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CN118475699A - 包含嗜肝衣壳蛋白和α-半乳糖苷酶的AAV颗粒及其治疗法布里病的用途 - Google Patents

包含嗜肝衣壳蛋白和α-半乳糖苷酶的AAV颗粒及其治疗法布里病的用途 Download PDF

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CN118475699A
CN118475699A CN202280067930.1A CN202280067930A CN118475699A CN 118475699 A CN118475699 A CN 118475699A CN 202280067930 A CN202280067930 A CN 202280067930A CN 118475699 A CN118475699 A CN 118475699A
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CN
China
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seq
sequence
encoding
protein
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朱云祥
P·佩钱
A·班加
S·戈多·维洛斯拉达
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Logic Biotherapy Co
Beihai Kangcheng Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Logic Biotherapy Co
Beihai Kangcheng Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本公开提供了用于递送GAL蛋白的组合物，该组合物包含分离的腺相关病毒(AAV)颗粒，例如重组腺相关病毒颗粒，这些颗粒包含嗜肝衣壳蛋白，例如sL65衣壳蛋白。本公开还提供了组合物，这些组合物包含第一核酸和第二核酸，该第一核酸编码嗜肝衣壳蛋白，例如sL65衣壳蛋白，该第二核酸包含编码GAL蛋白的转基因。本公开还提供了用于制备分离的AAV颗粒，例如重组AAV颗粒的方法；和用于将外源GAL蛋白递送至受试者的方法；和/或用于治疗患有GAL相关疾病或病症，例如溶酶体贮积症，例如法布里病的受试者的方法。

Description

包含嗜肝衣壳蛋白和α-半乳糖苷酶的AAV颗粒及其治疗法布 里病的用途
相关申请
本申请要求于2021年8月25日提交的美国临时申请第63/237,122号的优先权，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
背景技术
溶酶体贮积症是由细胞鞘糖脂、糖原或粘多糖的积累(由于有缺陷的水解酶)引起的一组常染色体隐性疾病。法布里病是由酶α-半乳糖苷酶(α-GAL)的缺乏引起的几种溶酶体贮积症之一。这种酶是用于体内鞘糖脂诸如球形三酰基神经酰胺(也称为GL-3或GB-3)和相关鞘糖脂的日常代谢所必需的。当这种脂质和其它类似脂质的适当代谢不发生时，GL-3在遍及全身的大多数细胞中积累。所得的进行性脂质积累导致细胞损伤。细胞损伤引起广泛的轻微至严重的症状，包括潜在的威胁生命的后果，诸如常常在相对早期的肾衰竭、心力衰竭和中风。
当症状首次出现时，大致有两种类型的反映人年龄的法布里病。对于经典类型，症状在儿童或青少年期间出现。一种标志性疾病症状(手和脚的疼痛烧灼感)，早在二岁时就可被注意到。症状随着时间逐渐恶化。对于迟发型/非典型类型，人们直到他们在30多岁或更老时才有症状。问题的第一个指征可以是肾衰竭或心脏病。
法布里病的治疗主要通过使用重组GAL的酶替代疗法(ERT)，例如使用作为(Genzyme,Inc.)和(TKT,Inc.)销售的产品。ERT通常包括静脉内、皮下或肌内输注纯化形式的对应野生型蛋白，或植入生物易蚀性固体形式的蛋白用于延长释放。使用ERT的主要并发症之一是由于输注的蛋白质的快速降解而获得和维持治疗有效量的蛋白质。因此，ERT需要大量的高剂量输注，并且因此成本高且耗时。另外，ERT疗法具有几个其它的缺陷，诸如大规模产生、纯化和储存适当折叠的蛋白、获得适当糖基化的天然蛋白、在一些患者中产生抗蛋白免疫应答的困难，以及蛋白不能以足够的量穿过血脑屏障以影响具有显著中枢神经系统参与的疾病。
因此，对于开发治疗法布里病和改善患有GAL相关病症的患者的GAL缺乏的新疗法仍然存在长期的需求。
发明内容
本公开提供了用于治疗患者的GAL相关疾病的基于AAV的组合物和方法。具体地，通过利用包含嗜肝衣壳蛋白(例如，sL65衣壳蛋白或LK03衣壳蛋白)的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，实现了靶蛋白(例如，GAL)的优异且高度特异性的肝脏转导和表达，因此使得本公开的rAAV颗粒成为用于治疗GAL相关疾病(诸如法布里病)的有希望的基因疗法候选物。
因此，在一个方面，本公开提供了一种分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含AAV衣壳蛋白和核酸，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列，该核酸包含编码α-半乳糖苷酶(GAL)蛋白的转基因。
在一些实施方案中，编码衣壳蛋白的核酸包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与其至少85％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因是密码子优化的。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因进一步编码信号序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
在一些实施方案中，密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:8-10中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
在一些实施方案中，密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:13-14中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iv)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(v)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(viii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：
(i)信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；或
(ii)信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含与包含编码GAL蛋白的转基因的核酸可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，启动子包括组织特异性启动子或泛素启动子。
在一些实施方案中，启动子包括：
(i)A1AT启动子；EF-1a启动子；鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和/或其衍生物CAG；CMV即刻早期增强子和/或启动子；β葡糖苷酸酶(GUSB)启动子；泛素C(UBC)启动子；神经元特异性烯醇化酶(NSE)；血小板衍生生长因子(PDGF)启动子；血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子；细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子；突触蛋白(Syn)启动子；甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子；Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子；代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子；神经丝轻(NFL)或重(NFH)启动子；β-球蛋白微基因nβ2启动子；前脑啡肽原(PPE)启动子；脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子；心血管启动子；肝脏启动子；骨骼肌启动子或片段，例如截短物，或其功能性变体；和/或
(ii)SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，ITR序列相对于包含编码GAL蛋白的转基因的核酸位于5'位置。
在一些实施方案中，ITR序列相对于包含编码GAL蛋白的转基因的核酸位于3'位置。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒包含：相对于包含编码GAL蛋白的转基因的核酸位于5'位置的ITR序列和相对于包含编码GAL蛋白的转基因的核酸位于3'位置的ITR序列。
在一些实施方案中，ITR序列包含SEQ ID NO:17和/或18的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含增强子。
在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含内含子区。
在一些实施方案中，内含子区包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含Kozak序列。
在一些实施方案中，Kozak序列包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含多腺苷酸化(polyA)信号区。
在一些实施方案中，polyA信号区包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，polyA信号区包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列。
在一些实施方案中，WPRE序列包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，WPRE序列包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：5'ITR序列、增强子、启动子序列、Kozak序列、编码信号序列的核苷酸序列、编码GAL蛋白的核苷酸序列、polyA信号区和3'ITR序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：5'ITR序列、增强子、启动子序列、Kozak序列、编码信号序列的核苷酸序列、编码GAL蛋白的核苷酸序列、WPRE序列、polyA信号区和3'ITR序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的rAAV颗粒以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种包含第一核酸和第二核酸的组合物，该第一核酸编码AAV衣壳蛋白，该第二核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码衣壳蛋白的第一核酸包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与其至少85％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因是密码子优化的。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因进一步编码信号序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
在一些实施方案中，密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:8-10中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
在一些实施方案中，密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:13-14中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iv)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(v)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：
(i)信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；或
(ii)信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因的分离的核酸，其中编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，转基因进一步编码信号序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:8-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的核酸的组合物。
在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的rAAV颗粒或本发明的组合物或本发明的核酸的细胞。
在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
在一个方面，本发明提供了一种制备分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括：(i)提供包含核酸的宿主细胞，该核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因；以及(ii)在适于将转基因包封在AAV衣壳蛋白中的条件下温育宿主细胞，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与其至少85％相同的氨基酸序列；从而制备分离的rAAV颗粒。
在另一个方面，本发明提供了一种制备分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，该方法包括：(i)提供包含第一核酸的宿主细胞，该第一核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因；(ii)将编码AAV衣壳蛋白的第二核酸导入宿主细胞中，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与其至少85％相同的氨基酸序列；以及(iii)在适于将转基因包封在AAV衣壳蛋白中的条件下温育宿主细胞；从而制备分离的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明的rAAV颗粒以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方面，本发明提供了一种将外源GAL蛋白递送至受试者的方法，该方法包括施用有效量的本发明的药物组合物或本发明的分离的rAAV颗粒，从而将外源GAL递送至受试者。
在一些实施方案中，受试者患有GAL相关疾病、已经被诊断患有GAL相关疾病或处于患有GAL相关疾病的风险中。
在一些实施方案中，GAL相关疾病是溶酶体贮积病。
在另一个方面，本发明提供一种治疗患有或经诊断患有GAL相关疾病的受试者的方法，该方法包括施用有效量的本发明的药物组合物或本发明的分离的rAAV颗粒，从而治疗受试者的GAL相关疾病。
在一个方面，本发明提供了一种治疗患有或经诊断患有溶酶体贮积病的受试者的方法，该方法包括施用有效量的本发明的药物组合物或本发明的分离的rAAV颗粒，从而治疗受试者的溶酶体贮积病。
在一些实施方案中，GAL相关疾病或溶酶体贮积病是法布里病。
在一个方面，本发明提供了一种分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含AAV病毒基因组和衣壳蛋白，该AAV病毒基因组包含SEQ ID NO:31-41和51-61中任一者的核酸序列或由其组成，该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的重组病毒基因组，其包含SEQ ID NO:31-41和51-61中任一者的核酸序列或由其组成。
下文阐述本公开的各种方面或实施方案的细节。根据说明书和权利要求书，本公开的其它特征、目的和优点将显而易见。在本说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开领域中的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。
附图说明
图1提供了编码人α-半乳糖苷酶(GAL)蛋白和信号肽的示例性构建体的示意图。
图2描述了AAV-GLA构建体组合的示意图。示出了具有在ApoE-A1AT肝脏特异性启动子和bGH多腺苷酸化序列控制下的天然和密码子优化的信号肽以及人α半乳糖苷酶(GAL)的成熟肽的各种组合的AAV基因组。1-8＝构建体编号1-8；ITR＝AAV2反向末端重复序列；ApoE＝Apo E/C-I HCR-1增强子；A1AT＝A1AT启动子；bgi＝β-球蛋白内含子；bGH A+＝牛生长激素多腺苷酸化序列；sp＝信号肽；hGLA＝天然人GAL；coA-GLA＝sp和GAL的密码子优化的版本A；coB-GLA＝sp和GAL的密码子优化的版本B；coB-CpG-GLA＝CpG减少的sp和GAL的密码子优化的版本B；sp-IgG1＝人IgG1信号肽的反向翻译序列；coC-IgG1＝IgG1信号肽的密码子优化的版本C；sp-coC-CpG-IgG1＝CpG减少的IgG1信号肽的密码子优化的版本C。
图3描述了从转染后72小时用质粒转染的HepG2细胞收获的上清液中的GAL成熟肽以及裂解物中的前体和成熟肽的蛋白质印迹可视化。构建体编号1-8(具体地，构建体1A-8A)，表达天然的GLA和密码子优化的GLA。
图4描述了通过ELISA对从转染后72小时用质粒转染的HepG2细胞收获的上清液和裂解物中的GAL成熟肽的定量。构建体编号1-8(具体地，构建体1A-8A)，表达天然的GLA和密码子优化的GLA。
图5描述了对从转染后72小时用质粒转染的HepG2细胞收获的上清液中的GAL蛋白活性的评估。构建体编号1-8(具体地，构建体1A-8A)，表达天然的GLA和密码子优化的GLA。
图6描述了对来自法布里小鼠的血浆中GAL蛋白活性的评估，在基线时间点(第0天)和注射后(第7天)收获的样品中评估活性。
图7描述了示例性AAV-GLA构建体组合。示出了具有天然和密码子优化的信号肽以及人α半乳糖苷酶(GAL)的成熟肽的各种组合的AAV基因组。1-11＝构建体编号1-11；ITR＝AAV2反向末端重复序列；bGH polyA＝牛生长激素多腺苷酸化序列；sp＝信号肽；hGLA＝天然人GAL；coA-GLA＝sp和GAL的密码子优化的版本A；coB-GLA＝sp和GAL的密码子优化的版本B；coB-CpG-GLA＝CpG减少的sp和GAL的密码子优化的版本B；sp-IgG1＝人IgG1信号肽的反向翻译序列；sp-IgG1co＝IgG1信号肽的密码子优化的版本C；sp-IgG1coCpG＝CpG减少的IgG1信号肽的密码子优化的版本C；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；W3SL＝内部截短的WPRE序列；SV40＝SV40 polyA序列。
图8描述了从转染后72小时用质粒转染的HepG2细胞收获的上清液中的GAL成熟肽以及裂解物中的前体和成熟肽的蛋白质印迹可视化。构建体编号1-11(具体地，构建体1B-11B)，表达天然的GLA和密码子优化的GLA。
图9描述了对从转染后72小时用质粒转染的HepG2细胞收获的上清液中的GAL蛋白活性的评估。构建体编号1-11(具体地，构建体1B-11B)，表达天然的GLA和密码子优化的GLA。
图10描述了从HepG2细胞收获的上清液中GAL成熟肽的蛋白质印迹可视化，该HepG2细胞在三种不同MOI(即，5E4、1D5和2E5)下用包装到AAV/DJ中的所选构建体转导。
图11描述了对从HepG2细胞收获的上清液中GAL蛋白活性的评估，该HepG2细胞在三种不同MOI(即，5E4、1D5和2E5)下用包装到AAV/DJ中的所选构建体转导。
图12描述了对来自法布里小鼠的血浆样品中GAL蛋白活性(左)和lyso-GB3清除(右)的评估。在AAV-DJ中以5E11 vg/kg的剂量给法布里小鼠(每组n＝5)施用密码子优化的构建体(构建体2、4、6、7、8和9)。在第6周收获的样品中评估GAL活性和lyso-GB3水平。
图13描述了血浆GAL活性与血浆lyso-GB3水平之间的相关性。
图14描述了对来自法布里小鼠的血浆样品中GAL蛋白活性的评估。在AAV-DJ中以1E13 vg/kg的剂量给法布里小鼠(每组n＝4)施用密码子优化的构建体(构建体6和9)。在给药前以及在第1周、第4周和第6周收获的样品中评估GAL活性水平。
图15描述了对来自PXB小鼠的血浆样品中GAL蛋白活性(左)和白蛋白(右)水平的评估。在AAV-SL65中以3E13 vg/kg的剂量给PXB小鼠(每组n＝4)施用密码子优化的构建体(构建体6和9)。在给药前以及在第2周和第4周收获的样品中评估GAL活性和白蛋白水平。
图16描述了通过白蛋白对照标准化的血浆GAL蛋白活性。
具体实施方式
本公开提供了用于递送靶蛋白(例如GAL蛋白)的包含分离的病毒颗粒，例如重组病毒颗粒(例如腺相关病毒(AAV)颗粒)的组合物，该病毒颗粒包含嗜肝衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白或LK03衣壳蛋白)，以及用于在受试者中递送外源GAL蛋白的方法，和/或用于使用本公开的AAV颗粒治疗患有GAL相关疾病或病症(例如溶酶体贮积症，例如法布里病)的受试者的方法。
本公开还提供了包含第一核酸和第二核酸的组合物，该第一核酸编码AAV衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)，该第二核酸包含编码GAL蛋白的转基因，其中该衣壳蛋白包含SEQID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
腺相关病毒是细小病毒科的小型无包膜二十面体衣壳病毒，其特征在于单链DNA病毒基因组。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。AAV能够在脊椎动物宿主中复制，该宿主包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和绵羊物种。细小病毒和细小病毒科的其它成员大致描述于Kenneth I.Berns,Fields Virology(第3版，1996)中第69章“Parvoviridae:The Viruses and TheirReplication”，其内容全文以引用方式并入。
AAV已被证明可用作生物工具，这是由于它们相对简单的结构、它们感染广泛的细胞(包括静止细胞和分裂细胞)而不掺入到宿主基因组中且不复制的能力、以及它们相对温和的免疫原性特征。病毒的基因组可被修饰以含有用于装配功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分，该病毒或病毒颗粒经装载或经工程改造以表达或递送期望的核酸构建体或有效载荷，例如转基因、编码多肽的多核苷酸，例如GAL蛋白，该核酸构建体或有效载荷可递送至靶细胞、组织或生物体。在一些实施方案中，靶细胞是肝细胞。在一些实施方案中，靶组织是肝组织。
基因疗法呈现了用于法布里病的另选的方法。由于许多有利的特征，AAV通常用于基因治疗方法中。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可用于施用和/或递送GAL蛋白(例如，GAL和相关蛋白)，以便实现持续和高浓度，从而相对于非AAV疗法允许更长持续效力、更少剂量治疗、广泛生物分布和/或更一致水平的GAL蛋白。
与现有的酶替代方法相比，本文所述的组合物和方法提供了改善的特征，包括：(i)在细胞、组织(例如，肝脏细胞或组织)中增加的GAL活性；(ii)在整个肝脏中增加且均匀的生物分布，和/或(iii)肝脏中提高的有效载荷表达(例如，GLA mRNA表达)。本文所述的组合物和方法可用于治疗与GAL蛋白和/或GAL活性缺乏相关的病症，诸如溶酶体贮积病，例如法布里病。
I.定义
如本文所用，以下术语中的每一者具有与本部分中的含义相关的含义。
冠词“一个/一种(a/an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。以举例的方式，“元素”意指一个元素或多于一个元素，例如多个元素。
术语“包括”在本文中用来意指短语“包括但不限于”，并且与该短语可互换使用。
除非上下文另有明确指示，否则术语“或”在本文中用来意指术语“和/或”，并且与该术语可互换使用。
α-半乳糖苷酶(GAL)：如本文所用，术语“α-半乳糖苷酶(GAL)”，也称为α-GAL、GALA、半乳糖基半乳糖基葡糖基神经酰胺酶、gelibiase、α-D-半乳糖苷酶A、α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶1、阿加糖酶α、α-gal A和阿加糖酶，是指从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的溶酶体酶。如本文所用，术语“GAL”、“GAL蛋白”、“GAL酶”、“α-GAL”、“α-GAL”等是指蛋白产物或蛋白产物的部分，包括GLA基因(集合基因ID：ENSG00000102393)的肽、其同源物或变体、及其直系同源物，包括非人蛋白及其同源物。GAL蛋白包括GLA基因产物的片段、衍生物和修饰。人GLA的示例性氨基酸和核苷酸序列示出于表1中。
腺相关病毒(AAV)：如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指依赖病毒属的成员或其变体(例如，功能性变体)。在一些实施方案中，AAV是野生型的或天然存在的。在一些实施方案中，AAV是重组的。
AAV颗粒：如本文所用，“AAV颗粒”是指包含AAV衣壳(例如，AAV衣壳变体)和多核苷酸(例如，病毒基因组)的颗粒或病毒体。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个有效载荷区和至少一个ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒能够将编码有效载荷的核酸(例如，有效载荷区)递送至细胞，通常为哺乳动物(例如，人)细胞。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以是重组产生的。在一些实施方案中，AAV颗粒可以衍生自本文所述或本领域已知的任何血清型，包括血清型的组合(例如，“假型”AAV)或衍生自各种基因组(例如，单链或自互补的)。在一些实施方案中，AAV颗粒可以是复制缺陷的和/或靶向的。在一些实施方案中，AAV颗粒可以包含存在例如插入衣壳中的肽(例如，靶向肽)，以增强对期望的靶组织的趋向性。应当理解，对本公开的AAV颗粒的提及还包括其药物组合物，即使没有明确记载。
