CN118421496A - 一种具有预防结肠炎和缓解便秘功效的鼠李糖乳酪杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明一种具有预防结肠炎和缓解便秘功效的鼠李糖乳酪杆菌，其保藏号为CGMCC NO.27364。本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌可以改善DSS诱导引起的小鼠体重下降，降低小鼠疾病活动指数，改善小鼠结肠缩短，缓解结肠组织损伤。该菌株同时还具有提高小鼠粪便含水率，促进小肠推动率，缓解小肠绒毛及结肠黏膜损伤。
Description
技术领域
本发明属于益生菌筛选应用技术领域，具体涉及一种具有预防结肠炎和缓解便秘功效的鼠李糖乳酪杆菌。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种炎症性肠病，其发生病变的部位主要是直肠基底或部分直肠，由于该病病因不明、无特效疗法，因此对它缺乏有效预防手段。UC的传统治疗药物包括氨基水杨酸类、激素类、抗生素和免疫抑制类等四类药物，然而这些药物停药后容易复发，且副作用显著，从而限制了它们在临床上的使用。
随着人们生活水平的不断提高，饮食结构的改变，便秘逐步成为影响人们生活质量的重要因素之一。目前针对便秘的治疗主要采用药物治疗、生物反馈疗法、改变饮食习惯和生活方式、肠道微生态治疗这四种方法，但药物疗法导致不良反应、生物反馈疗法适用群受限、健康生活方式难以维持，因此肠道微生态治疗成为当前便秘治疗的热门研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供具有预防结肠炎和缓解便秘功效的鼠李糖乳酪杆菌，从而预防结肠炎发生和缓解便秘。
本发明所提供鼠李糖乳酪杆菌(Lactobacillus rhamnosus，简称LGG)AFY03株为结肠炎和便秘的缓解菌株，AFY03株的保藏编号为CGMCCNo.27364，保藏日期为2023年05月17日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的菌株用于预防结肠炎和缓解便秘。
本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌AFY03株可用于制备用于预防和治疗结肠炎病和便秘的制品。
所述的鼠李糖乳酪杆菌AFY03株，其培养温度优选为37℃。
本发明所筛选获得的鼠李糖乳酪杆菌AFY03株经小鼠模型试验证实可缓解由DSS诱导引起的小鼠结肠炎和冰水活性炭诱导的小鼠便秘；使用该菌株可显著降低模型小鼠结肠炎和便秘的发病率。
附图说明
图1：鼠李糖乳酪杆菌AFY03对结肠炎小鼠体重的影响图；
图2：鼠李糖乳酪杆菌AFY03对疾病活动指数的影响图；
图3：鼠李糖乳酪杆菌AFY03对结肠炎小鼠结肠长度的影响图；
图4：鼠李糖乳酪杆菌AFY03对结肠炎小鼠结肠组织病理学形态的影响图；
图5：小鼠基础机体指标变化情况图；
图6：各组小鼠实验过程中的粪便含水率图；
图7：各组小鼠首粒红便排出时间图；
图8：各组小鼠小肠长度和小肠推进率图；
图9：小肠组织病理学形态图；
图10：结肠组织病理学形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：菌株的分离、纯化
采自新疆阿勒泰地区自然发酵酸奶，吸取40mL自然发酵酸奶放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。
1.乳酸菌的分离与鉴定
1.1乳酸菌的分离纯化
分别取1mL自然发酵酸奶样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后取10-4、10-5、10-6 3个梯度的菌液100菌液进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。
1.2乳酸菌DNA提取
将已纯的疑似目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。将提取完成的DNA做好编号，放于-20℃冰柜保藏备用。
1.4基因组DNA PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
