CN118541377A - 大分子的纯化 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了在混合腔室中对细胞进行化学处理的自动化方法，其中，所述自动化方法包括提供细胞、提供用于处理细胞的化学试剂、形成包含细胞和化学试剂的液体混合物，以及通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物。还提供了用于纯化大分子(例如质粒)的自动化方法，以及包括被配置用于纯化此类大分子的工作站的自动化系统。

Description

大分子的纯化

相关申请

本申请要求2022年1月4日提交的美国临时申请第63/296,224号以及2022年3月2日提交的欧洲申请第22159731.3号的优先权，各申请的全部内容以参引的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及大分子纯化领域及其使用的自动化工具。更具体地说，本发明涉及一种在混合腔室中对细胞进行化学处理的自动化方法以及一种纯化大分子(例如质粒)的自动化方法。本发明还涉及其中的混合方法以及用于纯化大分子等的装置和系统。

背景技术

质粒是目前由于其作为核酸载体的用途而具有日益增长的商业和科学重要性的一种大分子。质粒是细胞内一种小的、染色体外的DNA分子，其与染色体DNA物理上分离并可以独立复制。虽然大多数质粒都是双链DNA分子，但有些质粒由单链DNA或主要以双链RNA组成。染色体很大并且包含在正常条件下生存所需的所有基本遗传信息，而质粒通常非常小并且仅包含可能用于特定情况或条件下的另外的基因。质粒是常用的细菌克隆载体，其用于制备大量所需蛋白质，并且在基因治疗领域，质粒可用于例如表达哺乳动物细胞中缺乏的蛋白质。如今，质粒的使用与疫苗生产高度相关，例如将含有编码免疫反应所针对的抗原的DNA序列的基因工程质粒引入患者体内。

另一种非常感兴趣的核酸载体是病毒载体，它是一种非传染性的亚微观物质。病毒载体广泛应用于基因治疗和癌症治疗以及疫苗开发。上述医疗应用中最常用的三种病毒是腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。病毒种类繁多，基因组结构多种多样。慢病毒是一种具有单链RNA基因组的包膜逆转录病毒。腺相关病毒是具有单链DNA基因组的无包膜病毒。腺病毒是一种具有双链DNA基因组的无包膜病毒。上述病毒特别有用的特性是它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞。使用慢病毒和腺病毒的进一步优点包括易于操作和能够承载更大的DNA插入片段。此外，腺病毒已被用于递送CRISPR/Cas9基因编辑系统和生产病毒载体COVID-19疫苗。

用于将大分子从一个细胞运输到另一个细胞的另一种载体是外泌体和其他细胞外囊泡。外泌体是与膜结合的细胞外囊泡，在大多数真核细胞的内体结构中产生。由于外泌体具有在体内和体外引发强烈细胞反应的能力，外泌体越来越多地被视为潜在的治疗手段。例如，外泌体具有独特的优势，使其成为高效的药物载体。此外，外泌体可被认为是有效递送小干扰RNA的有前途的载体，并且患者来源的外泌体已经在多个临床试验中被用作一种新型癌症免疫疗法。

在质粒纯化中，随着成分混合，基因组DNA可能会被剪切并且至少部分会与纯化的质粒DNA被一起回收，从而使产品至少对于药物制剂而言无用。因此，很难找到这样一种对含有感兴趣的质粒的细胞进行处理的方法，使其既能有效释放质粒，又不会导致基因组DNA剪切。

在手动控制的程序中，可以将成分组合以形成混合物，然后可以将包含所述混合物的承载物(例如瓶或管)温和地颠倒以得到均匀的混合物。可以将染料添加到混合物中以监测混合过程的效果，因此当达到所需效果时可以停止混合过程。上述可以将过程的持续时间限制到最短，从而减少质粒剪切的程度。

目前提出的质粒纯化自动化方法包括混合流、搅动流或桨叶。所有这些方法都有局限性和缺点，包括可能导致基因组剪切。桨叶混合在桨叶末端提供高剪切速度。流混合——其依赖于在管内或腔室中的湍流混合——也可能涉及剪切流。因此，现有技术装置难以集成到质粒纯化的全自动方法或其装置或系统中。

