)、BCMA28(SEQID NO:242)、BCMA30(SEQ ID NO:243)、BCMA31(SEQ ID NO:244)、BCMA32(SEQ ID NO:245)、BCMA33(SEQ ID NO:246)、BCMA34(SEQ ID NO:247)和BCMA35(SEQ ID NO:248)。

CAR的制备

构建了用于生成不同靶点CAR的mRNA的载体。首先，通过PCR扩增上述抗体的scFv序列(在N端含有CD8信号肽)和CAR片段(从铰链结构域到CD3ζ结构域，包括CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域)，并将其克隆到pDA载体中(Xba1/Sal1)。图18提供了用于CAR mRNA生成的pDA-CAR载体的示意图作为示例。其次，通过体外转录(IVT)制备不同的CAR mRNA。通过Spe1酶切将pDA-CAR质粒线性化，并使用PCR Cleanup试剂盒进行纯化。使用nanodrop测量DNA浓度并通过琼脂糖凝胶电泳检查后，按照生产厂家的操作规程(Thermofisher，货号：AM13455)进行IVT。使用nanodrop测量RNA产物的浓度，并通过PAGE凝胶电泳进行检查。

实施例4：CART的制备和表征

在实施例3中获得的不同靶点的CAR mRNA通过电穿孔导入A549肿瘤细胞和T细胞(CART细胞)，操作步骤如下：收集A549肿瘤细胞和T细胞，用Opti-MEM培养基洗涤3次。将细胞沉淀重悬于Opti-MEM培养基中，调整细胞浓度至1×10e7/ml。将10μg RNA分装至1.5mlEP管中，加入100μl T细胞或A549细胞，并混匀。将100μl细胞与RNA混合物加入BTX电穿孔杯中，轻拍以避免气泡。使用BTX机器进行电穿孔，参数如下：对于T细胞，500伏特，0.7毫秒；对于A549肿瘤细胞，300伏特，0.5毫秒。然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃下培养。

(1)间皮素

通过FACS染色测量CART细胞与不同靶点-Fc重组蛋白质的结合。如图19所示，抗间皮素scFv-M1,-M2,-M3,-M6,-M7,-M8,-M9,-M10,-M11,-M12,-M13,-M14,-M15,-M16,-M17,-M20,-M22,-M23,-M24,-M25,-M27,-M28,-M29,-M30,-M31,-M32,-M33,-M34,-M35,-M36和-M37能够结合间皮素-Fc重组蛋白质。未表达CAR分子的T细胞作为对照(“Mock”)。如图20A-20B所示，间皮素的异位表达水平与通过电穿孔导入A549细胞的间皮素mRNA量相关。

通过体外细胞毒性试验测量间皮素CART细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。将表达EGFP的肿瘤细胞系或用不同量的肿瘤抗原电穿孔处理的EGFP-A549细胞接种于平底96孔板中，3000个细胞/100μl/孔。将CART细胞稀释到适当浓度，与肿瘤细胞按不同E/T比率(如10:1,3:1,1:1)混合接种，每孔100μl。将共培养板置于IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)以计算杀伤效率。

A549细胞低水平表达间皮素。如图21所示，表达抗间皮素scFv-M4,-M22,-M28和-M31的CART细胞有效抑制了A549细胞的生长，表明这些基于scFv的CART细胞对肿瘤细胞具有相对高的细胞毒性。如图22所示，表达抗间皮素scFv-M4,-M6,-M7,-M8,-M9,-M10,-M11,-M12,-M13,-M15,-M20,-M22,-M23,-M24,-M27,-M28,-M31,-M32,-M35和-M38的CART细胞对过表达间皮素的A549肿瘤细胞(用10μg间皮素mRNA电穿孔处理)显示出有效的杀伤作用。如图23A所示，表达抗间皮素scFv-M4,-M6,-M13,-M20,-M27,-M31和-M37的CART细胞对低水平异位表达间皮素的A549肿瘤细胞(用2μg间皮素mRNA电穿孔处理)维持了强杀伤效果。表达抗间皮素scFv-M7,-M8,-M9,-M10,-M11,-M12,-M15,-M23,-M24,-M32,-M35和-M38的CART细胞选择性地对高水平间皮素表达的肿瘤细胞显示高细胞毒性，而对低水平表达的肿瘤细胞则显示出优越的安全性，因为某些正常组织中表达间皮素。

使用ss1 CAR转导的T细胞作为对照进行了单独的实验。在所有测试的CAR中，转导M12 CAR的T细胞表现出比ss1 CART细胞更好的特异性和效力(如图23B所示)。T细胞表达的SS1 CAR分子来源于单链抗间皮素单克隆抗体(scFv，发表在Chowdhury,et al.,1998,ProcNatl Acad Sci USA95:669-674)，其作为对照。SS1 CAR的结构包括ss1.BBZ、CD8铰链、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号结构域。

图23C显示了不同的基于mRNA的抗间皮素CART细胞的杀伤曲线，其中以A549-GFP肿瘤细胞为靶细胞，分别电穿孔0(上面板)，2μg(中间板)或10μg(下面板)间皮素mRNA(E/T比＝10:1)。如图所示，抗间皮素scFv-M12,-M24和-M32 CART细胞对低水平间皮素表达的A549肿瘤细胞(2μg组)具有中等杀伤效果，但对高水平间皮素表达的A549肿瘤细胞(10μg组)具有强杀伤效果。结果表明，这些CART细胞能够特异性靶向高水平间皮素表达的肿瘤细胞，避免损伤低水平表达的正常组织。

图24显示了OVCAR3(人卵巢癌细胞)，H226(人肺癌细胞)，ASPC1(人胰腺肿瘤细胞)，A549(人肺癌细胞)和HCC70(人乳腺癌细胞)用同型对照和抗间皮素单克隆抗体的FACS染色情况。如图所示，某些癌细胞，包括OVCAR3，H226和ASPC1，高水平表达间皮素；A549低水平表达间皮素，而HCC70不表达间皮素。

(2)BCMA

我们使用了上述抗BCMAscFv构建了12种不同的抗BCMA CAR。此外，还有三个CART产品在平行测试中，包括NBC10(诺华公司和宾夕法尼亚大学，BMCA10.BBz)、FHVH33(美国国立卫生研究院)和B38M(南京传奇生物科技)。所有测试的CAR都包含41BBz共刺激结构域。

表2：BCMA CART、CAR％和表达水平

CART	scFv	CAR％	MFI
				1	NBC10	22％	1.2E+05
2	FHVH33	84％	3.2E+05
				3	BCMA21	31％	1.6E+05
4	BCMA22	12％	7.5E+04
				5	BCMA23	18％	2.2E+05
6	BCMA24	23％	9.4E+04
				7	BCMA27	27％	1.7E+05
8	BCMA28	29％	6.5E+04
				9	BCMA30	25％	4.6E+04
10	BCMA31	37％	2.5E+05
				11	BCMA32	19％	5.6E+04
12	BCMA33	27％	2.6E+05
				13	BCMA34	16％	9.5E+04
14	BCMA35	18％	1.1E+05
				15	B38M	51％	5.8E+05
16	NTD

T细胞通过慢病毒载体转导，以表达不同的BCMA CAR。上面的表2显示了本文披露研究中使用的CAR-T细胞、CAR表达细胞的百分比及其相应的表达水平。图25A和图25B分别显示了CAR+T细胞的频率及其表达水平(平均荧光强度，MFI)。在我们生成的十二种scFv中，BCMA31(#10，SEQ ID NO:256)和BCMA33(#12，SEQ ID NO:258)的表达水平高于其他种类。图26显示了各测试CAR-T细胞中CAR+CD8细胞的频率。图27展示了CAR-T细胞的表型。BCMA27(#7)、BCMA31(#10)和BCMA33(#12)T细胞中未分化T细胞群(CD45RO-；CCR7+)的频率高于其他样本，表明这些T细胞分化程度较低。

(3)CD123

CD123 CAR mRNA通过电穿孔的方法导入T细胞中，具体步骤如下：收集T细胞，用Opti-MEM培养基洗涤，重新悬浮于Opti-MEM培养基中，浓度为1×10e7/ml；将10μg RNA与100μl T细胞等分混合，混匀后在BTX机器上以500伏特，0.7毫秒的参数进行电穿孔；然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃下培养。

