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CN118355128A - 用于捕获测序用文库dna的方法 - Google Patents

用于捕获测序用文库dna的方法 Download PDF

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CN118355128A
CN118355128A CN202280074682.3A CN202280074682A CN118355128A CN 118355128 A CN118355128 A CN 118355128A CN 202280074682 A CN202280074682 A CN 202280074682A CN 118355128 A CN118355128 A CN 118355128A
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CN202280074682.3A
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L·J·克拉夫特
E·M·布拉斯塔德
M·莱萨尔-维格
J·D·布罗丁
R·苏布兰马尼安
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Inmair Ltd
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Inmair Ltd
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Abstract

本公开的实施方案涉及将文库DNA复合物捕获到用于测序的固体载体的图案化表面的方法。本文所述的方法改善了簇的单克隆性以及测序数据质量和读长。

Description

用于捕获测序用文库DNA的方法
技术领域
本公开涉及在用于测序应用(诸如核酸测序)的固体载体的表面上捕获文库DNA的方法。
序列表的参考
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表作为创建于2022年10月17日的名称为Sequence_listing_ILLINC.567WO.xml的文件提供，该文件的大小为21.7KB。该序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。
背景技术
许多当前测序平台使用“边合成边测序”(SBS)技术和基于荧光的检测方法。在一些示例中，在称为接种的过程中，将从文库分离的待测序的许多靶多核苷酸或者模板多核苷酸附接到基底的表面。然后，在称为聚类的过程中，可合成模板多核苷酸的多个拷贝，这些拷贝附接到表面上靠近作为拷贝的模板多核苷酸接种的位置。随后，在以下条件下合成聚类多核苷酸的新生拷贝：当每个核苷酸附接到新生链时，聚类多核苷酸的新生拷贝发射识别每个核苷酸的信号。接种的模板多核苷酸的多个拷贝靠近其最初接种的位置进行聚类使得在可视化聚合期间产生的信号扩增，从而改善检测。
当模板多核苷酸接种尽可能多的可用基底表面时，SBS的接种和聚类效果很好，这可最大化可在测序运行期间获得的测序信息量。一般来说，用于接种和聚类的基底的可用表面积越小，SBS过程的效率可能越低，从而导致用于获得给定文库的给定量的测序信息的时间、反应物、费用增加以及数据处理变得复杂。
模板多核苷酸(文库DNA)的文库一般可包括大量的模板多核苷酸分子，这些模板多核苷酸分子的核苷酸序列彼此不同。如果两个这样的模板多核苷酸在基底的表面(例如，未图案化表面)上接种得太近，则聚类可能会产生拷贝多核苷酸的空间混合群体，其中一些具有接种在附近的模板多核苷酸中的一个的序列，而其他具有在表面上也接种在附近的另一个模板多核苷酸的序列。或者，由彼此靠太近接种的两个不同模板多核苷酸形成的两个簇可能彼此太相邻或彼此邻接，使得在SBS过程中使用的成像系统可能无法将它们区分为单独的簇，即使这些簇之间可能没有或极少有基底附接的序列的空间混合。这种不利条件通常被称为多克隆性。对于含有多个受限隔室或位置的图案化表面(诸如含有被间隙区域分开的多个纳米孔的表面)，多克隆性一般由不同模板多核苷酸在同一受限位置中的多次接种产生，并且随后的扩增过程在同一受限位置中产生拷贝模板多核苷酸的多个混合群体。当来自文库的具有不同序列的模板多核苷酸彼此足够远地接种或附接到表面(例如，未图案化表面)的各个位置，使得聚类产生各自由单个模板多核苷酸的接种产生的拷贝多核苷酸的空间不同簇(这种情况一般称为单克隆性)时，接种和聚类效果也很好。对于图案化表面，单克隆性是指当用单个模板多核苷酸或单个优势模板多核苷酸接种每个隔室或受限区域(例如，纳米孔)时，使得聚类产生同一模板多核苷酸的相同拷贝的单个簇或者在同一隔室或受限位置中产生单个优势簇的情况。多克隆性可能导致文库使用率较低、测序期间噪声信号比较高以及数据质量较低。因此，期望在以下条件下进行SBS：基底表面的尽可能多的可用表面积用于接种和聚类，同时还促进接种的模板多核苷酸的分离，以便尽可能最大化簇的单克隆性并最小化多克隆簇。因此，需要开发新方法来改善聚类过程期间多核苷酸的单克隆性。
发明内容
本公开的一些方面涉及一种用于测序的固体载体，该固体载体具有图案化表面，该图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；
并且
其中捕获部分与聚类寡核苷酸正交，并且每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm，或约20nm至约50nm。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，图案化表面包括多个纳米孔，并且纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的一个文库DNA结合区域。在一些其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是形成捕获位点的图案化表面的纳米孔，或形成捕获位点的平面阵列的表面(例如，未图案化表面)上的捕获垫。
本公开的一些附加方面涉及一种用于测序的固体载体，该固体载体具有图案化表面，该图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，这些辅助结合位点能够通过非共价或共价相互作用与文库DNA结合区域中的捕获部分结合；
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；并且
其中捕获部分与聚类寡核苷酸正交。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，固体载体还包含通过捕获部分附接至文库结合区域的多个文库DNA复合物，其中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被不超过三个文库DNA复合物占据。在进一步的实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被单个文库DNA复合物或仅单个优势文库DNA复合物占据。在一些进一步的实施方案中，文库DNA复合物在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的DNA结合区域中的扩增产生单克隆簇或单个优势簇。在一些实施方案中，由扩增产生的固体载体上的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的簇是单克隆簇。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，每个文库DNA复合物包含支架，其中该数量的辅助结合位点在支架上，并且文库多核苷酸通过与支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至支架。在一些此类实施方案中，支架包括纳米颗粒、树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架、或多肽支架、或它们的组合。在进一步的实施方案中，支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的单链DNA或通过滚环扩增(RCA)产生的单链DNA。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的非共价杂交而附接至支架。在其他实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的共价结合而附接至支架。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，捕获部分的至少一部分适于通过与文库DNA复合物上的一个或多个辅助结合位点的非共价相互作用来捕获文库DNA复合物。在一些此类实施方案中，捕获部分的至少一部分各自包含能够与文库DNA复合物上的一个辅助结合位点杂交的寡核苷酸接种序列。在进一步的实施方案中，寡核苷酸接种序列包含约5至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸或约20至约30个核苷酸。在其他实施方案中，捕获部分的至少一部分适于通过抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)-生物素相互作用来捕获文库DNA复合物。