EP 0 811 055(Genzyme Corp)记载了其目的为提供一种自动化方法来大规模分离高质量质粒，以满足未来的需求。更具体地说，在第一个方面，EP 0 811 055涉及一种裂解细胞的方法。所述方法包括使细胞悬浮液和裂解溶液同时流过静态混合器，其中细胞以裂解状态离开静态混合器。在另一方面，EP 0 811 055涉及一种使细胞裂解物或其他含蛋白质溶液和沉淀溶液同时流过静态混合器的方法，其中裂解物或蛋白质溶液离开静态混合器时其可沉淀组分已沉淀。这两种方法可以通过串联使用静态混合器而结合起来。在优选的实施方案中，合适的静态混合器包含内部螺旋结构，所述结构使两种液体以相反的旋转流相互接触，从而导致液体在湍流中混合在一起。EP 0 811 055的一个声称的优点是可以温和且连续地顺序裂解大量细胞，大大简化了从大量材料中分离质粒的流程，而不会损坏质粒DNA。

US 5,330,914(CEMU Bioteknik)涉及一种从细胞悬浮液中自动纯化染色体外DNA(例如质粒)的方法，所述方法包括

将细胞悬浮液引入腔室，

将裂解溶液引入腔室并将其与腔室内容物混合以裂解其中的细胞，

将沉淀溶液引入腔室并将其与腔室内容物混合以沉淀其中的染色体DNA和，任选地，蛋白质和细胞碎片，

通过过滤器过滤腔室内容物并将液体内容物送至收集装置，

从收集装置内容物中纯化染色体外DNA，

将溶解溶液引入腔室并将其与腔室内容物混合以溶解其中剩余的沉淀物，以及

将溶解的沉淀物从腔室送至废料箱。

混合腔室被记载为设有搅动装置，例如振动或旋转装置，其用于混合细胞悬浮液和裂解溶液。

US2005/0026177(Boehringer Ingelheim)涉及一种可扩大的方法和用于制备生物分子(特别是药品级质粒DNA)的装置。US2005/0026177的一个目的是提供一种可自动化和可扩大的方法，用于以生产规模分离感兴趣的多核苷酸，特别是质粒DNA，其中包括改进的碱裂解方法作为细胞分解步骤。US2005/0026177记载了如何在初步实验中测试数种混合技术，之后发现，装有玻璃珠粒的管可使分别由细胞悬浮液和裂解溶液组成的两种溶液充分混合和接触。进一步地，US2005/0026177教导了所述方法可以连续且完全自动化地运行。

WO 2012/134440(Gjerde等人)涉及样品制备的方法和装置，例如分离、提取或纯化核酸，例如DNA和RNA，尤其是质粒。该方法被记载为高度可自动化的并用于以移液管吸头柱形式纯化核酸。然而，从WO 2012/134440可以清楚地看出，其中使用的术语“可自动化”是指在裂解步骤之后立即从细胞沉淀开始的纯化程序。

尽管存在现有方法，但仍然需要一种可自动化的质粒纯化方法，与现有技术方法相比，该方法有较小的或至少减轻的基因组DNA剪切从而污染最终产物(例如提取或纯化的质粒)的风险。在这种可自动化的方法中，优选所有步骤都是自动化的，或者至少将细胞与裂解缓冲剂混合的重要步骤是自动化的。对可以实现这种方法的实际硬件也有相关需求，例如可以温和地处理精细质粒的新型混合器。

同样，纯化病毒载体或病毒粒子的方法也有很多种，但现有的大多数方法都存在缺陷。其中一个缺点是缺乏纯化大量载体或其部分所需的可扩大性。另一个缺点是，现有技术的方式和方法需要多个比较低效的步骤，从而导致成本过高而且由于累积产量损失导致产率较低。虽然许多众所周知的蛋白质纯化方法的过程适用于病毒粒子纯化，但病毒粒子的复杂性带来了亟需解决的独特挑战。