通过FACS染色测量CD123 CAR-T细胞与CD123-Fc重组蛋白质的结合。如图28所示，表达具有抗CD123 scFv-C1、-C2、-C3、-C4、-C5、-C6、-C7、-C9、-C10、-C11、-C13、-C14、-C15、-C16、-C17、-C18、-C19、-C21、-C23、-C24、-C25、-C26、-C27、-C28、-C29、-C30、-C32、-C33、-C34和-C35的CAR-T细胞能够与CD123-Fc重组蛋白质结合。Mock组为未带有CAR分子的对照T细胞。

将不同量的CD123 mRNA电穿孔到A549肿瘤细胞中。电穿孔程序与上述T细胞的程序相同，但设置为300伏特，0.5毫秒。通过FACS染色使用同型对照或抗CD123抗体测量电穿孔不同量的CD123 mRNA的A549肿瘤细胞中CD123的表达。如图29所示，A549细胞弱表达内源性CD123，外源性CD123的表达水平与电穿孔到A549细胞中的CD123 mRNA量相关。

通过体外细胞毒性实验测量CD123 CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。将EGFP表达的肿瘤细胞或电穿孔不同量肿瘤抗原的EGFP-A549细胞接种到平底96孔板中，3000细胞/100μl/孔；将CAR-T细胞稀释至适当浓度，与100μl肿瘤细胞按不同的E/T比例(如10:1、3:1、1:1)接种；然后将共培养板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。经过3天扫描后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)以计算杀伤效率。

图30和图31显示了不同mRNA构建的抗CD123 CAR-T细胞在10:1(图30)或3:1(图31)E/T比例下对A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。如图所示，表达抗CD123scFv-C2、-C3、-C4、-C6、-C9、-C11、-C13、-C14、-C15、-C16、-C17、-C19、-C21、-C23、-C24和-C32的CAR-T细胞有效地抑制了A549细胞的生长，甚至消灭了A549细胞，尽管A549细胞低水平表达内源性CD123，表明这些基于scFv的CAR-T细胞对肿瘤细胞具有较高的细胞毒性。

图32和图33显示了不同mRNA构建的抗CD123 CAR-T细胞在10:1(图32)或3:1(图33)E/T比例下对表达外源性CD123(电穿孔10μg CD123 mRNA)的A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。如图所示，表达抗CD123 scFv-C1、-C2、-C3、-C4、-C5、-C6、-C7、-C9、-C11、-C13、-C14、-C15、-C16、-C17、-C18、-C19、-C21、-C23、-C24、-C25、-C26、-C27、-C28、-C29、-C30、-C32、-C33、-C34和-C35 CAR-T细胞有效地抑制了CD123表达的A549肿瘤细胞的生长，甚至减少了这些细胞的数量，确认了它们杀死CD123表达肿瘤细胞的能力。

实施例1-2中筛选的抗体和CAR的序列如表3和表4所示。

表3 scFv(Kabat)的CDR区

表4序列与SEQ ID NO的对应关系

实施例5转导CAR或共同转导CAR和LACOSTIM的细胞检测

除非另有说明，否则靶向不同靶点的CAR和CART的构建如前述实施例3-4中所述。

5.1间皮素CART或共转导有CAR和LACOSTIM的间皮素CART

5.1.1:共转导有间皮素CAR和LACOSTIM的T细胞的细胞因子产生

构建了共表达LACOSTIM(A40C28，SEQ ID NO:600)和M12或ss1的慢病毒载体，以及仅包含M12、M32或ss1 CAR的载体(图34A)。使用这些慢病毒载体转导T细胞，并通过流式细胞术检测CAR表达(图34B)。通过与表达低水平或高水平MSLN的MSLN阴性肿瘤PC3(图34C上图)或MSLN阳性肿瘤系OVCAR3和H266(图34C下图)共培养，测试这些转导细胞的功能以评估其特异性和活性。在测试MSLN低表达肿瘤PC3或PC3+Meso 0.5μg时，结果显示，A40C28-M12的背景细胞因子分泌略高于仅M12，但低于仅ss1，表明共表达LACOSTIM和M12 CAR的T细胞比之前临床使用的ss1 CAR更安全且能更特异地识别MSLN高表达的肿瘤。

5.1.2:间皮素表达癌细胞特异性激活抗间皮素CART细胞和表达LACO的间皮素CART细胞

CD107a是T细胞早期激活的标志。通过以下步骤检测间皮素CARTs被间皮素表达肿瘤细胞激活的情况：每孔加入20μl PE-CD107a单克隆抗体，将肿瘤细胞稀释至2×10e6/ml，接种在96孔圆底板上(每孔100μl)；将CAR-T细胞稀释至1×10e6/ml，接种在96孔圆底板上(每孔100μl)；以500rpm×5分钟离心使细胞附着，并在37℃下培养1小时；将Golgi stop以1500倍稀释的培养基加入每孔(每孔20μl)；在37℃下培养2.5小时后，用抗CD3-APC和抗CD8-FITC抗体在37℃下染色30分钟，洗涤后进行流式细胞术分析。

准备了共表达LACOSTIM(如A40C28；SEQ ID NO:600)的CART细胞，并通过CD107a染色确认其被肿瘤细胞激活的情况。制备了包括mock T细胞(未电转)、含A40C28的T细胞、抗间皮素M12 CART细胞(M12 CART)、共表达A40C28的M12CART细胞(M12+A40C28 CART)、M32CART细胞和M32+A40C28 CART细胞等各种mRNA CART细胞。这些细胞与各种癌细胞系(OVCAR3、H226、ASPC1、A549和HCC70)共培养，并通过流式细胞术测量CD107a表达。结果显示，抗间皮素M12和M32 CAR-T细胞被间皮素高表达的OVCAR3、H226和ASPC1特异性激活，但未被低或不表达间皮素的A549和HCC70激活(图35)。

5.1.3:表达LACO的间皮素CART细胞的肿瘤杀伤作用

在肿瘤杀伤试验中测量提供的间皮素CART细胞的肿瘤杀伤效果。与A549-GFP肿瘤细胞共培养了包括mock T细胞(未电转)、含A40C28的T细胞、抗间皮素M12CART细胞、共表达A40C28的M12 CART细胞、M32 CART细胞和共表达A40C28的M32 CART细胞等各种mRNA抗间皮素CAR-T细胞，这些A549-GFP肿瘤细胞被电穿孔0、0.5μg和10μg间皮素mRNA，E/T比为3:1。结果显示，抗间皮素scFv-M12和-M32 CART细胞对低间皮素表达的A549肿瘤细胞(0.5μg组)具有低杀伤效果，对高间皮素表达的A549肿瘤细胞(10μg组)具有强杀伤效果，而A40C28显著提高了CART细胞对间皮素表达肿瘤细胞的杀伤效率(图36)。

基于慢病毒的CART细胞通过以下步骤生成：从外周血单个核细胞(PBMC)中分离出T细胞，并通过抗CD3/CD28磁珠(T细胞：磁珠＝1:3)激活。在第1天，激活的T细胞以感染复数(MOI)为3的慢病毒转染。在第7天，通过FACS染色评估T细胞的转染效率。通常，转染效率在10％到70％之间。CART细胞培养至第14天，随后立即用于功能研究或使用液氮冷冻保存。

测量了基于慢病毒的抗间皮素CART细胞的肿瘤杀伤效果。包括mock T细胞(UTD)、M12 CART细胞、M12+A40C28 CART细胞在内的CART细胞与不同癌细胞共培养，包括H226、OVCAR3和MOLM14，这些细胞以0或μgμg间皮素mRNA电穿孔，效靶比为2:1。如图37所示，M12CART细胞和M12+A40C28 CART细胞均对表达间皮素的癌细胞显示出强大的杀伤效果，且共表达A40C28大大提高了杀伤效率。

第二种分子LACOSTIM(1412-4D11，SEQ ID NO:813)也被制备并用于研究。制备了各种基于mRNA的抗间皮素CART细胞，包括mock T细胞(未电转)、M12 CART细胞、M12+1412-4D11 CART细胞、M32 CART细胞和M32+1412-4D11 CART细胞。这些CART细胞与以0或2μg间皮素mRNA电穿孔的A549-GFP肿瘤细胞共培养，效靶比(E/T)为10:1。如图38所示，M12和M32CART细胞均对表达间皮素的A549肿瘤细胞(2μg组)表现出有效的杀伤作用，且共表达1412-4D11显著提高了CART细胞的杀伤效率。