提取完的DNA进行PCR扩增，其中上游引物27F(5'－AGA GTT TGA TCC TGGCTCAG－3')1'、下游引物1495R(5'－CTA CGG CTA CCTTGT TAC GA－3')1A ，2A CGG CTACCTTGT TAC GA此、模板DNA 1G，用无菌dd H2O将体系补足至25补足。并以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。
然后取5取i扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110V，45min。将检测成功的PCR产物送往北京擎科生物技术有限公司进行测序，测序成功的序列使用NCBI中的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序进行比对分析，确定所筛选的菌株为鼠李糖乳酪杆菌。
将筛选的菌株命名为鼠李糖乳酪杆菌AFY03株进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.27364，保藏日期为2023年05月17日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2：鼠李糖乳酪杆菌AFY03株对小鼠结肠炎的影响
动物实验设计如表1所示：40只6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重为(20±3g)，小鼠适应性喂养1周，适应期内所有组均给予正常饮水与饲料，适应期结束分为4组(n＝10)，即正常组、模型组、SASP组、AFY03组。适应性喂养结束后，除正常组，其余三组小鼠连续自由饮用7天2％DSS水，SASP组每日灌胃100mg/kg柳氮磺胺吡啶，AFY03组每日灌胃109CFU/kg鼠李糖乳酪杆菌AFY03。28天后，将小鼠禁食不禁水12h后解剖小鼠，眼眶静脉采血后脱颈处死并进行解剖，收集血样，解剖小鼠并收集结肠组织(盲肠至肛门)并测量长度。其中小鼠的结肠组织取一部分(0.5cm)于4％多聚甲醛固定液里用于组织病理学分析，剩余部分存放于-80℃并用于结肠组织相关基因及细胞因子表达分析。
表2：动物实验设计方案表
2.1鼠李糖乳酪杆菌AFY03株小鼠体重变化的影响
适应性喂养结束后，在0-7天内，每日测量小鼠体质量，在8-21天内，每隔一天测一次小鼠体质量，记录并观察变化。
实验期间，小鼠体重变化如图1所示，与正常组作比较，模型组其体重显著降低(P<0.05)；SASP和AFY03两个组相较于模型组，在早期的时候都有一定程度的体重减轻，但是随着SASP与鼠李糖乳酪杆菌AFY03治疗的作用下与模型组相比，在第七天体重开始回升，模型组第10天体重有所回升，但效果不如AFY03组。证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03显著改善了DSS诱导引起的体重下降。
2.2鼠李糖乳酪杆菌AFY03株对疾病活动指数的影响
实验期间，每两天进行一次DAI评分。粪便隐血情况采灵敏度高的邻联甲苯胺法测定，具体操作流程按照试剂盒说明书进行。评分细则详见表2。
表2：小鼠DAI评分标准表
由图2所示，模型组的DAI评分在建模后开始增加，在自由饮用2％DSS溶液期间小鼠DAI显著升高，在自由饮用UP水期间有所下降，但评分仍高于其余三组(p<0.05)。而鼠李糖乳酪杆菌AFY03组与模型组相比较，DAI评分显著降低直到实验观察期结束。这一结果证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03显著改善了由DSS诱导引起的小鼠的体重减轻、腹泻和血便。
2.3鼠李糖乳酪杆菌AFY03株对小鼠结肠长度的影响
从图3所示，在不同的组别下，正常组小鼠的结肠最长(8.35cm)，而模型组小鼠最短(5.55cm)，SASP组(6.35cm)和鼠李糖AFY03组(6.65cm)的小鼠结肠长度中等，比模型组小鼠的结肠要长。与模型组作比较，SASP处理和鼠李糖乳酪杆菌AFY03处理显著改善了DSS诱导引起的小鼠结肠缩短(p<0.05)。
2.4鼠李糖乳酪杆菌AFY03株对小鼠结肠组织病理变化的影响
采用H&E染色法制片，显微镜下观察结肠组织病理变化。
通过HE染色法制作结肠组织切片，并在显微镜下观察，如图4所示，正常组小鼠的结肠形态比较好，肠道上皮和隐窝的结构也比较正常，黏膜也是正常的，并且有很多完整的杯状细胞，几乎没有炎症的渗润，无明显组织损伤。观察DSS诱导的结肠炎小鼠(模型组)，结肠上皮细胞损伤不完整，同时隐窝变形或隐窝不完全甚至消失，杯状细胞数量大幅减少并受到损坏，腺体样受损，可见存在炎性细胞的浸润且程度严重。与模型组相比，SASP组肠粘膜组织完整，有较大范围的正常上皮组织，有较小范围的杯状细胞丢失，无其他显著的损害，有破碎的肠道，有少量的炎症细胞，但较模型组没有其他显著的病理学变化。AFY03组的结肠组织中，炎症细胞的渗入很少或者不显著，而肠腺体的数目也基本上是正常的，上皮细胞的形态是正常的，只有很少的杯状细胞发生了变形或者丢失，无明显隐窝损坏或缺失。