在本文所述的固体载体的一些其他实施方案中，捕获部分的至少一部分适于通过与文库DNA复合物上的辅助结合位点形成共价结合来捕获文库DNA复合物。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，固体载体是流通池，在流通池的图案化表面上含有多个纳米孔。在一些其他实施方案中，固体载体含有多个捕获垫，从而在固体载体上形成图案化表面。在一些进一步的实施方案中，纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。在其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是纳米孔或捕获垫，从而在流通池中形成图案化表面。在一些实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm，或约20nm至约50nm。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，文库DNA结合区域的至少一部分各自包含约1至约200、约10至约100或约20至约50个捕获部分。在一些实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约10至100,000。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物。
本公开的某些附加方面涉及一种制备测序用固体载体的图案化表面的方法，该方法包括：
使包含多个文库DNA复合物的溶液与包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域的图案化表面接触；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获一个文库DNA复合物的捕获部分，间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸，并且捕获部分与聚类寡核苷酸正交；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，并且每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；以及通过文库DNA复合物的辅助结合位点和文库DNA结合区域的捕获部分之间的非共价或共价相互作用，将多个文库DNA复合物附接至图案化表面的文库DNA结合区域。
在本文所述的方法的一些实施方案中，其中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被不超过三个文库DNA复合物占据。在进一步的实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被单个文库DNA复合物或仅单个优势文库DNA复合物占据。
在一些实施方案中，该方法还包括扩增文库多核苷酸。在一些此类实施方案中，文库DNA复合物在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的DNA结合区域中的扩增产生单克隆簇或单个优势簇。在一些进一步的实施方案中，由扩增产生的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的簇是单克隆簇。
在本文所述的方法的一些实施方案中，固体载体包括流通池，例如图案化流通池。在其他实施方案中，固体载体表面诸如流通池表面可以是未图案化的。在一些此类实施方案中，图案化流通池表面含有多个纳米孔，纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。在其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是纳米孔或捕获垫，从而在流通池上形成图案化表面。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm，或约20nm至约50nm。
在本文所述的方法的一些实施方案中，每个文库DNA复合物包含支架，其中该数量的辅助结合位点在支架上，并且单个文库多核苷酸通过与支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至支架。在一些此类实施方案中，支架包括树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架或多肽支架。在一些实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的非共价杂交而附接至支架。在其他实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的共价结合而附接至支架。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
在本文所述的方法的一些实施方案中，捕获部分的至少一部分各自包含寡核苷酸接种序列，并且每个文库DNA复合物通过文库DNA复合物上的一个或多个辅助结合位点与寡核苷酸接种序列的杂交而附接至文库DNA结合区域。在一些此类实施方案中，寡核苷酸接种序列包含约10至约40个核苷酸或约20至约30个核苷酸。在其他实施方案中，捕获部分的至少一部分各自包含抗生物素蛋白部分，文库DNA复合物上的辅助结合位点的至少一部分各自包含生物素部分，并且文库DNA复合物通过抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)-生物素相互作用来附接至文库DNA结合区域。在一些其他实施方案中，每个文库DNA复合物通过共价结合来附接至文库DNA结合区域。共价结合可包括但不限于胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
在本文所述的方法的一些实施方案中，文库DNA结合区域的至少一部分各自包含约1至约200、约10至约100或约20至约50个捕获部分。在一些实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约10至100,000。
在本文所述的方法的一些实施方案中，聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物，如本文所述。
本公开的附加方面涉及一种包含多个文库DNA复合物的DNA文库，每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和含一定数量的辅助结合位点的支架，这些辅助结合位点适于附接至图案化固体载体的文库DNA结合区域上的一定数量的捕获部分，
其中文库多核苷酸包含插入序列和衔接子区域；
其中衔接子区域包含聚类序列，每个辅助结合位点包含互补捕获部分，其中聚类序列和互补捕获部分是正交的；并且
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于文库DNA结合区域中的捕获部分的数量。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，文库DNA复合物还包含在聚类序列和支架之间的间隔区域。在一些此类实施方案中，间隔区域包含接头。在进一步的实施方案中，接头包括PEG接头。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，文库多核苷酸还包含索引序列(例如，i5)、第一测序结合位点(例如，SBS3)、第二测序结合位点(例如，SBS12)和/或第二索引序列(例如，i7)。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，衔接子区域包含P5、P7、P15或P17序列，或与P5、P7、P15或P17序列互补或至少部分互补的序列(即，P5'、P7'、P15'或P17'序列)。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，DNA文库是双链文库。在其他实施方案中，DNA文库是单链文库。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、具有瓶刷结构的单链DNA、通过滚环扩增产生的单链DNA、或多肽支架、或它们的组合。在一些进一步的实施方案中，DNA复合物的每个互补捕获部分包含可与图案化固体载体的文库结合区域上的捕获部分杂交的寡核苷酸序列。
在本文所述的方法、固体载体或DNA文库的任何实施方案中，DNA结合区域的每个捕获部分可包含与聚类寡核苷酸正交的寡核苷酸序列。捕获部分也被称为接种引物或接种寡核苷酸。
附图说明
图1示出了通过经由接头将互补接种寡核苷酸(PX')掺入到文库DNA的标准衔接子序列中的正交接种策略的示例。
图2示出了通过经由接头和/或支架将一定数量的互补接种寡核苷酸(PX')掺入到文库DNA的标准衔接子序列中的本文所述的文库DNA接种方法的实施方案。
图3是根据本公开的实施方案的文库DNA复合物的放大视图，该文库DNA复合物包含与固体载体的DNA结合区域杂交的一定数量的互补接种寡核苷酸(PX')。
图4A至图4C各自示出了根据本公开的实施方案的包含DNA结合区域的固体载体的剖视图，该DNA结合区域是离散的或被间隙区域分开。
具体实施方式