5.1.4:共转导有间皮素CAR和LACOSTIM的T细胞的溶解活性

慢病毒载体转导的T细胞的功能，通过其对不同水平MSLN表达的肿瘤细胞系(0.2μg MSLN RNA转导的PC3或MOLM14，10μg MSLN RNA转导的PC3或MOLM14，MSLN阳性肿瘤OVCAR3和H226)的杀伤能力进行测试。结果如图39显示，对于MSLN阴性肿瘤PC3或MOLM14，M12和M12-A40C28的背景杀伤低于M32CAR、ss1 CAR和ss1 CAR+A40C28；对于低MSLN表达的肿瘤PC3+0.5μg MSLN和MOLM14+0.5μg MSLN，M12和M12-A40C28的背景杀伤也低于M32 CAR、ss1CAR和ss1 CAR+A40C28；而对于MSLN高表达的肿瘤，M12+A40C28表现出有效的肿瘤杀伤，尽管低于ss1或ss1+A40C28。因此，M12+A40C28 CAR显示出比ss1 CAR更好的安全性。

5.1.5:间皮素CART对多种肿瘤细胞的有效杀伤

间皮素CART细胞的肿瘤杀伤效果在其他肿瘤细胞中得到进一步确认。通过FACS染色使用同型对照、抗间皮素单克隆抗体和抗CD40单克隆抗体检测肿瘤细胞(OVCAR3、H226、ASPC1、A549、HCC70、786-O和Jeko1)中的间皮素和CD40表达。结果(图40)显示，OVCAR3、H226和ASPC1高水平表达间皮素；A549、HCC70、786-O和Jeko1低水平或不表达间皮素。此外，OVCAR3、786-O和Jeko1高水平表达CD40，而H226、A549、HCC70和ASPC1低水平或不表达CD40。

分别共培养包括mock T细胞(未电转)、仅含A40C28的T细胞、仅含1412-4D11的T细胞、M12 CART细胞、M12+A40C28 CART细胞、M12+1412-4D11 CART细胞、M32 CART细胞、M32+A40C28 CART细胞和M32+1412-4D11 CART细胞在内的各种基于mRNA的抗间皮素CART细胞与OVCAR3、H226、ASPC1、A549、HCC70、786-O或Jeko1肿瘤细胞系。CD107a染色结果(图41)显示，抗间皮素M12和M32 CART细胞被高间皮素表达的肿瘤细胞特异性激活，但不被低或不表达间皮素的肿瘤细胞系激活。A40C28和1412-4D11显著提高了CART细胞对间皮素和/或CD40表达肿瘤细胞的杀伤效率。

进一步在杀伤曲线(图42)中显示了包括mock T细胞(未电转)、M12 CART细胞、M12+A40C28 CART细胞、M12+1412-4D11 CART细胞、M32 CART细胞、M32+A40C28 CART细胞和M32+1412-4D11 CART细胞在内的各种基于mRNA的抗间皮素CART细胞，分别与OVCAR3-GFP、H226-GFP或ASPC1肿瘤细胞以E/T比＝3:1共培养。结果显示，抗间皮素scFv-M12和-M32CART细胞对间皮素过表达的A549肿瘤细胞具有中等杀伤效果，而共表达1412-4D11或A40C28显著提高了这些间皮素CART细胞对间皮素和/或CD40表达肿瘤细胞的杀伤效率。

通过ELISA检测了在CART杀伤试验中的IFN-γ和IL2分泌。包括mock T细胞(未电转)、M12 CART细胞、M12+A40C28 CART细胞、M12+1412-4D11 CART细胞、M32 CART细胞、M32+A40C28 CART细胞和M32+1412-4D11 CART细胞在内的各种基于mRNA的抗间皮素CART细胞，分别与OVCAR3-GFP、H226-GFP或ASPC1肿瘤细胞以E/T比＝3:1共培养。如图43所示，当CART细胞被所有测试的癌细胞刺激时，与LACO(A40C28或1412-4D11)共表达显著增强了CART细胞释放IFN-γ和IL2的能力。

5.1.6:与间皮素CAR和LACOSTIM共转导的T细胞特异性测试

通过流式细胞术检测一组肿瘤的MSLN或CD40的表达情况(图44A)。用慢病毒载体转导的T细胞被不同表达水平MSLN和CD40的肿瘤细胞系刺激，并通过流式细胞术检测CD137的上调情况。结果发现，M12或A40C28-M12 CART细胞仅对高表达MSLN的肿瘤OVCAR3和H266具有反应性，而ss1或ss1-A40C28 CART细胞对某些低表达MSLN的肿瘤的活性高于M12 CART细胞(图44B)。

5.1.7:A40C28-M12 LVV CART在H226异种移植NOG肿瘤模型中的抗肿瘤效力

为了验证A40C28-M12慢病毒载体(LVV)CART在体内的抗肿瘤效力和功效，将NSG小鼠皮下注射(s.i.)5E6个转导了绿色荧光蛋白质(CBG)的H226肿瘤细胞(H226-CBG)。11天后，小鼠按指示(图45A-45B)分别静脉注射(i.v.)1E6或5E6个CAR阳性T细胞。不同时间点测量肿瘤体积(图45C)和生物发光的平均辐射(图45D)。结果显示，在5M剂量下，M12 CAR和A40C28-M12 CAR组均能有效控制肿瘤生长，其中A40C28-M12 CAR的效率略高于单独使用M12 CAR。在1M剂量下，A40C28-M12 CART略微且暂时地控制了肿瘤生长，而M12未能控制肿瘤生长，与未转导的T细胞(UTD)和单独使用A40C28的组一样。

5.1.8:A40C28-M12 LVV CART在H226异种移植NOG肿瘤模型中的抗肿瘤效力

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)位于肿瘤微环境中，是针对肿瘤细胞特异性免疫反应的基本要素，并在多种癌症中具有预后重要性。为了探索A40C28 LACOSTIM对TILs的影响，从处理2周的小鼠中分离出TILs(图46A)。通过多重免疫组化(mIHC)检测肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、颗粒酶B+T细胞和MSLN+靶细胞的分布(图46B)。结果表明，A40C28 LACO促进了在处理过的H226异种移植模型中TILs(CD4+和CD8+)的浸润和/或增殖(图46C)。

5.2BCMA CART或CAR和LACOSTIM共转导的BCMA CART

5.2.1:肿瘤细胞中BCMA的表达

如图47A和47B所示，通过FACS染色(图47A)和RT-PCR(图47B)检测了不同肿瘤细胞系中BCMA的表达。通过FACS染色检测到Jeko-1(低水平)、Raji(中等水平)和RPMI-8226细胞(高水平)中有BCMA表达。尽管在Nalm6细胞中未通过FACS检测到BCMA表达，但RT-PCR分析显示其表达量非常低。

5.2.2:BCMA CART显示出对肿瘤细胞的细胞毒性

将CART细胞与Jeko-1细胞和RPMI-8226肿瘤细胞共培养，检测INF-γ和IL-2的产生。如图48A(INF-γ)和48B(IL-2)所示，我们生成的12种CART细胞中，BCMA23(#5；SEQ IDNO:251)、BCMA24(#6；SEQ ID NO:252)、BCMA27(#7；SEQ ID NO:253)、BCMA31(#10；SEQ IDNO:256)和BCMA33(#12；SEQ ID NO:258)产生的细胞因子比其他细胞(包括NBC10和B38MCAR T细胞)更多。

我们还分别检测了CART细胞对Jeko-1(图49A-49D)和RPMI-8226细胞(图50A-50E)的细胞溶解活性。BCMA23(#5)、BCMA24(#6)、BCMA31(#10)和BCMA33(#12)CART细胞对Jeko-1细胞显示出不同程度的细胞毒性，其中BCMA31(#10)最高，能有效消除Jeko-1(图49C-49D)。此外，BCMA21(#3；SEQ ID NO:249)、BCMA22(#4；SEQ ID NO:250)、BCMA23(#5；SEQ ID NO:251)、BCMA24(#6；SEQ ID NO:252)、BCMA27(#7；SEQ ID NO:253)、BCMA31(#10；SEQ ID NO:256)、BCMA33(#12；SEQ ID NO:258)、BCMA34(#13；SEQ ID NO:259)和BCMA35(#14；SEQ IDNO:260)对RPMI-8226细胞显示出不同程度的细胞毒性，其中BCMA21(#3)、BCMA23(#5)、BCMA24(#6)、BCMA27(#7)、BCMA31(#10)和BCMA33(#12)能有效消除RPMI-8226细胞。