AAV载体：如本文所用，术语“AAV载体”或“AAV构建体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体。“AAV载体”是指包括AAV核苷酸序列以及异源核苷酸序列的载体。AAV载体仅需要顺式的145个碱基末端重复序列以产生病毒。所有其它病毒序列是不必要的，并且可以反式提供(Muzyczka(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158:97-129)。通常，rAAV载体基因组将仅保留反向末端重复(ITR)序列，以便将可由载体有效包装的转基因的大小最大化。ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代来变更，只要该序列提供功能性拯救、复制和包装即可。
施用：如本文所用，对受试者的术语“施用”包括通过用于将组合物递送至受试者的期望位置的任何合适途径将本公开的组合物分配、递送或施用于受试者。另选地或组合地，递送是通过局部、肠胃外或口服途径、脑内注射、肌内注射、皮下/皮内注射、静脉内注射、口腔施用、经皮递送以及通过直肠、结肠、阴道、鼻内或呼吸道途径的施用。
衣壳：如本文所用，术语“衣壳”是指病毒颗粒(例如AAV颗粒)的外部(例如蛋白质壳)，其基本上(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％、>99％或100％)是蛋白质。在一些实施方案中，衣壳是包含本文描述的AAV衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3多肽)的AAV衣壳。AAV衣壳蛋白可以是野生型AAV衣壳蛋白或变体，例如来自野生型或参考衣壳蛋白的结构和/或功能变体，本文称为“AAV衣壳变体”。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体具有包封(例如，封装)病毒基因组的能力和/或能够进入细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一些实施方案中，衣壳蛋白是sL65衣壳蛋白，如本文所述。
密码子优化：如本文所用，术语“密码子优化”是指以此类方式改变给定基因的密码子的过程，即：由基因编码的多肽序列保持相同，而改变的密码子改善多肽序列的表达过程。例如，如果多肽具有人蛋白质序列并且在大肠杆菌中表达，如果对DNA序列进行密码子优化以将人密码子改变为对于在大肠杆菌中表达更有效的密码子，则表达通常会得到改善。
接触：如本文所用，术语“接触”(即，使细胞与药剂接触)旨在包括将药剂和细胞一起体外温育(例如，将药剂添加到培养中的细胞中)或向受试者施用药剂使得药剂和受试者的细胞体内接触。术语“接触”不旨在包括将细胞暴露于可在受试者中天然存在的药剂(即，可作为天然生理过程的结果发生的暴露)。
GAL相关病症：术语“GAL相关病症”、“GAL相关疾病”等是指具有GLA基因缺陷的疾病或病症，该缺陷诸如在GLA中导致患者细胞中GAL蛋白表达缺陷或缺乏的可遗传(例如X连锁)突变。GAL相关病症包括但不限于溶酶体贮积病，例如法布里病。
法布里病：如本文所用，术语“法布里病”，也称为α-半乳糖苷酶A缺乏症、安德森-法布里病、弥漫性体部血管角质瘤、弥漫性血管角质瘤和GAL缺乏症，是指由溶酶体酶α-半乳糖苷酶A(GAL)的缺失或显著缺乏活性引起的鞘糖脂代谢的罕见遗传病症。这种酶是用于体内鞘糖脂诸如球形三酰基神经酰胺(也称为GL-3或GB-3)和相关鞘糖脂的日常代谢所必需的。当这种脂质和其它类似脂质的适当代谢不发生时，GL-3在遍及全身的大多数细胞中积累。所得的进行性脂质积累导致细胞损伤。细胞损伤引起广泛的轻微至严重的症状，包括潜在的威胁生命的后果，诸如常常在相对早期的肾衰竭、心力衰竭和中风。当症状首次出现时，大致有两种类型的反映人年龄的法布里病。对于经典类型，症状在儿童或青少年期间出现。一种标志性疾病症状(手和脚的疼痛烧灼感)，早在二岁时就可被注意到。症状随着时间逐渐恶化。对于迟发型/非典型类型，人们直到他们在30多岁或更老时才有症状。问题的第一个指征可以是肾衰竭或心脏病。
辅助功能：如本文所用，如本文所用的术语“辅助功能”是指编码进行AAV复制所依赖的功能(即，“辅助功能”)的多肽的基因。辅助功能包括用于AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、帽表达产物的合成和AAV衣壳装配的那些部分。基于病毒的附属功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒和痘苗病毒。辅助功能包括但不限于腺病毒E1、E2a、VA和E4、或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶。在一个实施方案中，辅助功能不包括腺病毒E1。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指从天然状态变更或去除(例如，从在天然状态下与其相关的至少一些组分变更或去除)的物质或实体。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，诸如例如宿主细胞中。此类多核苷酸可以是载体的一部分并且/或者此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然存在的环境的一部分。在一些实施方案中，分离的核酸是重组的，例如掺入到载体中。
溶酶体贮积病：如本文所用，术语“溶酶体贮积病”或“溶酶体贮积症”是指遗传代谢疾病，其特征在于由于酶缺乏而导致的各种毒性物质在身体细胞中的异常积聚。溶酶体贮积病影响身体的不同部分，包括骨骼、脑、皮肤、心脏和中枢神经系统。示例性的溶酶体贮积病包括但不限于法布里病、庞贝病、戈谢病、萨氏病、胱氨酸病、贝敦氏症、天冬氨酰基葡萄糖胺尿症、桑霍夫病、异染性脑白质营养不良、粘脂糖症、Schindler病和尼曼匹克病。在每种情况下，溶酶体贮积病是由导致酶的缺失或缺乏的先天性代谢缺陷引起的，导致物质在身体的各种细胞中的不适当的储存。大部分溶酶体贮积症以常染色体隐性方式遗传。
突变：如本文所用，术语“突变”是指改变和/或变更。在一些实施方案中，突变可以是对蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(包括多核酸)的改变和/或变更。在一些实施方案中，突变包括对蛋白质和/或核酸序列的改变和/或变更。此类改变和/或变更可以包括一个或多个氨基酸(在蛋白质和/或肽的情况下)和/或核苷酸(在核酸和/或多核酸的情况下)的添加、取代和/或缺失。在其中突变包括氨基酸和/或核苷酸的添加和/或取代的实施方案中，此类添加和/或取代可以包括1个或多个氨基酸和/或核苷酸残基并且可以包括修饰的氨基酸和/或核苷酸。一个或多个突变可产生，例如核酸序列或多肽或蛋白质序列的“突变体”、“衍生物”或“变体”。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”或“野生型”意指在自然界中存在而没有人工辅助或人工参与。“天然存在的”或“野生型”可以是指天然形式的生物分子、序列或实体。
核酸：如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、或多核糖核苷酸(含有D-核糖)或任何其它类型的多核苷酸组成的任何核酸聚合物，该任何其它类型的多核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间不存在有意的长度区别，并且这些术语将互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。
可操作地连接：如本文所用，短语“可操作地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能性连接。
颗粒：如本文所用，“颗粒”是由至少两种组分(蛋白衣壳和包封在衣壳内的多核苷酸序列)组成的病毒。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或由受过训练的(例如，许可的)专业人员对特定疾病或病状进行护理中的受试者。
有效载荷：如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”或“转基因”是指由病毒基因组编码或在病毒基因组内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区(例如，转基因、编码多肽的多核苷酸)的表达产物。
有效载荷构建体：如本文所用，“有效载荷构建体”是编码或包含有效载荷的一个或多个多核苷酸区，该有效载荷在一侧或两侧上侧接有反向末端重复(ITR)序列。有效载荷构建体是在病毒生产细胞中复制以产生病毒基因组的模板。
有效载荷构建体载体：如本文所用，“有效载荷构建体载体”是编码或包含有效载荷构建体和用于在细菌细胞中复制和表达的调控区的载体。有效载荷构建体载体还可以包含用于在病毒复制细胞中病毒表达的组分。
肽：如本文所用，术语“肽”是指小于或等于约50个氨基酸长(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长)的氨基酸链。
药学上可接受的：本文中所用的短语“药学上可接受的”是指一些化合物、材料、组合物和/或剂型，它们在合理的医学判断范围内适合与人类和动物组织接触且没有过度的毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指除存在于药物组合物中的活性剂(例如，如本文所述)以外并且具有在受试者中基本上无毒且非炎性的特性的任何成分。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是能够悬浮和/或溶解活性剂的媒介物。赋形剂可以包括，例如：抗粘合剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。赋形剂包括但不限于：二丁基羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(磷酸氢钙)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和/或木糖醇。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”或“药学上可接受的组合物”包含AAV多核苷酸、AAV基因组或AAV颗粒以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、溶剂、佐剂等。
多肽：如本文所用，术语“多肽”是指由在链中结合在一起的大量氨基酸残基组成的有机聚合物。单体蛋白质分子是多肽。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全地延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全地延迟来自感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与感染、疾病、病症和/或病状相关的病理学的风险。
启动子：如本文所用，术语“启动子”是指聚合酶将结合以起始转录(DNA至RNA)或逆转录(RNA至DNA)的核酸位点。
调控序列：如本文所用，术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列例如描述于Goeddel；Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列、组成型活性的调控序列、诱导型的调控序列以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。可将本公开的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或其部分，包括融合蛋白或其部分。
血清型：如本文所用，术语“血清型”是指基于表面抗原的AAV衣壳中的不同变异，这允许在亚种水平上对AAV进行流行病学分类。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”是指在蛋白质合成期间可指导蛋白质转运或定位至内质网的序列。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间、例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此之间的百分比相似性的计算可以以与百分比同一性的计算相同的方式进行，除了百分比相似性的计算考虑保守取代，如本领域所理解的。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的的可施用根据本公开的组合物的任何生物体。类似地，“受试者”或“患者”是指可能寻求、可能需要、正在接受或将接受治疗，或由受过训练的专业人员对特定疾病或病状进行护理中的生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)。在某些实施方案中，受试者或患者可易感或疑似患有GAL相关病症，例如溶酶体贮积症，例如法布里病。在某些实施方案中，受试者或患者可被诊断患有法布里病。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行完全或实现或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来捕获许多生物和化学现象中固有的完整性的潜在缺乏。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防效果和/或引起期望的生物学和/或药理学效果的任何药剂。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，该药剂在施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者时，足以治疗感染、疾病、病症和/或病状、改善其症状、诊断、预防感染、疾病、病症和/或病状并且/或者延迟其发作。在一些实施方案中，以单一剂量提供治疗有效量。在一些实施方案中，在包含多个剂量的给药方案中施用治疗有效量。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果单位剂型包含当作为此类剂量方案的一部分施用时有效的量，则单位剂型可被认为包含治疗有效量的特定药剂或实体。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全地减轻、改善、改进、缓解、逆转、延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作、抑制其进展、降低其严重性并且/或者降低其发生率。出于降低发展与疾病、病症和/或病状相关的病理学的风险的目的，治疗可施用于未表现出疾病、病症和/或病状的体征的受试者并且/或者施用于仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。
载体：如本文所用，“载体”是转运、转导或以其他方式充当异源分子的载剂的任何分子或部分。本公开的载体可以重组产生，并且可以基于并且/或者可以包含腺相关病毒(AAV)亲本或参考序列。此类亲本或参考AAV序列可作为用于工程载体的原始、第二、第三或后续序列。在非限制性示例中，此类亲本或参考AAV序列可以包含以下序列中的任何一者或多者：编码多肽或多重多肽的多核苷酸序列，其具有可以是野生型或由野生型修饰的序列，并且该序列可以编码蛋白质、蛋白质结构域或GAL蛋白的一个或多个亚基及其变体的全长或部分序列；编码GAL蛋白及其变体的多核苷酸，其具有可以是野生型或由野生型修饰的序列；以及编码GAL蛋白及其变体的转基因，该变体可以或可以不由野生型序列修饰。
病毒构建体载体：如本文所用，“病毒构建体载体”是包含一个或多个编码或包含Rep和/或Cap蛋白的多核苷酸区的载体。病毒构建体载体还可以包含一个或多个编码或包含用于在病毒复制细胞中病毒表达的组分的多核苷酸区。
病毒基因组：如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”是包含至少一个反向末端重复序列(ITR)和至少一个编码的有效载荷的多核苷酸。病毒基因组编码有效载荷的至少一个拷贝。
野生型：如本文所用，“野生型”是生物分子、序列或实体的天然形式。
在以下子部分中进一步详细地描述本公开的方法的各种另外的方面。
II.本公开的组合物
本公开提供了用于递送蛋白(例如，GAL蛋白)的包含分离的病毒颗粒，例如重组病毒颗粒(例如，腺相关病毒(AAV)颗粒)的组合物，该病毒颗粒包含嗜肝衣壳蛋白(例如，sL65衣壳蛋白或LK03衣壳蛋白)，以及该组合物用于治疗患有GAL相关疾病或病症(例如溶酶体贮积症，例如法布里病)的受试者的用途。
本公开还提供了包含第一核酸和第二核酸的组合物，该第一核酸编码AAV衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)，该第二核酸包含编码GAL蛋白的转基因，其中该衣壳蛋白包含SEQID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
属于细小病毒科依赖病毒属的AAV病毒，如本文所用，并且包括超过100种已知的AAV病毒血清型中的任何血清型。一般来讲，AAV病毒的血清型的基因组序列在氨基酸和核酸的水平上具有显著同源性，提供相同系列的遗传功能，产生在物理和功能方面基本上等同的病毒体，并且通过几乎相同的机制进行复制和装配。
AAV基因组大约4.7千碱基长，并且由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，该单链脱氧核糖核酸可以是正义或负义的。基因组包含编码负责复制的蛋白(Rep)和衣壳的结构蛋白(Cap)的两个开放阅读框(ORF)。开放阅读框侧接有两个反向末端重复序列(ITR)，其作为病毒基因组的复制起点。rep框由四个编码Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)的重叠基因组成。帽框含有三个衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列。Rep蛋白对于复制和包装是重要的，而衣壳蛋白被装配以产生AAV的蛋白壳或AAV衣壳。参见Carter B,Adeno-associated virus and adeno-associated virus vectors for gene delivery,LassieD,et ah,Eds.,“Gene Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies”(MarcelDekker,Inc.,New York,NY,US,2000)和Gao G，等人，J.Virol.2004；78(12):6381-6388。
AAV载体通常需要共辅助剂以在细胞中进行生产性感染。在不存在此类辅助功能的情况下，AAV病毒体基本上进入宿主细胞，但不掺入到细胞基因组中。
由于几个独特的特征，已经研究了AAV载体用于递送基因治疗剂。该特征的非限制性示例包括：(i)感染分裂和非分裂细胞两者的能力；(ii)具有感染性的广泛宿主范围，包括人细胞；(iii)野生型AAV没有与任何疾病相关，并且没有表明在感染的细胞中复制；(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫应答，以及(v)宿主染色体中的非掺入性质，从而降低长期遗传改变的可能性。此外，具有AAV载体的感染对改变细胞基因表达模式的影响最小(Stilwell和Samulski等人，Biotechniques,2003,34,148，其内容全文以引用方式并入本文)。
通常，用于GAL蛋白递送的AAV载体可以是复制缺陷的重组病毒载体，因为它们在病毒基因组内缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。在一些情况下，有缺陷的AAV载体可能缺少大多数或全部编码序列，并且基本上仅含有一个或两个AAV ITR序列和有效载荷序列。
在某些实施方案中，分离的，例如重组AAV颗粒包含衣壳蛋白(例如嗜肝衣壳蛋白，例如sL65衣壳蛋白)和核酸，该核酸包含编码GAL蛋白的转基因。在一些实施方案中，转基因进一步编码信号序列。
在一些实施方案中，可将本公开的AAV颗粒引入至哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞中。
可修饰AAV载体以提高递送效率。本公开的此类修饰的AAV载体可以被有效地包装，并且可以用于以高频率和以最小毒性成功地感染靶细胞。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可用于将GAL蛋白递送至特定器官或组织，例如肝脏(参见例如，国际专利申请号PCT/AU2021/050158；其内容全文以引用方式并入本文)。
如本文所用，术语“AAV载体”或“AAV颗粒”包含衣壳和病毒基因组，该病毒基因组包含有效载荷。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或在病毒基因组内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区(例如，转基因、编码多肽或多重多肽例如GAL蛋白的多核苷酸)的表达产物。
应理解，本文所述的组合物可具有另外的保守或非必需氨基酸取代，该取代对它们的功能没有实质影响。
AAV血清型
如本文所用，“AAV血清型”主要由AAV衣壳定义。本公开的AAV颗粒可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。特别地，AAV颗粒可以利用或基于血清型，或包括嗜肝AAV衣壳(例如，sL65衣壳蛋白)及其变体的氨基酸序列。
包含sL65衣壳蛋白的AAV颗粒被证明具有几个用于肝脏靶向衣壳的基本属性。特别地，包含sL65衣壳蛋白的AAV颗粒在非人灵长类动物中具有优异的肝脏转导和转基因表达。此外，表明了包含sL65衣壳蛋白的AAV颗粒具有高肝脏特异性转导，这降低了由脱靶组织中转基因表达引起的安全隐患。此外，包含sL65衣壳蛋白的AAV颗粒导致遍及肝脏的广泛且均匀的分布，这使得它们对于细胞内的和基于分泌的蛋白的基因疗法两者都是理想的。最后，包含sL65衣壳蛋白的AAV颗粒可以在可扩缩的生物反应器中实现高产量生产，因此使得能够制造成本有效的产品。
在一个方面，本公开提供了分离的AAV颗粒，例如重组AAV颗粒，其包含衣壳蛋白和核酸，该核酸包含编码本文所述的GAL蛋白的转基因。在一些实施方案中，衣壳蛋白包括AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白包括sL65 VP1衣壳蛋白或其功能性变体。
在一些实施方案中，AAV衣壳可以包含如国际专利申请号PCT/AU2021/050158中所述的序列、其片段或变体，其内容全文以引用方式并入本文，诸如PCT/AU2021/050158的AAV-C11.11(aka SEQ ID NO:12)。编码衣壳蛋白的核酸包含如国际专利申请号PCT/AU2021/050158中所述的核苷酸序列，诸如AAV-C11.11(aka SEQ ID NO:31)。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白可以包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列、其片段或变体。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白可由SEQ ID NO:46的核酸序列、其片段或变体编码。
在一些实施方案中，AAV颗粒的AAV血清型(例如，用于本文所述的GAL蛋白的向量化递送的AAV颗粒)是sL65或其变体。在一些实施方案中，AAV颗粒(例如，本文所述的重组AAV颗粒)包含sL65衣壳蛋白。
在一些实施方案中，衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含由SEQ ID NO:46的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码衣壳蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包括LK03衣壳蛋白或其功能性变体。在一些实施方案中，AAV衣壳可以包含如国际专利申请公开号WO2013029030A1中所述的序列、其片段或变体，其内容全文以引用方式并入本文，诸如WO2013029030A1的SEQ ID NO:31。编码衣壳蛋白的核酸包含如国际专利申请号WO2013029030A1中所述的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO:4。
AAV病毒基因组
在一些方面，本公开的重组AAV颗粒用作包含编码GAL蛋白的病毒基因组的表达载体。在一些实施方案中，病毒基因组可以编码GAL蛋白和信号肽。
在一些实施方案中，重组AAV颗粒，例如用于本文所述的GAL蛋白的向量化递送的重组AAV颗粒，包含AAV病毒基因组，或包含病毒基因组的AAV载体。在一些实施方案中，病毒基因组还包含以下中的一者或多者：反向末端重复(ITR)区、增强子(例如，ApoE/C1增强子)、启动子(例如，hA1At启动子)、内含子区(例如，人β-球蛋白截短的内含子)、Kozak序列、编码有效载荷(例如，本文所述的GAL蛋白)的核酸编码转基因、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列、poly A信号区或其组合。
病毒基因组组分：反向末端重复(ITR)
在一些实施方案中，病毒基因组可以包含至少一个反向末端重复(ITR)区。本公开的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区和有效载荷区的病毒基因组，即编码蛋白(例如GAL蛋白)的转基因。ITR序列相对于有效载荷区位于5'或3'位置。在一些实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR在5'和3'端侧接有效载荷区。在一些实施方案中，ITR作为复制起点起作用，该复制起点包括用于复制的识别位点。在一些实施方案中，ITR包含可互补且对称排列的序列区。在一些实施方案中，并入本文所述的病毒基因组中的ITR可由天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列组成。
ITR可衍生自与衣壳相同的血清型或其衍生物。ITR可以具有与衣壳不同的血清型。在一些实施方案中，AAV颗粒具有多于一个ITR。在非限制性示例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在一些实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性示例包括具有与衣壳相同血清型的零个、一个或两个ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR都是AAV2 ITR。
独立地，每个ITR的长度可以是约100至约150个核苷酸。在一些实施方案中，ITR包含长度为100至180个核苷酸，例如，长度为约100至115、约100至120、约100至130、约100至140、约100至150、约100至160、约100至170、约100至180、约110至120、约110至130、约110至140、约110至150、约110至160、约110至170、约110至180、约120至130、约120至140、约120至150、约120至160、约120至170、约120至180、约130至140、约130至150、约130至160、约130至170、约130至180、约140至150、约140至160、约140至170、约140至180、约150至160、约150至170、约150至180、约160至170、约160至180、或约170至180个核苷酸。ITR长度的非限制性示例是长度为120、130、140、141、142、145个核苷酸。
在一些实施方案中，ITR包含SEQ ID NO:17-18中任一者的核苷酸序列，或与前述序列中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
