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CN118421568B - 一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用 - Google Patents

一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用 Download PDF

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CN118421568B CN202410875287.6A CN202410875287A CN118421568B CN 118421568 B CN118421568 B CN 118421568B CN 202410875287 A CN202410875287 A CN 202410875287A CN 118421568 B CN118421568 B CN 118421568B
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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用，涉及细胞培养基技术领域。本发明提供的iPSCs培养基，不含血清，成分明确，批次间可重复性好；规避了使用血清可能导致的异源体排斥和冲突，安全性高。小分子添加剂无毒副作用，保证了后续应用的安全性；搭配合理，各成分间协同作用，能提供各类细胞来源的iPSCs生长增殖所需的营养环境，普适性好；而且上述小分子化合物价格低廉，能够替代原有培养基中大多数价格昂贵的添加剂，大大降低了iPSCs的培养成本。上述培养基更适合iPSCs细胞增殖与克隆克隆性，而且培养的iPSCs细胞也表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，具有可观的经济效益和应用前景。

Description

一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养基技术领域，尤其涉及一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用。
背景技术
诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）最初是通过将四个转录因子的组合（OCT4、KLF4、SOX2、c-Myc, OSKM）转入到分化的体细胞中，使其重编程而得到。此后，iPSCs已从多种细胞类型和多个物种中获得，表明了这是一种普遍的分子机制。iPSCs不仅具有胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）的多能性，而且来源丰富，对再生医学来说，有着不可估量的潜在价值。因此，越来越多的研究者使用 iPSCs来模拟身体组织、器官和其他系统的发育；不仅如此，还可以通过对患者样本的重新编程，进行疾病建模；此外，人类 iPSCs 也已经成为新的细胞疗法和药物发现的基础，并已达到临床应用。
相关技术中，大多数的诱导性多能干细胞（iPSCs）的培养体系中含有血清，例如胎牛血清（FBS）。作为细胞培养中最常用的添加剂，血清提供了细胞在体外培养（增殖、分化等）所必需的蛋白、营养素、激素和生长因子等等。然而，血清的成分复杂，整个组成在很大程度上还未知，而且批次之间存在着显著差异，成分不确定性以及批次间差异很容易导致可重复性的下降。不仅如此，含有血清的培养基无法规避动物血清中的异源体，而使用动物血清培养的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突；而且，即便经过过滤、筛选等，血清中仍然有可能存在潜在的感染性病原体，例如极小的病毒或朊病毒等，从而使其安全性下降，最终也使得iPSCs在临床上的应用价值和安全性大大降低。
为了规避这些问题，已经研发出用于iPSCs的无血清培养基，例如包含血清替代物（KOSR）的无血清培养基。然而，该体系成分仍然不完全明确，依然具有含胎牛血清培养基的一些缺点（例如批次之间的可变性），而且有报道指出其培养的细胞还存在细胞增殖速度慢等问题。不仅如此，血清替代物例如人血小板裂解液（HPL）还存在着可用性不足以及供体之间疾病传播的可能性，仍然存在争议。另一种策略是采用完全化学添加剂的培养基培养iPSCs，虽然该培养基在大多数情况下无异源细胞，但满足iPSCs正常培养所需的添加剂组合非常昂贵，大大限制了其在临床应用的潜在价值，而且不同的添加剂组合通常只适用于特定的细胞类型。
因此，提供一种无血清、成分明确、批次差异小、安全性好，且兼具经济价值和临床应用价值的普适性的iPSCs培养基对研究iPSCs机理、药物筛选以及iPSCs的应用显得尤为重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种诱导性多能干细胞的培养基及其应用，旨在提供一种无血清、成分明确、批次差异小、安全性好、普适性好的iPSCs培养基，以解决目前iPSCs培养基中，含血清培养基存在成分不明确、批次间差异显著、存在人体异源体排斥、安全性不足的问题，而化学添加剂培养基存在价格昂贵、普适性差的问题，为iPSCs的转化和临床研究提供有力支持。
本发明第一方面的实施例，提供了一种诱导性多能干细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括黄烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素；所述培养基不含有血清。
根据本发明第一方面实施例的诱导性多能干细胞的培养基，至少具有如下有益效果：本发明提供的诱导性多能干细胞（iPSCs）的培养基，在基础培养基中添加了小分子化合物组合作为添加剂。本发明培养基不含血清，通过添加小分子化合物组合的策略，改善了iPSCs的培养基条件，为血清依赖的iPSCs培养提供了新的思路和策略。上述iPSCs培养基具有以下优势：
（1）不含血清，成分完全明确；避免了血清培养基存在的成分不确定性以及批次间差异，培养基批次间可重复性好；规避了使用血清可能导致的异源体成分引起的排斥和冲突，安全性高，临床的应用价值和潜力大大提升。
（2）与传统血清培养基相比，本发明的无血清iPSCs培养基更适合iPSCs细胞增殖以及细胞的克隆性，同时保持与传统培养基大致相似的微观方面以及细胞大小；而且培养的iPSCs细胞也表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，也更有助于iPSCs细胞培养后产生的各种组织工程替代品的临床转化。