5.2.2:装甲BCMA31 CAR T细胞显示出更强的抗肿瘤活性

LACO(例如，在本研究中使用的A40C.CD28)是一种开关受体，可以结合CD40抗原并激活T细胞中的CD28信号通路。在本研究中，LACO-BCMA31 CART细胞、BCMA31 CAR T细胞和B38M CAR T细胞生成如下。首先，生成并转导慢病毒至T细胞以表达BCMA31.BBz(SEQ IDNO:256)、LACO-BCMA31.BBz(SEQ ID NO:601)和B38M.BBz。如图51A-51B所示，B38M.BBz的表达水平最高。LACO-BCMA31.BBz构建体中的BCMA31.BBz表达水平低于仅BCMA31.BBz构建体中的表达水平。此外，LACO-BCMA31 CART的扩增速度比BCMA31 CART和B38M CART快得多(图52A)，且BCMA31和B38M CART细胞的大小比LACO-BCMA31和NTD T细胞大(图52B)。

我们将这些T细胞与一组肿瘤细胞共培养，检测T细胞产生的INF-γ和IL-2。当与Jeko-1和Raji共培养时，LACO-BCMA31 T细胞产生的IL-2显著多于其他T细胞类型(图53A)。当与Nalm6、Jeko-1和Raji共培养时，LACO-BCMA31 T细胞产生的INF-γ也显著多于其他T细胞类型(图53B)。

我们在体内评估这些CAR T细胞的功能。通过静脉注射在NSG小鼠中建立Jeko-1肿瘤细胞模型。九天后，通过静脉注射注入T细胞。生物发光成像显示，BCMA31(SEQ ID NO:256)、LACO-BCMA31(SEQ ID NO:601)、BCMA31-LACO(SEQ ID NO:602)和B38M T细胞显著减少了肿瘤生长。LACO-BCMA31和BCMA31-LACO T细胞具有最大的抗肿瘤效果(图55A-55C)。

接下来，我们将BCMA31.BBz、LACO或BCMA31.BBz和LACO mRNA电穿孔至T细胞以进行瞬时表达。T细胞中CAR和LACO的表达如图55和下表5所示。

表5电转导mRNA的T细胞产品

我们将T细胞与不同的肿瘤细胞共培养四小时，然后检测T细胞对肿瘤细胞的激活情况。在与BCMA+肿瘤细胞(包括Nalm6、Jeko-1、RPMI-8226和Raji)共培养时，BCMA31 T细胞和BCMA31+LACO T细胞的CD107a强烈激活(图56)。

通过Incucyte活细胞分析系统进一步确认了对肿瘤细胞的细胞毒性T细胞活性。与NTD(未转导)和单独表达LACO的T细胞相比，BCMA31 T细胞和BCMA+LACO T细胞有效地控制了BCMA+肿瘤细胞的生长(图57A-57D)。

5.3CD123 CART或共转导CAR和LACOSTIM的CD123 CART

5.3.1:CART细胞的CD107a染色

通过FACS染色测量各种肿瘤细胞系的CD123表达。图58显示了用PE同型对照和PE-抗CD123单抗染色的A549、SK-OV3、Jeko-1、Molm-14、SupT-1、293T、Nalm-6和PC-3细胞的FACS染色结果。如图所示，大多数测试的肿瘤细胞系不表达CD123，只有Molm-14相对高水平地表达CD123。

CD107a是T细胞早期激活标志。通过CD107a染色测量由表达CD123的肿瘤细胞激活的CD123 CART，具体程序如下：在每孔96孔板中加入20μl PE-CD107a单抗；肿瘤细胞稀释至2×10e6/ml，种在96孔圆底板中(100μl/孔)；CART细胞稀释至1×10e6/ml，种在96孔圆底板中(100μl/孔)；板子以500rpm离心5分钟，使细胞贴壁，并在37℃培养1小时；用培养基稀释1500倍的Golgi stop，每孔加入20μl；在37℃下培养2.5小时，加入抗CD3-APC和抗CD8-FITC抗体在37℃染色30分钟，洗涤后进行流式细胞术分析。

在我们的研究中，通过CD107a染色测量由表达CD123的肿瘤细胞激活的CARTs(表达抗CD123-C5、抗CD123-C7、抗CD123-C11)。测试的细胞包括电穿孔10μg、0.1μg和0μgCD123 mRNA的A549、SK-OV3、PC-3、脐带血来源的CD34+造血干细胞(CD34+脐带)、骨髓来源的CD34+造血干细胞(CD34+M)、Molm-14、Nalm6、Jeko-1肿瘤细胞系和新鲜分离的患者AML肿瘤细胞(CD123+)。如图59所示，表达抗CD123-C5、-C7和-C11的CART细胞被高表达CD123的肿瘤细胞特别是CD123+AML肿瘤细胞特异性激活，而低表达CD123的肿瘤细胞系未能激活这些CART细胞。这些结果表明，肿瘤细胞的CD123表达可以激活CD123 CARTs。

5.3.2:表达LACO的CD123 CART细胞的肿瘤杀伤

通过肿瘤杀伤试验测量提供的CD123 CART细胞的细胞溶解活性。在这项研究中使用了LACOSTIM A40C28。各种基于mRNA的抗CD123 CART细胞，包括mock T细胞(未电转)、表达C5 CAR(SEQ ID NO:494)的T细胞、表达C5 CAR和A40C28(SEQ ID NO:600)的T细胞、表达C7 CAR(SEQ ID NO:495)的T细胞、表达C7CAR和A40C28的T细胞、表达C11 CAR(SEQ ID NO:496)的T细胞和表达C11 CAR和A40C28的T细胞，与Molm-14、Nalm6、Jeko-1肿瘤细胞以E/T比＝10:1共培养。如图60所示，共表达LACO(A40C28)提高了CART细胞对所有肿瘤细胞的杀伤效率。

进一步在电穿孔0、0.1μg或10μg CD123 mRNA的A549细胞中检验CD123 CART细胞的细胞溶解活性。如图62所示，A549细胞中CD123的异位表达水平与CD123CARTs对这些肿瘤的细胞溶解活性相关。再次，共表达LACO持续增强了CART细胞的抗肿瘤效果(图61)。

在CART杀伤试验中通过ELISA检测IFN-γ释放。如图62所示，表达CD123的癌细胞(如MOLM14细胞，特别是患者001的AML细胞)促进了CART细胞的IFN-γ释放；并且共表达LACO(A40C28)进一步增强了这种释放。

实施例6:CD40 LACO

6.1抗人CD40单克隆抗体的制备

使用全人抗体噬菌体展示库按以下步骤制备抗CD40抗体：(1)噬菌体展示库的表达和纯化；(2)CD40特异性scFv-噬菌体的选择；(3)mpELISA筛选：经过三轮选择后，选择阳性克隆进行单克隆噬菌体ELISA(mpELISA)筛选。通过单个细菌克隆产生噬菌体上清液，并测试其对CD40-6His蛋白质的结合。上清液与预封闭的涂有2μg/ml CD40-6His蛋白质的Maxisorp板孵育。经过三次洗涤后，每孔加入100μl稀释1:5000的HRP-结合抗M13抗体的封闭缓冲液(5％牛奶+1％BSA在1×PBS中)并在室温下孵育60分钟。用PBST洗板五次后，每孔加入100μl TMB底物溶液并孵育10-30分钟直至出现蓝色。通过每孔加入50μl终止溶液(2NH2SO4)终止反应。在微孔板读数器上读取450nm处的吸光度。图63显示了五个代表性的96孔抗人CD40-Fc单克隆噬菌体ELISA板。