病毒基因组组分：启动子和表达增强子
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个元件以增强转基因靶特异性和表达。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性示例包括启动子、内源miRNA、转录后调控元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信号序列、上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。参见例如，Powell等人Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene TargetSpecificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，多肽在靶细胞中的表达可由特异性启动子驱动，包括但不限于物种特异性、可诱导的、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(Parr等人，Nat.Med.3:1145-9(1997)；其内容全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，病毒基因组包含足以在例如靶细胞中表达由转基因编码的有效载荷(例如，GAL蛋白)的启动子。在一些实施方案中，当启动子驱动在AAV颗粒的病毒基因组的有效载荷区中编码的多肽的表达时，该启动子被认为是有效的。
在一些实施方案中，当启动子驱动在所靶向的细胞或组织中的表达时，该启动子被认为是有效的启动子。
在一些实施方案中，启动子驱动GAL蛋白在靶向的组织中的表达持续一段时间。由启动子驱动的表达可以持续以下的时间段：1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。表达可以持续1至5小时、1至12小时、1至2天、1至5天、1至2周、1至3周、1至4周、1至2个月、1至4个月、1至6个月、2至6个月、3至6个月、3至9个月、4至8个月、6至12个月、1至2年、1至5年、2至5年、3至6年、3至8年、4至8年、或5至10年。
在一些实施方案中，启动子驱动多肽(例如，GAL多肽)的表达持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超过65年。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性示例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。
在一些实施方案中，病毒基因组包含导致在一个或多个(例如，多个)细胞和/或组织中表达的启动子，例如泛素启动子。在一些实施方案中，在大多数哺乳动物组织中驱动或促进表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α-亚基(EF1α)、细胞巨化病毒(CMV)即刻早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖苷酸酶(GUSB)和泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于限制对某些细胞类型的表达，诸如但不限于：肝脏特异性启动子、CNS特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或可用于限制对例如神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的表达的各种特异性神经系统细胞或组织型启动子。示例性启动子包括但不限于：EF-1a启动子；鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和/或其衍生物CAG；CMV即刻早期增强子和/或启动子；β葡糖苷酸酶(GUSB)启动子；泛素C(UBC)启动子；神经元特异性烯醇化酶(NSE)；血小板衍生生长因子(PDGF)启动子；血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子；细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子；突触蛋白(Syn)启动子；甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子；Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子；代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子；神经丝轻(NFL)或重(NFH)启动子；β-球蛋白微基因nβ2启动子；前脑啡肽原(PPE)启动子；脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子；心血管启动子(例如，αMHC、cTnT和CMV-MLC2k)；肝脏启动子(例如，hA1AT、TBG)；骨骼肌启动子(例如，肌间线蛋白、MCK、C512)或片段，例如截短物，或其功能性变体。
在一些实施方案中，启动子是如以下文献中所述的泛素启动子：Yu等人.(Molecular Pain 2011,7:63)、Soderblom等人.(E.Neuro 2015)、Gill等人.,(GeneTherapy 2001，第8卷，1539-1546)以及Husain等人.(Gene Therapy 2009)，其各自全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，病毒基因组包含肝脏特异性启动子，例如导致有效载荷在肝细胞和/或组织中表达的启动子。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子是人α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，启动子可以小于1kb。启动子可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸的长度。启动子可以具有200至300、200至400、200至500、200至600、200至700、200至800、300至400、300至500、300至600、300至700、300至800、400至500、400至600、400至700、400至800、500至600、500至700、500至800、600至700、600至800、或700至800个之间的核苷酸的长度。
在一些实施方案中，启动子可以是相同或不同的起始或亲本启动子(诸如但不限于CMV和CBA)的两种或更多种组分的组合。每个组分可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸的长度。每个组分可以具有200至300、200至400、200至500、200至600、200至700、200至800、300至400、300至500、300至600、300至700、300至800、400至500、400至600、400至700、400至800、500至600、500至700、500至800、600至700、600至800、或700至800个之间的核苷酸的长度。
在一些实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性示例，启动子是A1AT启动子和CMV启动子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子元件。增强子元件，在本文中也称为“增强子”，可以是但不限于组织特异性增强子，例如肝脏特异性增强子，例如人载脂蛋白E/C-I(ApoE/C-I)基因座(或肝对照区)。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。在一些实施方案中，增强子是CMV增强子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子和/或启动子。在一些实施方案中，增强子是ApoE/C-I增强子。在一些实施方案中，启动子是A1AT启动子。在一些实施方案中，病毒基因组包含ApoE/C-I增强子和人A1AT启动子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含工程化的启动子。在另一个实施方案中，病毒基因组包含来自天然表达蛋白的启动子。
病毒基因组组分：内含子
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个内含子或其片段或衍生物。在一些实施方案中，该至少一个内含子可以增强如本文所述的GAL蛋白的表达。内含子的非限制性示例包括：人β-球蛋白内含子(例如，长476bps的内部截短的人β-球蛋白内含子2)、MVM(67-97bps)、F.IX截短的内含子1(300bps)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bps)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bps)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bps)和杂合腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bps)。
在一些实施方案中，内含子的长度可以是100至500个核苷酸。内含子可以具有80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个核苷酸的长度。内含子可以具有80至100、80至120、80至140、80至160、80至180、80至200、80至250、80至300、80至350、80至400、80至450、80至500、200至300、200至400、200至500、300至400、300至500、或400至500个之间的核苷酸的长度。
在一些实施方案中，病毒基因组可以包含人β-球蛋白内含子或其片段或变体。在一些实施方案中，内含子包含一个或多个人β-球蛋白序列(例如，包括其片段/变体)。在一些实施方案中，启动子可以是人A1AT启动子。
在一些实施方案中，内含子包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与前述序列中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码的蛋白质可以位于表达载体中的内含子的下游，该内含子诸如但不限于SV40内含子或β球蛋白内含子或本领域已知的其它内含子。此外，编码的GAL蛋白还可以位于表达载体中的多腺苷酸化序列的上游。在一些实施方案中，编码的蛋白质可以位于表达载体中的包含内含子的启动子下游(例如，相对于包含内含子的启动子的3')和/或多腺苷酸化序列上游(例如，相对于多腺苷酸化序列的5')的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30、40、50、60或70个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的GAL蛋白可以位于表达载体中的内含子下游(例如，相对于内含子的3')和/或多腺苷酸化序列上游(例如，相对于多腺苷酸化序列的5')的1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30、25至30、30至35、35至40、45至50、50至55、55至60、60至65、或65至70个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的蛋白质可以位于表达载体中的内含子下游(例如，相对于内含子的3')和/或多腺苷酸化序列上游(例如，相对于多腺苷酸化序列的5')的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超过25％的核苷酸内。在一些实施方案中，编码的蛋白质可位于表达载体中的内含子下游(例如，相对于内含子的3')和/或多腺苷酸化序列上游(例如，相对于多腺苷酸化序列的5')的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％、或20-25％的序列内。
在某些实施方案中，内含子序列不是增强子序列。在一些实施方案中，内含子序列不是启动子序列的子组分。在一些实施方案中，内含子序列是启动子序列的子组分。
病毒基因组组分：非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，基因的野生型非翻译区(UTR)被转录但不被翻译。一般来讲，5'UTR在转录起始位点开始并在起始密码子处结束，并且3'UTR紧接着终止密码子开始并继续直至转录的终止信号。
通常在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征可以被工程化到UTR中以增强稳定性和蛋白质生产。作为非限制性示例，来自肝脏中正常表达的mRNA的5'UTR(例如，白蛋白、血清淀粉状蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、红细胞生成素或因子VIII)可用于本公开的AAV颗粒的病毒基因组中以增强肝细胞系或肝脏中的表达。
在一些实施方案中，本文所述的病毒基因组编码转基因(例如，编码GAL蛋白的转基因)包含Kozak序列。
尽管不希望受理论束缚，但野生型5'非翻译区(UTR)包括翻译起始中起作用的特征。Kozak序列(通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程)通常包括在5'UTR中。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个'G'。在一些实施方案中，在脊椎动物mRNA中用于翻译起始的有利背景是GCCACCatgG(SEQ ID NO:42)(M.Kozak,1996,Mammalian Genome 7:563)。在一些实施方案中，Kozak序列包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
虽然不希望受理论束缚，但已知野生型3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷的延伸。这些富含AU的标记在具有高周转率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以被分成三类(Chen等人，1995，其内容全文以引用方式并入本文)：I类ARE，诸如但不限于c-Myc和MyoD，在富含U的区域内含有AUUUA基序的几个分散拷贝。II类ARE，诸如但不限于GM-CSF和TNF-a，具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARE，诸如但不限于c-Jun和肌细胞生成素，较少明确定义。这些富含U的区域不包含AUUUA基序。已知与ARE结合的大多数蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族的成员(最显著的是HuR)已被证明增加mRNA的稳定性。HuR与所有三类的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，并且因此导致体内信息的稳定。
引入、去除或修饰富含3'UTR AU的元件(ARE)可用于调节多核苷酸的稳定性。当工程化特定多核苷酸，例如病毒基因组的有效载荷区时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使多核苷酸较不稳定，并从而缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，可将ARE鉴定并去除或突变以增加细胞内稳定性并因此增加所得蛋白质的翻译和生产。
在一些实施方案中，病毒基因组的3'UTR可以包括用于模板化添加poly-A尾的寡(dT)序列。
在一些实施方案中，病毒基因组的3'UTR可以包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在一些实施方案中，WPRE包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。在一些实施方案中，WPRE包含SEQ ID NO:26的内部截短的核苷酸序列W3SL，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
可将来自本领域已知的任何基因的任何UTR掺入到AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以以与选择它们的基因相同的方向放置，或者它们可以在方向或位置上变更。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组中使用的UTR可以被反转、缩短、延长或用本领域已知的一个或多个其它5'UTR或3'UTR制备。如本文所用，当涉及UTR时，术语“变更的”意指相对于参考序列，UTR已经以某种方式改变。例如，相对于野生型或天然UTR，3'或5'UTR可通过如上所述的方向或位置的改变而变更，或者可以通过包含另外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座而变更。
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个人工UTR，该人工UTR不是野生型UTR的变体。
在一些实施方案中，病毒基因组包含选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或特性的转录物家族的UTR。
病毒基因组组分：多腺苷酸化序列
在一些实施方案中，本公开的病毒基因组包含至少一个多腺苷酸化(polyA)序列。本公开的病毒基因组可以在有效载荷编码序列的3'端与3'UTR的5'端之间包含多腺苷酸化序列。在一些实施方案中，polyA信号区相对于包含编码有效载荷(例如，本文所述的GAL蛋白)的转基因的核酸位于3'位置。
在一些实施方案中，polyA信号区包含约100至600个核苷酸(例如约100至500个核苷酸、约100至400个核苷酸、约100至300个核苷酸、约100至200个核苷酸、约200至600个核苷酸、约200至500个核苷酸、约200至400个核苷酸、约200至300个核苷酸、约300至600个核苷酸、约300至500个核苷酸、约300至400个核苷酸、约400至600个核苷酸、约400至500个核苷酸或约500至600个核苷酸)的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约100至150个核苷酸(例如约127个核苷酸)的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约450至500个核苷酸(例如约477个核苷酸)的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约520至约560个核苷酸(例如约552个核苷酸)的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约127个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，病毒基因组包含牛生长激素(bGH)polyA序列。在一些实施方案中，polyA序列包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含SV40 polyA序列。在一些实施方案中，polyA序列包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或与前述序列基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
病毒基因组组分：填充序列
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列。填充序列可以是野生型序列或工程化的序列。填充序列可以是野生型序列的变体。在一些实施方案中，填充序列是人白蛋白的衍生物。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列以使病毒基因组的长度为用于包装的最佳大小。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列以使病毒基因组的长度为约2.3kb。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在一些实施方案中，病毒基因组包含单链(ss)病毒基因组并且包含一个或多个填充序列，该填充序列独立地或一起具有约0.1kb至3.8kb之间(诸如但不限于，0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb)的长度。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是3.1kb。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是2.7kb。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是0.4kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充序列的长度是0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充序列的长度是0.4kb。
在一些实施方案中，病毒基因组包含自互补(sc)病毒基因组并且包含一个或多个填充序列，该填充序列独立地或一起具有约0.1kb至1.5kb之间(诸如但不限于，0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb)的长度。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中填充序列的总长度是0.4kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充序列的长度是0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充序列的长度是0.4kb。
在一些实施方案中，病毒基因组包含填充序列的任何部分。病毒基因组可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的填充序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于5'ITR序列的3'。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于启动子序列的5'。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于多腺苷酸化信号序列的3'。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于3'ITR序列的5'。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于两个内含子序列之间。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于内含子序列内。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'ITR序列的3'且第二填充序列位于多腺苷酸化信号序列的3'。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5'且第二填充序列位于多腺苷酸化信号序列的3'。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'ITR序列的3'且第二填充序列位于5'ITR序列的5'。
在一些实施方案中，病毒基因组可以在病毒基因组的一个或多个区域之间包含一个或多个填充序列。在一些实施方案中，填充区可位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、多腺苷酸化信号序列区和/或外显子区的区域之前。在一些实施方案中，填充区可位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、多腺苷酸化信号序列区和/或外显子区的区域之后。在一些实施方案中，填充区可位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、多腺苷酸化信号序列区和/或外显子区的区域之前和之后。
在一些实施方案中，病毒基因组包含5'ITR之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含启动子区之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含有效载荷区之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子区之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子区之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含多腺苷酸化信号序列区之后的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含外显子区之后的填充序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含启动子区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含有效载荷区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含多腺苷酸化信号序列区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含外显子区之前的填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含3'ITR之前的填充序列。
在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于5'ITR和启动子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于5'ITR和有效载荷区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于5'ITR和内含子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于5'ITR和增强子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于5'ITR和多腺苷酸化信号序列区)之间。
在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和有效载荷区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和内含子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和增强子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和多腺苷酸化信号序列区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和外显子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于启动子区和3'ITR)之间。