（3）本发明所述的添加剂均为天然存在的小分子化合物，无毒副作用，保证了后续应用的安全性；搭配合理，各成分间协同作用，能提供各类细胞来源的iPSCs生长增殖所需的营养环境，普适性好；而且上述小分子化合物价格低廉，能够替代原有培养基中大多数价格昂贵的添加剂，大大降低了iPSCs的培养成本，为后续iPSCs的产业化应用提供了可能，具有极为可观的经济效益和应用前景。
本发明的上述添加剂中：
黄烷酮，又称2,3-二氢黄酮、2-苯基苯并吡喃-4-酮、2-苯基苯并二氢吡喃-4-酮，英文名Flavanone (2,3-Dihydroflavone, 4-Flavanone, 2-Phenyl-4-chromanone, 2-Phenylchroman-4-one)，分子式C15H12O2，CAS号：487-26-3。黄烷酮具有较强的抗氧化和清除自由基活性，可减少某些慢性疾病的风险、阻滞一些心血管疾病以及某些癌症。黄烷酮还具有抗病毒、抗菌、消炎活性，对毛细管脆性有一定改善效果、抑制人血小板凝聚、抗溃疡、降低过敏反应。黄烷酮可以与丁香酸共同作用，起到清除自由基、防止细胞氧化的功能。
丁香酸，又称NSC 2129、SYRA，英文名Syringic acid，分子式C9H10O5，CAS号：530-57-4。丁香酸是一种有效的抗氧化中草药，是具有潜在的抗血管生成、抗糖基化、抗高血糖、神经保护和增强记忆的活性。可以与黄烷酮共同作用，起到清除自由基、防止细胞氧化的功能。
天麻素，又称天麻苷，英文名Gastrodin (Gastrodine)，分子式C13H18O7，CAS号：62499-27-8。天麻素是一种多元酚（4-羟基苄醇的葡糖苷），是从中草药天麻（Gastrodiaelata）中提取的最重要也是最有效的成分，具有抗炎作用，长期以来一直用于头晕、癫痫、中风和痴呆症的研究。可以与芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
芝麻素，英文名Sesamin (Fagarol)，分子式C20H18O6，CAS号：607-80-7。芝麻素是一种从花椒属（Fagara）植物的树皮和芝麻油中分离出来的木脂素，是多不饱和脂肪酸生物合成中有效且选择性的delta 5去饱和酶抑制剂，对脑缺血具有有效的神经保护作用。可以与天麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
马钱苷，又称马钱子苷、马钱素，英文名Loganin，分子式C17H26O10，CAS号：18524-94-2。马钱苷是山茱萸中的主要环烯醚萜苷类化合物，具有抗炎、抗休克的作用。可以与天麻素、芝麻素、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
黄豆黄素，又称黄豆黄苷、黄豆黄甙、大豆黄苷，英文名Glycitin (Glycitein 7-O-β-glucoside)，分子式C22H22O10，CAS号：40246-10-4。黄豆黄素是一种天然异黄酮，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗衰老和雌激素作用，还可能通过骨髓干细胞（BMSC）中的TGF-β或AKT信号通路调节成骨细胞。可以与天麻素、芝麻素、马钱苷、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
龙胆苦苷，又称龙胆苦甙，英文名Gentiopicroside，分子式C16H20O9，CAS号：20831-76-9。龙胆苦苷是一种天然的环烯醚萜苷，具有抗炎和抗氧化活性。可以与天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
山姜素，英文名Alpinetin，分子式C16H14O4，CAS号：36052-37-6。山姜素是从草豆蔻中分离得到的黄酮类化合物，能够活化 PPAR-γ，具有抗炎活性。可以与天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、羟基积雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
羟基积雪草苷，英文名Madecassoside (Asiaticoside A)，分子式C48H78O20，CAS号：34540-22-2。羟基积雪草苷是一个从积雪草中分离出来的五环三萜，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗自噬的特性。可以与天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
山奈素，英文名Kaempferide (4'-Methylkaempferol, 4'-O-Methylkaempferol,Kaempferol 4'-methylether)，分子式C16H12O6，CAS号：491-54-3。山奈素是一种从山柰根中提取的天然产物，具有多种生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒等活性。可以与天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促进细胞增殖的功能。
本发明提供的无血清iPSCs培养基中，各添加剂搭配合理，成分间协同作用，能提供iPSCs生长增殖所需的营养环境，可以促进iPSCs细胞增殖，更适合细胞的克隆性，而且培养的iPSCs细胞也表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，为iPSCs细胞的临床应用提供有力支持。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计：所述黄烷酮的浓度为0.05~1µM；所述丁香酸的浓度为0.1~1µM；所述天麻素的浓度为0.05~1µM；所述芝麻素的浓度为0.1~2µM；所述马钱苷的浓度为0.05~1µM；所述黄豆黄素的浓度为0.05~1µM；所述龙胆苦苷的浓度为0.05~1µM；所述山姜素的浓度为0.05~1µM；所述羟基积雪草苷的浓度为0.05~1µM；所述山奈素的浓度为0.05~1µM。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计：所述黄烷酮的浓度为0.05~0.2µM；所述丁香酸的浓度为0.1~0.4µM；所述天麻素的浓度为0.05~0.2µM；所述芝麻素的浓度为0.1~1µM；所述马钱苷的浓度为0.05~0.2µM；所述黄豆黄素的浓度为0.05~0.2µM；所述龙胆苦苷的浓度为0.05~0.2µM；所述山姜素的浓度为0.05~0.2µM；所述羟基积雪草苷的浓度为0.05~0.2µM；所述山奈素的浓度为0.05~0.2µM。