本公开涉及用于在边合成边测序(SBS)期间增加单克隆聚类的固体载体构型和方法。固体载体包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域。每个DNA结合区域含有一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸。捕获部分与聚类寡核苷酸正交。每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸(单链或双链)和一定数量的辅助结合位点，这些辅助结合位点能够通过非共价或共价相互作用与文库DNA结合区域中的捕获部分结合，并且每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量。当第一文库DNA(也被称为模板DNA、文库链或模板链)附接至特定DNA结合区域时，此类DNA结合区域中的捕获部分与第一文库DNA复合物的辅助结合位点结合。这排除了任何附加或后续的模板DNA与相同DNA结合区域的结合。因此，相同DNA结合区域中的任何二次接种事件都是不利的。本文所述的固体载体和方法改善了文库链占据的纳米孔的单克隆性。另外，所述方法还提高了纳米孔对固体载体的占用率、信号强度和测序数据质量以及文库捕获的效率。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其他形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其他形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含”和“包括”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
如本文所用，常见的缩写定义如下：
dATP 三磷酸脱氧腺苷
dCTP 三磷酸脱氧胞苷
dGTP 三磷酸脱氧鸟苷
dTTP 三磷酸脱氧胸苷
PAZAM 任何丙烯酰胺与Azapa比率的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)；
SBS 边合成边测序
如本文所用，术语“附接”是指两件事情彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，分析物(诸如核酸)可以通过共价键或非共价键附接至材料(诸如凝胶或固体载体)上。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的化学键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所用，术语“阵列”是指附接至一个或多个基底的不同探针(例如探针分子)的群体，使得这些不同探针分子可根据相对位置彼此区分。阵列可包括各自位于基底上的不同可寻址位置处的不同探针。另选地或除此之外，阵列可包括各自带有不同探针的单独基底，其中可根据基底在基底所附接至的表面上的位置或根据基底在液体中的位置来识别不同的探针。可用于本发明的阵列的另外的示例包括但不限于美国专利第5,429,807号、第5,436,327号、第5,561,071号、第5,583,211号、第5,658,734号、第5,837,858号、第5,874,219号、第5,919,523号、第6,136,269号、第6,287,768号、第6,287,776号、第6,288,220号、第6,297,006号、第6,291,193号、第6,346,413号、第6,416,949号、第6,482,591号、第6,514,751号和第6,610,482号；WO 93/17126、WO 95/11995、WO 95/35505、EP 742 287和EP799 897中描述的那些阵列。
如本文所用，术语“共价附接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价附接的水凝胶是指与基底的官能化表面形成化学键的水凝胶，这与经由其他方式(例如，粘附或静电相互作用)附接至该表面形成比较。应当理解，共价附接到表面的聚合物也可以经由除共价附接之外的方式键合。
如本文所用，术语“可逆共价键”是指例如在施加热、光或其他(生物)化学方法(例如，通过暴露于降解剂，诸如酶或催化剂)下可以裂解的共价键，而“不可逆共价键”在此类条件下对于降解是稳定的。可逆共价键的非限制性示例包括可热裂解或可光解裂解的环加合物(例如，呋喃-马来酰亚胺环加合物)、亚烯基键、酯、酰胺、缩醛、半缩醛胺醚、缩醛胺、亚胺、腙、多硫化物键(例如，二硫化物键)、基于硼的键(例如，硼醇酸和硼酸/酯)、基于硅的键(例如，甲硅烷基醚、硅氧烷)和基于磷的键(例如，亚磷酸酯、磷酸酯)。
如本文所用，术语“非共价相互作用”与共价键的不同之处在于，它不涉及共用电子，而是涉及分子之间或分子内电磁相互作用更分散的变化。非共价相互作用一般可分为四类：静电效应、π效应、范德华力和疏水效应。静电相互作用的非限制性示例包括离子相互作用、氢键合(特定类型的偶极-偶极相互作用)、卤素键合等。范德华力是涉及永久或诱导偶极或多极的静电相互作用的子集。π效应可分拆成许多类，包括(但不限于)π-π相互作用、阳离子-π和阴离子-π相互作用和极性-π相互作用。一般来讲，π效应跟分子与分子系统(诸如苯)的π-轨道的相互作用相关。疏水效应是非极性物质在水性溶液中聚集并排斥水分子的倾向。非共价相互作用可以是分子间的和分子内的。非共价相互作用可以是分子间的和分子内的。
如本文所用，术语“主体-客体相互作用”是指能够通过分子识别经由一种或多种类型的非共价相互作用(诸如离子键合、氢键合、疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用和π-π相互作用)形成结合复合物的两个或更多个基团。例如，主客体相互作用可包括以下项之间形成的相互作用：葫芦脲与金刚烷类(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁；环糊精与金刚烷(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁，杯芳烃与金刚烷(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁；冠醚(例如，18-冠-6、15-冠-5、12-冠-4)或穴状配体(例如，[2.2.2]穴状配体)与阳离子(例如，金属阳离子、铵离子)；抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)和生物素；以及抗体和半抗原。
如本文所用，术语“离子键”是指两个或更多个离子之间涉及阳离子和阴离子之间的静电吸引的化学键。例如，阳离子可选自如本文所述的“金属阳离子”或“非金属阳离子”。非金属阳离子可包括铵盐(例如，烷基铵盐)或鏻盐(例如，烷基鏻盐)。阴离子可选自磷酸根、硫代磷酸根、膦酸根、硫代膦酸根、亚膦酸根、硫代亚膦酸根、硫酸根、磺酸根、亚硫酸根、亚磺酸根、碳酸根、羧酸根、醇盐、苯酚根和硫代苯酚根。
如本文所用，术语“氢键”是指富电子原子(例如，氮、氧或氟)上的孤电子对与附接到负电性原子(例如，氮或氧)的氢原子之间的键合相互作用。
如本文所用，术语“主体-客体相互作用”是指能够通过分子识别经由一种或多种类型的非共价相互作用(诸如离子键合、氢键合、疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用和π-π相互作用)形成结合复合物的两个或更多个基团。例如，主客体相互作用可包括以下项之间形成的相互作用：葫芦脲与金刚烷类(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁；环糊精与金刚烷(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁，杯芳烃与金刚烷(例如，1-金刚烷胺)、铵离子(例如，氨基酸)、二茂铁；冠醚(例如，18-冠-6、15-冠-5、12-冠-4)或穴状配体(例如，[2.2.2]穴状配体)与阳离子(例如，金属阳离子、铵离子)；抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)和生物素；以及抗体和半抗原。
如本文所用，术语“通过过滤器百分比”或“％PF”是在测序期间成功“读取”纳米孔的能力的量度。随着接枝密度增加，％PF最初增加，随后迅速下降，因为孔内的多克隆性增加，从而导致清晰可读的目标信号减少。换句话说，随着引物密度增加，两个或更多个模板杂交到孔的表面上的可能性增加。多于一个模板的存在增加了两个模板都被扩增从而导致多克隆性的可能性，并且增加了信号强度降低或不可读的可能性。因此，被占据的孔的％PF可以用于测量克隆程度。虽然上面提到了纳米孔，但是相同的概念适用于任何固体载体或基底。
如本文所用，当用作动词时，术语“涂覆”旨在表示在表面上提供层或覆盖物。表面的至少一部分可提供有层或覆盖物。在一些情况下，整个表面可提供有层或覆盖物。在替代情况下，仅表面的一部分将提供有层或覆盖物。当用于描述表面与材料之间的关系时，术语“涂层”旨在表示材料作为层或覆盖物存在于表面上。该材料可以密封该表面，例如，防止液体或气体与该表面接触。然而，该材料不必形成密封。例如，该材料对于液体、气体或液体或气体中携带的一种或多种组分可以是多孔的。可涂覆表面的示例性材料包括但不限于凝胶、聚合物、有机聚合物、液体、金属、第二表面、塑料、二氧化硅或气体。
如本文所用，术语“分析物”旨在包括待检测、表征、修饰、合成等的多种分析物中的任一种。示例性分析物包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA或它们的类似物)、蛋白质、多糖、细胞、核酸、细胞器、抗体、表位、受体、配体、酶(例如，激酶、磷酸酶或聚合酶)、肽、小分子候选药物等。阵列可以包括来自分析物文库的多种不同种类。例如，种类可以是来自抗体文库的不同抗体、来自核酸文库的具有不同序列的核酸、来自蛋白质文库的具有不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子组合文库的候选药物等。
如本文所用，术语“轮廓”旨在表示表面形状的局部变化。示例性轮廓包括但不限于孔、凹坑、通道、杆、柱和脊。轮廓可作为表面中的多种凹入部或表面的凸起中的任一种出现。轮廓的全部或部分可用作阵列中的特征。例如，在固体载体的特定平面中出现的轮廓的一部分可以用作该特定平面中的特征。在一些实施方案中，在表面上以规则或重复图案提供轮廓。