在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于有效载荷区和内含子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于有效载荷区和增强子区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于有效载荷区和多腺苷酸化信号序列区)之间。在一些实施方案中，填充序列可位于两个区域(诸如但不限于有效载荷区和外显子区)之间。
病毒基因组组分：有效载荷
在一些实施方案中，重组AAV颗粒，例如用于GAL蛋白的向量化递送的AAV颗粒，包含编码有效载荷的病毒基因组。在一些实施方案中，病毒基因组包含与包含编码有效载荷的转基因的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，有效载荷包含GAL蛋白。
在一些实施方案中，本文的公开内容提供了允许改善由基因治疗载体递送的GAL蛋白的表达和/或活性的构建体。
在一些实施方案中，本公开提供了允许改善由基因治疗载体递送的GAL蛋白的生物分布的构建体。
在一些实施方案中，本公开提供了允许改善由基因治疗载体递送的GAL蛋白的亚细胞分布或运输的构建体。
在一些实施方案中，本公开提供了允许改善由基因治疗载体递送的GAL蛋白向溶酶体膜的运输的构建体。
在一些方面，本公开涉及一种包含分离的重组AAV颗粒的组合物，该分离的重组AAV颗粒包含嗜肝衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)和核酸序列，该核酸序列包含编码GAL蛋白或其功能性片段或变体的转基因，以及在受试者中体外或体内(例如人类和/或动物疾病模型，例如GAL相关疾病，例如溶酶体贮积病，例如法布里病)施用或递送该组合物的方法。
本公开的AAV颗粒可以包含编码至少一个“有效载荷”的核酸序列。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或在病毒基因组内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区(例如，转基因、编码多肽或多重多肽例如GAL蛋白或其片段或变体的多核苷酸)的表达产物。有效载荷可以包含本领域已知的任何核酸，该核酸可用于在转导的或与携带有效载荷的AAV颗粒接触的靶细胞中表达(通过补充蛋白产物或使用调节核酸进行基因置换)GAL蛋白。
如本文所述用于AAV基因组的编码GAL的转基因的具体特征包括使用野生型GAL编码序列和密码子优化的GAL编码构建体。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因是野生型GAL编码序列并且编码野生型GAL蛋白或其功能性变体。在一些实施方案中，功能性变体是保留其野生型对应物的一些或全部活性的变体，以便实现期望的治疗效果。例如，在一些实施方案中，功能性变体有效地用于基因疗法以治疗病症或病状，例如GLA基因产物缺乏或GAL相关病症，例如溶酶体贮积症，例如法布里病。除非另有说明，否则如本文所述的GAL蛋白的变体(例如，在本公开的构建体、载体、基因组、方法、试剂盒、组合物等的上下文中)是功能性变体。在一些实施方案中，GAL蛋白包含野生型GAL蛋白(例如，GAL蛋白NP_000160.1)的氨基酸1至429。在一些实施方案中，GAL蛋白包含野生型GAL蛋白的氨基酸32至429。在一些实施方案中，编码的GAL蛋白可以衍生自任何物种，诸如但不限于人、非人灵长类动物或啮齿动物。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码人(智人)GAL蛋白或其变体的有效载荷区(或转基因)。
表1.示例性GAL序列
SEQ ID NO: 类型 物种 描述
29 蛋白质 智人 GAL蛋白NP_000160.1
30 DNA 智人 GLA mRNA转录物变体1NM_000169.3
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码与表1中提供的人GAL蛋白序列或其片段具有至少85％、例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，GAL蛋白衍生自非人灵长类动物诸如食蟹猴(Macacafascicularis)的GAL蛋白编码序列。某些实施方案提供了作为食蟹猴序列的人源化形式的GAL蛋白。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码食蟹猴或食蟹(长尾)猕猴(Macacafascicularis)GAL蛋白或其变体的有效载荷区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码恒河猴(Macaca mulatta)GAL蛋白或其变体的有效载荷区。
在一些实施方案中，由转基因编码的GAL蛋白可以包含与上述和表1中提供的那些中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，GAL蛋白可以由与上述和表1中提供的那些中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
如本文所述的GAL蛋白有效载荷可以编码任何GAL蛋白，或GAL蛋白的任何部分或衍生物，并且不限于表1中提供的GAL蛋白或蛋白编码序列。
在一些实施方案中，GAL蛋白或其功能性变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸。
在一些实施方案中，编码GAL的转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与SEQID NO:2基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，还可以使用编码相同或基本上相同的GAL蛋白氨基酸序列(例如，具有至少约90％氨基酸序列同一性的那些氨基酸序列)的密码子优化的变体和其它变体。
在一些实施方案中，对编码GAL蛋白的转基因进行密码子优化以在包括人细胞的哺乳动物细胞中表达，诸如SEQ ID NO:3-5中列出的序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核苷酸序列。
有效载荷构建体可以包含编码和非编码核酸序列的组合。
病毒基因组和其中的有效载荷区的任何区段、片段或整体可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，病毒基因组编码一个或多个有效载荷。作为非限制性示例，编码一个或多个有效载荷的病毒基因组可被复制并包装到病毒颗粒中。用包含一个或多个有效载荷的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达有效载荷中的每一者。
在一些实施方案中，病毒基因组可以编码编码或非编码RNA。在某些实施方案中，腺相关病毒载体颗粒还包含至少一个选自由Kozak序列、主链序列和内含子序列组成的组的顺式元件。
在一些实施方案中，有效载荷是多肽，该多肽可以是肽或蛋白质。由有效载荷构建体编码的蛋白质可以包含分泌蛋白、胞内蛋白、胞外蛋白和/或膜蛋白。编码的蛋白质可以是结构性的或功能性的。由病毒基因组编码的蛋白质包括但不限于哺乳动物蛋白质。在某些实施方案中，AAV颗粒含有编码GAL蛋白或其片段或变体的病毒基因组。本文所述的AAV颗粒可用于人类疾病、兽用应用以及多种体内和体外环境的领域。
在一些实施方案中，有效载荷可以包含用作评估细胞转化和表达的标志物蛋白的多肽、融合蛋白、具有期望的生物活性的多肽、可补充遗传缺陷的基因产物、RNA分子、转录因子以及在调节和/或表达中感兴趣的其它基因产物。在一些实施方案中，有效载荷可以包含提供期望效果或调控功能的核苷酸序列(例如，转座子、转录因子)。
编码的有效载荷可以包括基因治疗产品。基因治疗产品可以包括但不限于多肽、RNA分子或当在靶细胞中表达时提供期望的治疗效果的其他基因产物。在一些实施方案中，基因治疗产品可以包含非功能性基因的替代物或者缺失、表达量不足或突变的基因。在一些实施方案中，基因治疗产品可以包含非功能性蛋白质或多肽的替代物，或者缺失、表达量不足、错折叠、降解过快或突变的蛋白质或多肽。例如，基因治疗产品可以包含GAL蛋白或编码GAL蛋白的多核苷酸以治疗GAL缺乏或GAL相关病症。
在一些实施方案中，有效载荷编码信使RNA(mRNA)。如本文所用，术语“信使RNA”(mRNA)是指编码感兴趣的多肽并且能够被翻译以体外、体内、原位或离体产生编码的感兴趣的多肽的任何多核苷酸。某些实施方案提供了作为编码GAL或其变体的mRNA。
mRNA的组分包括但不限于编码区、5'-UTR(非翻译区)、3'-UTR、5'-帽和poly-A尾。在一些实施方案中，编码的mRNA或AAV基因组的任何部分可以是密码子优化的。
在一些实施方案中，由编码GAL或其变体的有效载荷构建体编码的蛋白质或多肽长度为约50与约4500个之间的氨基酸残基(以下在本上下文中，“X个氨基酸长度”是指X个氨基酸残基)。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至2000个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至1000个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至1500个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至1000个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至800个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至600个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至400个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至200个之间的氨基酸。在一些实施方案中，所编码的蛋白质或多肽长度为50至100个之间的氨基酸。
编码有效载荷的有效载荷构建体可以包括或编码选择性标志物。选择性标志物可以包含基因序列或由在宿主细胞中表达的基因序列编码的蛋白质或多肽，该基因序列允许从可能表达或可能不表达选择性标志物的细胞群体中鉴定、选择和/或纯化宿主细胞。在一些实施方案中，选择性标志物提供抗性以在以其他方式杀死宿主细胞的选择过程(诸如用抗生素处理)中存活。在一些实施方案中，抗生素选择性标志物可以包含一种或多种抗生素抗性因子，包括但不限于新霉素抗性(例如，neo)、潮霉素抗性、卡那霉素抗性和/或嘌呤霉素抗性。
在一些实施方案中，编码有效载荷的有效载荷构建体可以包含选择性标志物，该选择性标志物包括但不限于β-内酰胺酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶或本领域所理解的任何其它报道基因，该报道基因包括细胞表面标志物，诸如CD4或截短的神经生长因子(NGFR)(对于GFP，参见WO 96/23810；Heim等人，Current Biology 2:178-182(1996)；Heim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等人，Science 373:663-664(1995)；对于β-内酰胺酶，参见WO 96/30540)；该文献中的每一者的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，编码选择性标志物的有效载荷构建体可以包含荧光蛋白。如本文所述的荧光蛋白可以包含任何荧光标志物，包括但不限于绿色、黄色和/或红色荧光蛋白(GFP、YFP和/或RFP)。在一些实施方案中，编码选择性标志物的有效载荷构建体可以包含人流感血凝素(HA)标签。
在某些实施方案中，用于在靶细胞中表达有效载荷的核酸将被掺入到病毒基因组中并位于两个ITR序列之间。
有效载荷组分：信号序列
在一些实施方案中，包含编码有效载荷(例如GAL蛋白)的转基因的核酸序列包含编码信号序列(例如，本文的信号序列区)的核酸序列。在一些实施方案中，包含编码有效载荷的转基因的核酸序列包含两个信号序列区。在一些实施方案中，包含编码有效载荷的转基因的核酸序列包含三个或更多个信号序列区。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列相对于编码GAL蛋白的核苷酸序列位于5'。在一些实施方案中，编码的GAL蛋白在N末端包含信号序列，其中该信号序列任选地在GAL蛋白的细胞加工和/或定位期间被切割。
在一些实施方案中，信号序列是GAL蛋白(例如，人GAL蛋白)的天然信号序列。
在一些实施方案中，人GAL信号序列可以包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQID NO:6基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号序列可以包含相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人GAL信号序列可以由SEQ ID NO:7的核酸序列，或与SEQ IDNO:7基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，编码人GAL信号序列的核酸是密码子优化的。在一些实施方案中，信号序列可以由SEQ ID NO:8-10中任一者的核酸序列，或与SEQ ID NO:8-10中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，信号序列是异源信号序列。
在一些实施方案中，异源信号序列是人或小鼠IgG1信号序列。
在一些实施方案中，小鼠和人IgG1信号序列可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号序列可以包含相对于SEQ ID NO:11具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人IgG1信号序列可以由SEQ ID NO:12的核酸序列，或与SEQID NO:12基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，小鼠IgG1信号序列可以由SEQ ID NO:12的核酸序列，或与SEQID NO:12基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，编码IgG1信号序列(例如，小鼠和/或人序列)的核酸是密码子优化的。在一些实施方案中，信号序列可以由SEQ ID NO:13或14的核酸序列，或与SEQ IDNO:13或14基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，异源信号序列是合成的IgG1信号序列。
在一些实施方案中，合成的IgG1信号序列可以包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号序列可以包含相对于SEQ ID NO:15具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，合成的IgG1信号序列可以由SEQ ID NO:16的核酸序列，或与SEQ ID NO:16基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列(例如，人GAL信号肽)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列；并且编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列相对于编码的GAL蛋白位于N末端。在一些实施方案中，编码的具有人GAL信号肽序列的GAL蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码人GAL信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7-10中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2-5中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与SEQID NO:2基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQID NO:3基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQID NO:4基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与SEQ ID NO:10基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQID NO:5基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码的信号序列(例如，人或小鼠IgG1信号肽)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列；并且编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列相对于编码的GAL蛋白位于N末端。在一些实施方案中，编码的具有人或小鼠IgG1信号肽序列的GAL蛋白包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:28基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码人或小鼠IgG1信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:12-14中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2-5中任一者基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与SEQ ID NO:12基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与SEQID NO:2基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与SEQ ID NO:13基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQID NO:3基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与SEQ ID NO:13基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQID NO:4基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与SEQ ID NO:14基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列，并且编码GAL蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQID NO:5基本上相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同)的核酸序列。
示例性有效载荷：GAL
在一些实施方案中，本公开的分离的重组AAV颗粒包含嗜肝衣壳蛋白(例如，sL65衣壳蛋白)和核酸，该核酸包含编码GAL蛋白的转基因。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如，取代)；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:11具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如，取代)；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
示例性AAV病毒基因组和颗粒
如本文所述，本公开的AAV颗粒包含衣壳蛋白(例如嗜肝衣壳蛋白，例如sL65衣壳蛋白)和AAV病毒基因组或载体。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由SEQ ID NO:46的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的核苷酸序列编码的。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含与编码GAL蛋白的转基因可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，病毒基因组还包含反向末端重复区、增强子、启动子、内含子、Kozak序列、WPRE序列、polyA区或其组合。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含SEQ IDNo:31-41和51-61中任一者的核苷酸序列的核苷酸序列，例如从5'ITR至3'ITR的核苷酸序列，例如如表2中所述，或与前述序列中任一者基本上相同(例如，具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
表2.示例性病毒基因组(ITR至ITR)序列
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:31或51的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:31或51的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:31或51的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:32或52的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:32或52的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:32或52的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:33或53的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:33或53的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:33或53的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:34或54的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:34或54的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:34或54的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:35或55的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:35或55的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:35或55的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:36或56的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:36或56的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:36或56的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:37或57的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:37或57的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:37或57的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:38或58的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:38或58的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:38或58的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:39或59的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:39或59的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；WPRE序列，其包含SEQ IDNO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ IDNO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:39或59的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:40或60的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:40或60的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；WPRE序列，其包含SEQ IDNO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ IDNO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:40或60的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含SEQ ID NO:41或61的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:41或61的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列的病毒基因组以5'至3'顺序包含：5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；内含子，其包含SEQ IDNO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列至少85％(例如，至少85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核苷酸序列；WPRE截短的序列(W3SL)，其包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:41或61的核苷酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的核苷酸序列的病毒基因组，编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸序列的GAL蛋白。