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述黄烷酮的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约22.425ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述黄烷酮使用DMSO溶解，配成44mg/ml (196.2mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述丁香酸的浓度为0.1~1µM，优选为0.1~0.4µM，更优选为约0.2µM（约39.6ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述丁香酸使用乙醇溶解，配成39mg/ml (196.8mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述天麻素的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约28.6ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述天麻素使用DMSO溶解，配成50mg/ml (174.65mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述芝麻素的浓度为0.1~2µM，优选为0.1~1µM，更优选为约0.5µM（约177ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述芝麻素使用DMSO溶解，配成70mg/ml (197.54mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述马钱苷的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约39ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述马钱苷使用DMSO溶解，配成78mg/ml (199.8mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述黄豆黄素的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约44.64ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述黄豆黄素使用DMSO溶解，配成89mg/ml (199.37mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述龙胆苦苷的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约35.6ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述龙胆苦苷使用DMSO溶解，配成71mg/ml (199.25mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述山姜素的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约27ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述山姜素使用DMSO溶解，配成54mg/ml (199.79mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述羟基积雪草苷的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约97.5ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述羟基积雪草苷使用DMSO溶解，配成100mg/ml(102.55 mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述山奈素的浓度为0.05~1µM，优选为0.05~0.2µM，更优选为约0.1µM（约30ng/ml）。
在本发明的一些实施方式中，所述山奈素使用DMSO溶解，配成60mg/ml (199.82mM)母液，使用时稀释成终浓度。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂还包括支持诱导性多能干细胞生长的以下组分：一种或多种脂类、一种或多种转金属蛋白及转金属蛋白替代物、一种或多种胰岛素及胰岛素替代物、一种或多种微量元素、一种或多种维生素、一种或多种氨基酸、一种或多种受体酪氨酸激酶、一种或多种激素以及一种或多种类激素化合物。
具体的，所述受体酪氨酸激酶包括碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和肝生长因子（HGF）中的至少一种。优选为表皮细胞生长因子。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂包括以下组分：脂质浓缩液、转铁蛋白、结晶牛胰岛素、硒、糖皮质激素、盐酸异丙肾上腺素以及表皮细胞生长因子。
在本发明的一些实施方式中，所述脂质浓缩液（Lipid Concentrate）是浓缩的脂质乳液，其化学成分是确定的，无蛋白添加剂，可用于多种应用，包括 CHO、杂交瘤和昆虫细胞培养物的生长和维持，通过杂交瘤产生单克隆抗体，以及在昆虫细胞中表达病毒。可选用市售的脂质浓缩液，例如10×或20×或50×，使用时稀释成1×。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述转铁蛋白（transferrin）的浓度为1~10µg/ml，优选为5~6µg/ml，更优选为约5.5µg/ml。转铁蛋白是一种糖蛋白，包括含铁离子的转铁蛋白和不含铁离子的转铁蛋白，其中优选的转铁蛋白为含铁离子的转铁蛋白，它能够调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内；另外，它还可以与其他微量元素结合，从而调节iPSCs的生长增殖与功能表达。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述结晶牛胰岛素（crystallized bovine insulin）的浓度为1~20µg/ml，优选为5~15µg/ml，更优选为约10µg/ml。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述硒（selenium）的浓度为5~10ng/ml，优选为6~7ng/ml，更优选为约6.7ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述糖皮质激素的浓度为0.5~1.5µM，优选为0.9~1.2µM，更优选为约1.1µM。