就外泌体的纯化而言，最紧迫的问题之一是纯化过程中囊泡受损的风险，以及丧失生物活性、对足够大样本的需求和分离效率。

发明内容

鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种用于混合两种或更多种成分的可自动化方法、一种用于纯化大分子的可自动化方法以及一种包括用于纯化大分子的工作站的自动化系统，如所附权利要求所限定。所述发明至少部分地缓解了上述问题并且至少部分地解决了上述一个或更多个需求。从以下详细公开内容以及从属权利要求中可以得出进一步的细节和优点。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于在混合腔室中对细胞进行化学处理的自动化方法，其中，所述可自动化方法包括

提供细胞，

提供用于处理细胞的化学试剂，

形成包含细胞和化学试剂的液体混合物，以及

通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物。

根据本发明的另一个方面，提供了一种纯化大分子的自动化方法，所述方法包括：

提供细胞，

提供裂解缓冲剂，

提供沉淀剂，

形成包含细胞和裂解缓冲剂的液体混合物，通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物，

通过将沉淀剂添加到至少一部分液体混合物中来提供非沉淀的液体混合物，

通过将至少一部分非沉淀的液体混合物通过至少一个过滤器来提供滤液。

根据本发明的再另一个方面，提供了一种自动化系统，包括被配置用于纯化由细胞产生的大分子的工作站，其中工作站至少包括

被配置为进行来回反复的液体流动的混合腔室，

被配置为进行重力过滤的过滤器，和

被配置为进行来回反复的液体流动的液相色谱柱。

参照下文描述的实施例，本发明的这些和其他方面将变得显而易见并得以阐明。

附图说明

为了举例说明，下面将结合附图所示的实施方案对本发明进行更详细的说明。

图1示意性地示出了根据本发明的自动纯化方法的概览。自动化纯化方法包括从悬浮细胞到回收粒料(pellet)的步骤。

图2示意性地举例说明了本发明的混合器的布置，其中混合器被配置为以自动来回反复流动模式运行。

图3A示意性地示出了在构成混合腔室的竖直布置的容器中如何在向上流动中实现来回反复的流动混合。

图3B示意性地示出了在构成混合腔室的竖直布置的容器中如何在向下流动中实现来回反复的流动混合。

图4示意性地举例说明了自动化系统的布置，所述系统包括被配置用于纯化由细胞产生的大分子的工作站，其中工作站是圆盘传送带(carousel)式。

图5示意性地示出了纯化大分子的自动化方法的步骤，所述方法在圆盘传送带式工作站上进行。

具体实施方式

在下面的详细描述中，定义了技术术语和表述，并描述了本发明的实施方案。

一般而言，除非本文另有明确定义，否则本申请文本中使用的所有术语和表述都应根据相关现有技术中通常应用的含义进行解释。

如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如“一个大分子”包括一个或更多个大分子，“一个质粒”包括一个或更多个质粒，“一个细胞”包括一个或更多个细胞等等。

在本发明的范围内，术语“大分子”应理解为任何非常大的分子，其比普通分子大得多，普通分子的直径通常小于10埃(10^-6mm)。大分子由比普通分子多得多的原子组成。这种大分子相应的分子量在35 000的数量级。具有重要生物学意义的蛋白质和核酸均位列由大分子构成的众多物质之中。

此外，就本申请的目的而言，术语“大分子”在某些情况下还涵盖质粒、病毒及其部分。

在本发明的范围内，术语“裂解缓冲液”应理解为是指能够裂解与其混合的细胞的任何添加剂。换言之，“裂解缓冲液”是包含“裂解缓冲剂”的缓冲液。

类似地，术语“沉淀缓冲液”在宽泛的上下文中使用并且在本发明的范围内被理解为指包含“沉淀剂”的缓冲液。因此，本文使用的“沉淀缓冲液”不需要任何pH缓冲作用；“沉淀缓冲液”是能够提供沉淀的成分。