在实施方案中，AAV颗粒包含AAV病毒基因组，该AAV病毒基因组包含本文所述的任何病毒基因组的核苷酸序列，例如如表2中所述，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如，具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，AAV颗粒还包含衣壳蛋白，例如结构蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含VP1多肽、VP2多肽和/或VP3多肽。在一些实施方案中，VP1多肽、VP2多肽和/或VP3多肽由至少一个Cap基因编码。在一些实施方案中，衣壳蛋白是sL65衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒还包含Rep蛋白，例如非结构蛋白。在一些实施方案中，Rep蛋白包括Rep78蛋白、Rep68、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白。在一些实施方案中，Rep78蛋白、Rep68蛋白、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白由至少一个Rep基因编码。
在一些实施方案中，本公开提供了包含上述鉴定的病毒基因组中的任一者的载体、细胞和/或AAV颗粒。
在一些实施方案中，AAV载体是单链载体(ssAAV)。
在一些实施方案中，AAV载体是自互补AAV载体(scAAV)。参见例如，美国专利号7,465,583。scAAV载体含有一起退火以形成双链DNA的两条DNA链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。
用于生产和/或修饰AAV载体的方法在本领域中公开，诸如假型AAV载体(国际专利公开号WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO 2005005610和WO 2005072364，这些文献中的每一篇的内容全文以引用方式并入本文)。
编码病毒衣壳的核酸和病毒基因组
本公开还提供了组合物，该组合物包含编码AAV衣壳蛋白的核酸和包含编码GAL蛋白的转基因的核酸，例如，其中两种核酸可位于不同载体上。在一些实施方案中，组合物包含第一核酸和第二核酸，该第一核酸编码AAV衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)，该第二核酸包含编码GAL蛋白的转基因，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码衣壳蛋白的第一核酸包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，或与其至少85％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因是密码子优化的。在一些实施方案中，包含编码GAL蛋白的转基因的第二核酸包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因进一步编码信号序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含人GAL信号肽。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含IgG1信号肽(例如，小鼠和/或人肽)。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:11具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如，取代)；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序编码：信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:11具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如，取代)；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码GAL蛋白的转基因以5'至3'顺序包含：编码信号序列的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸和/或第二核酸可以还包含以下中的一者或多者：反向末端重复(ITR)区、启动子、增强子、内含子区、Kozak序列、WPRE序列、polyA信号区或其组合。
在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸还包含至少一个ITR序列。ITR序列相对于转基因位于5'或3'位置。在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸包含两个ITR。这两个ITR在5'和3'端侧接转基因。
在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸还包含启动子序列和/或增强子。在一些实施方案中，启动子是导致在一个或多个(例如，多个)细胞和/或组织中表达的泛素启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子，例如限制对某些细胞类型的表达的启动子，例如肝脏特异性启动子。在一些实施方案中，启动子和/或增强子位于转基因的5'位置，如本文所述。在一些实施方案中，启动子和/或增强子位于转基因的5'位置，如本文所述，并且至少一个ITR序列位于启动子和/或增强子的5'。
在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸还包含至少一个内含子或其片段或衍生物。在一些实施方案中，该至少一个内含子可以增强转基因的表达。在一些实施方案中，内含子包含β-球蛋白内含子或其片段或变体。
在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸还包含Kozak序列和/或WPRE序列。在一些实施方案中，Kozak序列相对于转基因位于5'位置，如本文所述。在一些实施方案中，WPRE序列相对于转基因位于3'位置，如本文所述。
在一些实施方案中，包含转基因的第二核酸还包含至少一个多腺苷酸化(polyA)序列。在一些实施方案中，polyA序列相对于转基因位于3'位置，如本文所述。在一些实施方案中，polyA序列位于转基因的3'位置，如本文所述，并且至少一个ITR序列位于polyA序列的3'。
在一些实施方案中，第二核酸从5'至3'包含：ITR序列、增强子、启动子序列、内含子、Kozak序列、如本文所述的任何转基因、polyA序列和第二ITR序列。
在一些实施方案中，第二核酸从5'至3'包含：ITR序列、增强子、启动子序列、内含子、Kozak序列、如本文所述的任何转基因、WPRE序列、polyA序列和第二ITR序列。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸一起包含在单个载体中，该载体包含在组合物中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸包含在不同载体中，其中两种载体都包含在组合物中。
在一些实施方案中，本公开提供包含如本文所述的分离的rAAV颗粒的一个或多个细胞(例如，多个细胞)。在一些实施方案中，本公开提供包含如本文所述的核酸组合物的一个或多个细胞(例如，多个细胞)。
本公开进一步提供核酸，例如分离的核酸，该核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因，其中编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列。本公开还提供包含核酸(例如，分离的核酸)的组合物，该核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因，其中编码GAL蛋白的转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码GAL蛋白的转基因进一步编码信号序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含人GAL信号肽。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，编码的信号序列包含人IgG1信号肽。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含相对于SEQ IDNO:11具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
本公开还提供了包含核酸的组合物，该核酸包含编码信号序列的转基因。在一些实施方案中，编码的信号序列包含人GAL信号肽。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:6具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:8-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
本公开还提供了包含核酸的组合物，该核酸包含编码信号序列的转基因。在一些实施方案中，编码的信号序列包含人IgG1信号肽。在一些实施方案中，编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列包含相对于SEQ ID NO:11具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列的核酸编码。
在一些实施方案中，本公开进一步提供分离的，例如重组的病毒基因组(例如AAV病毒基因组)，该基因组包含SEQ ID NO:31-41和51-61中任一者的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:31的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:32的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:33的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQID NO:34的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:35的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:36的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:37的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:38的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:39的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:40的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:41的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:51的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:52的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQID NO:53的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:54的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:55的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:56的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:57的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:58的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:59的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:60的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，病毒基因组(例如，AAV病毒基因组)包含SEQ ID NO:61的核酸序列或由其组成。本公开进一步提供了包含任何前述病毒基因组的组合物。本公开进一步提供包含任何前述病毒基因组的细胞，例如细菌、哺乳动物或昆虫细胞。
III.病毒生产
一般病毒生产过程
在一些实施方案中，用于生产AAV(例如rAAV)颗粒的细胞可以包括哺乳动物细胞(诸如HEK293细胞)和/或昆虫细胞(诸如Sf9细胞)。
在各种实施方案中，AAV生产包括用于生产AAV颗粒和载体的过程和方法，该颗粒和载体可接触靶细胞以递送有效载荷(例如重组病毒构建体)，该有效载荷包括编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如重组腺相关病毒(rAAV)载体。在某些实施方案中，AAV颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒，诸如重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
在一些实施方案中，本文公开了包含本公开的病毒基因组的载体。在一些实施方案中，本文公开了包含本公开的病毒基因组的细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞)或昆虫细胞(例如，Sf9细胞)。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备本公开的重组AAV颗粒的方法，该方法包括：(i)提供包含本文所述的病毒基因组(例如，包含编码GAL蛋白的转基因的核酸)的宿主细胞，并在适于将病毒基因组包封在衣壳蛋白，例如本文所述的衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白或其功能性变体)中的条件下温育宿主细胞，从而制备重组AAV颗粒。在一些实施方案中，该方法包括在步骤(i)之前，将包含病毒基因组的第一核酸引入细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码衣壳蛋白的第二核酸。在一些实施方案中，在第一核酸分子之前、同时或之后将第二核酸引入宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞)或昆虫细胞(例如，Sf9细胞)。
在各种实施方案中，本文提供了生产AAV颗粒或载体的方法，该方法通过(a)使病毒生产细胞与一个或多个编码至少一种AAV衣壳蛋白的病毒表达构建体以及一个或多个编码有效载荷分子的有效载荷构建体接触，该有效载荷构建体可选自：转基因、编码蛋白质的多核苷酸和调节核酸；(b)在使得至少一种AAV颗粒或载体被生产的条件下培养病毒生产细胞，以及(c)从生产流中分离AAV颗粒或载体。
在这些方法中，病毒表达构建体可以编码至少一种结构蛋白和/或至少一种非结构蛋白。结构蛋白可以包括任何天然或野生型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或其嵌合蛋白。在一些实施方案中，VP1衣壳蛋白可以是sL65VP1衣壳蛋白。非结构蛋白可以包括任何天然或野生型Rep78、Rep68、Rep52和/或Rep40蛋白或其嵌合蛋白。
在某些实施方案中，接触经由瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔发生。
在某些实施方案中，病毒生产细胞选自哺乳动物细胞和昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括Sf9昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括Sf21昆虫细胞。
在各种实施方案中，本公开的有效载荷构建体载体可以包括至少一个反向末端重复序列(ITR)并且可以包括哺乳动物DNA。
还提供了根据本文所述的方法产生的AAV颗粒和病毒载体。
在各种实施方案中，本公开的AAV颗粒可以与一种或多种可接受的赋形剂配制为药物组合物。
在某些实施方案中，AAV颗粒或病毒载体可通过本文所述的方法产生。
在某些实施方案中，AAV颗粒可通过使病毒生产细胞(例如，昆虫细胞或哺乳动物细胞)与编码至少一种衣壳蛋白的至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体载体接触来产生。可通过瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔来接触病毒生产细胞。有效载荷构建体载体可以包括编码有效载荷分子的有效载荷构建体，该有效载荷构建体诸如但不限于转基因、编码蛋白质的多核苷酸和调节核酸。病毒生产细胞可以在使得至少一种AAV颗粒或载体被生产、分离(例如，使用温度诱导的裂解、机械裂解和/或化学裂解)和/或纯化(例如，使用过滤、层析和/或免疫亲和纯化)的条件下培养。作为非限制性示例，有效载荷构建体载体可以包括哺乳动物DNA。
在某些实施方案中，使用本文所述的方法在昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Sf9)细胞)中产生AAV颗粒。作为非限制性示例，使用病毒转导接触昆虫细胞，该病毒转导可以包括杆状病毒转导。
在某些实施方案中，使用本文所述的方法在哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞)中产生AAV颗粒。作为非限制性示例，使用病毒转导接触哺乳动物细胞，该病毒转导可以包括多质粒瞬时转染(诸如三重质粒瞬时转染)。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒生产方法在病毒生产细胞中产生大于101、大于102、大于103、大于104或大于105个AAV颗粒。
在某些实施方案中，本公开的过程包括使用病毒生产系统在病毒生产细胞中生产病毒颗粒，该病毒生产系统包括至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体。可以将至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体共转染(例如双重转染、三重转染)到病毒生产细胞中。使用本领域技术人员已知和常规进行的标准分子生物学技术完成转染。病毒生产细胞提供表达蛋白质所必需的细胞机器和生产AAV颗粒所必需的其它生物材料，包括复制有效载荷构建体的Rep蛋白和装配形成包封复制的有效载荷构建体的衣壳的Cap蛋白。从病毒生产细胞中提取所得的AAV颗粒并加工成用于施用的药物制剂。
在各种实施方案中，一旦施用，本文公开的AAV颗粒可在不受理论束缚的情况下接触靶细胞并进入细胞，例如，在核内体中。AAV颗粒，例如从核内体释放的AAV颗粒，可随后接触靶细胞的细胞核以递送有效载荷构建体。可将有效载荷构建体，例如重组病毒构建体，递送至靶细胞的细胞核，其中可表达由有效载荷构建体编码的有效载荷分子。
在某些实施方案中，用于生产病毒颗粒的过程利用病毒生产细胞的种子培养物，该病毒生产细胞包括一种或多种杆状病毒(例如，已经用病毒表达构建体和有效载荷构建体载体转染的杆状病毒表达载体(BEV)或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC))。在某些实施方案中，收获种子培养物，分成等份并冷冻，并且可以在稍后的时间点用于起始生产细胞的原初群体的感染。
在一些实施方案中，AAV颗粒的大规模生产利用生物反应器。不受理论束缚，生物反应器的使用可允许精确测量和/或控制支持病毒生产细胞的生长和活性的变量，诸如质量、温度、混合条件(叶轮RPM或波振荡)、CO2浓度、O2浓度、气体喷射速率和体积、气体覆盖速率和体积、pH、活细胞密度(VCD)、细胞活力、细胞直径和/或光密度(OD)。在某些实施方案中，生物反应器用于分批生产，在生物反应器中在实验确定的时间点收获整个培养物并纯化AAV颗粒。在一些实施方案中，生物反应器用于连续生产，在生物反应器中在实验确定的时间点收获培养物的一部分用于纯化AAV颗粒，并且在生物反应器中剩余的培养物用另外的生长培养基组分更新。
在各种实施方案中，可以在包括细胞裂解、澄清、灭菌和纯化的过程中从病毒生产细胞中提取AAV病毒颗粒。细胞裂解包括破坏病毒生产细胞的结构、从而释放AAV颗粒的任何过程。在某些实施方案中，细胞裂解可以包括热冲击、化学或机械裂解方法。澄清可包括裂解的细胞、培养基组分和AAV颗粒的混合物的总纯化。在某些实施方案中，澄清包括离心和/或过滤，包括但不限于深度端、切向流和/或中空纤维过滤。
在各种实施方案中，病毒生产的最终结果是AAV颗粒的纯化集合，该纯化集合包括两种组分：(1)有效载荷构建体(例如重组AAV载体基因组构建体)和(2)病毒衣壳。
在某些实施方案中，本公开的病毒生产系统或过程包括用于使用病毒生产细胞(VPC)和质粒构建体生产杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的步骤。将来自细胞库(CB)的病毒生产细胞(VPC)解冻并扩增以提供目标工作体积和VPC浓度。所得的VPC库被分成Rep/CapVPC库和有效载荷VPC库。将一种或多种Rep/Cap质粒构建体(病毒表达构建体)加工成Rep/Cap杆粒多核苷酸并转染到Rep/Cap VPC库中。将一种或多种有效载荷质粒构建体(有效载荷构建体)加工成有效载荷杆粒多核苷酸并转染到有效载荷VPC库中。温育两个VPC库以产生P1 Rep/Cap杆状病毒表达载体(BEV)和P1有效载荷BEV。将两个BEV库扩增成噬斑集合，选择单个噬斑用于克隆噬斑(CP)纯化(也称为单噬斑扩增)。该过程可包括单个CP纯化步骤或可包括串联或由其它处理步骤分开的多个CP纯化步骤。一个或多个CP纯化步骤提供CPRep/Cap BEV库和CP有效载荷BEV库。然后可以储存这两个BEV库并用于将来的生产步骤，或者然后可以将它们转染到VPC中以产生Rep/Cap BIIC库和有效载荷BIIC库。
在某些实施方案中，本公开的病毒生产系统或过程包括用于使用病毒生产细胞(VPC)和杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)生产AAV颗粒的步骤。将来自细胞库(CB)的病毒生产细胞(VPC)解冻并扩增以提供目标工作体积和VPC浓度。将工作体积的病毒生产细胞接种到生产生物反应器中，并可进一步扩增到具有用于BIIC感染的目标VPC浓度的200-2000L的工作体积。然后用Rep/Cap BIIC和有效载荷BIIC以目标VPC:BIIC比率和目标BIIC:BIIC比率共感染生产生物反应器中的工作体积的VPC。VCD感染也可利用BEV。共感染的VPC在生产生物反应器中温育和扩增以产生批量收获的AAV颗粒和VPC。
病毒表达构建体
在各种实施方案中，本公开的病毒生产系统包括一种或多种可转染/转导到病毒生产细胞中的病毒表达构建体。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是杆粒，也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，病毒表达包括蛋白质编码核苷酸序列和至少一个用于在病毒生产细胞中表达的表达控制序列。在某些实施方案中，病毒表达包括与用于在病毒生产细胞中表达的至少一个表达控制序列可操作地连接的蛋白质编码核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体含有在一个或多个启动子控制下的细小病毒基因。细小病毒基因可包括编码非结构AAV复制蛋白的核苷酸序列，诸如编码Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白的Rep基因。细小病毒基因可包括编码结构AAV蛋白的核苷酸序列，诸如编码VP1、VP2和VP3蛋白的Cap基因。在一些实施方案中，VP1蛋白是sL65 VP1蛋白。
本公开的病毒表达构建体可以包括生物的或化学的任何化合物或制剂，该化合物或制剂促进用核酸转化、转染或转导细胞。示例性生物病毒表达构建体包括质粒、线性核酸分子和包括杆状病毒的重组病毒。示例性化学载体包括脂质复合物。根据本公开，病毒表达构建体用于将核酸序列掺入到病毒复制细胞中。(O'Reilly,David R.,Lois K.Miller和Verne A.Luckow.Baculovirus expression vectors:a laboratory manual.OxfordUniversity Press,1994.)；Maniatis等人编辑Molecular Cloning.CSH Laboratory,NY,N.Y.(1982)；以及Philiport和Scluber编辑Liposomes as tools in Basic Research andIndustry.CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)，该文献中的每一者与病毒表达构建体及其用途相关的内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体是AAV表达构建体，该AAV表达构建体包括编码非结构AAV复制蛋白、结构AAV衣壳蛋白或其组合的一个或多个核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是质粒载体。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是杆状病毒构建体。
本公开不受用于产生AAV颗粒或病毒载体的病毒表达构建体的数目限制。在某些实施方案中，根据本公开，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个病毒表达构建体可用于在病毒生产细胞中产生AAV颗粒。在本公开的某些实施方案中，病毒表达构建体可用于在昆虫细胞中产生AAV颗粒。在某些实施方案中，可对衣壳和/或rep基因的野生型AAV序列进行修饰，例如以改善病毒颗粒的属性(诸如增加的感染性或特异性)或以提高生产产量。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以含有包括起始密码子区的核苷酸序列，诸如包括一个或多个起始密码子区的编码AAV衣壳蛋白的序列。在某些实施方案中，起始密码子区可以在表达控制序列内。起始密码子可以是ATG或非ATG密码子(即，次优起始密码子，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG)。
在某些实施方案中，用于AAV生产的病毒表达构建体可以含有编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG(即，次优起始密码子)，允许在生产系统中表达改变比率的病毒衣壳蛋白，以提供宿主细胞的改善的感染性。在非限制性示例中，病毒构建体载体可含有核酸构建体，该核酸构建体包含编码AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US 8,163,543中所述，该文献与AAV衣壳蛋白及其生产相关的内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是编码用于在昆虫细胞中表达的细小病毒rep蛋白的质粒载体或杆状病毒构建体。在某些实施方案中，单个编码序列用于Rep78和Rep52蛋白，其中用于翻译Rep78蛋白的起始密码子是次优起始密码子，选自由ACG、TTG、CTG和GTG组成的组，其在昆虫细胞中表达时实现部分外显子跳跃，如美国专利号8,512,981中所述，该文献的内容全文以引用方式并入本文，例如以促进与Rep52相比的Rep78的不丰富表达，这可以促进高载体产量。