在本发明的一些实施方式中，所述糖皮质激素为氢化可的松（hydrocortisone），又称皮质醇，化学式为C21H30O5，是从肾上腺皮质中提取出的一种有机化合物，对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol hydrochloride）的浓度为0.1~0.5µg/ml，优选为0.2~0.3µg/ml，更优选为约0.212µg/ml。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述表皮细胞生长因子（epidermal growth factor, EGF）的浓度为1~20ng/ml，优选为5~15ng/ml，更优选为约10ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂还包括以下组分：青霉素、庆大霉素。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述青霉素（penicillin）的浓度为约100 U/ml。
在本发明的一些实施方式中，以培养基的终浓度计，所述庆大霉素（gentamicin）的浓度为约25mg/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基包括DMEM (Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium)、MEM (Minimal Essential Medium)、BME (Basal Medium Eagle)、F-12、RPMI 1640、GMEM (Glasgow’s Minimal Essential Medium)中的至少一种。优选的，所述基础培养基为DMEM。基础培养基指人工制备的含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素、脂质等细胞生长所需营养物质的培养品，能够提供iPSCs的生存和最低的生理活动。
在本发明的一些实施方式中，本领域的技术人员已知为了能够有利于细胞的生长，还可以在培养基中添加其它组分。本领域技术人员已知根据所培养的细胞以及其它条件来选择需要在具体培养基中添加的其它组分，例如L-谷氨酰胺、NEAA MEM以及2-巯基乙醇等。
在本发明的一个具体的实施方式中，本发明所述诱导性多能干细胞的培养基包括基础培养基DMEM，以及添加剂黄烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素。更为具体的，所述诱导性多能干细胞的培养基的配方为：DMEM+0.1µM黄烷酮+0.2µM丁香酸+0.1µM天麻素+0.5µM芝麻素+0.1µM马钱苷+0.1µM黄豆黄素+0.1µM龙胆苦苷+0.1µM山姜素+0.1µM羟基积雪草苷+0.1µM山奈素。
在本发明的另一个具体的实施方式中，本发明所述诱导性多能干细胞的培养基包括基础培养基DMEM，以及添加剂黄烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、马钱苷、黄豆黄素、龙胆苦苷、山姜素、羟基积雪草苷、山奈素、脂质浓缩液、转铁蛋白、结晶牛胰岛素、硒、氢化可的松、盐酸异丙肾上腺素、表皮细胞生长因子、青霉素、庆大霉素。更为具体的，所述诱导性多能干细胞的培养基的配方为：DMEM+0.1µM黄烷酮+0.2µM丁香酸+0.1µM天麻素+0.5µM芝麻素+0.1µM马钱苷+0.1µM黄豆黄素+0.1µM龙胆苦苷+0.1µM山姜素+0.1µM羟基积雪草苷+0.1µM山奈素+1×脂质浓缩液+5.5µg/ml转铁蛋白+10µg/ml结晶牛胰岛素6.7ng/ml硒+1.1µMhydrocortisone氢化可的松+0.212µg/ml盐酸异丙肾上腺素+10ng/ml表皮细胞生长因子+100 U/ml青霉素+25mg/ml庆大霉素。
本发明第二方面的实施例，提供了一种上述的诱导性多能干细胞的培养基在培养诱导性多能干细胞中的应用，所述应用为非诊断或治疗目的。
根据本发明第二方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明将上述诱导性多能干细胞（iPSCs）的培养基应用于iPSCs培养中，首先降低了细胞的培养成本，为后续iPSCs的产业化应用提供了可能。而且培养基不含血清，成分完全明确，避免了血清培养基存在的成分不确定性以及批次间差异，培养基批次间可重复性好，规避了使用血清可能导致的异源体成分引起的排斥和冲突，安全性高，为转化和临床研究提供更高的安全性，为iPSCs的临床应用打下了基础。不仅如此，上述培养基应用于iPSCs培养中，可以促进iPSCs细胞增殖，更适合细胞的克隆性，而且培养的iPSCs细胞也表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，也更有助于iPSCs细胞培养后产生的各种组织工程替代品的临床转化。上述天然小分子添加剂策略也为改善体外iPSCs培养的条件提供了另一种思路：通过不同的培养条件，包括天然小分子添加剂、细胞因子组合、共刺激分子和各种基因工程细胞等，改善iPSCs的扩增以及功能。
本发明第三方面的实施例，提供了一种诱导性多能干细胞，采用上述的诱导性多能干细胞的培养基培养得到。
根据本发明第三方面实施例的诱导性多能干细胞，至少具有如下有益效果：本发明的诱导性多能干细胞（iPSCs），培养基中不含血清，成分完全明确，规避了使用血清可能导致的异源体成分引起的排斥和冲突，安全性高，为后续的iPSCs临床应用打下了基础。而且iPSCs细胞增殖更快，细胞的克隆性更好，表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，更适合于iPSCs细胞培养后生产临床应用的细胞或组织替代品。
本发明第四方面的实施例，提供了一种诱导性多能干细胞的培养方法，包括步骤：
(i) 将一种或多种干细胞多能性因子导入体细胞；
(ii) 采用上述的诱导性多能干细胞的培养基诱导培养(i)中导入干细胞多能性因子的体细胞，获得诱导细胞；
(iii) 检测并分析(ii)中所述诱导细胞的多能性；
(iv) 挑出具有多能性的所述诱导细胞的单克隆；
(v) 采用上述的诱导性多能干细胞的培养基培养(iv)中挑出的单克隆，得到所述诱导性多能干细胞。