当材料在轮廓“内”时，其位于轮廓的空间中。例如，对于孔而言，材料在孔内部，而对于柱或杆而言，材料覆盖在表面的平面上方延伸的轮廓。
如本文所用，当参考核酸使用时，术语“不同”意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两种或更多种核酸可具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。另选地，两种或更多种核酸可具有沿其长度的相当大部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种核酸可具有对于两种或更多种分子不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有在两种或更多种分子上相同的通用序列部分。该术语可类似地应用于基于氨基酸序列差异可区分为彼此不同的蛋白质。
如本文所用，术语“一个模板多核苷酸簇”或“一个文库DNA簇”是指由于在基底的特定受限位置或隔室处(例如，同一纳米孔内)捕获的单个模板多核苷酸的扩增而固定在基底的特定受限位置或隔室上(例如，同一纳米孔内)的多个相同模板多核苷酸。当聚类产生由接种在同一受限位置或隔室中(例如，同一纳米孔内)的两个或更多个不同模板多核苷酸形成的两个或更多个簇时，术语“一个优势簇”或“一个优势文库DNA簇”在如本文所述的多克隆性的上下文中使用。当在SBS过程中使用的成像系统能够将它们区分为单独的簇时，负责测序中的碱基调用的簇被称为“优势簇”。形成优势簇的文库DNA复合物(模板多核苷酸)在本文中被称为“优势文库DNA复合物”。
如本文所用，当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“特征”是指阵列中被配置成附接特定分析物的位置。例如，特征可以是表面上的轮廓的全部或一部分。特征可以仅含有单一分析物，或其可以含有若干分析物的群体，任选地若干分析物可以是相同种类。在一些实施方案中，特征在附接分析物之前存在于固体载体上。在其他实施方案中，特征通过将分析物附接至固体载体上而产生。
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可以进行反应的室、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些实施方案中，室被配置用于检测在室中(例如，在与室流体接触的表面上)发生的反应。例如，室可以包括允许对室中的阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。示例性流通池包括但不限于在核苷酸测序装置中使用的那些流通池，例如用于由因美纳公司(Illumina,Inc.)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))商业化的Genome 或平台的流通池；或用于由Life Technologies(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))商业化的SOLiDTM或Ion TorrentTM测序平台的流通池。示例性流通池及其制造和使用方法也描述于例如WO 2014/142841 A1、美国专利申请公布第2010/0111768 A1号和美国专利第8,951,781号中，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“凝胶材料”旨在表示液体和气体可透过的半刚性材料。通常，凝胶材料在吸收液体时能够溶胀并且在除去液体(例如，通过干燥)时能够收缩。示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的那些凝胶，诸如琼脂糖；具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联的聚合物结构的那些凝胶，诸如聚丙烯酰胺、不含硅烷的丙烯酰胺(参见例如美国专利申请公布号2011/0059865 A1)、PAZAM(参见例如美国专利号9,012,022，其以引用方式并入本文)以及美国专利公布号2015/0005447和2016/0122816(它们全部全文以引用方式并入)中描述的聚合物。特别有用的凝胶材料将符合其所在的孔或其他轮廓的形状。一些有用的凝胶材料既可(a)符合其所在的孔或其他轮廓的形状，又可(b)具有基本上不超过其所在的孔或轮廓的体积的体积。在一些特定实施方案中，凝胶材料是聚合物水凝胶。
如本文所用，术语“间隙区域”是指基底中或表面上与基底或表面的其它区域分开的区域。间隙区域不允许文库DNA的结合。例如，间隙区域可将一个文库DNA结合区域与另一个文库DNA结合区域分开。彼此分开的两个区域可以为离散的，彼此缺乏接触。在一些实施方案中，间隙区域是连续的，而轮廓或特征是离散的，例如，就像其他连续表面中的孔的阵列的情况一样。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与表面上的轮廓或特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的轮廓可以具有量或浓度超过存在于间隙区域处的量或浓度的凝胶材料或分析物。在一些实施方案中，凝胶材料或分析物可能不存在于间隙区域处。在一些实施方案中，DNA结合区域在纳米孔或捕获垫的阵列内部，而聚类引物(例如，P5/P7或P15/P17)位于分开纳米孔/捕获垫的间隙区域上。在其他实施方案中，聚类引物位于多个第一纳米孔或第一纳米孔阵列内部，而DNA结合区域位于多个第二纳米孔或第二纳米孔阵列内部，这些第二纳米孔的大小/尺寸/直径小于第一纳米孔，从而产生孔内孔构型。因此，第一纳米孔内的区域被认为是第二纳米孔的间隙区域。此外，第一纳米孔阵列也被间隙区域分开。
如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的种类或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。核酸可含有具有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可包括天然的或非天然的核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包括在核酸或核苷酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。除非另有明确说明，否则术语“探针”或“靶”当参考核酸使用时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符并且不一定限制核酸的结构或功能。术语“探针”和“靶”可以类似地应用于其他分析物，诸如蛋白质、小分子、细胞等。
如本文所用，术语“表面”旨在表示固体载体或凝胶材料的外部部分或外部层。该表面可与另一种材料接触，该另一种材料诸如气体、液体、凝胶、聚合物、有机聚合物、类似或不同材料的第二表面、金属或涂层。表面或其区域可为基本上平坦的或平面的。该表面可具有表面轮廓，诸如孔、凹坑、通道、脊、凸起区域、钉、杆等。
如本文所用，术语“凹入部”是指图案化支撑件中的离散凹面特征，该离散凹面特征具有完全被图案化支撑件表面的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可以为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，本文所述的纳米孔被视为凹入部。
如本文所用，“固体载体”或“基底”可互换使用，并且两者均指不溶于水性液体的刚性基底。该基底可以为无孔的或多孔的。固体载体可任选地能够吸收液体(例如，由于孔隙率)，但是通常将足够刚性，使得基底在吸收液体时不显著膨胀，并且在通过干燥移除液体时基本上不收缩。无孔固体载体一般来讲对液体或气体不可渗透。示例性固体载体包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(例如丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。特别有用的材料为玻璃。其他合适的基底材料可包括聚合物材料、塑料、硅、石英(熔融石英)、硼浮法玻璃、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属(包括金)、光纤或光纤束、蓝宝石或塑料材料(诸如COC和环氧化物)。可基于特定用途所期望的特性来选择特定材料。例如，对期望波长的辐射是透明的材料可用于将利用期望波长的辐射的分析技术，诸如本文所阐述的技术中的一种或多种。相反，可能期望选择不通过特定波长的辐射的材料(例如，不透明的、吸收性的或反射性的)。这可用于形成待在结构化基底的制造期间使用的掩模；或用于使用结构化基底进行的化学反应或分析检测。可利用的材料的其他特性是对下游过程中使用的某些试剂的惰性或反应性；或在制造加工期间易于操作或低成本。可以用于本公开的结构化基底或方法中的材料的另外的示例描述于美国专利申请公布号2012/0316086 A1和2013/0116153，这些专利中的每一项以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“孔”是指固体载体中的离散轮廓，该离散轮廓具有完全被表面的一个或多个间隙区域包围的表面开口。孔可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与表面正交截取的孔的横截面可以是弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。在一些实施方案中，孔是微孔或纳米孔。