在某些实施方案中，VP编码区编码特定AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白。VP编码区的AAV血清型可以相同或不同。在某些实施方案中，可以对VP编码区进行密码子优化。在某些实施方案中，VP编码区或核苷酸序列可针对哺乳动物细胞进行密码子优化。在某些实施方案中，VP编码区或核苷酸序列可针对昆虫细胞进行密码子优化。在某些实施方案中，VP编码区或核苷酸序列可针对草地贪夜蛾细胞进行密码子优化。在某些实施方案中，VP编码区或核苷酸序列可针对Sf9或Sf21细胞系进行密码子优化。
在某些实施方案中，编码一种或多种VP衣壳蛋白的核苷酸序列可经密码子优化以具有与参考核苷酸序列小于100％的核苷酸同源性。在某些实施方案中，密码子优化的VP核苷酸序列与参考VP核苷酸序列之间的核苷酸同源性小于100％、小于99％、小于98％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％、小于93％、小于92％、小于91％、小于90％、小于89％、小于88％、小于87％、小于86％、小于85％、小于84％、小于83％、小于82％、小于81％、小于80％、小于78％、小于76％、小于74％、小于72％、小于70％、小于68％、小于66％、小于64％、小于62％、小于60％、小于55％、小于50％和小于40％。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是杆粒，也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体(例如杆粒)可以包括通过同源重组(转座子供体/受体系统)掺入到该杆粒中的多核苷酸，该同源重组通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术进行。
在某些实施方案中，掺入到杆粒中的多核苷酸(即多核苷酸插入物)可包括与蛋白质编码核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。在某些实施方案中，掺入到杆粒中的多核苷酸可以包括表达控制序列，该表达控制序列包括启动子，诸如p10或polh，并且该表达控制序列与编码结构AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其组合)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，VP1蛋白是sL65 VP1衣壳蛋白。在某些实施方案中，掺入到杆粒中的多核苷酸可以包括表达控制序列，该表达控制序列包括启动子，诸如p10或polh，并且该表达控制序列与编码非结构AAV衣壳蛋白(例如Rep78、Rep52或其组合)的核苷酸序列可操作地连接。
本公开的方法不受使用特定表达控制序列的限制。然而，当达到一定化学计量的VP产物(对于VP1、VP2和VP3，分别接近1:1:10)时，以及当Rep52或Rep40(也称为p19 Rep)的水平显著高于Rep78或Rep68(也称为p5 Rep)时，可获得生产细胞(诸如昆虫细胞)中AAV产率的提高。在某些实施方案中，p5/p19比率低于0.6多、低于0.4或低于0.3，但总是至少0.03。这些比率可以在蛋白质的水平上测量，或者可以与特定mRNA的相对水平有关。
在某些实施方案中，在病毒生产细胞(诸如哺乳动物或昆虫细胞)中生产AAV颗粒，其中所有三种VP蛋白以接近、约或为以下的化学计量表达：1:1:10(VP1:VP2:VP3)；2:2:10(VP1:VP2:VP3)；2:0:10(VP1:VP2:VP3)；1-2:0-2:10(VP1:VP2:VP3)；1-2:1-2:10(VP1:VP2:VP3)；2-3:0-3:10(VP1:VP2:VP3)；2-3:2-3:10(VP1:VP2:VP3)；3:3:10(VP1:VP2:VP3)；3-5:0-5:10(VP1:VP2:VP3)；或3-5:3-5:10(VP1:VP2:VP3)。
在某些实施方案中，表达控制区被工程化以产生选自由以下项组成的组的VP1:VP2:VP3比率：约或精确地1:0:10；约或精确地1:1:10；约或精确地2:1:10；约或精确地2:1:10；约或精确地2:2:10；约或精确地3:0:10；约或精确地3:1:10；约或精确地3:2:10；约或精确地3:3:10；约或精确地4:0:10；约或精确地4:1:10；约或精确地4:2:10；约或精确地4:3:10；约或精确地4:4:10；约或精确地5:5:10；约或精确地1-2:0-2:10；约或精确地1-2:1-2:10；约或精确地1-3:0-3:10；约或精确地1-3:1-3:10；约或精确地1-4:0-4:10；约或精确地1-4:1-4:10；约或精确地1-5:1-5:10；约或精确地2-3:0-3:10；约或精确地2-3:2-3:10；约或精确地2-4:2-4:10；约或精确地2-5:2-5:10；约或精确地3-4:3-4:10；约或精确地3-5:3-5:10；以及约或精确地4-5:4-5:10。
在本公开的某些实施方案中，Rep52或Rep78从杆状病毒衍生的多面体启动子(polh)转录。Rep52或Rep78也可以从较弱的启动子转录，例如ie-1启动子的缺失突变体，Δie-1启动子具有该ie-1启动子的约20％的转录活性。可以使用与Δie-1启动子基本上同源的启动子。关于启动子，至少50％、60％、70％、80％、90％或更高的同源性被认为是基本上同源的启动子。
哺乳动物细胞
本文公开的本公开的病毒生产描述了用于生产AAV颗粒或病毒载体的过程和方法，该AAV颗粒或病毒载体接触靶细胞以递送有效载荷构建体(例如，重组AAV颗粒或病毒构建体)，该有效载荷构建体包含编码有效载荷分子的核苷酸。病毒生产细胞可以选自任何生物有机体，包括原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，该真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包括哺乳动物细胞的病毒生产细胞中产生。病毒生产细胞可以包括哺乳动物细胞，诸如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T(293T)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、Huh7、HepG2、C127、3T3、CHO、HeLa细胞、KB细胞、BHK和原代成纤维细胞、肝细胞和衍生自哺乳动物的成肌细胞。病毒生产细胞可以包括衍生自任何哺乳动物物种(包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)或细胞类型(包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化的细胞等)的细胞。
通常用于生产重组AAV颗粒的AAV病毒生产细胞包括但不限于如以下文献中所述的其它哺乳动物细胞系：美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、6,428,988和5,688,676；美国专利申请2002/0081721和国际专利公开号WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947，该文献中的每一者的内容全文以引用方式并入本文，只要它们不与本公开冲突。在某些实施方案中，AAV病毒生产细胞是反式互补包装细胞系，该反式互补包装细胞系提供从复制缺陷型辅助病毒(例如，HEK293细胞或其它Ea反式互补细胞)中缺失的功能。
在某些实施方案中，包装细胞系293-10-3(ATCC登录号PTA-2361)可用于产生AAV颗粒，如美国专利号US 6,281,010中所述，该文献与293-10-3包装细胞系及其用途相关的内容全文以引用方式并入本文。
在本公开的某些实施方案中，用于反式互补E1缺失的腺病毒载体的细胞系，诸如HeLa细胞系，在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下编码腺病毒E1a和腺病毒E1b，可用于AAV颗粒生产，如美国专利号6365394中所述，该文献与HeLa细胞系及其用途相关的内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，使用多质粒瞬时转染方法(诸如三重质粒瞬时转染)在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒。在某些实施方案中，多质粒瞬时转染方法包括以下三种不同构建体的转染：(i)有效载荷构建体，(ii)Rep/Cap构建体(细小病毒Rep和细小病毒Cap)，和(iii)辅助构建体。在某些实施方案中，AAV颗粒产生的三种组分的三重转染方法可用于产生用于包括转导效率、靶组织(趋向性)评价和稳定性的测定的小批量病毒。在某些实施方案中，AAV颗粒生产的三种组分的三重转染方法可用于生产大量用于临床或商业应用的材料。
待配制的AAV颗粒可通过三重转染或杆状病毒介导的病毒生产或本领域已知的任何其它方法来生产。可以使用本领域已知的任何合适的允许或包装细胞来生产载体。在某些实施方案中，使用反式互补包装细胞系，该反式互补包装细胞系提供从复制缺陷型辅助病毒(例如，293细胞或其它E1a反式互补细胞)中缺失的功能。
基因盒可以含有一些或全部的细小病毒(例如，AAV)cap和rep基因。在某些实施方案中，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的包装载体引入细胞中来反式提供一些或全部的cap和rep功能。在某些实施方案中，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。另选地，使用稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系。
在某些实施方案中，重组AAV病毒颗粒是根据如US2016/0032254中所述的程序从培养物上清液生产和纯化的，该文献与重组AAV病毒颗粒的生产和加工相关的内容全文以引用方式并入。生产还可涉及本领域已知的方法，包括使用293T细胞的那些方法、三重转染或任何合适的生产方法。
在某些实施方案中，哺乳动物病毒生产细胞(例如，293T细胞)可以处于粘附/粘着状态(例如，与磷酸钙)或悬浮状态(例如，与聚乙烯亚胺(PEI))。用生产AAV所需的质粒转染哺乳动物病毒生产细胞(即，AAV rep/cap构建体、腺病毒辅助构建体和/或ITR侧接的有效载荷构建体)。在某些实施方案中，转染过程可以包括任选的介质改变(例如，用于粘附形式的细胞的介质改变、用于悬浮形式的细胞的无介质改变、如果需要用于悬浮形式的细胞的介质改变)。在某些实施方案中，转染过程可以包括转染介质，诸如DMEM或F17。在某些实施方案中，转染介质可以包括血清或可以是无血清的(例如，与磷酸钙和与血清处于粘附状态的细胞，与PEI和没有血清处于悬浮状态的细胞)。
随后可通过刮擦(粘附形式)和/或粒化(悬浮形式和刮擦的粘附形式)收集细胞并转移到容器中。必要时可重复收集步骤以完全收集产生的细胞。接下来，可通过连续冻融循环(-80C至37C)、化学裂解(诸如添加洗涤剂triton)、机械裂解或通过使细胞培养物在达到约0％生存力后降解来实现细胞裂解。通过离心和/或深层过滤去除细胞碎片。通过DNAqPCR或ddPCR，通过DNA酶抗性基因组滴定对样品进行AAV颗粒定量。
根据基因组拷贝数(每毫升基因组颗粒)测量AAV颗粒滴度。基因组颗粒浓度是基于如先前报道的载体DNA的DNA qPCR(Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6:272-278，该文献与颗粒浓度的测量相关的内容全文各自以引用方式并入)。
昆虫细胞
本公开的病毒生产包括用于生产AAV颗粒或病毒载体的过程和方法，该AAV颗粒或病毒载体接触靶细胞以递送有效载荷构建体(例如，重组病毒构建体)，该有效载荷构建体包含编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒或病毒载体可以在包括昆虫细胞的病毒生产细胞中产生。
培养中的昆虫细胞的生长条件和培养中的昆虫细胞中异源产物的产生是本领域公知的，参见美国专利号6,204,059，该文献与昆虫细胞在病毒生产中的生长和使用相关的内容全文以引用方式并入本文。
根据本公开，可以使用允许细小病毒复制并且可以维持在培养物中的任何昆虫细胞。通常用于生产重组AAV颗粒的AAV病毒生产细胞包括但不限于：草地贪夜蛾包括但不限于Sf9或Sf21细胞系、果蝇细胞系或蚊子细胞系，诸如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系。昆虫细胞用于表达异源蛋白的用途已被充分证明，将核酸诸如载体(例如，昆虫细胞相容性载体)引入此类细胞的方法以及在培养物中维持此类细胞的方法也已被充分证明。参见，例如，Methods in Molecular Biology，编辑Richard,Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等人，J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人，J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人，Vir.219:37-44(1996)；Zhao等人，Vir.272:382-93(2000)；以及Samulski等人，美国专利号6,204,059，该文献中的每一者与昆虫细胞在病毒生产中的用途相关的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，使用WO2015/191508中所述的方法制备AAV颗粒，该文献的内容全文以引用方式并入本文，只要它们不与本公开冲突。
在某些实施方案中，可使用昆虫宿主细胞系统与杆状病毒系统的组合(例如，如由Luckow等人，Bio/Technology 6:47(1988)所述)。在某些实施方案中，用于制备嵌合肽的表达系统是粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Tn5B1-4昆虫细胞/杆状病毒系统，该系统可用于高水平的蛋白质，如美国专利号6660521中所述，该文献与病毒颗粒的生产相关的内容全文以引用方式并入本文。
昆虫细胞的扩增、培养、转染、感染和储存可在本领域已知的任何细胞培养基、细胞转染培养基或储存培养基中进行，包括HycloneTMSFX-InsectTM细胞培养基、表达系统ESFAFTM昆虫细胞培养基、ThermoFisher Sf-900IITM培养基、ThermoFisher Sf-900IIITM培养基或ThermoFisher Grace's昆虫培养基。本公开的昆虫细胞混合物还可以包括本公开中描述的任何制剂添加剂或元素，包括(但不限于)盐、酸、碱、缓冲液、表面活性剂(诸如泊洛沙姆188/普朗尼克F-68)以及其他已知的培养基元素。制剂添加剂可逐渐地掺入或作为“刺突”掺入(在短时间内掺入大体积)。
杆状病毒生产系统
在某些实施方案中，本公开的过程可包括使用病毒表达构建体和有效载荷构建体载体在杆状病毒系统中产生AAV颗粒或病毒载体。在某些实施方案中，杆状病毒系统包括杆状病毒表达载体(BEV)和/或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是杆粒，也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是通过同源重组(转座子供体/受体系统)掺入到杆粒中的多核苷酸，该同源重组通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术进行。单独的病毒复制细胞群体的转染产生两组或更多组(例如，两组、三组)杆状病毒(BEV)，一组或多组可包括病毒表达构建体(表达BEV)，以及一组或多组可包括有效载荷构建体(有效载荷BEV)。杆状病毒可用于感染病毒生产细胞以生产AAV颗粒或病毒载体。
在某些实施方案中，过程包括转染单个病毒复制细胞群体以产生单个杆状病毒(BEV)组，该组包括病毒表达构建体和有效载荷构建体两者。这些杆状病毒可用于感染病毒生产细胞以生产AAV颗粒或病毒载体。
在某些实施方案中，使用杆粒转染剂，诸如PromegaHD、WFI水或ThermoFisherII试剂产生BEV。在某些实施方案中，BEV在病毒生产细胞(诸如昆虫细胞)中生产和扩增。
在某些实施方案中，方法利用包括一种或多种BEV的病毒生产细胞(包括杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC))的种子培养物。种子BIIC已用包括病毒表达构建体的表达BEV以及包括有效载荷构建体的有效载荷BEV进行转染/转导/感染。在某些实施方案中，收获种子培养物，分成等份并冷冻，并且可以在稍后时间用于起始生产细胞的原初群体的转染/转导/感染。在某些实施方案中，将一堆种子BIIC储存在-80℃或储存于LN2蒸气中。
杆状病毒是由几种对杆状病毒的功能和复制必需的必需蛋白(诸如复制蛋白、包膜蛋白和衣壳蛋白)组成。因此，杆状病毒基因组包括几个编码必需蛋白的必需基因核苷酸序列。作为非限制性示例，基因组可包括必需基因区域，该必需基因区域包括编码杆状病毒构建体的必需蛋白的必需基因核苷酸序列。必需蛋白可包括：GP64杆状病毒包膜蛋白、VP39杆状病毒衣壳蛋白或杆状病毒构建体的其它类似必需蛋白。
用于在昆虫细胞，包括但不限于草地贪夜蛾(Sf9)细胞中产生AAV颗粒的杆状病毒表达载体(BEV)提供高滴度的病毒载体产物。编码病毒表达构建体和有效载荷构建体的重组杆状病毒启动病毒载体复制细胞的生产性感染。从初次感染中释放的感染性杆状病毒颗粒二次感染培养物中的另外的细胞，在作为初始感染复数的函数的多个感染周期中以指数方式感染整个细胞培养群体，参见Urabe,M.等人J Virol.2006年2月；80(4):1874-85，该文献与BEV和病毒颗粒的生产和使用相关的内容全文以引用方式并入本文。
在昆虫细胞系统中用杆状病毒生产AAV颗粒可以解决已知的杆状病毒遗传和物理不稳定性。
在某些实施方案中，本公开的产生系统通过利用无滴度感染的细胞保存和放大系统解决了历经多次传代的杆状病毒不稳定性。用编码AAV颗粒的结构和/或非结构组分的病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模种子培养物。将杆状病毒感染的病毒生产细胞收获成可在液氮中冷冻保存的等分试样；对于大规模病毒生产细胞培养物的感染，等分试样保持活力和感染性。Wasilko DJ等人Protein Expr Purif.2009年6月；65(2):122-32，该文献与BEV和病毒颗粒的生产和使用相关的内容全文以引用方式并入本文。
遗传稳定的杆状病毒可用于产生用于在无脊椎动物细胞中产生AAV颗粒的一种或多种组分的来源。在某些实施方案中，有缺陷的杆状病毒表达载体可以游离地保持在昆虫细胞中。在此类实施方案中，对应的杆粒载体用复制控制元件工程化，该复制控制元件包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件。
在某些实施方案中，允许杆状病毒感染的稳定的病毒生产细胞用AAV复制和载体生产所必需的任何元件的至少一个稳定掺入的拷贝进行工程化，该元件包括但不限于整个AAV基因组、Rep和Cap基因、Rep基因、Cap基因、作为单独转录盒的每种Rep蛋白、作为单独转录盒的每种VP蛋白、AAP(装配活化蛋白)或具有天然或非天然启动子的杆状病毒辅助基因中的至少一者。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以使用三重转染产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在哺乳动物细胞中产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过在哺乳动物细胞中的三重转染产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过在HEK293细胞中的三重转染产生。
如本文所述，包含嗜肝衣壳蛋白(例如sL65衣壳蛋白)并编码GAL蛋白的AAV颗粒可用于人类疾病、兽用应用和多种体内和体外环境的领域。本公开的AAV颗粒可用于治疗、预防、减轻或改善GAL相关疾病和/或病症(例如溶酶体贮积病，例如法布里病)的医学领域。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒用于预防和/或治疗GAL相关病症，例如溶酶体贮积病、例如法布里病。
IV.药物组合物
本公开另外地提供了一种用于治疗哺乳动物受试者(包括人受试者)的GAL相关病症以及与GAL蛋白的功能缺乏或表达缺乏相关的病症的方法，该方法包括向受试者施用一种病毒颗粒，或其药物组合物，该病毒颗粒包含嗜肝衣壳蛋白(例如，sL65衣壳蛋白)和包含编码GAL蛋白的转基因的核酸。
如本文所用，术语“组合物”包含AAV颗粒和至少一种赋形剂。如本文所用，术语“药物组合物”包含AAV颗粒和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
尽管描述了药物组合物，例如包含编码待递送的GAL蛋白的有效载荷的AAV，本文提供了主要涉及适于对人类施用的药物组合物，本领域技术人员将理解，此类组合物大致适于对任何其他动物(例如对非人动物，例如非人哺乳动物)施用。为了使组合物适于施用于各种动物而对适于施用于人类的药物组合物进行的修饰是公知的，并且普通的兽医药理学家可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行此类修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于：人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用于人、人患者或受试者。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒制剂可以含有编码至少一种有效载荷的核酸。在一些实施方案中，制剂可含有编码1、2、3、4或5个有效载荷的核酸。在一些实施方案中，制剂可含有编码有效载荷构建体的核酸，该核酸编码选自诸如但不限于以下类别的蛋白：人蛋白、兽用蛋白、细菌蛋白、生物蛋白、抗体、免疫原性蛋白、治疗性肽和蛋白、分泌蛋白、质膜蛋白、细胞质蛋白、细胞支架蛋白、细胞内膜结合蛋白、核蛋白、与人疾病相关的蛋白和/或与非人疾病相关的蛋白。在一些实施方案中，制剂含有至少三种编码蛋白质的有效载荷构建体。某些实施方案规定有效载荷中的至少一者是GAL蛋白或其变体。
根据本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量和/或作为多个单个单位剂量批量地制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量大致等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的便利部分，诸如例如此类剂量的二分之一或三分之一。
在本公开的一个方面，本公开的AAV颗粒将呈含有药学上可接受的载剂的药物组合物的形式。如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指通常可用于药物施用的任何基本上无毒的载剂，其中本公开的分离的多肽将保持稳定和生物可利用。药学上可接受的载剂必须具有足够高的纯度并且具有足够低的毒性以使其适于施用于所治疗的哺乳动物。其进一步应保持活性剂的稳定性和生物利用度。药学上可接受的载剂可以是液体或固体，并且考虑到计划的施用方式进行选择，以当与给定组合物的活性剂和其它组分组合时提供期望的体积、稠度等。合适的药学上可接受的载剂包含任何及所有的溶剂、分散介质、包膜、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理上可相容的类似物。药学上可接受的载剂还包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。除非任何常规介质或药剂与基因治疗载体不相容，否则考虑其在本公开的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
本公开的药物组合物可以被配制用于递送至用于兽用目的的动物(例如家畜(牛、猪、狗、小鼠、大鼠)和其他非人哺乳动物受试者，以及递送至人受试者。
在一个实施方案中，本公开的药物组合物呈可注射组合物的形式。组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液。制剂也可以是乳化的。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、磷酸盐缓冲盐水等及其组合。另外，如果需要，制剂可以含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、表面活性剂或免疫增强剂。
无菌注射溶液可以通过以下方式来制备：将所需量的本公开的组合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起掺入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌。一般来讲，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末加上任何另外期望的成分。
本文所述的核酸分子的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如用于确定ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。从细胞培养测定和/或动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。剂量通常在包括几乎没有或没有毒性的ED50的浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在该范围内变化。对于在本公开的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定估计。
V.制剂
本文所述的AAV药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法制备。一般来讲，此类制备方法包括以下的步骤：将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它附属成分缔合，并且然后如果必要和/或期望的话，将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或状况并且进一步根据待施用组合物的途径而变化。
例如，组合物可以包含0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。以举例的方式，组合物可以包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％至30％之间、5％至80％之间、或至少80％(w/w)的活性成分。
本公开的AAV颗粒可使用一种或多种赋形剂配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放；(4)变更生物分布(例如，将病毒颗粒靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加编码的蛋白的体内翻译；(6)变更编码的蛋白的体内释放谱和/或(7)允许有效载荷的可调节表达。
本公开的制剂可包括但不限于：盐水、脂类、脂质体、脂纳米颗粒、聚合物、脂复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米颗粒模拟物及其组合。此外，本公开的病毒载体可使用自装配的核酸纳米颗粒来配制。
在一些实施方案中，可以配制编码GAL蛋白的病毒载体以优化比重和/或渗透度。在一些实施方案中，可以优化制剂的比重和/或渗透度以确保在肝脏中的最佳药物分布。