“裂解缓冲剂”和“沉淀剂”这两个术语在相关技术领域中都是以常规意义使用的。

在本发明的范围内，术语“腔室”应理解为指设备或类似物内的封闭空间。术语“混合腔室”、“腔室”和“混合柱”在整个申请文本中可互换使用。

下面描述本发明的示例性实施方案。

本发明人开发了一种新型混合器，本文中有时将其称为自动温和混合器(AGM)，用于纯化至少一种类型的大分子，例如质粒和病毒。从下文公开的内容可以看出，涉及处理和准备细胞以进行纯化的发明是独立的。然而，本领域技术人员将理解，根据本发明的自动化方法和自动化仪器将能够实现至少一种大分子的任何纯化方法的进一步自动化。

因此，使用AGM的一个优点是它可以完全集成到可自动化的纯化方法中。这种可自动化方法可以扩大到任何所需的规模。本发明的技术基于来回反复流动方法。

本发明的另一个优点是，新型混合器可以温和地混合有时可能非常精细的组分，例如质粒，例如超螺旋质粒和病毒粒子。温和的混合通过避免通常使用的湍流和/或机械搅拌器的严苛条件来实现。相反，根据本发明，混合的组分或成分是通过将其“折叠”在一起来混合的。本文使用的术语“折叠”用于描述以温和的方式(即不搅拌或不搅动)将组分或成分混合在一起的方法，以避免产生湍流。

本发明基于层流提供的自动混合。液体流进入管道，流过管道并扩张(expand)至腔室。随着流的扩张，液体和悬浮颗粒会流回自身之上，即折回引起混合。下行流也是一种层流，其中液体和颗粒的折回发生在混合腔室中。本发明的优点在于其中的混合过程是机械的但温和的、可扩大的并且可集成到用于大分子纯化的全自动方法中。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于在混合腔室中对细胞进行化学处理的自动化方法，其中，所述自动化方法包括

提供细胞，

提供用于处理细胞的化学试剂，

形成包含细胞和化学试剂的液体混合物，和

通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物。

本领域技术人员可以理解，上述“液体混合物”也可被认为是悬浮液，即含有固体颗粒的非均匀混合流体。通过提供来回反复的液体流来使液体混合物或悬浮液混合，所述混合可以提供更均匀的液体混合物或更均匀的悬浮液。

根据上述自动化方法，可以在混合腔室中混合两种或更多种成分。第一种成分可以是包含细胞的液体，第二种成分可以是裂解缓冲液或沉淀缓冲液。可以通过在混合腔室内提供来回反复的液体流来实现混合。

该方法可以进一步包括将液体混合物引入管中，所述管配置为可连接至混合腔室，所述混合腔室比所述管宽。本领域技术人员还应当认识到，上述管和混合腔室不必是单独的实体。液体混合物也可被引入通道中，其中液体混合物可首先进入通道的第一部分，然后进入通道的第二部分，所述通道的第一部分比通道的第二部分宽。

可以至少通过使用配置为可连接到混合腔室的泵，产生压力梯度将液体注入混合腔室来提供来回反复的液体流。对混合腔室施加真空可能会导致液体被吸入混合腔室。混合腔室内液体的运动可以描述为来回反复的液体流动。本领域技术人员应当意识到，本文中的“真空”不应以绝对术语来理解，而应以相对术语来理解。

或者，可以至少通过使用配置为可连接到混合腔室的泵，产生压力梯度而从混合腔室喷射液体来提供来回反复的液体流。对混合腔室施加泵作用可导致其中所含液体的分配。液体的运动可以描述为来回反复的液体流动。

压力梯度的方向可以交替多次，优选2-10次，更优选4-6次。可以通过在混合腔室中重复抽吸和分配任意次数来获得来回反复流动模式，例如1-10次，例如2-5次。

来回反复流动模式是一种主要用于色谱法的众所周知的原理，有时也称为双流色谱法，参见例如US 7,482,169(Gjerde等人)。因此，本领域技术人员可以容易地配置市售的硬件来使用来回反复流动模式执行所要求的混合。

本发明基于这样一种发现，即来回反复流动可以配置为在用于纯化大分子的方案中产生液体成分的完全令人满意的混合，所述大分子例如为质粒或病毒。采用这种流动的一个主要优点是，其通过提供将本发明的自动混合集成至任何自动化的现有技术方法的机会，使这种流程方案可完全自动化。上述方法可以避免手动并因此耗时地小心翻转容器。到目前为止，在纯化大分子的各种方案中，都需要这样翻转容器才能使液体成分达到完全令人满意的混合。