如本文所用，术语“聚类寡核苷酸”或“聚类引物”是指固定在固体载体的表面上用于扩增模板多核苷酸以产生相同模板的相同拷贝(即簇)的核苷酸序列。聚类寡核苷酸的示例可包括但不限于如本文所述的P5引物、P7引物、P15引物、P17引物。在一些实施方案中，“聚类引物”也被称为“表面引物”。
P5和P7引物用于因美纳公司销售的商业流通池的表面上，用于测序合适的引物的具体示例包括P5和/或P7引物，其用于因美纳公司销售的商业流通池的表面上，以用于在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。这些引物也被称为聚类引物或聚类寡核苷酸。引物序列描述于美国专利公布第2011/0059865A1号中，该专利公布以引用方式并入本文。P5和P7引物序列包括以下：
成对末端组：
P5：成对末端5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ ID NO.1)
P7：成对末端5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.2)
单个读段组：
P5：单个读段5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO.3)
P7：单个读段5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.4)
在一些实施方案中，P5和P7引物可以在5'末端包含接头或间隔区。可以包括此类接头或间隔区，以便允许裂解，或者赋予一些其他所需的特性，例如以实现与聚合物或固体载体的共价附接，或用作间隔区以将裂解位点定位成与固体载体相距最佳距离。在某些情况下，10个至50个间隔区核苷酸可以定位于P5或P7引物与聚合物或固体载体的附接点之间。在一些实施方案中，使用聚T间隔区，但也可以使用其他核苷酸以及它们的组合。TET是染料标记的具有与P5/P7引物互补的序列的寡核苷酸。TET可与表面上的P5/P7引物杂交；可以洗掉过量的TET，并且可以使用扫描仪器(诸如台风扫描仪(Typhoon Scanner)(通用电气公司(General Electric)))通过荧光检测来测量附接的染料浓度。除P5/P7引物外，测序引物序列的其他非限制性示例(诸如P15/P17引物)也已公开于美国公开第2019/0352327号中。这些附加聚类引物包括以下：
P15：5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAT*CTACAC(SEQ ID NO.5)，其中T*是指烯丙基改性的T
P17引物5'→3'
YYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.6)，其中Y是经受化学裂解的二醇接头，例如通过用试剂(诸如高碘酸盐)氧化，如在美国公开第2012/0309634号中公开的，该公开的全文通过引用方式并入。
如本文所用，在将文库DNA复合物捕获至表面的上下文中的术语“正交”意指用于将文库DNA复合物接种或附接至固体载体的表面(例如，文库DNA结合区域的捕获部分)的捕获机制不同于用于聚类步骤的表面寡核苷酸(例如，间隙区域中的聚类引物)。
应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基或二基。例如，当取代基需要两个与分子其余部分的附接点时，应当理解，该取代基为二基。例如，被识别为需要两个附接点的烷基的取代基包括二基，诸如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-等。其他基团命名惯例清楚地指示该基团为二基，诸如“亚烷基”或“亚烯基”。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可以具有1至30个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至30”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至30个碳原子”意味着烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括30个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的烷基。烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级烷基。仅以举例的方式，“C1-C6烷基”表示烷基链中存在一至六个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2至30个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的烯基。烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被命名为“C2-C6烯基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-C6烯基”表示烯基链中存在两至六个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2至30个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“炔基”。炔基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的炔基。炔基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小炔基。炔基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被命名为“C2-C6炔基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-C6炔基”表示炔基链中存在两至六个碳原子，即，炔基链选自由乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基组成的组。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
如本文所用，“亚烷基”意指仅含有碳和氢的支链或直链完全饱和的双自由基化学基团，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。亚烷基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的亚烷基。亚烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小亚烷基。亚烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级亚烷基。
如本文所用，术语“杂亚烷基”是指其中亚烷基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子(例如，氧、氮、硫、磷或它们的组合)的亚烷基链。
如本文所用，“亚烯基”是指仅含有碳和氢并且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链双自由基化学基团，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。亚烯基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的亚烯基。亚烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小亚烯基。亚烯基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级亚烯基。
如本文所用，“亚炔基”是指仅含有碳和氢并且含有至少一个碳-碳三键的直链或支链双自由基化学基团，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。亚炔基基团可以是具有10至30个碳原子的较大大小的亚炔基。亚炔基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小亚炔基。亚炔基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级亚炔基。
术语“芳族”是指具有共轭π电子体系的环或环系，并且包括碳环芳族基团(例如，苯基)和杂环芳族基团(例如，吡啶)这两者。该术语包括单环基团或稠环多环(即，共用相邻原子对的环)基团，前提条件是整个环系是芳族的。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C6-C10芳基”、“C6或C10芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。芳基基团可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。
如本文所用，“亚芳基”是指仅含有碳和氢的芳环或环系，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。杂芳基基团可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。
如本文所用，“杂亚芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子的芳环或环系，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。