本公开的制剂可以包括一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量一起增加AAV颗粒的稳定性、增加病毒颗粒的细胞转染或转导、增加病毒颗粒编码的蛋白质的表达、并且/或者变更AAV颗粒编码的蛋白质的释放谱。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和用于兽用用途。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药物等级的。在一些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
如本文所用的赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，只要适合于期望的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其内容全文以引用方式并入本文)。常规赋形剂介质的使用可考虑在本公开的范围内，除非任何常规赋形剂介质可与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不期望的生物效应或另外以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用。
在一些实施方案中，AAV制剂可以包含至少一种非活性成分的赋形剂。如本文所用，术语“非活性成分”是指对包含在制剂中的药物组合物的活性没有贡献的一种或多种药剂。在一些实施方案中，可用于本公开的制剂中的所有、全无或一些非活性成分可由美国食品和药品管理局(FDA)批准。
本文公开的AAV颗粒的制剂可以包括阳离子或阴离子。在一些实施方案中，制剂包括金属阳离子，诸如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+或其组合。在一些实施方案中，制剂可以包括与金属阳离子复合的聚合物或多核苷酸(参见，例如，美国专利号6,265,389和6,555,525，该文献中的每一者的内容全文以引用方式并入本文)。
VI.本公开的方法
本公开还提供使用本公开的组合物的方法，该方法大致包括施用AAV颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物。
在一个方面，本公开提供了用于将外源GAL蛋白递送至受试者的方法。该方法大致包括施用有效量的AAV病毒颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物，从而将外源GAL递送至受试者。
本公开进一步提供了用于治疗患有或诊断患有溶酶体贮积病(例如，法布里病)的受试者的方法。该方法包括施用有效量的AAV病毒颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物，从而治疗受试者的溶酶体贮积病。
本公开还提供用于治疗患有或诊断患有GAL相关疾病(例如，法布里病)的受试者的方法。该方法包括施用有效量的AAV病毒颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物，从而治疗受试者的GAL相关疾病。
本公开还提供了用于治疗患有或诊断患有法布里病的受试者的方法。该方法包括施用有效量的AAV病毒颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物，从而治疗受试者的法布里病。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒通过递送功能性有效载荷(其为包含GAL蛋白或其变体的治疗产物)可调节有此需要的受试者中的基因产物的水平或功能。功能性有效载荷可以减轻或减少有此需要的受试者中由基因产物的异常水平和/或功能(例如，蛋白质中的缺失或缺陷)导致的症状。
在一些实施方案中，AAV颗粒的递送可停止或减缓GAL相关病症(例如溶酶体贮积病，例如法布里病)的进展，如通过受试者中GAL的水平所测量的。GAL的水平可以使用本领域已知的任何方法测量，例如，通过测量血液中GAL的水平。患有法布里病的男性通常可经由酶测定试验诊断。患有典型法布里病的男性基本上没有GAL酶(低于正常的1％)。具有非典型法布里基因突变的男性将具有一些酶，但其仍然非常低。相反，女性可具有接近正常水平的酶，因此酶测定不足以用于诊断，因此必须进行DNA序列分析。
在某些实施方案中，AAV颗粒的递送可以改善GAL相关病症(例如法布里病)的一种或多种症状，该症状包括例如：麻木、麻刺感、烧灼或其他异常感觉(尤其是手和脚(肢端感觉异常))、疼痛发作/危象、发烧、身体疼痛或不适、对剧烈体力活动的不耐受、频繁和/或慢性疲劳、热和冷温度不耐受、出汗减少或不存在、下肢、踝和脚中的肿胀(浮肿)、角膜或晶状体混浊-在角膜上并且有时在眼睛的晶状体上出现条纹状或轮纹状不透明/浑浊的图案(角膜白斑和法布里白内障)、胃肠道问题(例如频繁轻度至重度腹泻和/或便秘、胀气、胃或肠道疼痛和痉挛、过早饱腹、食物不耐受和体重增加困难)、阻塞性或收缩性肺部疾病(常表现为喘息、慢性咳嗽、呼吸短促或呼吸困难(喘证))、复发性支气管炎和疲劳(经常被诊断为阻塞性肺疾病)、耳鸣(耳鸣(tinnitus))以及进行性或突发性听力丧失、虚弱、意识朦胧、头晕、眩晕(旋转头晕)和来自神经损害的头痛、以及其他脑血管疾病影响、引起或加重许多其他法布里病症状的周围神经病变(周围神经系统受损)、短暂性脑缺血发作(TIA)、中风、肾功能受损和肾衰竭(经常没有糖尿病、蛋白尿和微白蛋白尿)、肾透析和移植、心脏并发症诸如心律失常(心率或节律异常，包括心房颤动)；左心室肥厚(LVH)和功能障碍的心脏瓣膜、心脏病发作和心力衰竭。可根据本领域已知的标准方法和技术容易地评估任何这些症状的改善。也可监测上文未列出的其它症状，以确定治疗法布里病的有效性。
在某些实施方案中，需要治疗的受试者是患有典型类型法布里病的受试者。在其他实施方案中，需要治疗的受试者是患有迟发型或非典型类型法布里病的受试者。在某些实施方案中，本公开提供了通过施用AAV颗粒或包含本公开的AAV颗粒的药物组合物，在有需要的任何前述受试者中减少鞘糖脂诸如在骨骼肌、心肌和/或肝脏中的蓄积的方法。
一般来讲，用于病毒感染感兴趣的细胞的方法是本领域已知的。可将该病毒放置与感兴趣的细胞接触，或者另选地可将其注射入患有GAL相关病症(例如溶酶体贮积病，例如法布里病)的受试者中。
将本公开的组合物引入受试者中用于治疗目的的指导在本领域中是已知的并且可以在美国专利号5,631,236、5,688,773、5,691,177、5,670,488、5,529,774、5,601,818和PCT公开号WO 95/06486中获得，该文献的全部内容以引用方式并入本文。
本公开的AAV颗粒可以通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于：肠内(进入肠)、胃肠道、硬膜外(进入硬脑膜)、口服(通过口)、经皮肤、硬膜外、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、颅内(进入颅骨)、经皮(应用到皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、鼻内施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内大丸剂、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、器官实质内(进入其实体)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射进入腹膜)、囊内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理性腔)、腔内(进入阴茎基部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(扩散通过完整皮肤用于全身分布)、经粘膜(扩散通过粘膜)、经阴道的、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠剂、滴眼剂(到结膜上)、滴耳药、耳内(在耳或通过耳)、颊(朝向面颊)、结膜、皮肤、牙齿(至一颗或多颗牙齿)、电渗透、子宫颈内、窦内、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、关节内、胆道内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、尾部内(在马尾内)、脑池内(在小脑髓大池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张间隙内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺体的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬脑膜内或硬脑膜下)、表皮内(到表皮)、食管内(到食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远端部分内)、病灶内(局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管的内腔内)、淋巴内(在淋巴内)、髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦内)、椎管内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平的脑脊液内)、胸内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、冲洗(以清洗或冲洗开放伤口或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃(通过鼻并进入胃)、闭合敷料技术(局部途径施用，然后用闭合该区域的敷料覆盖)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内通过经口或经鼻吸入以实现局部或全身效应)、眼球后(在脑桥后面或在眼球后面)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下层、软膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管的壁)、经鼓室(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、尾阻滞、诊断、神经阻滞、胆灌流、心脏灌流、光分离置换法或脊柱。
在一些实施方案中，AAV颗粒可通过全身递送来递送。在一些实施方案中，全身递送可以通过血管内施用。在一些实施方案中，全身递送可以通过静脉内(IV)施用。
应用本公开的方法用于治疗和/或预防病症可导致治愈该病症，减少与该病症相关的至少一种症状，长期或短期或仅仅是对受试者的短暂有益效果。
因此，如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”包括将如本文所述的组合物应用或施用于患有GAL相关疾病，例如溶酶体贮积病(例如法布里病)或对此类病状易感的受试者，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、变更、补救、改善、改进或影响此类病状或此类病状的至少一种症状。如本文所用，如果病状的复发被减少、减缓、延迟或预防，则该病状也被“治疗”。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是指对受试者施用一种或多种本主题组合物。如果在不期望的病状(例如，宿主动物的疾病或其它不期望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的，即，其保护宿主免于发展不期望的病状，然而如果在不期望的病状的表现之后施用，则治疗是治疗性的(即，其旨在减少、改善或维持现有的不期望的病状或由此产生的副作用)。
如本文所用，“治疗有效量”旨在包括当向患者施用以治疗GAL相关疾病，例如溶酶体贮积病(例如法布里病)时，足以实现该疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)的本公开的组合物的量。“治疗有效量”可根据组合物、组合物如何施用、疾病及其严重性和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、由疾病表达介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗患者的其它个体特征而变化。
如本文所用，“预防有效量”旨在包括以下组合物的量：当施用于尚未经历或表现出例如GAL相关疾病例如溶酶体贮积病(例如法布里病)的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状。改善疾病包括减缓疾病的进程或降低随后发展的疾病的严重性。“预防有效量”可根据组合物、组合物如何施用、疾病的危险程度和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗患者的其它个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理益处/风险比产生一些期望的局部或全身效应的组合物的量。本公开的方法中采用的组合物可以以足以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比的量施用。
如本文所述的组合物可以根据需要施用以实现期望的效果并且取决于多种因素，包括但不限于病状的严重性、受试者的年龄和病史以及组合物的性质，例如基因的身份或受影响的生化途径。
本公开的药物组合物可以以单剂量施用，或者在本公开的特定实施方案中，可以采用多剂量(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以实现治疗效果。当采用多次施用时，可以使用诸如本文所述的分次给药方案。如本文所用，“分次剂量”是将单个单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如两次或更多次施用单个单位剂量。如本文所用，“单个单位剂量”是以一次剂量/一次/单一途径/单一接触点，即单一施用事件施用的任何治疗组合物的剂量。在一些实施方案中，将单个单位剂量提供为离散剂型(例如，片剂、胶囊、贴剂、装载注射器、小瓶等)。如本文所用，“总日剂量”是在24小时期间给予或规定的量。它可以作为单个单位剂量施用。病毒颗粒可仅在缓冲液中配制或在本文所述的制剂中配制。
治疗或预防方案可覆盖至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周的时期，或对受试者长期施用。
一般来讲，本公开的核酸分子和/或载体以治疗有效量提供，以引起期望的效果，例如增加GAL表达和/或活性。根据治疗的次数和量两者，待施用的病毒颗粒的量也将取决于以下因素，诸如临床状态、年龄、先前治疗、受试者的一般健康和/或年龄、存在的其它疾病以及病症的严重性。需要施用的活性成分的精确量取决于基因治疗专家的判断并且将因个体患者而异。此外，用治疗有效量的本公开的核酸分子和/或载体治疗受试者可以包括单次治疗，或优选地可以包括一系列治疗。还应当理解，用于治疗的有效剂量可以历经特定治疗的过程增加或减少。剂量的变化可由如本文所述的诊断测定的结果引起。药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
在一些实施方案中，治疗有效量或预防有效量的本公开的病毒颗粒(或本公开的药物组合物)的滴度范围为：约1×105、约1.5×105、约2×105、约2.5×105、约3×105、约3.5×105、约4×105、约4.5×105、约5×105、约5.5×105、约6×105、约6.5×105、约7×105、约7.5×105、约8×105、约8.5×105、约9×105、约9.5×105、约1×106、约1.5×106、约2×106、约2.5×106、约3×106、约3.5×106、约4×106、约4.5×106、约5×106、约5.5×106、约6×106、约6.5×106、约7×106、约7.5×106、约8×106、约8.5×10、约9×106、约9.5×106、约1×107、约1.5×107、约2×107、约2.5×107、约3×107、约3.5×107、约4×107、约4.5×107、约5×107、约5.5×107、约6×107、约6.5×107、约7×107、约7.5×107、约8×107、约8.5×107、约9×107、约9.5×107、约1×108、约1.5×108、约2×108、约2.5×108、约3×108、约3.5×108、约4×108、约4.5×108、约5×108、约5.5×108、约6×108、约6.5×108、约7×108、约7.5×108、约8×108、约8.5×108、约9×108、约9.5×108、约1×109、约1.5×109、约2×109、约2.5×1098、约3×109、约3.5×109、约4×109、约4.5×109、约5×109、约5.5×109、约6×109、约6.5×109、约7×109、约7.5×109、约8×109、约8.5×109、约9×109、约9.5×109、约1×1010、约1.5×1010、约2×1010、约2.5×1010、约3×1010、约3.5×1010、约4×1010、约4.5×1010、约5×1010、约5.5×1010、约6×1010、约6.5×1010、约7×1010、约7.5×1010、约8×1010、约8.5×1010、约9×1010、约9.5×1010、约1×1011、约1.5×1011、约2×1011、约2.5×1011、约3×1011、约3.5×1011、约4×1011、约4.5×1011、约5×1011、约5.5×1011、约6×1011、约6.5×1011、约7×1011、约7.5×1011、约8×1011、约8.5×1011、约9×1011、约9.5×1011、约1×1012、约1.5×1012、约2×1012、约2.5×1012、约3×1012、约3.5×1012、约4×1012、约4.5×1012、约5×1012、约5.5×1012、约6×1012、约6.5×1012、约7×1012、约7.5×1012、约8×1012、约8.5×1012、约9×1012、约9.5×1012、约1×1013、约1.5×1013、约2×1034、约2.5×1013、约3×1013、约3.5×1013、约4×1013、约4.5×1013、约5×1013、约5.5×1013、约6×1013、约6.5×1013、约7×1013、约7.5×1013、约8×1013、约8.5×1013、约9×1013、约9.5×1013、约1×1014、约1.5×1014、约2×1014、约2.5×1014、约3×1014、约3.5×1014、约4×1014、约4.5×1014、约5×1014、约5.5×1014、约6×1014、约6.5×1014、约7×1014、约7.5×1014、约8×1014、约8.5×1014、约9×1014、约9.5×1014、约1×1015个病毒颗粒(vp)。
在一些实施方案中，治疗有效量或预防有效量的本公开的病毒颗粒(或本公开的药物组合物)是在基因组拷贝(“GC”)中，也称为“病毒基因组”(“vg”)，范围为：约1×105、约1.5×105、约2×105、约2.5×105、约3×105、约3.5×105、约4×105、约4.5×105、约5×105、约5.5×105、约6×105、约6.5×105、约7×105、约7.5×105、约8×105、约8.5×105、约9×105、约9.5×105、约1×106、约1.5×106、约2×106、约2.5×106、约3×106、约3.5×106、约4×106、约4.5×106、约5×106、约5.5×106、约6×106、约6.5×106、约7×106、约7.5×106、约8×106、约8.5×10、约9×106、约9.5×106、约1×107、约1.5×107、约2×107、约2.5×107、约3×107、约3.5×107、约4×107、约4.5×107、约5×107、约5.5×107、约6×107、约6.5×107、约7×107、约7.5×107、约8×107、约8.5×107、约9×107、约9.5×107、约1×108、约1.5×108、约2×108、约2.5×108、约3×108、约3.5×108、约4×108、约4.5×108、约5×108、约5.5×108、约6×108、约6.5×108、约7×108、约7.5×108、约8×108、约8.5×108、约9×108、约9.5×108、约1×109、约1.5×109、约2×109、约2.5×1098、约3×109、约3.5×109、约4×109、约4.5×109、约5×109、约5.5×109、约6×109、约6.5×109、约7×109、约7.5×109、约8×109、约8.5×109、约9×109、约9.5×109、约1×1010、约1.5×1010、约2×1010、约2.5×1010、约3×1010、约3.5×1010、约4×1010、约4.5×1010、约5×1010、约5.5×1010、约6×1010、约6.5×1010、约7×1010、约7.5×1010、约8×1010、约8.5×1010、约9×1010、约9.5×1010、约1×1011、约1.5×1011、约2×1011、约2.5×1011、约3×1011、约3.5×1011、约4×1011、约4.5×1011、约5×1011、约5.5×1011、约6×1011、约6.5×1011、约7×1011、约7.5×1011、约8×1011、约8.5×1011、约9×1011、约9.5×1011、约1×1012、约1.5×1012、约2×1012、约2.5×1012、约3×1012、约3.5×1012、约4×1012、约4.5×1012、约5×1012、约5.5×1012、约6×1012、约6.5×1012、约7×1012、约7.5×1012、约8×1012、约8.5×1012、约9×1012、约9.5×1012、约1×1013、约1.5×1013、约2×1034、约2.5×1013、约3×1013、约3.5×1013、约4×1013、约4.5×1013、约5×1013、约5.5×1013、约6×1013、约6.5×1013、约7×1013、约7.5×1013、约8×1013、约8.5×1013、约9×1013、约9.5×1013、约1×1014、约1.5×1014、约2×1014、约2.5×1014、约3×1014、约3.5×1014、约4×1014、约4.5×1014、约5×1014、约5.5×1014、约6×1014、约6.5×1014、约7×1014、约7.5×1014、约8×1014、约8.5×1014、约9×1014、约9.5×1014、约1×1015、约1.5×1015、约2×1015、约2.5×1015、约3×1015、约3.5×1015、约4×1015、约4.5×1015、约5×1015、约5.5×1015、约6×1015、约6.5×1015、约7×1015、约7.5×1015、约8×1015、约8.5×1015、约9×1015、约9.5×1015或约1×1016个vg。
本领域已知的任何方法可用于确定本公开的病毒组合物的基因组拷贝(GC)数。用于进行AAV GC数量滴定的一种方法如下：纯化的AAV病毒颗粒样品首先用DNA酶处理以从生产过程中消除未衣壳化的AAV基因组DNA或污染的质粒DNA。然后对DNA酶抗性颗粒进行热处理以从衣壳释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域的引物/探针集组，通过实时PCR或ddPCR对释放的基因组定量。
在本公开的某些实施方案中，本公开的组合物与另外的治疗剂或治疗组合施用。组合物和另外的治疗剂可在同一组合物中组合施用，或者另外的治疗剂可作为单独组合物的一部分或通过本文所述的另一方法施用。
治疗剂可由美国食品和药品管理局批准或可处于临床试验中或处于临床前研究阶段。治疗剂可利用本领域已知的任何治疗方式，非限制性示例包括基因沉默或干扰(即，miRNA、siRNA、RNAi、shRNA)、基因编辑(即，TALEN、CRISPR/Cas9系统、锌指核酸酶)以及基因、蛋白质或酶替代。
适用于本公开的方法的另外的治疗剂或治疗的示例包括已知治疗GAL相关疾病(例如，法布里病)的那些药剂或治疗。在一个实施方案中，另外的治疗剂或治疗是酶替代疗法。它涉及重组人GAL的静脉内施用，例如，以(Genzyme,Inc.)和(TKT,Inc.)销售的产品。在其它实施方案中，适用于本公开的方法的另外的治疗剂或治疗包括口服伴侣疗法，例如(或米加司他)。
VII.试剂盒
本公开还提供用于方便地和/或有效地实施本公开的方法的多种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或进行多次实验。
本公开的任何载体、构建体或GAL蛋白可以包含在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于产生和/或合成本公开的化合物和/或组合物的试剂和/或说明书。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或多种缓冲液。在一些实施方案中，本公开的试剂盒可以包括用于制备蛋白质或核酸阵列或文库的组分，并且因此可以包括例如固体支持物。
在一些实施方案中，试剂盒组分可以以水性介质或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置大致包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置，组分可放置到容器装置中并适当地进行等分。在存在多于一种试剂盒组分的情况下(标记试剂和标记可以包装在一起)，试剂盒大致还可以包含第二、第三或其它另外的容器，另外的组分可以分别放置到该另外的容器中。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器装置。在一些实施方案中，组分的各种组合可以包含在一个或多个小瓶中。本公开的试剂盒还可通常包括用于容纳本公开的化合物和/或组合物(例如蛋白质、核酸)的装置，以及任何其它用于商业销售的紧密密封的试剂容器。此类容器可以包括注射或吹塑成型的塑料容器，所需的小瓶保留到该塑料容器中。
在一些实施方案中，试剂盒组分在一种和/或多种液体溶液中提供。在一些实施方案中，液体溶液是水溶液，其中特别使用无菌水溶液。在一些实施方案中，试剂盒组分可以以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，此类粉末可通过添加合适体积的溶剂来重构。在一些实施方案中，设想还可以在另一容器装置中提供溶剂。在一些实施方案中，标记染料以干粉形式提供。在一些实施方案中，预期在本公开的试剂盒中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微克或至少或至多那些量的干燥染料。在此类实施方案中，然后可以将染料再悬浮于任何合适的溶剂中，诸如DMSO。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于使用试剂盒组分以及使用不包括在试剂盒中的任何其它试剂的说明书。说明书可以包括可以实现的变体。
通过以下非限制性实施例进一步说明本公开。
实施例
实施例1.载体设计和合成
产生了编码人GAL蛋白的各种AAV病毒基因组。编码的GAL蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其对应于人GAL蛋白(SEQ ID NO:47)的氨基酸32-429，并且由SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。还对编码GAL蛋白的核酸序列进行密码子优化(SEQ ID NO:3-5)。
编码GAL蛋白的病毒基因组被设计成进一步编码信号肽。一些病毒基因组被设计为包括具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的天然GAL信号肽，其对应于人GAL蛋白(SEQ ID NO:47)的氨基酸1-31。天然GAL信号肽由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码。还对编码GAL信号肽的核酸序列进行密码子优化(SEQ ID NO:8-10)。