根据本发明第四方面实施例的诱导性多能干细胞的培养方法，至少具有如下有益效果：本发明提供的诱导性多能干细胞的培养方法，简单方便，对技术人员依赖性更低；细胞的培养成本更低，为后续iPSCs的产业化应用提供了可能。不仅如此，上述方法培养的iPSCs，细胞增殖更快，细胞的克隆性更好，同时细胞可以保持与传统培养方法大致相似的微观方面、细胞大小和代谢；而且培养的iPSCs细胞也表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好，也更有助于iPSCs细胞培养后产生的各种组织工程替代品的临床转化。
在本发明的一些实施方式中，术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期（在小鼠中具体为受精后3.5天）之后的胎鼠或成鼠取材， 取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源（如精原干细胞、生殖嵴干细胞等）。本发明中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠。本发明中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞或上皮细胞。
在本发明的一些实施方式中，术语“诱导”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性 干细胞。其中，干细胞多能性因子指能将分化细胞回复为多能性状态的因子，多为核转录因子，包括但不仅限于：SOX2、OCT3/4、KIF4、NONOG、LIN28、c-Myc、lin28、esrrb、tbx3、VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Forskolin、DZNep、TTNPB或其组合。
在本发明的一些实施方式中，所述干细胞多能性因子包括VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Forskolin、DZNep、TTNPB的组合。
在本发明的一些实施方式中，将干细胞多能性因子导入体细胞的方法可以是本领域技术 人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电转、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。
在本发明的一些实施方式中，检测并分析细胞的多能性的方法是本领域技术人员熟知的，包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。
本发明第六方面的实施例，提供了一种上述的诱导性多能干细胞或者上述的培养方法培养得到的诱导性多能干细胞在构建疾病模型、新药筛选、制备治疗神经系统疾病或心血管系统疾病的药物中的应用，所述应用为非诊断或治疗目的。
根据本发明第六方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明获得的iPSCs，具有前文所述的技术效果，将上述iPSCs应用于构建疾病模型、新药筛选、制备治疗神经系统疾病或心血管系统疾病的药物等各方面，不仅具有iPSCs的自身优势（例如具有胚胎干细胞的多能性、来源丰富、不涉及人类伦理问题等等），而且不引入异源体，安全性更好，对临床应用、再生医学等领域来说，有着不可估量的潜在价值。而且，细胞培养成本更低，增殖更快，活性更好，在经济效益和产业化应用方面拥有极其明显的优势。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
图1（A）是本发明实施例提供的尿液（UE）细胞来源的iPSCs细胞的微观细胞形态示意图；
图1（B）是本发明实施例提供的毛囊（HF）细胞来源的iPSCs细胞的微观细胞形态示意图；
图1（C）是本发明实施例提供的皮肤（SF）细胞来源的iPSCs细胞的微观细胞形态示意图；
图2是本发明实施例提供的iPSCs细胞的大小直径测量结果示意图；
图3是本发明实施例提供的iPSCs细胞的倍增时间测量结果示意图；
图4是本发明实施例提供的iPSCs细胞的克隆原性评估结果示意图；
图5是本发明实施例提供的iPSCs细胞的细胞外酸化率（ECAR）评价结果示意图；
图6是本发明实施例提供的iPSCs细胞的线粒体呼吸的耗氧率（OCR）评价结果示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
本发明的描述中，除非另有说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。除非另有说明，各个反应或操作步骤可以按照顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本发明中的反应方法是按照顺序进行的。
以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中，所有细胞材料均取自深圳市第二人民医院，皮肤组织取自因肿瘤手术或包皮环切手术获得的皮肤组织样本，毛发拔取自于干细胞实验室的工作人员，尿液取自于干细胞实验室的工作人员，所有捐献者均签署了《体液、组织、细胞捐献知情同意书》，且取材过程符合相关伦理学规定。
实施例1 一种无血清iPSCs培养基
本实施例的无血清iPSCs培养基包括基础培养基和添加剂。
基础培养基为DMEM，购自GIBCO品牌。
所述添加剂的成分以终浓度计，包括：0.1µM黄烷酮+0.2µM丁香酸+0.1µM天麻素+0.5µM芝麻素+0.1µM马钱苷+0.1µM黄豆黄素+0.1µM龙胆苦苷+0.1µM山姜素+0.1µM羟基积雪草苷+0.1µM山奈素+1×脂质浓缩液+5.5µg/ml转铁蛋白+10µg/ml结晶牛胰岛素6.7ng/ml硒+1.1µM 氢化可的松（hydrocortisone）+0.212µg/ml盐酸异丙肾上腺素+10ng/ml表皮细胞生长因子+100 U/ml青霉素+25mg/ml庆大霉素。
其中，添加剂购买信息如下（若无特别说明，下同）：黄烷酮购自MCE品牌，货号CASNo. :487-26-3；丁香酸购自MCE品牌，货号CAS No. :530-57-4；天麻素购自MCE品牌，货号CAS No. :62499-27-8；芝麻素购自MCE品牌，货号CAS No. :607-80-7；马钱苷购自MCE品牌，货号CAS No. :18524-94-2；黄豆黄素购自MCE品牌，货号CAS No. :40957-83-3；龙胆苦苷购自MCE品牌，货号CAS No. :20831-76-9；山姜素购自MCE品牌，货号CAS No. :36052-37-6；羟基积雪草苷购自MCE品牌，货号CAS No. :34540-22-2；山奈素购自MCE品牌，货号CAS No. :491-54-3；1×脂质浓缩液购自GIBCO品牌，货号：11905031；转铁蛋白购自Aladdin品牌，货号T302200-10mg；结晶牛胰岛素购自YuanYe品牌，货号S12033-1g；硒购自Aladdin品牌，货号S105199-5g；氢化可的松购自Aladdin品牌，货号H657409-5g；盐酸异丙肾上腺素购自Aladdin品牌，货号I129810-5g；表皮细胞生长因子购自Sigma-Aldrich品牌，货号E9644-.5MG；青霉素购自Aladdin品牌，货号P113151-20ml；庆大霉素购自YuanYe品牌，货号R20013-10ml。