克隆和序列分析：根据ELISA结果选择了总共56个阳性克隆，并用作PCR克隆scFv序列的模板。通过abysis网站(http://abysis.org/)根据Kabat编号方案分析scFv的CDR区域，并在SEQ ID NO：828-863中提供。

6.2 CD40 scFv-CD28(LACO)融合蛋白质的制备

由Sangon Biotech(上海，中国)合成CD40 scFv-CD28融合体。接下来，通过Spe1酶切割线性化pUC57-CAR质粒。通过琼脂糖DNA凝胶检查消化的完整性。使用PCR Cleanup试剂盒(#28106，QIAGEN)纯化线性化载体，并用试剂盒中的EB洗脱水洗脱。通过nanodrop测量DNA浓度。然后，按照制造商(Thermofisher，Cat No:AM13455)的操作规程进行体外转录(IVT)。对于一次反应，加入1μg模板DNA、NTP/ARCA缓冲液、T7缓冲液、GTP、T7酶和无RNA酶水到0.2ml PCR管中并在37℃孵育3小时。3小时后，每个反应加入2μl Dnase并在37℃孵育15分钟。根据制造商的操作规程进行尾部程序。使用Rneasy Mini试剂盒(#74106，QIAGEN)纯化IVT mRNA，并用无RNA酶的水洗脱。通过nanodrop测量RNA浓度。通过琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性和大小。

通过FACS染色测量表达在CART细胞上的抗CD40 scFv与CD40-Fc蛋白质的结合。如图64所示，C5、C7、C8和C9显示出对CD40-Fc重组蛋白质的强结合。

6.3肿瘤细胞系和原代人类淋巴细胞

通过使用含绿色荧光蛋白质(CBG)和增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)的慢病毒转染A549细胞，并随后转染HLA-A2，生成了A549-ESO-CBG细胞系。从正常供体中提取的原代淋巴细胞使用抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies)刺激，并在R10培养基(RPMI-1640补充10％胎牛血清；Invitrogen)中培养。T细胞在刺激后第10天冷冻保存于90％胎牛血清和10％ DMSO的溶液中，浓度为1e8细胞/小瓶。

6.4 LACO表达的CART细胞的制备和表征

本文提供的LACO表达的CART细胞通过电穿孔按以下步骤制备：收集T细胞并用Opti-MEM培养基清洗3次。将细胞沉淀重悬于Opti-MEM培养基中，并将细胞浓度调整为5×10⁷/ml。将一定量的RNA分装到1.5ml的EP管中，加入100μl的T细胞(≥5×10⁶细胞)，轻轻混合以避免气泡。使用BTX机器在以下参数下对T细胞进行电穿孔：500伏，0.7毫秒，单次脉冲。然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃下培养。

表6：本研究使用的RNA

ID	RNA(每个10μg)
		C4	40-18.28+4D5.BBZ
C5	40-37.28+4D5.BBZ
		C6	40-38.28+4D5.BBZ
C7	40-45.28+4D5.BBZ
		C8	40-47.28+4D5.BBZ
C9	40-52.28+4D5.BBZ
		C11	A40C28+4D5.BBZ
C13	4D5.BBZ
		C14	未电转

4D5:抗Her2(scFv)；4D5.BBZ:含有4D5、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号结构域的抗Her2 CAR；40-18.28:含有抗CD40 scFv 40-18与CD28胞内结构域融合的LACOSTIM(其他列出的LACOSTIMs 40-37.28,40-37.28,40-37.28,40-37.28,40-37.28,40-37.28也是同样)；A40C28:含有抗CD40scFv A40C与CD28胞内结构域融合的LACOSTIM；未电转:不含CAR的T细胞。

LACO表达的CART细胞对肿瘤细胞的细胞毒性通过体外细胞毒性试验进行测量。将A549-ESO-CGB细胞调整至30,000/ml，并以3000细胞/100μl/孔接种于平底96孔板中。将CART细胞稀释至适当浓度，以100μl/孔与不同效靶比(如10:1,3:1,1:1,或0.3:1)的肿瘤细胞共培养，注意避免气泡。共培养板放入IncuCyte S3机器中，设置扫描参数。经过3天扫描后，分析绿色对象总积分强度(GCU xμm²/孔)以计算杀伤效率。

如图65所示，与仅表达Her2 CAR的T细胞相比，C7、C9或C11 T细胞对肿瘤细胞显示出显著增强的杀伤效果，证实了共表达相应LACOSTIMs增强了CART细胞的肿瘤杀伤效果。

6.5LACO表达的CART细胞被癌细胞特异性激活

CD107a是T细胞早期激活标志物。通过CD107a染色的以下程序测量CART细胞被肿瘤细胞激活情况：每孔96孔板加入20μl PE-CD107a单抗；将肿瘤细胞稀释至2×10⁶/ml，并在96孔圆底板上接种(100μl/孔)；将CART细胞稀释至1×10⁶/ml，并在96孔圆底板上接种(100μl/孔)；板以500转/分钟离心5分钟以附着细胞，并在37℃培养1小时；Golgi stop以1500倍稀释后每孔加入20μl；细胞在37℃继续培养2.5小时，加入抗CD3-APC和抗CD8-FITC抗体在37℃染色30分钟，洗涤并通过流式细胞仪分析。

图66A-66C显示了与A549(图66A)、PC-3(图66B)和SK-OV3(图66C)共培养及杀伤试验中CAR-T细胞的CD107a染色结果。如图所示，与肿瘤细胞共培养的C7、C9和C11 T细胞有更高百分比被激活，证实了共表达相应LACOSTIMs增强了CAR T细胞的肿瘤诱导激活效果。

实施例4中筛选的抗CD40抗体(40-18、40-37、40-38、40-45、40-47和40-52)及相应的LACOSTIMs序列如表7所示。

表7(Kabat)

Claims

1.一种环状RNA，所述环状RNA依次包含内部核糖体进入位点(IRES)元件、蛋白质编码序列和poly A。

2.根据权利要求1所述的环状RNA，其中所述poly A的长度至少为45个核苷酸。

3.根据权利要求1所述的环状RNA，其中所述poly A的长度至少为70个核苷酸。

4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述蛋白质用于治疗用途。

5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述蛋白质包含抗原、抗体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)；优选地，抗体是scFv。

6.根据权利要求5所述的环状RNA，其中所述CAR的结合结构域是抗间皮素scFv。

7.根据权利要求5所述的环状RNA，其中所述蛋白质包含抗体或包含所述抗体作为结合结构域的CAR，其中所述抗体特异性结合间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2、B7H3或CD40。

8.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合间皮素的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下组：

(5)如SEQ ID NO:5所示的LCDR1、如SEQ ID NO:20的LCDR2、如SEQ ID NO:34所示的LCDR3、如SEQ ID NO:49所示的HCDR1、如SEQ ID NO:62所示的HCDR2和如SEQ ID NO:75所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:10所示的LCDR1、如SEQ ID NO:25所示的LCDR2、如SEQ ID NO:39所示的LCDR3、如SEQ ID NO:48所示的HCDR1、如SEQ ID NO:61所示的HCDR2和如SEQ ID NO:80所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:11所示的LCDR1、如SEQ ID NO:26所示的LCDR2、如SEQ ID NO:40所示的LCDR3、如SEQ ID NO:54所示的HCDR1、如SEQ ID NO:67所示的HCDR2和如SEQ ID NO:81所示的HCDR3；

(12)如SEQ ID NO:12所示的LCDR1、如SEQ ID NO:27所示的LCDR2、如SEQ ID NO:41所示的LCDR3、如SEQ ID NO:53所示的HCDR1、如SEQ ID NO:66所示的HCDR2和如SEQ ID NO:82所示的HCDR3；

(13)如SEQ ID NO:13所示的LCDR1、如SEQ ID NO:28所示的LCDR2、如SEQ ID NO:42所示的LCDR3、如SEQ ID NO:55所示的HCDR1、如SEQ ID NO:68所示的HCDR2和如SEQ ID NO:83所示的HCDR3；

(14)如SEQ ID NO:14所示的LCDR1、如SEQ ID NO:29所示的LCDR2、如SEQ ID NO:43所示的LCDR3、如SEQ ID NO:56所示的HCDR1、如SEQ ID NO:69所示的HCDR2和如SEQ ID NO:84所示的HCDR3；和