另选地，将具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的人IgG1信号序列掺入到病毒基因组中。人IgG1信号肽由SEQ ID NO:12的核苷酸序列编码。还对编码IgG1信号肽的核酸序列进行密码子优化(SEQ ID NO:13和14)。
图1提供了编码具有信号肽的GAL蛋白的示例性构建体的示意图。
实施例2.表达构建体的体外评估
评估各种AAV-GLA构建体组合用于α-GAL成熟肽的体外产生。
用包含构建体1-8的质粒转染HepG2细胞(图2)。实施例2和3中(以及其中引用的图中)的构建体1至8分别是指如本文所述的构建体1A至8A，或SEQ ID No:31-38(参见表6)。转染后72小时收获细胞并处理以测量裂解物和上清液两者中的α-GAL水平。α-GAL肽水平的蛋白质印迹可视化和ELISA定量证明，某些构建体在裂解物和上清液两者中显示出更高的α-GAL表达，如通过ELISA检测，构建体2和构建体8在上清液中产生至少750ng/ml(参见，图3、图4和表3)。还包括β-肌动蛋白标准作为上样对照。评估了每个构建体的α-GAL蛋白的活性，其中构建体2和构建体8在上清液中显示至少15nmol/hr*ml(参见，图5和表4)。
表3.上清液和裂解物中GAL浓度相对于构建体编号1的倍数变化
表4.上清液中GAL活性相对于构建体编号1的倍数变化
盒 活性(nmol/h.ml) 倍数变化
构建体1 9.0 1.0
构建体2 19.1 2.1
构建体3 14.0 1.6
构建体4 11.5 1.3
构建体5 12.0 1.3
构建体6 11.9 1.3
构建体7 5.3 0.6
构建体8 20.6 2.3
除其他事项外，本实施例证明，本公开的构建体可体外产生成熟的功能性GAL。在一些实施方案中，GAL的水平和/或活性可以相对于参考构建体得到改善。
实施例3.表达构建体的体内评估
评估各种AAV-GLA构建体组合用于α-GAL成熟肽的体内产生和活性。
将构建体1(图2)包装在AAV-DJ中并经由静脉内(IV)施用递送至14周大的法布里小鼠(n＝3)。实施例3中的构建体1是指如本文所述的构建体1A，或SEQ ID No:31(参见表6)。以5E13 vg/kg的剂量将组合物施用到眼眶静脉。在第0天和注射后第7天收获血浆样品，并评估GAL活性(图6)。
除其他事项外，本实施例证明，本公开的构建体体内产生成熟的功能性GAL。在一些实施方案中，GAL的水平和/或活性可以相对于参考构建体得到改善。
将图2中所示的构建体包装在启动子下的AAV ITR内，并测试表达。还测试了这些构建体在细胞中的GLA酶活性。
产生包含病毒基因组的AAV颗粒。这些重组AAV颗粒包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的嗜肝衣壳蛋白sL65。衣壳蛋白由具有SEQ ID NO:46的核苷酸序列的核酸编码。
实施例4.表达构建体的体外评估
评估AAV-GLA构建体组合用于α-GAL成熟肽的体外产生。用包含构建体1-11的质粒转染HepG2细胞(图7)。实施例4和5以及其中引用的图中的构建体1至11分别是指构建体1B至11B，或SEQ ID No:51-61(参见表6)。构建体1B至11B与构建体1A至11A的不同之处在于构建体1B至11B在紧邻3'ITR的5'处的填充序列中含有2个碱基对添加(“gt”)，并且在紧邻5'ITR的3'处的填充序列外和填充序列中含有6个碱基对缺失。
简而言之，将细胞接种在细胞培养基(DMEM和10％ FBS，2ml/孔)中的12孔板中。根据制造商的说明书制备质粒和脂质复合物。将2μg DNA和Opti-MEM以总体积92μl混合，并且加入6μl Fugene HD转染试剂(Promega)且立即涡流5秒。将DNA/脂质复合物在室温温育15分钟，并且然后加入到细胞中，在37℃温育48-72小时。
α-GAL肽水平的蛋白质印迹可视化证明，某些构建体在裂解物和上清液两者中都显示出更高的α-GAL表达(图8)。还包括β-肌动蛋白标准作为上样对照。还评估了每个构建体的α-GAL蛋白的活性，其中构建体2、4、5、6、7、8、9、10和11在上清液中显示至少70nmol/hr*ml(图9和表5)。
表5.上清液中α-GAL活性相对于构建体编号1的倍数变化
HepG2细胞也用与Ref2K一起包装到AAV/DJ中的选择构建体(即，构建体2、4、6、7、8和9)转导。简而言之，在第0天将细胞在12孔板中铺板500,000个细胞，并且在第1天用包装到AAV/DJ中的构建体以三种不同感染复数(MOI)，即5E4、1E5和2E5转导。转导后72小时收获细胞，并收集上清液样品。α-GAL肽水平的蛋白质印迹可视化证明在1E5的MOI下的转导导致GAL的更好表达，并且某些构建体在上清液中显示更高的α-GAL表达，诸如构建体6、8和9(图10)。还评估了每个构建体的α-GAL蛋白的活性。与蛋白质印迹结果一致，在1E5的MOI下的转导导致更高的GAL活性水平，特别是对于构建体6、8和9(图11)。
实施例5.AAV-DJ中表达构建体的体内评估
评估AAV-GLA构建体组合用于α-GAL成熟肽的体内产生和活性。实施例5以及其中引用的图中的构建体1至11分别是指构建体1B至11B，或SEQ ID No:51-61(参见表6)。
简而言之，将法布里小鼠(B6；129-Glatm1Kul/J；JAX 003535)(每组n＝5)在AAV-DJ中用密码子优化的构建体给药并监测6周。以5E11 vg/kg的剂量在制剂缓冲液(10mM磷酸钠、150mM NaCl和0.001％普朗尼克F68)中施用组合物。第6周后处死动物。测量血浆中的α-GAL活性，并且还评价了lyso-GB3积累的清除(图12)。如图12所示，接受构建体6、8和9的小鼠具有α-GAL活性的显著增加，以及lyso-GB3水平的显著降低。α-GAL与lyso-GB3水平之间的相关性示出于图13中。
如上所述，在法布里小鼠(每组n＝4)中以1E13 vg/kg的较高剂量进一步测试AAV-DJ中的构建体6和9。给药前以及在第1周、第4周和第6周收获血浆样品，并测量α-GAL活性。如图14所示，接受构建体9的小鼠具有最高水平的α-GAL活性。
除其他事项外，本实施例证明，本公开的构建体体内产生成熟的功能性GAL，并且在接受本公开的构建体的小鼠中GAL的水平和/或活性显著改善。
实施例6.对包装在含有SL65衣壳的AAV颗粒中的表达构建体的体内评估
选择所选的表达构建体用于在包含嗜肝衣壳蛋白SL65的AAV颗粒中进行评估。嗜肝衣壳蛋白sL65包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。衣壳蛋白由具有SEQ ID NO:46的核苷酸序列的核酸编码。体内评价α-GAL成熟肽的产生和活性。
简而言之，将构建体6和9包装在包含嗜肝衣壳蛋白SL65的AAV颗粒中，并经由IV施用递送至PXB小鼠(每组n＝4)。实施例6以及其中引用的图中的构建体6和9分别是指构建体6B至9B，或SEQ ID No:56和59(参见表6)。以3E13 vg/kg的剂量施用组合物。给药前以及在第2周和第4周收获血浆样品。第4周后处死动物。测量血浆中的α-GAL活性，并评价人白蛋白(ALB)的水平作为对照(图15)。如图15所示，相对于给药前，接受构建体6或9的小鼠具有α-GAL活性水平的显著增加，而没有观察到ALB水平的显著改变。图16示出了通过ALB水平标准化的校正α-GAL活性水平。具体地，在施用包装在具有SL65衣壳的AAV颗粒中的构建体9后两周，在小鼠中观察到α-GAL活性的水平增加17倍。
除其他事项外，本实施例证明，本公开的构建体体内产生成熟的功能性GAL，并且在接受本公开的构建体的小鼠中GAL的水平和/或活性显著改善。
等效物和范围
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体实施方案和方法的许多等效形式。此类等效物旨在由所附权利要求书的范围涵盖。
表6：本公开的序列

Claims (88)

1.一种分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，包含AAV衣壳蛋白和核酸，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列，所述核酸包含编码α-半乳糖苷酶(GAL)蛋白的转基因。
2.根据权利要求1所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述衣壳蛋白的核酸包含SEQ IDNO:46的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的rAAV颗粒，其中编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因是密码子优化的。
6.根据权利要求5所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因进一步编码信号序列。
8.根据权利要求7所述的分离的rAAV颗粒，其中编码的信号序列包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求7或8所述的分离的rAAV颗粒，其中所述编码的信号序列由包含SEQ IDNO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
10.根据权利要求7或8所述的分离的rAAV颗粒，其中所述编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
11.根据权利要求10所述的分离的rAAV颗粒，其中所述密码子优化的核酸包含SEQ IDNO:8-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列。
12.根据权利要求7所述的分离的rAAV颗粒，其中所述编码的信号序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。
13.根据权利要求7或12所述的分离的rAAV颗粒，其中所述编码的信号序列由包含SEQID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
14.根据权利要求7或12所述的分离的rAAV颗粒，其中所述编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
15.根据权利要求14所述的分离的rAAV颗粒，其中所述密码子优化的核酸包含SEQ IDNO:13-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iv)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(v)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(viii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序编码：
(i)信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；或
(ii)信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含与核酸可操作地连接的启动子，所述核酸包含编码所述GAL蛋白的所述转基因。
20.根据权利要求19所述的分离的rAAV颗粒，其中所述启动子包括组织特异性启动子或泛素启动子。
21.根据权利要求19或20所述的分离的rAAV颗粒，其中所述启动子包括：
(i)A1AT启动子；EF-1a启动子；鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和/或其衍生物CAG；CMV即刻早期增强子和/或启动子；β葡糖苷酸酶(GUSB)启动子；泛素C(UBC)启动子；神经元特异性烯醇化酶(NSE)；血小板衍生生长因子(PDGF)启动子；血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子；细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子；突触蛋白(Syn)启动子；甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子；Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子；代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子；神经丝轻(NFL)或重(NFH)启动子；β-球蛋白微基因nβ2启动子；
前脑啡肽原(PPE)启动子；脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子；髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子；心血管启动子；肝脏启动子；骨骼肌启动子或片段，例如截短物，或其功能性变体；和/或
(ii)SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含反向末端重复(ITR)序列。
23.根据权利要求22所述的分离的rAAV颗粒，其中所述ITR序列相对于包含编码所述GAL蛋白的所述转基因的所述核酸位于5'位置。
24.根据权利要求22所述的分离的rAAV颗粒，其中所述ITR序列相对于包含编码所述GAL蛋白的所述转基因的所述核酸位于3'位置。
25.根据权利要求22所述的分离的rAAV颗粒，包含：相对于包含编码所述GAL蛋白的所述转基因的所述核酸位于5'位置的ITR序列和相对于包含编码所述GAL蛋白的所述转基因的所述核酸位于3'位置的ITR序列。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其中所述ITR序列包含SEQID NO:17和/或18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含增强子。
28.根据权利要求27所述的分离的rAAV颗粒，其中所述增强子包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
29.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含内含子区。
30.根据权利要求29所述的分离的rAAV颗粒，其中所述内含子区包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含Kozak序列。
32.根据权利要求31所述的分离的rAAV颗粒，其中所述Kozak序列包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含多腺苷酸化(polyA)信号区。
34.根据权利要求33所述的分离的rAAV颗粒，其中所述polyA信号区包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
35.根据权利要求33所述的分离的rAAV颗粒，其中所述polyA信号区包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的分离的rAAV颗粒，还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列。
37.根据权利要求36所述的分离的rAAV颗粒，其中所述WPRE序列包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
38.根据权利要求36所述的分离的rAAV颗粒，其中所述WPRE序列包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：5'ITR序列、增强子、启动子序列、Kozak序列、编码信号序列的核苷酸序列、编码GAL蛋白的核苷酸序列、polyA信号区和3'ITR序列。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：5'ITR序列、增强子、启动子序列、Kozak序列、编码信号序列的核苷酸序列、编码GAL蛋白的核苷酸序列、WPRE序列、polyA信号区和3'ITR序列。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
42.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
43.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
44.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
45.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
46.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
47.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
48.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(ix)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
49.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
50.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
51.根据权利要求1至40中任一项所述的分离的rAAV颗粒，其以5'至3'顺序包含：
(i)5'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I增强子，其包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iii)A1AT启动子，其包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(iv)内含子，其包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列；以及
(x)3'ITR序列区，其包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或与其至少95％相同的核苷酸序列。
52.一种组合物，包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸编码AAV衣壳蛋白，所述第二核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中编码所述衣壳蛋白的所述第一核酸包含SEQID NO:46的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
54.根据权利要求52或53所述的组合物，其中编码的GAL蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
56.根据权利要求52至54中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因是密码子优化的。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因包含SEQ IDNO:3-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因进一步编码信号序列。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述编码的信号序列包含SEQID NO:6的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。
60.根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述编码的信号序列由包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
61.根据权利要求58或59所述的组合物，其中所述编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸包含SEQID NO:8-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列。
63.根据权利要求58所述的组合物，其中所述编码的信号序列包含SEQID NO:11的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。
64.根据权利要求58或63所述的组合物，其中所述编码的信号序列由包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
65.根据权利要求58或63所述的组合物，其中所述编码的信号序列由密码子优化的核酸编码。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:13-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列。
67.根据权利要求52至66中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:7-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
68.根据权利要求52至67中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序包含：
(i)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(ii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(iv)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(v)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；
(vii)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列；或
(vi)编码信号序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列；以及编码GAL蛋白的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
69.根据权利要求52至68中任一项所述的组合物，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因以5'至3'顺序编码：
(i)信号序列，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；或
(ii)信号序列，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、与其至少70％相同的氨基酸序列；以及GAL蛋白，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
70.一种分离的核酸，包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因，其中编码所述GAL蛋白的所述转基因包含SEQ ID NO:3-5中任一者的核苷酸序列或与其至少85％相同的核苷酸序列。
71.根据权利要求70所述的核酸，其中所述转基因进一步编码信号序列。
72.根据权利要求71所述的核酸，其中所述编码的信号序列由包含SEQID NO:8-10中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
73.根据权利要求71所述的核酸，其中所述编码的信号序列由包含SEQID NO:12-14中任一者的核苷酸序列或与其至少70％相同的核苷酸序列的核酸编码。
74.一种组合物，包含根据权利要求70至73中任一项所述的核酸。
75.一种细胞，包含根据权利要求1至51中任一项所述的分离的rAAV颗粒、或根据权利要求52至69和74中任一项所述的组合物、或根据权利要求70至73中任一项所述的核酸。
76.根据权利要求75所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
77.一种制备分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括：
(i)提供包含核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因；以及
(ii)在适于将所述转基因包封在AAV衣壳蛋白中的条件下温育所述宿主细胞，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；从而制备所述分离的rAAV颗粒。
78.一种制备分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括：
(i)提供包含第一核酸的宿主细胞，所述第一核酸包含编码α-葡糖苷酶(GAL)蛋白的转基因；
(ii)将编码AAV衣壳蛋白的第二核酸导入所述宿主细胞中，其中所述衣壳蛋白包含SEQID NO:45的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列；以及
(iii)在适于将所述转基因包封在所述AAV衣壳蛋白中的条件下温育所述宿主细胞；从而制备所述分离的rAAV颗粒。
79.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或细菌细胞。
80.一种药物组合物，包含根据权利要求1至51中任一项所述的rAAV颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
81.一种将外源GAL蛋白递送至受试者的方法，包括施用有效量的根据权利要求79所述的药物组合物或根据权利要求1至51中任一项所述的分离的rAAV颗粒，从而将所述外源GAL递送至所述受试者。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者患有GAL相关疾病、已经被诊断患有GAL相关疾病或处于患有GAL相关疾病的风险中。
83.根据实施方案81或82所述的方法，其中所述GAL相关疾病是溶酶体贮积病。
84.一种治疗患有或经诊断患有GAL相关疾病的受试者的方法，包括施用有效量的根据权利要求80所述的药物组合物或根据权利要求1至51中任一项所述的分离的rAAV颗粒，从而治疗所述受试者的所述GAL相关疾病。
85.一种治疗患有或经诊断患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括施用有效量的根据权利要求80所述的药物组合物或根据权利要求1至51中任一项所述的分离的rAAV颗粒，从而治疗所述受试者的所述溶酶体贮积病。
86.根据权利要求82至85中任一项所述的方法，其中所述GAL相关疾病或所述溶酶体贮积病是法布里病。
87.一种分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，包含AAV病毒基因组和衣壳蛋白，所述AAV病毒基因组包含SEQ ID NO:31-41和51-61中任一者的核酸序列或由其组成，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
88.一种分离的重组病毒基因组，包含SEQ ID NO:31-41和51-61中任一者的核酸序列或由其组成。
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