实施例2 一种无血清iPSCs培养基
本实施例的无血清iPSCs培养基包括基础培养基和添加剂。
基础培养基为DMEM，购自GIBCO品牌。
所述添加剂的成分以终浓度计，包括：0.05µM黄烷酮+0.1µM丁香酸+0.05µM天麻素+0.1µM芝麻素+0.05µM马钱苷+0.05µM黄豆黄素+0.05µM龙胆苦苷+0.05µM山姜素+0.05µM羟基积雪草苷+0.05µM山奈素+1×脂质浓缩液+5µg/ml转铁蛋白+5µg/ml结晶牛胰岛素6ng/ml硒+0.9µM氢化可的松（hydrocortisone）+0.2µg/ml盐酸异丙肾上腺素+5ng/ml表皮细胞生长因子+100 U/ml青霉素+25mg/ml庆大霉素。
实施例3 一种无血清iPSCs培养基
本实施例的无血清iPSCs培养基包括基础培养基和添加剂。
基础培养基为DMEM，购自GIBCO品牌。
所述添加剂的成分以终浓度计，包括：0.2µM黄烷酮+0.4µM丁香酸+0.2µM天麻素+1µM芝麻素+0.2µM马钱苷+0.2µM黄豆黄素+0.2µM龙胆苦苷+0.2µM山姜素+0.2µM羟基积雪草苷+0.2µM山奈素+1×脂质浓缩液+6µg/ml转铁蛋白+15µg/ml结晶牛胰岛素+7ng/ml硒+1.2µM氢化可的松（hydrocortisone）+0.3µg/ml盐酸异丙肾上腺素+15ng/ml表皮细胞生长因子+100 U/ml青霉素+25mg/ml庆大霉素。
实施例4 尿液（UE）细胞来源的iPSCs
1、尿液（UE）来源细胞制备
收集正常成年人尿液，将尿液转移到50ml离心管里，400g离心10分钟，吸弃上清，每管留下1~5ml，混合到一个离心管里，加入含有青/链霉素的PBS（PBS 95ml加入5ml青/链霉素混匀）约10~30ml，轻轻混匀。400g离心10分钟，吸弃上清至剩余0.5~1ml液体，加入DMEM/F12重悬混匀，转移至在37℃、5% CO2培养箱中放置20分钟的六孔板中（六孔板已包被0.1%明胶），将六孔板放置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养3天后，取出观察，若培养基污染则弃去，若培养基正常，加入1ml培养基，继续静置培养。
2、iPSCs培养
通过电转VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Forskolin、DZNep、TTNPB这七种化合物组合的方法诱导UE细胞重编程iPSCs细胞，诱导方法参见本领域专业文献，利用实施例1的无血清iPSCs培养基进行诱导培养。培养板采用Matrigel包被（培养板置于37℃、5% CO2二氧化碳培养箱中包被至少30分钟），将细胞摇匀后37℃、置于5% CO2二氧化碳培养箱培养，每日观察并换液，一般传代后3~4天，细胞密度约70%左右即可传代，过晚传代细胞密度过大，克隆过大，易发生分化，故即使细胞密度不高，一般5~7天也要进行传代。检测并分析获得细胞的多能性，挑出具有多能性的单克隆并继续培养，获得重编程iPSCs 细胞。
采用本实施例的方法诱导得到的UE细胞重编程iPSCs细胞，整个过程不使用饲养层细胞、不使用病毒载体、并采用本发明成分确定的无血清培养基（Serum-free medium，简称为SFM）培养，这样的人iPSCs 细胞无外源基因整合且具有多能性。
实施例5毛囊（HF）细胞来源的iPSCs
1、毛囊（HF）来源细胞制备
选择正常成年人脑后头发或眉毛作为毛发来源，将头发贴根部剪去至仅留1cm左右发根，75%酒精消毒10分钟，用清洁眉镊快速将发根拔出，置PBS中漂洗后种入基质胶预先包被的培养皿中，所用培养液为含1% B27、10ng/ml bFGF和50ng/ml EGF的DMEM/F12。1周后观察毛发生长情况。以后每3~4天换液一次。
2、iPSCs培养
通过电转VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Forskolin、DZNep、TTNPB这七种化合物组合的方法诱导HF细胞重编程iPSCs细胞，诱导方法参见本领域专业文献，利用实施例2的无血清iPSCs培养基进行诱导培养。培养板采用Matrigel包被（培养板置于37℃、5% CO2二氧化碳培养箱中包被至少30分钟），将细胞摇匀后37℃、置于5% CO2二氧化碳培养箱培养，每日观察并换液，一般传代后3~4天，细胞密度约70%左右即可传代，过晚传代细胞密度过大，克隆过大，易发生分化，故即使细胞密度不高，一般5~7天也要进行传代。检测并分析获得细胞的多能性，挑出具有多能性的单克隆并继续培养，获得重编程iPSCs 细胞。
采用本实施例的方法诱导得到的HF细胞重编程iPSCs细胞，整个过程不使用饲养层细胞、不使用病毒载体、并采用本发明成分确定的无血清培养基（Serum-free medium，简称为SFM）培养，这样的人iPSCs 细胞无外源基因整合且具有多能性。
实施例6皮肤（SF）细胞来源的iPSCs
1、皮肤（SF）来源细胞制备
本实施例采用的成纤维细胞来自手术皮肤成纤维细胞。手术过程中取腹部2cm*2cm大小组织一块，置于4℃含双抗的PBS或者生理盐水中运输，含双抗PBS充分洗涤去除血液后，尽量去除皮下组织，将皮条以0.2%胶原酶完全覆盖并以保鲜膜密封，4℃消化过夜（12~16小时），从12小时起每小时观察消化情况，检测标准以能用眼科镊能轻轻揭下表皮为度，记录消化时间。完成消化后的标本在无菌室弃消化液，用含10%胎牛血清的DMEM漂洗2次，终止消化。用眼科镊轻轻揭下表皮，用眼科剪将真皮剪成1mm*1mm大小的小块。加入0.2% 的胶原酶浸没组织，37℃消化1~4小时或更长时间，至组织块基本消散开，看不到明显组织块为度；加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化，100μm滤膜过滤去掉残余组织块，滤液以1000rpm离心5分钟洗脱两次后用培养液调定密度为2*105接种，37℃、5% CO2湿度培养箱培养。以后每2~3天换液一次，并观察细胞贴壁生长情况，待细胞长满80~90%左右汇和度时以胰酶消化法传代。
2、iPSCs培养