如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。杂原子可以存在于环系中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可以具有3至20个环元(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环基”。杂环基基团也可以是具有3至10个环元的中等大小杂环基。杂环基基团也可以是具有3至6个环元的杂环基。杂环基基团可以被命名为“3至6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的示例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。杂环基基团可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。
如本文所用，“杂亚环基”意指含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系，其经由两个附接点与分子的其余部分附接。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“碳环基”。碳环基基团也可以是具有3至10个碳原子的中等大小碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被命名为“C3-C6碳环基”或类似的名称。碳环基环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，“亚环烷基”意指经由两个附接点与分子的其余部分附接的完全饱和的碳环或环系。
“环烯基”或“亚环烯基”基团是指分别包含含有3至10个碳原子(例如，3至7个碳原子)的闭合非芳族环并含有至少一个碳-碳双键的烯基或亚烯基基团。环烯基或亚环烯基基团可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。
“环炔基”基团是指分别包含含有3至12个碳原子(例如，8至10个碳原子)的闭合非芳族环并含有至少一个碳-碳三键的炔基基团。环炔基基团可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“叠氮基”是指-N3基团。
如本文所用，术语“硫基键”是指-(S)n-基团，其中n为1至10或1至6。优选地，n可以是1，从而形成“硫化物”键；n为2至10(例如，2至6)，从而形成“多硫化物”键。例如，n是2，从而形成“二硫化物”键。在一些实施方案中，硫原子可以任选地被氧化。特别地，硫基键可以是砜-S(＝O)-键或亚砜-S(＝O)2-键。
如本文所用，术语“缩醛”是指-OC(R)(R')O-基团，其中R和R'独立地为氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“半缩醛胺醚”是指-OC(R)(R')NR”-基团，其中R、R'和R”独立地为氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“缩醛胺”是指-NR(R')(R”)NR”'-基团，其中R、R'、R”和R”'独立地为氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“亚胺”是指-C(R)＝N-基团，其中R是氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“腙”是指-C(R)＝N-NR'-基团，其中R和R'独立地为氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“硼基键”是指-(O)a-B(OR)-(O)b-基团，其中R独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。
如本文所用，术语“硅基键”是指-(O)a-Si(R)(R')-(O)b-基团，其中R和R'独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。
如本文所用，术语“磷基键”是指-(O)a-P(R)-(O)b-基团，其中R和R'独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。
如本文所用，术语“醛”是指-C(＝O)H基团，其中该基团在与该基团的附接点处与碳原子附接。
如本文所用，术语“酮”是指-C(＝O)-基团，其中该基团在与该基团的附接点处与两个其他碳原子附接。
如本文所用，术语“羧酸”基团是指-C(＝O)OH基团。
如本文所用，术语“磺酰氟”是指-S(＝O)2F基团。
如本文所用，术语“重氮”是指-C(＝N+＝N-)-基团。
如本文所用，术语“肟”是指-C(R)＝N-OR'基团，其中R和R'独立地为氢或如本文所述的“取代基”。
如本文所用，术语“肟基卤化物”是指-C(X)＝N-OR基团，其中R是氢或如本文所述的“取代基”，并且X是卤素。
如本文所用，术语“氧化腈”是指-C≡N+-O-基团。
如本文所用，术语“硝酮”是指-C(＝NR+-O-)-基团，其中R是氢或本文所述的“取代基”。
当基团被描述为“任选地取代的”时，其可以是未取代的或取代的。同样，当基团被描述为“取代的”时，取代基可以选自所指示的取代基中的一者或多者。如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，该取代基独立地选自：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C7碳环基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、C3-C7碳环基-C1-C6-烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基-C1-C6-烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、(芳基)C1-C6烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、(5-10元杂芳基)C1-C6烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、卤代基、-CN、羟基、C1-C6烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、-O(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基；(C1-C6卤代烷氧基)C1-C6烷基；-O(C1-C6卤代烷氧基)C1-C6烷基；芳氧基、巯基(氢硫基)、卤代(C1-C6)烷基(例如，-CF3)、卤代(C1-C6)烷氧基(例如，-OCF3)、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基、-SO3H、磺酸根、硫酸根、亚磺基、-OSO2C1-4烷基、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。
根据上述定义，可理解本文所述的和在权利要求中列举的实施方案。
接种文库DNA的方法
目前在因美纳公司的SBS平台上使用的文库接种方法依赖于杂交事件来将文库DNA捕获到流通池表面上。接种方法的一个实施方案在美国序列号63/128,663中描述并在图1中示出。具体地讲，该方法依赖于使用与表面结合的聚类引物正交的单独接种引物，以将文库DNA附接至固体载体。在图1中，为双链文库DNA提供衔接子序列P5/P7'和P5'/P7，并经由PEG接头提供单独的接种序列PX'。用于接种文库DNA的图案化固体载体包括多个纳米孔，纳米孔的至少一部分各自包含多个聚类引物(P5/P7引物)和一定数量的捕获引物，每个捕获引物具有序列PX(与PX'互补)。然后当含有文库DNA的溶液与固体载体表面接触时，携带PX'的文库DNA与PX捕获引物杂交。固体载体上的聚类引物专门用于扩增接种的文库DNA样品。
本公开提供了一种将文库DNA附接至固体载体的改进方法。具体地讲，该方法可使得在固体载体的表面上的每个独特DNA结合区域(例如，纳米孔或捕获垫)中接种不超过三个文库DNA。在一些情况下，文库DNA在固体载体上的扩增在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域中产生单克隆簇或单个优势簇。在一些情况下，由扩增产生的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的簇是单克隆簇。
本公开的某些方面涉及一种制备测序用固体载体的图案化表面的方法，该方法包括：
使包含多个文库DNA复合物的溶液与包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域的图案化表面接触；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获一个文库DNA复合物的捕获部分，间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸，并且捕获部分与聚类寡核苷酸正交；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，并且每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；以及通过文库DNA复合物的辅助结合位点和文库DNA结合区域的捕获部分之间的非共价或共价相互作用，将多个文库DNA复合物附接至图案化表面的文库DNA结合区域。