在显微镜观察下，模型组出现了极为显著的病理学改变，SASP组出现少量炎症细胞浸润现象，但病理学变化不明显。AFY03组几乎不见炎性细胞浸润，无明显病理学变化。由此证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03对DSS诱导的溃疡性结肠炎引起的结肠组织损伤具有一定的改善作用，能够有效抑制炎症产生。
实施例3：鼠李糖乳酪杆菌AFY03株对小鼠便秘的影响
实验动物处理：4周龄，体重在25±5g之间的雌性昆明小鼠50只饲养于动物房中，其中室温保持25±2℃，相对湿度维持50±5％，每隔12小时调节光/暗周期，给予小鼠标准饲料和饮水，适应性喂养一周后开始实验。适应性喂养结束后，将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为：正常组、便秘组、比沙可啶药物治疗组、鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组和鼠李糖乳酪杆菌AFY03低剂量组。在14天的实验周期内，每天通过灌胃给予正常组和便秘组生理盐水，比沙可啶组每天灌胃比沙可啶溶液(浓度为100mg/kg)，鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组每天灌胃浓度为1×109CFU/kg的菌悬液，低剂量组每天灌胃浓度为1×108CFU/kg的菌悬液；间隔两小时后，除正常组小鼠外，其他4组小鼠每日灌胃冰水活性炭(质量浓度为100g/L，0℃)。实验过程中每日需测定所有小鼠的体质量、摄食量、饮水量、粪便质量、粪便含水率以及进行灌胃操作。第14天灌胃完成之后，所有组小鼠禁食不禁水24h。第15天，所有组小鼠均灌胃0.2mL的红墨汁，30min后每组一半小鼠(5只)眼眶静脉取血后处死，解剖小鼠，取出小肠后，观察并记录红墨汁在小肠中的推进距离，据此计算出小肠推进率。每组剩余5只小鼠观察并记录其首粒红便排出时间后收集血液并解剖。
3.1鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠基础机体指标的影响
鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠基础机体指标的影响如图5所示，随着时间的推移，各组小鼠的体重都有所增加。与实验第一天所测各组小鼠体重相比，正常组、便秘组、比沙可啶组、鼠李糖乳酪杆菌AFY03高、低剂量组的体重在第14天分别增加了17.0％、16.8％、14.5％、12.1％、14.8％，但通过分析发现各组小鼠的体重之间不存在显著性差异(p>0.05)，此外，实验期间各组小鼠的摄食量、饮水量均无显著性差异(p>0.05)。表明鼠李糖乳酪杆菌AFY03和各受试物对小鼠基础机体指标未造成明显影响。
3.2鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠粪便含水率的影响
由图6得，在实验的第1～9天，各组小鼠的粪便含水率无明显差异。在实验进行的第10天，便秘组小鼠的粪便含水率开始明显低于其余四组，到实验的第14天，便秘组小鼠的粪便含水率显著低于正常组(p<0.05)，证明由冰水活性炭诱导的小鼠便秘模型建模成功。虽然冰水活性炭会减弱肠道蠕动能力，但比沙可啶组小鼠的粪便含水率整体变化不大，粪便含水率在58％～63％之间变化，鼠李糖乳酪杆菌AFY03高、低剂量组的小鼠粪便含水率在实验期间虽有所下降，但从第10天开始粪便含水率不断接近比沙可啶组，且经过14天的灌胃后，鼠李糖乳酪杆菌AFY03高、低剂量组以及比沙可啶组的粪便含水率显著性高于便秘组(p<0.05)，其中高剂量组与比沙可啶组的小鼠粪便含水率无显著性差异(p>0.05)，证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组提高小鼠粪便含水率的能力与比沙可啶组大致相同。
3.3鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠首粒红便时间的影响