通过电转VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Forskolin、DZNep、TTNPB这七种化合物组合的方法诱导SF细胞重编程iPSCs细胞，诱导方法参见本领域专业文献，利用实施例3的无血清iPSCs培养基进行诱导培养。培养板采用Matrigel包被（培养板置于37℃、5% CO2二氧化碳培养箱中包被至少30分钟），将细胞摇匀后37℃、置于5% CO2二氧化碳培养箱培养，每日观察并换液，一般传代后3~4天，细胞密度约70%左右即可传代，过晚传代细胞密度过大，克隆过大，易发生分化，故即使细胞密度不高，一般5~7天也要进行传代。检测并分析获得细胞的多能性，挑出具有多能性的单克隆并继续培养，获得重编程iPSCs 细胞。
采用本实施例的方法诱导得到的SF细胞重编程iPSCs细胞，整个过程不使用饲养层细胞、不使用病毒载体、并采用本发明成分确定的无血清培养基（Serum-free medium，简称为SFM）培养，这样的人iPSCs 细胞无外源基因整合且具有多能性。
对比例1
对比例1与实施例4的区别为：培养基不同，对比例1采用经典的胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）诱导培养UE来源的iPSCs细胞。其余均与实施例4一致，在此不再赘述。
其中，胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）配方为：DMEM+5% 胎牛血清（FBS）+24.3µg/ml腺嘌呤（adenine）+5µg/ml结晶牛胰岛素（crystallized bovine insulin）+1.1µM氢化可的松（hydrocortisone）+0.212µg/ml盐酸异丙肾上腺素（isoproterenolhydrochloride）+10ng/ml表皮细胞生长因子（epidermal growth factor）+100 U/ml青霉素（penicillin）+25mg/ml庆大霉素（gentamicin）。
对比例2
对比例2与实施例5的区别为：培养基不同，对比例2采用经典的胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）诱导培养HF来源的iPSCs细胞。其余均与实施例5一致，在此不再赘述。
其中，胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）配方为：DMEM+5% 胎牛血清（FBS）+24.3µg/ml腺嘌呤（adenine）+5µg/ml结晶牛胰岛素（crystallized bovine insulin）+1.1µM氢化可的松（hydrocortisone）+0.212µg/ml盐酸异丙肾上腺素（isoproterenolhydrochloride）+10ng/ml表皮细胞生长因子（epidermal growth factor）+100 U/ml青霉素（penicillin）+25mg/ml庆大霉素（gentamicin）。
对比例3
对比例3与实施例6的区别为：培养基不同，对比例3采用经典的胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）诱导培养SF来源的iPSCs细胞。其余均与实施例6一致，在此不再赘述。
其中，胎牛血清培养基（FBSCM，简称FCM）配方为：DMEM+5% 胎牛血清（FBS）+24.3µg/ml腺嘌呤（adenine）+5µg/ml结晶牛胰岛素（crystallized bovine insulin）+1.1µM氢化可的松（hydrocortisone）+0.212µg/ml盐酸异丙肾上腺素（isoproterenolhydrochloride）+10ng/ml表皮细胞生长因子（epidermal growth factor）+100 U/ml青霉素（penicillin）+25mg/ml庆大霉素（gentamicin）。
测试例1 iPSCs的细胞微观外观评估
在显微镜下观察实施例4-6以及对比例1-3中iPSCs细胞的形态，结果如图1（A）-1（C）所示，其中，图1（A）为尿液（UE）细胞来源的iPSCs，UE（SFM）代表实施例4获得的iPSCs细胞，UE（FCM）代表对比例1获得的iPSCs细胞；图1（B）为毛囊（HF）细胞来源的iPSCs，HF（SFM）代表实施例5获得的iPSCs细胞，HF（FCM）代表对比例2获得的iPSCs细胞；图1（C）为皮肤（SF）细胞来源的iPSCs，SF（SFM）代表实施例6获得的iPSCs细胞，HF（FCM）代表对比例3获得的iPSCs细胞。由图1（A）-1（C）可知，无论在胎牛血清培养基（FCM）中还是无血清培养基（SFM）中，不同来源的iPSCs细胞的形态之间均无显著差异。
测试例2 iPSCs的增殖潜能评估
在将细胞接种在培养皿或培养瓶中之前，使用明胶涂层过夜。之后将实施例4-6以及对比例1-3中iPSCs细胞解冻，以10%的融合度接种于12孔板。连续4天，每天对应更换实施例1-3中培养基（SFM）或对比例的培养基FCM。在第1代（P1）和第2代（P2）的第4天，细胞被胰蛋白酶处理，并为后续的传代接种。每天，从孔中收集细胞，并分别使用库尔特贝克曼Z2系统进行计数，并计算平均细胞大小。使用GraphPadPri−smv.9.2软件进行统计分析。结果用带有标准差的平均值表示。此外，还采用了双向方差分析（ANOVA）来解释数据。
理论上，细胞的增殖潜能与其大小成反比。因此，每天测量实施例4-6以及对比例1-3中细胞大小，结果以曲线表示。结果如图2所示，其中，UE、HF、SF分别代表UE、HF、SF来源的iPSCs细胞，SFM、FCM分别代表利用相应的无血清培养基（SFM）或胎牛血清培养基（FCM）培养细胞；A代表实施例5（SFM）、对比例2（FCM）中iPSCs细胞大小，B代表实施例4（SFM）、对比例1（FCM）中iPSCs细胞大小，C代表实施例6（SFM）、对比例3（FCM）中iPSCs细胞大小。观察到P1代、P2代、P3代的iPSCs细胞的大小直径变化没有显著差异，曲线大致重叠。
测试例3 iPSCs的倍增时间测量
细胞培养同测试例2，采用增殖曲线计算倍增时间。使用GraphPadPri−smv.9.2软件进行统计分析。结果用带有标准差的平均值表示。此外，还采用了双向方差分析（ANOVA）来解释数据。
结果如图3所示，其中，UE、HF、SF分别代表UE、HF、SF来源的iPSCs细胞，SFM、FCM分别代表利用相应的无血清培养基（SFM）或胎牛血清培养基（FCM）培养细胞；A代表实施例5（SFM）、对比例2（FCM）中iPSCs细胞倍增时间，B代表实施例4（SFM）、对比例1（FCM）中iPSCs细胞倍增时间，C代表实施例6（SFM）、对比例3（FCM）中iPSCs细胞倍增时间。与对比例中SFM相比，HF、UE来源的iPSCs细胞在FCM中培养的P1代iPSCs倍增时间相对较高，而P3代在SFM培养条件下时间延长；而SF来源的iPSCs细胞在SFM中培养倍增时间始终较高。对于iPSCs细胞而言，FCM与SFM培养下相比较，经过3代细胞培养，代次之间未观察到高度的变异性（N = 3）。