如本文所述的文库DNA(也可被称为模板)可具有任何合适的长度，包括用于SBS过程中的测序。例如，文库多核苷酸的长度可以是约50至2000个核苷酸、约75至1000个核苷酸、约100至500个核苷酸、约125至450个核苷酸、约150至400个核苷酸、约175至350个核苷酸或约200至300个核苷酸。在一些实施方案中，文库DNA复合物包含单链文库多核苷酸。在其他实施方案中，文库DNA复合物包含双链文库多核苷酸。
在本文所述的方法的一些实施方案中，固体载体包括流通池。在一些此类实施方案中，流通池是图案化流通池，并且流通池表面含有多个纳米孔，纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。在其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是纳米孔或捕获垫，从而形成流通池的图案化表面。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm，或由前述值中的任意两个值限定的范围。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约20nm至约50nm。
在本文所述的方法的一些实施方案中，每个文库DNA复合物包含支架，其中该数量的辅助结合位点在支架上，并且单个文库多核苷酸通过与支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至支架。
图2示出了本文所述的正交接种方法的实施方案。首先，为文库DNA提供一定数量的互补接种寡核苷酸(PX')(即，辅助结合位点)，该数量的互补接种寡核苷酸附接至文库DNA多核苷酸的标准衔接子序列P5/P7而形成文库DNA复合物。该数量的PX'部分可经由接头(诸如PEG接头)直接附接至衔接子序列，或经由支架附接至衔接子序列。另选地，每个辅助结合位点可以是支架的一部分。固体载体的图案化表面具有多个纳米孔。在纳米孔内，存在一定数量的与PX'互补的表面结合的接种引物(PX)，以及一定数量的聚类引物(例如，P5/P7)。每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于纳米孔的DNA结合区域内的捕获部分的数量。通过将互补接种寡核苷酸(PX')与表面结合的接种引物(PX)杂交，将文库DNA复合物捕获在纳米孔内部。一旦纳米孔内的所有接种引物PX都被文库DNA复合物的PX'结合位点使用，附加的文库DNA复合物就被排除与相同的DNA结合区域杂交。
在本文所述的方法的一些此类实施方案中，DNA复合物的支架包括或为纳米颗粒、树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架、或多肽支架、或它们的组合。包含支架、用于将模板DNA与支架结合的单个模板位点和用于将辅助寡核苷酸与支架结合的多个辅助位点的纳米颗粒已描述于美国公开第2021/0187469A1号中，该公开全文以引用方式并入。支架可包含一个或多个支架DNA分子，诸如DNA树枝状大分子。在其他实施方案中，支架可包含单链DNA。在还其他实施方案中，支架可包含一种或多种支架多肽。具有瓶刷结构的聚合物也可用作支架，诸如美国序列号63/174,768中描述的那些。支架的其他非限制性示例可包括通过滚环扩增(RCA)产生的单链DNA，其含有多个辅助结合位点(例如，与固体载体上的接种引物互补的寡核苷酸序列)。
支架
可合成支架以包括并且其一旦合成就可包括多于一种类型的用于附接的化学或结构。也就是说，可合成支架以包括或将其修饰成包括附接至文库模板多核苷酸的单个位点，加上与辅助结合位点对应的具有与单个文库多核苷酸结合位点不同的化学或结构的一个或多个附加结合位点。
在一个示例中，支架可由一个或多个支架脱氧核糖核酸(DNA)分子合成。可如本文进一步公开那样设计和结构化DNA分子，以便允许包括不同的结合位点(即，对于模板多核苷酸以及辅助结合位点)，并且还提供一旦附接到多核苷酸就使模板多核苷酸彼此远离的尺寸排阻特性。在一些示例中，支架可包括杂交在一起以形成树枝状大分子的多个DNA分子。例如，衔接子可被形成为包括多个(诸如三个)DNA链或寡聚脱氧核苷酸(寡核苷酸-DNA)分子，这些分子可以通过沃森-克里克碱基配对彼此杂交而形成Y形，其中每个Y形的一个末端与另外两个末端中的一个杂交，并且每个Y形的另一个末端与另外两个末端中的另一个杂交。
此类衔接子可形成树枝状大分子的组成重复单元。例如，Y形衔接子的每个末端可具有DNA的突出端，其中寡核苷酸-DNA中的一个的末端延伸超出其与任何其他寡核苷酸-DNA杂交的部分。此类树枝状大分子的一代衔接子可在Y形的一端上具有突出端(此处称为上游末端)，该突出端可以与构成紧邻的前一代树枝状大分子的组成重复单元的另一个Y衔接子的末端的突出端杂交。并且衔接子的另连个末端(称为下游末端)可各自具有突出端，该突出端可以与构成紧邻的后续代树枝状大分子的组成重复单元的Y衔接子的上游末端的突出端杂交。因此，一代的衔接子可附接到下一代的两个衔接子，这两个衔接子可附接到后续代的四个衔接子，后续代的四个衔接子可附接到后续代的八个衔接子，以此类推。末端Y衔接子中的一个的任何一个末端(无论是任一代的下游突出端(诸如最后一代，其不与另一个衔接子的上游突出端杂交)还是第一代的上游突出端)可包括或附接到单个模板多核苷酸结合位点。在一个示例中，包括第一代衔接子的上游突出端的DNA寡核苷酸本身可以是模板多核苷酸的在样品制备期间添加到其上的延伸部。其他末端或突出端可包括或附接到辅助位点。
在一些示例中，支架可包括一个或多个单链DNA(ssDNA)分子，这些单链DNA分子被修饰或结构化成允许单个文库多核苷酸和一种或多种辅助组合物或结构附接至一个或多个辅助结合位点。可使用用于产生基于ssDNA的支架的各种方法。在一个示例中，在滚环扩增过程中，双链闭环或质粒可用作ssDNA支架分子的编码序列。通过链置换DNA聚合酶(例如，Phi29)复制其链可产生ssDNA分子，该分子包括环状编码链的复制链的串联拷贝。可采用反应条件以合成所需大小的ssDNA支架。5'末端或3'末端(prime end)可被进一步修饰以包括或附接至或可附接至作为单个模板位点的单个文库模板多核苷酸分子。辅助结合位点可包括ssDNA支架分子的另一个末端，或者对链的单独核苷酸的修饰。
在另一个示例中，可通过使用模板独立的聚合酶(例如，末端脱氧核苷酸转移酶或TdT)来合成ssDNA支架。TdT在单链DNA链的3-末端-羟基末端处掺入脱氧核苷酸，而不需要或复制模板。5'末端或3'末端可被进一步修饰以包括或附接至或可附接至作为单个模板位点的单个文库多核苷酸分子。辅助位点可包括ssDNA支架分子的另一个末端，或者对链的单独核苷酸的修饰。
在另一个示例中，可通过任何适用的方法产生多个单链DNA分子并将它们连接在一起以形成单个ssDNA分子作为支架来合成ssDNA支架。例如，聚合酶可通过在流失聚合反应(即，聚合酶在达到编码链的5-末端时停止延伸新生链的情况)中复制线性化DNA编码链来聚合DNA的新生链的形成。可合成多种ssDNA产物，然后将它们端到端连接以形成单个ssDNA支架。在一个示例中，一种ssDNA产物与另一种ssDNA产物的连接可借助于夹板来实现。例如，可设计短寡核苷酸-DNA，其3-末端与一种ssDNA产物的5-末端互补，并且其5-末端与另一种ssDNA产物的3-末端互补，使得DNA-寡核苷酸与这两种ssDNA产物的杂交将一种产物的5-末端与另一种产物的3-末端一起放在带切口的双链结构中，在该带切口的双链结构中它们与DNA-寡核苷酸杂交。然后可使用DNA连接酶(例如，T4)来将两端酶促连接在一起，以由这两种产物形成单个ssDNA分子。DNA-寡核苷酸可包括另外的反应，用于夹板辅助将这种第一反应的产物的一个或两个末端连接到另一种ssDNA产物，诸如此类，以构建可能需要的ssDNA支架。
在本文所述的方法的一些实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的非共价相互作用(诸如杂交)而附接至支架。在其他实施方案中，文库多核苷酸和支架之间的非共价相互作用可以是抗生物素蛋白-生物素相互作用。例如，每个文库多核苷酸包含允许与位于支架上的链霉抗生物素蛋白结合位点非共价结合的生物素部分。在其他实施方案中，文库多核苷酸上的生物素部分和支架上的链霉抗生物素蛋白结合位点可颠倒。
在本文所述的方法的一些其他实施方案中，文库多核苷酸通过与支架上的单个模板结合位点共价结合而附接至支架。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。在进一步的实施方案中，支架上的模板结合位点可包括氨基结合位点、羧基结合位点、硫醇结合位点、醛结合位点、叠氮基结合位点、羟基结合位点、环烯结合位点(诸如反式环辛烯结合位点或降冰片烯结合位点)、环炔结合位点(诸如环辛炔结合位点、二苯并环辛炔(DBCO)结合位点或双环壬炔结合位点)、氧代胺结合位点、SpyTag结合位点、Snap-tag结合位点、CLIP-tag结合位点或具有被分选酶识别的N-末端的蛋白质或者它们的组合。在一些此类实施方案中，文库多核苷酸或模板多核苷酸中的每一者包含允许与支架的模板结合位点共价结合的功能部分。文库多核苷酸的功能部分可包括或选自NHS酯部分、醛部分、亚氨酸酯部分、五氟苯基酯部分、羟甲基膦部分、碳化二亚胺部分、马来酰亚胺部分、卤代乙酰基部分、吡啶基二硫化物部分、硫代磺酸酯部分、乙烯基砜部分、肼部分、烷氧基胺部分、异氰酸酯部分、炔部分、环炔部分、膦部分、四嗪部分、叠氮基部分、SpyCatcher部分、O6-苄基鸟嘌呤部分、O6-苄基胞嘧啶部分或能够进行分选酶偶联的片段。在其他实施方案中，支架上的模板结合位点的功能部分和文库多核苷酸的功能部分可颠倒。
互补结合配偶体的非排他性列表在表1中呈现：
表1.