(15)如SEQ ID NO:15所示的LCDR1、如SEQ ID NO:18所示的LCDR2、如SEQ ID NO:44所示的LCDR3、如SEQ ID NO:57所示的HCDR1、如SEQ ID NO:70所示的HCDR2和如SEQ ID NO:85所示的HCDR3。

9.权利要求8所述的环状RNA，其中所述特异性结合MSLN的抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

10.根据权利要求8所述的环状RNA，其中所述特异性结合间皮素的抗体包含选自SEQID NO：116-130的氨基酸序列。

11.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD123的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下组：

(1)如SEQ ID NO:263所示的LCDR1、如SEQ ID NO:293所示的LCDR2、如SEQ ID NO:321所示的LCDR3、如SEQ ID NO:351所示的HCDR1、如SEQ ID NO:372所示的HCDR2和如SEQ IDNO:396所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:277所示的LCDR1、如SEQ ID NO:305所示的LCDR2、如SEQ ID NO:335所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:382所示的HCDR2和如SEQ IDNO:409所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:267所示的LCDR1、如SEQ ID NO:297所示的LCDR2、如SEQ ID NO:326所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ IDNO:400所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:278所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ ID NO:336所示的LCDR3、如SEQ ID NO:360所示的HCDR1、如SEQ ID NO:383所示的HCDR2和如SEQ IDNO:410所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:283所示的LCDR1、如SEQ ID NO:310所示的LCDR2、如SEQ ID NO:342所示的LCDR3、如SEQ ID NO:359所示的HCDR1、如SEQ ID NO:389所示的HCDR2和如SEQ IDNO:417所示的HCDR3；

(6)如SEQ ID NO:284所示的LCDR1、如SEQ ID NO:311所示的LCDR2、如SEQ ID NO:343所示的LCDR3、如SEQ ID NO:366所示的HCDR1、如SEQ ID NO:388所示的HCDR2和如SEQ IDNO:418所示的HCDR3；

(7)如SEQ ID NO:268所示的LCDR1、如SEQ ID NO:298所示的LCDR2、如SEQ ID NO:327所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ IDNO:377所示的HCDR2和如SEQ IDNO:401所示的HCDR3；

(8)如SEQ ID NO:264所示的LCDR1、如SEQ ID NO:294所示的LCDR2、如SEQ ID NO:322所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ IDNO:394所示的HCDR3；

(9)如SEQ ID NO:285所示的LCDR1、如SEQ ID NO:312所示的LCDR2、如SEQ ID NO:344所示的LCDR3、如SEQ ID NO:367所示的HCDR1、如SEQ ID NO:390所示的HCDR2和如SEQ IDNO:419所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:286所示的LCDR1、如SEQ ID NO:313所示的LCDR2、如SEQ ID NO:345所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ IDNO:420所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:262所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ ID NO:320所示的LCDR3、如SEQ ID NO:350所示的HCDR1、如SEQ ID NO:371所示的HCDR2和如SEQ IDNO:395所示的HCDR3；

(12)如SEQ ID NO:277所示的LCDR1、如SEQ ID NO:306所示的LCDR2、如SEQ ID NO:337所示的LCDR3、如SEQ ID NO:361所示的HCDR1、如SEQ ID NO:384所示的HCDR2和如SEQ IDNO:411所示的HCDR3；

(13)如SEQ ID NO:287所示的LCDR1、如SEQ ID NO:314所示的LCDR2、如SEQ ID NO:346所示的LCDR3、如SEQ ID NO:365所示的HCDR1、如SEQ ID NO:391所示的HCDR2和如SEQ IDNO:421所示的HCDR3；

(14)如SEQ ID NO:269所示的LCDR1、如SEQ ID NO:299所示的LCDR2、如SEQ ID NO:328所示的LCDR3、如SEQ ID NO:357所示的HCDR1、如SEQ ID NO:378所示的HCDR2和如SEQ IDNO:402所示的HCDR3；

(15)如SEQ ID NO:270所示的LCDR1、如SEQ ID NO:300所示的LCDR2、如SEQ ID NO:329所示的LCDR3、如SEQ ID NO:358所示的HCDR1、如SEQ ID NO:379所示的HCDR2和如SEQ IDNO:403所示的HCDR3；

(16)如SEQ ID NO:282所示的LCDR1、如SEQ ID NO:309所示的LCDR2、如SEQ ID NO:341所示的LCDR3、如SEQ ID NO:365所示的HCDR1、如SEQ ID NO:388所示的HCDR2和如SEQ IDNO:416所示的HCDR3；

(17)如SEQ ID NO:265所示的LCDR1、如SEQ ID NO:295所示的LCDR2、如SEQ ID NO:323所示的LCDR3、如SEQ ID NO:352所示的HCDR1、如SEQ ID NO:373所示的HCDR2和如SEQ IDNO:397所示的HCDR3；

(18)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ ID NO:324所示的LCDR3、如SEQ ID NO:353所示的HCDR1、如SEQ ID NO:374所示的HCDR2和如SEQ IDNO:398所示的HCDR3；

(19)如SEQ ID NO:271所示的LCDR1、如SEQ ID NO:301所示的LCDR2、如SEQ ID NO:330所示的LCDR3、如SEQ ID NO:351所示的HCDR1、如SEQ ID NO:380所示的HCDR2和如SEQ IDNO:404所示的HCDR3；

(20)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:291所示的LCDR2、如SEQ ID NO:319所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ IDNO:394所示的HCDR3；

(21)如SEQ ID NO:279所示的LCDR1、如SEQ ID NO:307所示的LCDR2、如SEQ ID NO:338所示的LCDR3、如SEQ ID NO:362所示的HCDR1、如SEQ ID NO:385所示的HCDR2和如SEQ IDNO:412所示的HCDR3；

(22)如SEQ ID NO:288所示的LCDR1、如SEQ ID NO:315所示的LCDR2、如SEQ ID NO:347所示的LCDR3、如SEQ ID NO:368所示的HCDR1、如SEQ ID NO:392所示的HCDR2和如SEQ IDNO:422所示的HCDR3；

(23)如SEQ ID NO:272所示的LCDR1、如SEQ ID NO:299所示的LCDR2、如SEQ ID NO:331所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ ID NO:377所示的HCDR2和如SEQ IDNO:405所示的HCDR3；

(24)如SEQ ID NO:273所示的LCDR1、如SEQ ID NO:302所示的LCDR2、如SEQ ID NO:332所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ IDNO:406所示的HCDR3；

(25)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ ID NO:317所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ IDNO:394所示的HCDR3；

(26)如SEQ ID NO:280所示的LCDR1、如SEQ ID NO:308所示的LCDR2、如SEQ ID NO:339所示的LCDR3、如SEQ ID NO:363所示的HCDR1、如SEQ ID NO:386所示的HCDR2和如SEQ IDNO:413所示的HCDR3；

(27)如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、如SEQ ID NO:303所示的LCDR2、如SEQ ID NO:327所示的LCDR3、如SEQ ID NO:356所示的HCDR1、如SEQ ID NO:377所示的HCDR2和如SEQ IDNO:401所示的HCDR3；

(28)如SEQ ID NO:261所示的LCDR1、如SEQ ID NO:290所示的LCDR2、如SEQ ID NO:318所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:370所示的HCDR2和如SEQ IDNO:394所示的HCDR3；

(29)如SEQ ID NO:262所示的LCDR1、如SEQ ID NO:292所示的LCDR2、如SEQ ID NO:320所示的LCDR3、如SEQ ID NO:350所示的HCDR1、如SEQ ID NO:371所示的HCDR2和如SEQ IDNO:395所示的HCDR3；

(30)如SEQ ID NO:275所示的LCDR1、如SEQ ID NO:304所示的LCDR2、如SEQ ID NO:333所示的LCDR3、如SEQ ID NO:359所示的HCDR1、如SEQ ID NO:381所示的HCDR2和如SEQ IDNO:407所示的HCDR3；

(31)如SEQ ID NO:289所示的LCDR1、如SEQ ID NO:316所示的LCDR2、如SEQ ID NO:348所示的LCDR3、如SEQ ID NO:369所示的HCDR1、如SEQ ID NO:393所示的HCDR2和如SEQ IDNO:423所示的HCDR3；