测试例4 iPSCs的克隆原性评估
分别将实施例4、5中UE、HF来源的iPSCs细胞以密度为1.3×105接种在25cm2的培养瓶中。培养基在第5天更换一次。第10天，细胞用3.7%的甲醛固定，之后细胞用Nile blue A/rhodamine 混合物染色15min，然后用自来水冲洗3次，培养瓶在室温下风干。然后直接在培养瓶中仔细地计算菌落形成单位（CFU）。接下来，为了加强评估和消除观察者的偏差，评估使用了扫描仪，使用Typhoon trio+扫描仪对培养瓶进行扫描，使用ImageJ软件评估染色区域。使用GraphPadPri−smv.9.2软件进行统计分析。结果用带有标准差的平均值表示。此外，还采用了双向方差分析（ANOVA）来解释数据。数据以计数CFU/25cm2的计数和扫描的染色/表面（AU）表示。
结果如图4所示，其中，UE、HF分别代表UE、HF来源的iPSCs细胞，SFM、FCM分别代表利用相应的无血清培养基（SFM）或胎牛血清培养基（FCM）培养细胞；A、B分别代表实施例5（SFM）、对比例2（FCM）中iPSCs细胞克隆数量（A）与染色结果（B），C、D分别代表实施例4（SFM）、对比例1（FCM）中iPSCs细胞克隆数量（C）与染色结果（D）。由图4可知，在3代iPSCs细胞培养过程中，SFM比FCM培养产生了更多的CFU（图4）。
测试例5 iPSCs的代谢评价
将iPSCs细胞（在100µl细胞培养基/孔中培养200,000 cell/cm2）接种于XFe96 96孔板中。在进行分析之前，细胞与相应的培养基（FCM或SFM）孵育三天。Seahorse XFe96传感器盒板在分析前一天用XF校准水合，并在37℃孵育过夜。在测量能量代谢之前，细胞使用培养基洗涤并孵育1小时。使用XFe细胞外通量分析仪测定代表糖酵解代谢的细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）和代表线粒体呼吸的耗氧率（OxygenConsumption Rate, OCR）。每次注射的浓度代表了孔中的最终浓度。
线粒体呼吸是由顺序注射1.5µM ATP synthase inhibitor oligomycin, 0.5µMFCCP, 0.5µM of a combination of the mitochondrial complex I inhibitorrotenone, 0.5µM mitochondrial complex III inhibitor antimycin A。
糖酵解代谢是由顺序注射10mM D-(+)-glucose, 1.5µM of the ATP synthaseinhibitor oligomycin (67.5% oligomycin A complex), 50mM 2-deoxy-D-glucose (2-DG)。
每次注射前后至少完成三个测量周期（3分钟混合+3分钟测量）。使用Wave软件v2.6计算氧消耗率（OCR）和细胞外酸化（ECAR）。使用CyQuant细胞增殖检测试剂盒，根据细胞数量进行归一化。使用Victor2 1420多标签计数板阅读器和Wallac1420软件在485 nm/535 nm下测量0.1秒的荧光。归一化值由Microsoft Excel软件的荧光测量值计算，并应用于代谢值。
使用Seahorse XFe96细胞外通量分析仪评估细胞代谢。使用CyQuant细胞增殖检测试剂盒，根据细胞数量对能量代谢值进行归一化处理。
使用GraphPadPri−smv.9.2软件进行统计分析。结果用带有标准差的平均值表示。此外，还采用了双向方差分析（ANOVA）来解释数据。
结果如图5-6所示，其中，UE、HF、SF分别代表UE、HF、SF来源的iPSCs细胞，SFM、FCM分别代表利用相应的无血清培养基（SFM）或胎牛血清培养基（FCM）培养细胞；图5中A代表实施例5（SFM）、对比例2（FCM）中iPSCs细胞的细胞外酸化率，图5中B代表实施例4（SFM）、对比例1（FCM）中iPSCs细胞的细胞外酸化率，图5中C代表实施例6（SFM）、对比例3（FCM）中iPSCs细胞的细胞外酸化率；图6中A代表实施例5（SFM）、对比例2（FCM）中iPSCs细胞的线粒体呼吸的耗氧率，图6中B代表实施例4（SFM）、对比例1（FCM）中iPSCs细胞的线粒体呼吸的耗氧率，图6中C代表实施例6（SFM）、对比例3（FCM）中iPSCs细胞的线粒体呼吸的耗氧率。
由图5-6可知，相比之下，当iPSCs细胞在SFM中培养时，其最大耗氧率（OCR）明显高于FCM（图5）。与FCM相比，SFM的ECAR基础值和ECAR最大值有增加的趋势（图6）。
综上所述，本发明评估了无血清培养基（SFM）在iPSCs细胞培养中的适用性，通过与使用经典胎牛血清培养基（FCM）的条件进行比较，评估了iPSCs细胞特征，包括显微形态、细胞大小、倍增时间、克隆原性、糖酵解和线粒体代谢。结果表明，SFM培养更适合iPSCs细胞增殖与克隆，同时保持了与FCM培养相似的形态和细胞大小。不仅如此，与FCM条件相比，SFM条件下的iPSCs细胞也显示出更大的线粒体呼吸，表现出更显著的线粒体代谢，细胞活性更好。最终，本发明SFM克服了细胞培养中使用血清时遇到的问题及障碍，更适合于生产临床应用的细胞或组织替代品，其安全性和明确的成分将有助于iPSCs细胞培养后产生的各种组织工程替代品的临床转化。
以上是对本申请的较佳实施进行了具体说明，但本申请并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本申请精神的前提下还可作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (1)

1.一种诱导性多能干细胞的培养基在培养诱导性多能干细胞中的应用，其特征在于，所述培养基包括基础培养基DMEM和添加剂；所述添加剂包括0.05~0.2µM黄烷酮、0.1~0.4µM丁香酸、0.05~0.2µM天麻素、0.1~1µM芝麻素、0.05~0.2µM马钱苷、0.05~0.2µM黄豆黄素、0.05~0.2µM龙胆苦苷、0.05~0.2µM山姜素、0.05~0.2µM羟基积雪草苷、0.05~0.2µM山奈素；所述添加剂还包括1×脂质浓缩液、5~6μg/ml转铁蛋白、5~15μg/ml结晶牛胰岛素、6~7ng/ml硒、0.9~1.2μM氢化可的松、0.2~0.3μg/ml盐酸异丙肾上腺素、5~15ng/ml表皮细胞生长因子、100U/ml青霉素、25mg/ml庆大霉素；所述培养基不含有血清，所述应用为非诊断或治疗目的。
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