最方便的是，将各种成分引入管中，然后将它们添加到混合腔室的顶部或上部，使它们在其中扩张。混合腔室——本文中有时称为扩张腔室——可以布置在任何合适的容器中。本发明的一个优点是混合器易于处理。此外，其比现有技术的设备更容易清洁，因为本发明的混合器可以独立存在，而不需集成至阀门管道等。

本领域技术人员将理解，所述扩张腔室的容积有利地足够大以处理正在混合的整个样品。

对于大规模应用，使用柱体积为1L(巨大规模(Giga scale))、床体积为25mL，或使用柱体积为10L(兆级规模(Tera scale))、床体积为259mL可能比较合适。

在一个说明性实例中，混合器容积可为约1L，而管尺寸约为内径4mm-8mm管。本领域技术人员将理解，可以根据混合腔室的尺寸来调整管的尺寸。较小的管可用于较小的混合腔室，用于较小型的质粒制备。较大的管可用于较大的混合腔室，用于较大型的质粒制备。为此，技术人员可以容易地选择并适当调整标准管和其他设备。例如，可以选择管和/或混合腔室的尺寸以提供所需程度的层流液体流，例如几乎完全层流的液体流。

因此，在一个有利的实例中，选择或配置条件、硬件和设置以在混合腔室内以及任选地在所使用的装置的其它部分内提供基本层流。本发明人出乎意料地发现，层流混合的温和条件对于混合液体(例如细胞悬浮液)是有效的，当使用现有技术的方案利用较剧烈的湍流(例如使用机械搅拌装置获得的湍流)时，所述液体中的内容物可能会被破坏。

在一个实例中，混合腔室内的流将允许存在一些湍流。

在一个有利的实例中，如图3A和图3B分别所示，布置真空用于向上抽吸液体，而泵送可用于向下分配液体。在两个方向上均发生温和的混合。任何合适的设备，例如蠕动泵，都可以用于此目的。本领域技术人员将理解，实现来回反复流动的方式可以通过许多不同的方式获得，这取决于例如所需的混合程度以及包含细胞的液体的性质(有时在本文中称为“细胞液体”)，因此它不是本发明的限制特征。

细胞可以以细胞悬浮液的形式提供。细胞可以以细胞集落的形式提供于固体培养基(例如生长培养基)的表面上或内部。

包含细胞的液体，即细胞液体，例如细胞悬浮液，在加入到本发明的混合腔室之前可以经过一个或更多个预处理和/或调理步骤。这些前置步骤可以是例如pH调节、离心、某些液体的倾析或任何其他本领域中通常使用的适当措施。

化学试剂可以是裂解缓冲剂或裂解缓冲液。有利地，液体混合物可以包含DNA酶或RNA酶，或者裂解缓冲液可以包含DNA酶或RNA酶。

根据本发明的自动化方法，液体混合物中包含的至少一部分细胞可在混合腔室中发生裂解。在裂解过程中，细胞释放大分子，例如病毒和/或质粒。液体混合物中的至少一部分细胞会释放大分子。

如果裂解缓冲液与细胞液体混合，则细胞有利地在混合腔室内进行裂解。此类裂解步骤的持续时间可以根据本领域技术人员所熟知的因素进行调整，例如细胞类型和裂解剂、液体流速等。此类细胞可以是真核细胞或原核细胞，例如细菌细胞。有利的细胞是被制备用以表达某些基因或蛋白质的重组细胞，所述基因或蛋白质的纯化形式可用于药物应用，例如治疗或疫苗。因此，裂解的细胞可能释放大分子，例如病毒和/或质粒。有利地，释放的大分子是质粒，例如超螺旋质粒DNA。

化学试剂可以是沉淀剂或沉淀缓冲液。

本发明的混合可用于任何类型的裂解和沉淀样品制备化学，包括离液质粒纯化或离子交换质粒纯化的制备。离子交换质粒纯化，包括阴离子交换质粒纯化，可以如以下国际公开文本WO 2022/076543和WO 2021/170564任一项中所记载，所述国际公开文本通过引用并入本文中。