(32)如SEQ ID NO:282所示的LCDR1、如SEQ ID NO:309所示的LCDR2、如SEQ ID NO:341所示的LCDR3、如SEQ ID NO:364所示的HCDR1、如SEQ ID NO:387所示的HCDR2和如SEQ IDNO:415所示的HCDR3；

(33)如SEQ ID NO:276所示的LCDR1、如SEQ ID NO:302所示的LCDR2、如SEQ ID NO:334所示的LCDR3、如SEQ ID NO:355所示的HCDR1、如SEQ ID NO:376所示的HCDR2和如SEQ IDNO:408所示的HCDR3；

(34)如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、如SEQ ID NO:296所示的LCDR2、如SEQ ID NO:325所示的LCDR3、如SEQ ID NO:354所示的HCDR1、如SEQ ID NO:375所示的HCDR2和如SEQ IDNO:399所示的HCDR3；和

(35)如SEQ ID NO:281所示的LCDR1、如SEQ ID NO:305所示的LCDR2、如SEQ ID NO:340所示的LCDR3、如SEQ ID NO:349所示的HCDR1、如SEQ ID NO:382所示的HCDR2和如SEQ IDNO:414所示的HCDR3。

12.权利要求11的环状RNA，其中所述特异性结合CD123的抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

13.根据权利要求11所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD123的抗体包含选自SEQID NO：497-531的氨基酸序列。

14.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合BCMA的抗体包含包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下组：

(1)如SEQ ID NO:146所示的LCDR1、如SEQ ID NO:156所示的LCDR2、如SEQ ID NO:167所示的LCDR3、如SEQ ID NO:178所示的HCDR1、如SEQ ID NO:189所示的HCDR2和如SEQ IDNO:201所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:157所示的LCDR2、如SEQ ID NO:168所示的LCDR3、如SEQ ID NO:179所示的HCDR1、如SEQ ID NO:190所示的HCDR2和如SEQ IDNO:202所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:148所示的LCDR1、如SEQ ID NO:158所示的LCDR2、如SEQ ID NO:169所示的LCDR3、如SEQ ID NO:180所示的HCDR1、如SEQ ID NO:191所示的HCDR2和如SEQ IDNO:203所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:149所示的LCDR1、如SEQ ID NO:159所示的LCDR2、如SEQ ID NO:169所示的LCDR3、如SEQ ID NO:181所示的HCDR1、如SEQ ID NO:192所示的HCDR2和如SEQ IDNO:204所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:150所示的LCDR1、如SEQ ID NO:160所示的LCDR2、如SEQ ID NO:170所示的LCDR3、如SEQ ID NO:182所示的HCDR1、如SEQ ID NO:193所示的HCDR2和如SEQ IDNO:205所示的HCDR3；

(6)如SEQ ID NO:151所示的LCDR1、如SEQ ID NO:161所示的LCDR2、SEQ ID NO:171所示的LCDR3、如SEQ ID NO:183所示的HCDR1、如SEQ ID NO:194所示的HCDR2和如SEQ ID NO:206所示的HCDR3；

(7)如SEQ ID NO:152所示的LCDR1、如SEQ ID NO:162所示的LCDR2、如SEQ ID NO:172所示的LCDR3、如SEQ ID NO:180所示的HCDR1、如SEQ ID NO:195所示的HCDR2和如SEQ IDNO:207所示的HCDR3；

(8)如SEQ ID NO:153所示的LCDR1、如SEQ ID NO:163所示的LCDR2、如SEQ ID NO:173所示的LCDR3、如SEQ ID NO:184所示的HCDR1、如SEQ ID NO:196所示的HCDR2和如SEQ IDNO:208所示的HCDR3；

(9)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:164所示的LCDR2、如SEQ ID NO:174所示的LCDR3、如SEQ ID NO:185所示的HCDR1、如SEQ ID NO:197所示的HCDR2和如SEQ IDNO:209所示的HCDR3；

(10)如SEQ ID NO:147所示的LCDR1、如SEQ ID NO:165所示的LCDR2、如SEQ ID NO:175所示的LCDR3、如SEQ ID NO:186所示的HCDR1、如SEQ ID NO:198所示的HCDR2和如SEQ IDNO:210所示的HCDR3；

(11)如SEQ ID NO:154所示的LCDR1、如SEQ ID NO:166所示的LCDR2、如SEQ ID NO:176所示的LCDR3、如SEQ ID NO:187所示的HCDR1、如SEQ ID NO:199所示的HCDR2和如SEQ IDNO:211所示的HCDR3；和

(12)如SEQ ID NO:155所示的LCDR1、如SEQ ID NO:159所示的LCDR2、如SEQ ID NO:177所示的LCDR3、如SEQ ID NO:188所示的HCDR1、如SEQ ID NO:200所示的HCDR2和如SEQ IDNO:212所示的HCDR3。

15.根据权利要求14所述的环状RNA，其中特异性结合BCMA的抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

16.根据权利要求14所述的环状RNA，其中所述特异性结合BCMA的抗体包含选自SEQ IDNO：237-248的氨基酸序列。

17.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD19的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是：如SEQ ID NO:542所示的LCDR1、如SEQ ID NO:543所示的LCDR2、如SEQ ID NO:544所示的LCDR3、如SEQ ID NO：545所示的HCDR1、如SEQ ID NO：546所示的HCDR2和如SEQ ID NO：547所示的HCDR3。

18.根据权利要求17所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD19的抗体包含如SEQ IDNO:549所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:548所示的重链可变区。

19.根据权利要求17所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD19的抗体包含如SEQ IDNO：550所示的氨基酸序列。

20.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合HER2的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是：如SEQ ID NO:532所示的LCDR1、如SEQ ID NO:533所示的LCDR2、如SEQ ID NO:534所示的LCDR3、如SEQ ID NO:535所示的HCDR1、如SEQ ID NO：536所示的HCDR2和如SEQ ID NO：537所示的HCDR3。

21.根据权利要求20所述的环状RNA，其中所述特异性结合HER2的抗体包含如SEQ IDNO:538所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:539所示的重链可变区。

22.根据权利要求20所述的环状RNA，其中所述特异性结合HER2的抗体包含如SEQ IDNO：540所示的氨基酸序列。

23.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合IL13Ra2的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是：如SEQ ID NO:552所示的LCDR1、如SEQ ID NO:553所示的LCDR2、如SEQ ID NO:554所示的LCDR3、如SEQ ID NO:555所示的HCDR1、如SEQ ID NO：556所示的HCDR2和如SEQ ID NO：557所示的HCDR3。

24.根据权利要求23所述的环状RNA，其中所述特异性结合IL13Ra2的抗体包含如SEQID NO:558所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:559所示的重链可变区。

25.根据权利要求23所述的环状RNA，其中所述特异性结合IL13Ra2的抗体包含如SEQID NO：560所示的氨基酸。

26.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合B7H3的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3是：如SEQ ID NO:562所示的LCDR1、如SEQ ID NO:563所示的LCDR2、如SEQ ID NO:564所示的LCDR3、如SEQ ID NO:565所示的HCDR1、如SEQ ID NO：566所示的HCDR2和如SEQ ID NO：567所示的HCDR3。

27.根据权利要求26所述的环状RNA，其中所述特异性结合B7H3的抗体包含如SEQ IDNO:568所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:569所示的重链可变区。

28.根据权利要求26所述的环状RNA，其中所述特异性结合B7H3的抗体包含如SEQ IDNO：570所示的氨基酸序列。

29.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD40的抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下组：

(1)如SEQ ID NO:828所示的LCDR1、如SEQ ID NO:834所示的LCDR2、如SEQ ID NO:840所示的LCDR3、如SEQ ID NO:846所示的HCDR1、如SEQ ID NO:852所示的HCDR2和如SEQ IDNO:858所示的HCDR3；

(2)如SEQ ID NO:829所示的LCDR1、如SEQ ID NO:835所示的LCDR2、如SEQ ID NO:841所示的LCDR3、如SEQ ID NO:847所示的HCDR1、如SEQ ID NO:853所示的HCDR2和如SEQ IDNO:859所示的HCDR3；