由图7可得，与正常组相比较，便秘组的首粒红便排出时间增加了59.0％(p<0.05)，再次说明由冰水活性炭诱导的便秘小鼠模型建模成功。与便秘组相比，比沙可啶组、鼠李糖乳酪杆菌AFY03高、低剂量组的小鼠首粒红便排出时间分别提前36.1％、31.4％、13.9％，与便秘组均存在显著性差异(p<0.05)。
3.4鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠小肠推进率的影响
由图8可知，实验所测得各组小鼠小肠长度无显著性差异(p>0.05)，表明由冰水活性炭诱导的小鼠便秘模型不会影响小鼠的小肠长度。通过比较红墨汁在小鼠小肠的推进率，可知便秘组小鼠的红墨汁小肠推进率显著低于正常组(p<0.05)。而给便秘小鼠灌胃鼠李糖乳酪杆菌AFY03后，在同等时间内，其小肠推进速度明显快于便秘组，小肠推进率显著高于便秘组(p<0.05)，证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03可促进小肠蠕动，加快红墨汁在小鼠小肠中的推进速度，起到缓解便秘的作用。
3.5鼠李糖乳酪杆菌AFY03对便秘小鼠小肠和结肠组织形态学的影响
将小肠、结肠在4％多聚甲醛溶液中固定后，再用95％的乙醇进行脱水，然后用二甲苯替换组织中的酒精，使其形成透明的组织，进行石蜡包埋，冷却后经切片机切片，用苏木精－伊红(H&E)染色，即制成小肠、结肠病理切片，在正置显微镜下进行观察。
如图9所示，正常组小鼠小肠绒毛排列整齐，无皱缩，肠壁厚实，杯状细胞分布均匀，而便秘组小肠绒毛破损严重，皱缩现象严重，杯状细胞被破坏。鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组、低剂量组的小鼠小肠绒毛虽然也出现了一定程度上的皱缩和断裂，但相较于便秘组的小肠绒毛更为完整，证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03对于小肠绒毛有一定的改善作用，而且高剂量组小鼠的小肠绒毛的形态与排列方式趋近于比沙可啶组。
如图10可见，正常组小鼠结肠组织形态良好，黏膜上皮和隐窝结构完整，有大量杯状细胞，无炎症细胞浸润现象。便秘组小鼠结肠组织的隐窝缩短，杯状细胞的数量减少，同时存在炎症细胞浸润现象。鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组、低剂量组虽存在少量淋巴细胞聚集，有一定的炎症细胞浸润现象，但鼠李糖乳酪杆菌AFY03高剂量组、低剂量组以及比沙可啶组相较于便秘组结肠形态有所改善，黏膜上皮与隐窝结构完整度与正常组相似，仍可证实鼠李糖乳酪杆菌AFY03可改善结肠黏膜的病理损伤。
Claims (8)
1.一种植物乳酪杆菌，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌的保藏编号为CGMCCNo.27364。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在预防治疗结肠炎或便秘中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备用于预防治疗结肠炎或便秘的制品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为功能性食品、药品或保健品。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为益生菌制剂。
6.一种益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂中包含有权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌的活菌。
7.权利要求5所述的益生菌制剂在制备用于预防治疗结肠炎或便秘的制品中的应用。
8.一种培养权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌的方法，其特征在于，所述的方法是在37℃条件下进行培养。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN119280284A (zh) * | 2024-11-15 | 2025-01-10 | 善恩康生物科技（苏州）有限公司 | 一种能够缓解便秘的鼠李糖乳酪杆菌mbp01及其应用 |
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2023
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