除了细胞液体和裂解缓冲液和/或沉淀缓冲液之外，本方法还可以包括至少一种附加成分，例如洗涤缓冲液。此类附加成分可以是单独泵送到混合腔室的试剂，如图2所示。本领域技术人员可以根据例如细胞以及要纯化的所需大分子、利用公知常识得出哪些附加成分是合适的。

进一步地，可以在开始混合之后，即在一个或更多个来回反复流动循环之后，将各种成分添加到混合腔室中。例如，在第一个混合阶段或循环之后，例如，混合包含细胞和裂解缓冲剂的液体混合物之后，可以将沉淀缓冲液或沉淀剂添加到混合腔室中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种纯化大分子的自动化方法，所述方法包括：

提供细胞，

提供裂解缓冲剂，

提供沉淀剂，

形成包含细胞和裂解缓冲剂的液体混合物，通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物，

通过将沉淀剂添加到至少一部分液体混合物中来提供非沉淀的液体混合物，

通过将至少一部分非沉淀的液体混合物通过至少一个过滤器来提供滤液。

本发明还涉及一种从包含细胞的液体中纯化大分子的自动化方法，所述方法包括将细胞液体至少与裂解缓冲液或沉淀缓冲液在混合腔室内以来回反复的液体流动的方式混合，以产生包括裂解和/或沉淀细胞的液体混合物。一旦混合，裂解或沉淀的细胞可以进行任何常用的进一步纯化步骤，例如借助膜、珠粒、纤维或柱步骤。任选地，可以使包括裂解和/或沉淀的细胞的所述液体混合物通过至少一个过滤器以产生滤液。

过滤器可以是自动化的并且能够将大分子与离开混合腔室的液体中存在的其他成分分离的任何合适的过滤器，例如重力过滤器。通过过滤步骤分离的成分实例为细胞碎片、絮凝剂和某些较大的蛋白质。尽管本发明的方法可以包括一个以上的过滤器而不偏离本发明的范围和精神，但是有利且可自动化的实例包括单个过滤步骤，其基于重力过滤的原理。为了使大分子的产率最大化，过滤步骤可以包括在混合液体通过过滤器后，通过添加合适的洗涤液来清洗过滤器。

上述自动化方法还可以包括：使至少一部分滤液通过色谱柱并从色谱柱中洗脱至少一部分大分子，从而捕获大分子。

色谱柱可以是能够将大分子与过滤液体中存在的其它成分分离的任何合适的柱，所述成分例如任何仍然残留的细胞碎片或絮凝剂以及较小的蛋白质。例如，可以配置色谱柱以选择性地将所需的大分子与内毒素、不需要的病毒或其部分分离。用于此步骤的设备是市售可得的，并且本领域技术人员可容易地对其进行改造以根据本发明进行使用。

在一个有利的实例中，液体在色谱柱上的通过包括来回反复流动。如上所述，这种流动在色谱领域是众所周知的，并且本领域技术人员可以容易地选择最佳条件来进行所设计的分离。

上述自动化方法还可以包括浓缩大分子，包括从色谱柱洗脱的大分子，即所述方法可以包括浓缩步骤以产生包括纯化的大分子的固体沉淀物。所谓的乙醇沉淀或(乙醇)柱浓缩可以是所述方法的最后一步。在这一步，可以和乙醇一起添加高浓度的盐，通常是乙酸钾或乙酸钠。

如上所述，本发明的一个主要优点是它能够将细胞液体与其他成分(例如裂解缓冲液)自动混合。因此，在本方法的一个实例中，至少将混合步骤、以及优选地过滤和采用色谱法的步骤配置为自动化的。

根据本发明的另一个方面，提供了一种自动化系统，包括被配置为纯化由细胞产生的大分子的工作站，其中工作站至少包括

被配置为进行来回反复的液体流动的混合腔室，

被配置为进行重力过滤的过滤器，和

被配置为进行来回反复的液体流动的液相色谱柱。

在本发明的系统的一个有利的实例中，工作站是圆盘传送带，即可连续循环处理细胞培养液以纯化所需大分子(例如质粒或病毒)的系统。图4和图5显示了包括圆盘传送带式工作站的此类系统的一个实例。