(3)如SEQ ID NO:830所示的LCDR1、如SEQ ID NO:836所示的LCDR2、如SEQ ID NO:842所示的LCDR3、如SEQ ID NO:848所示的HCDR1、如SEQ ID NO:854所示的HCDR2和如SEQ IDNO:860所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO:831所示的LCDR1、如SEQ ID NO:837所示的LCDR2、如SEQ ID NO:843所示的LCDR3、如SEQ ID NO:849所示的HCDR1、如SEQ IDNO:855所示的HCDR2和如SEQ IDNO:861所示的HCDR3；

(5)如SEQ ID NO:832所示的LCDR1、如SEQ ID NO:838所示的LCDR2、如SEQ ID NO:844所示的LCDR3、如SEQ ID NO:850所示的HCDR1、如SEQ ID NO:856所示的HCDR2和如SEQ IDNO:862所示的HCDR3；和

(6)如SEQ ID NO:833所示的LCDR1、如SEQ ID NO:839所示的LCDR2、如SEQ ID NO:845所示的LCDR3、如SEQ ID NO:851所示的HCDR1、如SEQ ID NO:857所示的HCDR2和如SEQ IDNO:863所示的HCDR3。

30.根据权利要求29所述环状RNA，其中特异性结合CD40的抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

31.根据权利要求29所述的环状RNA，其中所述特异性结合CD40的抗体包含选自SEQ IDNO：888-893的氨基酸序列。

32.根据权利要求7所述的环状RNA，其中所述CAR选自下组：

(1)靶向间皮素的CAR，其包含选自SEQ ID NO:131-145的氨基酸序列；

(2)靶向CD123的CAR，其包含选自SEQ ID NO:494-496的氨基酸序列；

(3)靶向BCMA的CAR，其包含选自SEQ ID NO:249-260的氨基酸序列；

(4)靶向CD19的CAR，其包含如SEQ ID NO:551所示的氨基酸序列；

(5)靶向HER2的CAR，其包含如SEQ ID NO:541所示的氨基酸序列；

(6)靶向IL13Ra2的CAR，其包含如SEQ ID NO:561所示的氨基酸序列；和

(7)靶向B7H3的CAR，其包含如SEQ ID NO:571所示的氨基酸序列。

33.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述蛋白质包含融合蛋白质并且所述融合蛋白质包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中(i)所述第一结构域包含(a)结合APC的激活受体的配体或其受体结合片段，或(b)结合APC的激活受体的抗体，或其抗原结合片段；(ii)第二结构域包含(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段，(c)与免疫效应细胞的共刺激受体结合的抗体或其抗原结合片段。

34.根据权利要求5-32中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述蛋白质进一步包含融合蛋白质，并且所述融合蛋白质包含激活抗原呈递细胞(APC)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中(i)所述第一结构域包含(a)结合APC的激活受体的配体或其受体结合片段，或(b)结合APC的激活受体的抗体，或其抗原结合片段；(ii)第二结构域包含(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段，(c)与免疫效应细胞的共刺激受体结合的抗体或其抗原结合片段。

35.根据权利要求33或34所述的环状RNA，其中所述第一结构域连接至所述第二结构域的N末端或C末端。

36.根据权利要求33-35中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述第一结构域和所述第二结构域经由连接子连接。

37.根据权利要求33-36中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述第一结构域包含CD40L或其受体结合片段、抗CD40抗体或其抗原结合片段，并且所述第二结构域包含CD28胞质结构域或抗CD28抗体或其抗原结合片段。

38.根据权利要求33-37中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述抗CD40抗体包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下组：

(4)如SEQ ID NO:831所示的LCDR1、如SEQ ID NO:837所示的LCDR2、如SEQ ID NO:843所示的LCDR3、如SEQ ID NO:849所示的HCDR1、如SEQ ID NO:855所示的HCDR2和如SEQ IDNO:861所示的HCDR3；

39.根据权利要求33-38中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述抗CD40抗体包含选自下组的轻链可变区和重链可变区：

40.根据权利要求33-39中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述抗CD40抗体包含选自SEQ ID NO：888-893的氨基酸序列。

41.根据权利要求33-40中任一权利要求所述的环状RNA，其中所述融合蛋白质包含选自SEQ ID NO:600、SEQ ID NO:695-708、801、803、813和894-899的序列。

42.一种用于产生权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA的前体RNA，所述前体RNA包含环化元件、内部核糖体进入位点(IRES)元件、蛋白质编码序列和poly A。

43.根据权利要求42所述的前体RNA，其中所述环化元件包含位于内部核糖体进入位点(IRES)元件的5′的第一内含子序列和poly A的3'的第二内含子序列。

44.根据权利要求43所述的前体RNA，其中所述第一内含子序列和所述第二内含子序列源自I类或II类内含子自剪接序列。

45.根据权利要求44所述的前体RNA，其中所述第一个内含子元件包含含有3′剪接位点二核苷酸的3′I类内含子片段，第二个内含子元件包含含有5′剪接位点二核苷酸的5′I类内含子片段。

46.根据权利要求42-45中任一权利要求所述的前体RNA，其中所述前体RNA进一步包含所述第一内含子元件和内部核糖体进入位点(IRES)元件之间的5′间隔区序列，以及polyA和所述第二内含子元件之间的3′间隔区序列。

47.根据权利要求42-46中任一权利要求所述的前体RNA，其中所述前体RNA进一步包含所述第一内含子元件外部的5′同源臂和所述第二内含子元件外部的3′同源臂。

48.一种用于制备权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA载体，其中所述载体包含所述前体RNA的DNA模板。

49.根据权利要求48所述的载体，其中所述载体进一步包含RNA聚合酶启动子。

50.一种产生环状RNA的方法，所述方法包括将权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA环化以产生所述环状RNA。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述方法包括在环化之前转录包含权利要求7-12中任一权利要求所述的前体RNA DNA模板的载体以获得前体RNA。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述转录步骤在细胞或无细胞系统中进行。

53.根据权利要求50-52中任一权利要求所述的方法，其中所述方法进一步包括纯化所述环状RNA。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述环状RNA通过基于oligo dT的捕获来纯化。

55.一种细胞或细胞群，其包含权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA。

56.包含第一环状RNA和第二环状RNA的细胞或细胞群，其中所述第一环状RNA是权利要求5-32中任一权利要求所述的环状RNA，并且所述第二环状RNA是权利要求33-41中任一权利要求所述的环状RNA。

57.一种在细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括将权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA或权利要求48或49所述的载体引入宿主细胞中，并表达由环状RNA蛋白质编码序列编码的蛋白质。

58.一种制备蛋白质的方法，该方法包括：

(a)翻译权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA以产生由所述环状RNA的蛋白质编码序列编码的蛋白质；和

(b)纯化该蛋白质。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述翻译步骤在细胞或无细胞系统中进行。

60.根据权利要求58所述的方法，其中所述步骤(a)包括将权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA或权利要求48或49所述的载体导入宿主细胞中，并在宿主细胞中翻译环状RNA以产生该蛋白质。

61.一种药物组合物，包括：

(a)权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA、权利要求48或49所述的载体或权利要求55或56所述的细胞或细胞群；和

(b)药学上可接受的载体。

62.一种组合物，包括：

(a)权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA、权利要求48或49所述的载体；和

(b)一种递送载体。

63.一种纯化权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA的方法，所述方法包括通过基于oligo dT的捕获纯化所述环状RNA。

64.一种用于治疗需要治疗的受试者疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA、权利要求48或49所述的载体或权利要求55或56所述的细胞或细胞群。

65.权利要求64的方法，其中所述疾病是肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述癌症表达间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2或B7H3。

67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液癌。

68.根据权利要求65或66的方法，其中所述癌症是急性髓性白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤。

69.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食道癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺癌或神经胶质瘤。

70.权利要求1-41中任一权利要求所述的环状RNA、权利要求42-47中任一权利要求所述的前体RNA、权利要求48或49所述的载体或权利要求55或56所述的细胞或细胞群在制备用于治疗需要治疗的受试者疾病的药物中的用途。

71.权利要求70所述的用途，其中所述疾病是肿瘤、癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。

72.权利要求71所述的方法，其中所述癌症表达间皮素、CD123、BCMA、HER2、IL13Ra2或B7H3。

73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液癌。

74.权利要求71或72所述的方法，其中所述癌症是急性髓性白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、人B细胞前体白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤。

75.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食道癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、甲状腺癌或神经胶质瘤。