本发明的系统还可以包括容纳液体的容器，所述液体例如洗脱液和洗涤液。所述系统可以配置为用于巨大规模(GigaPrep)或兆级规模(TeraPrep)的纯化，这些术语是本领域中常用和众所周知的。

按照众所周知的原理，系统的模块可以采用Z型驱动(Z drive)安装。有利的是，该工作站是为特定用途而设计的，以充分利用所有优势同时优化处理速度。例如，可以使用2层圆盘传送带，其为顶层稳定而底层移动。

应当理解，即使没有明确提及，本发明第一方面的上述实施方案也可适用于本发明的其他方面。

以上主要结合一些实施方案对本发明进行了描述。然而，本领域技术人员容易理解，除了上面公开的实施方案之外的其它实施方案同样可以在由所附权利要求限定的本发明的范围内。

附图详细说明

图1示意性地示出了根据本发明的自动纯化方法的概览。自动化纯化方法涵盖从悬浮细胞到回收粒料的步骤。该概览举例说明了如何将混合步骤整合到全自动质粒纯化方法中。更具体地说，该方法从使用安装在Z型驱动器上的自动温和搅拌器(AGM)开始。之后采用重力过滤器。然后，应用Z型驱动安装的色谱柱，例如柱(Biotage AB)。Z型驱动安装的色谱柱配置为能够捕获大分子以及在洗脱之前对其进行清洗。最后，可任选地使用Z型驱动安装的柱，借助乙醇进行浓缩。

图2示意性地举例说明了本发明的混合器的布置，其中混合器被配置为以自动来回反复流动模式运行。各个成分，例如试剂A、试剂B和试剂C，都由相应的试剂泵，即试剂泵A2、试剂泵B 3和试剂泵C 4，单独提供给混合腔室1。还提供了悬浮细胞5。在两个方向上均进行温和混合。为此，使用蠕动泵6。

图3A示意性地示出了在构成混合腔室的竖直布置的容器中如何在向上流动中实现来回反复的流动混合。

图3B示意性地示出了在构成混合腔室的竖直布置的容器中如何在向下流动中实现来回的反复流动混合。

图4示意性地举例说明了自动化系统的布置，所述系统包括被配置用于纯化由细胞产生的大分子的工作站，其中工作站是圆盘传送带式的。所述工作站包括巨大规模和兆级规模固定塔以及作为缓冲液储存器的容器。示例工作站中使用了色谱柱。用于裂解、沉淀、去除内毒素、水滤液洗涤和洗脱过程的耗材都是大批量的。

图5示意性地示出了纯化大分子的自动化方法的步骤，所述方法在圆盘传送带式的工作站上进行，更具体地说是在巨大规模和兆级规模圆盘传送带旋转工作站上进行。所述方法步骤包括混合和过滤，然后进行柱色谱法、柱清洗，然后进行两个后续步骤，即用乙醇进行选择性洗脱和浓缩。

实施例

本实施例仅用于说明性目的并且不应被解释为如所附权利要求所限定那样限制本发明。本申请下文和其他地方提供的所有参考文献均通过引用方式并入本文。

实施例1：质粒纯化——全自动样品流

为了执行以下方法，可以使用适合所需硬件元素的市售工作站。该方案如下：

1.重新悬浮15g细胞粒料。添加玻璃珠粒、RNA酶和染料。87mL

摇匀。倒入仪器里的样品容器中。可以借助双流混合柱自动实现细胞粒料再悬浮，但此步骤需要严格混合。双流混合柱旨在用于温和混合，且该技术可能更适合用于温和裂解和沉淀，以防止基因组DNA剪切。

2.泵入裂解缓冲液，103mL并进行双流混合。

3.柱头压力、真空和泵送量由连接在柱顶部的蠕动泵控制。

4.泵入沉淀缓冲液，123mL双流混合。

5.泵入25mL ERB内毒素去除缓冲液(endotoxin removal buffer)，

非常温和地双流混合，一个循环。

注意：尽量避免气泡形成和基因组DNA的剪切。ERB是一种表面活性剂。泵送至双流混合柱的顶部。对于每种大批量试剂，泵都是蠕动的。裂解、沉淀、ERB去除和可能的水性滤液洗涤过程中的耗材都是大批量的。

6.将混合物吸入双流混合柱并顺时针旋转圆盘传送带(图4和图5)

以将带有处理储存器的重力过滤器放置在双流混合柱下方。回收300mL滤液。

注意：操作5和操作6同时进行。

7.使用60mL平衡缓冲液来平衡20mL床柱。将60mL泵入柱顶部并进行双流混合。弃去。

注意：滤液仍在过滤中，柱处于调节位置，下方有一个平衡储液器。

8.逆时针旋转以将滤液样品置于捕获柱下方。通过8个双流循环捕获整个样本。

注意：柱头压力和真空度由位于柱顶部的蠕动泵控制。

9.顺时针旋转圆盘传送带至清洗样品储存器，泵入200mL并进行双流洗涤。

注意：清洗可重复。清洗可以是自上而下的流动。

10.顺时针旋转圆盘传送带至洗脱液储存器。泵入60mL并采用双流洗脱。使用200mL塑料收集瓶。

注意：洗脱可以是自上而下的流动。

11.对相同样本的捕获可以重复。对于每个捕获循环，可能需要额外的清洗位置和洗脱位置。在此实施例中，已利用了3个洗脱位置。

12.顺时针旋转圆盘传送带并泵入乙醇来进行沉淀步骤。插入管子来泵送乙醇。使用鼓泡混合。

Claims (19)

1.一种用于在混合腔室中对细胞进行化学处理的自动化方法，其中，所述自动化方法包括

提供细胞，

提供用于处理细胞的化学试剂，

形成包含细胞和化学试剂的液体混合物，以及

通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将液体混合物引入管中，所述管配置为可连接到混合腔室，所述混合腔室比所述管宽。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少通过使用配置为可连接到混合腔室的泵产生压力梯度将液体注入混合腔室来提供来回反复的液体流。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少通过使用配置为可连接到混合腔室的泵产生压力梯度从混合腔室喷射液体来提供来回反复的液体流。

5.根据权利要求3和4所述的方法，其中压力梯度的方向交替多次，优选2-10次，更优选4-6次。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞以细胞悬浮液的形式提供。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述化学试剂是裂解缓冲剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述液体混合物包含DNA酶或RNA酶。

9.根据权利要求7和8所述的方法，其中液体混合物中包含的至少一部分细胞在混合腔室中发生裂解。

10.根据权利要求7-9所述的方法，其中液体混合物的至少一部分细胞释放大分子。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述化学试剂是沉淀剂。

12.一种纯化大分子的自动化方法，所述方法包括

提供细胞，

提供裂解缓冲剂，

提供沉淀剂，

形成包含细胞和裂解缓冲剂的液体混合物，通过在混合腔室中提供来回反复的液体流来混合液体混合物，

通过将沉淀剂添加到至少一部分液体混合物中来提供非沉淀的液体混合物，

通过将至少一部分所述非沉淀的液体混合物通过至少一个过滤器来提供滤液。

13.根据权利要求12和13所述的方法，其中所述方法还包括

通过使至少一部分滤液通过色谱柱来捕获大分子，

从色谱柱中洗脱至少一部分所述大分子。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法还包括浓缩从色谱柱洗脱的大分子。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述过滤器是重力过滤器。

16.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中使液体通过色谱柱包括来回反复的液体流动。

17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中混合液体混合物、提供滤液和捕获大分子中的至少一个被配置为自动化的。

18.一种自动化系统，包括被配置用于纯化由细胞产生的大分子的工作站，其中所述工作站至少包括

被配置用于进行来回反复的液体流动的混合腔室，

被配置用于进行重力过滤的过滤器，和

被配置用于进行来回反复的液体流动的液相色谱柱。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述工作站是圆盘传送带。