在本文所述的方法的一些实施方案中，每个文库DNA复合物通过捕获部分与文库DNA复合物的辅助结合位点之间的非共价相互作用而附接至固体载体的DNA结合区域。例如，DNA结合区域的每个捕获部分包含寡核苷酸接种序列(也被称为接种引物，例如PX)，并且文库DNA复合物的辅助结合位点各自包含与接种引物互补或至少部分互补的寡核苷酸序列(例如PX')。通过文库DNA复合物的一个或多个辅助结合位点与寡核苷酸接种序列(接种引物)的杂交，将文库DNA复合物附接至文库DNA结合区域。在一些此类实施方案中，每个接种引物包含约10至约40个核苷酸或约20至约30个核苷酸。在其他实施方案中，每个捕获部分包含抗生物素蛋白部分，文库DNA复合物上的辅助结合位点各自包含生物素部分，并且文库DNA复合物通过抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)-生物素相互作用来附接至文库DNA结合区域。在其他实施方案中，抗生物素蛋白-生物素相互作用可逆转。
在本文所述的方法的一些其他实施方案中，每个文库DNA复合物通过共价结合来附接至文库DNA结合区域。共价结合可包括但不限于胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。在进一步的实施方案中，捕获部分可包含氨基结合位点、羧基结合位点、硫醇结合位点、醛结合位点、叠氮基结合位点、羟基结合位点、环烯结合位点(诸如反式环辛烯结合位点或降冰片烯结合位点)、环炔结合位点(诸如环辛炔结合位点、二苯并环辛炔(DBCO)结合位点或双环壬炔结合位点)、氧代胺结合位点、SpyTag结合位点、Snap-tag结合位点、CLIP-tag结合位点或具有被分选酶识别的N-末端的蛋白质或者它们的组合。在一些此类实施方案中，文库DNA复合物上的每个辅助结合位点包含允许与DNA结合区域的捕获部分共价结合的功能部分。文库DNA复合物的辅助结合位点的功能部分可包括或选自NHS酯部分、醛部分、亚氨酸酯部分、五氟苯基酯部分、羟甲基膦部分、碳化二亚胺部分、马来酰亚胺部分、卤代乙酰基部分、吡啶基二硫化物部分、硫代磺酸酯部分、乙烯基砜部分、肼部分、烷氧基胺部分、异氰酸酯部分、炔部分、环炔部分、膦部分、四嗪部分、叠氮基部分、SpyCatcher部分、O6-苄基鸟嘌呤部分、O6-苄基胞嘧啶部分或能够进行分选酶偶联的片段。在一个示例中，固体载体的捕获部分包含叠氮基基团，并且文库DNA复合物的辅助结合位点包含二苯并环辛炔(DBCO)部分，其经历应变促进的无铜点击反应以形成共价结合。互补配偶体(捕获部分与文库DNA复合物的辅助结合位点之间)的附加示例性实施方案在上表1中呈现。在其他实施方案中，固体载体上的捕获部分的功能部分和文库DNA复合物的辅助结合位点的功能部分可颠倒。
图3是与固体载体的纳米孔300附接的本文所述的文库DNA复合物的放大视图。文库DNA 301包含双链文库多核苷酸、衔接子序列和支架302。一定数量的辅助结合位点PX'寡核苷酸304附接至支架302。每个寡核苷酸304可通过任选的接头303附接至支架302。另选地，每个寡核苷酸304和接头303是支架302的结构的一部分。例如，支架302可以是树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架或多肽支架。辅助结合位点304的至少一部分各自与纳米孔300内部的表面结合的接种引物杂交，使得纳米孔300内部的所有可用的接种引物被使用或占据(通过与PX'杂交)。
在本文所述的方法的一些实施方案中，每个文库DNA结合区域可包含约1至200个捕获部分。在一些进一步的实施方案中，每个文库DNA结合区域可包含约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个部分，或由任何两个前述值限定的范围。在一些实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约10至100,000。在进一步的实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或10,000，或由任何两个前述值限定的范围。
在本文所述的方法的一些实施方案中，聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物。
在具有纳米孔的图案化流通池上的标准文库接种方法通常使得在纳米孔的至少一部分中每个纳米孔接种约2至5个文库DNA(模板多核苷酸)。使用本申请所述的方法，可将接种提高到每个DNA结合区域(例如，纳米孔或捕获垫)不超过3个文库DNA复合物，从而可提高单克隆性。在进一步的实施方案中，其中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被一个或两个文库DNA复合物占据。在更进一步的实施方案中，其中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被单个文库DNA复合物或仅单个优势文库DNA复合物占据。
在一些实施方案中，该方法还包括扩增文库多核苷酸。在一些实施方案中，文库DNA复合物在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的DNA结合区域中的扩增产生单克隆簇或单个优势簇。在一些实施方案中，由扩增产生的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的簇是单克隆簇。
文库DNA制备
文库制备是任何高通量测序平台中的第一步骤。在文库制备期间，将核酸序列(例如基因组DNA样品，或者cDNA或RNA样品)转化到测序文库中，然后可对该核酸序列进行测序。以DNA样品为例，文库制备的第一步骤是DNA样品的随机片段化。首先将样品DNA片段化，并将特定大小(通常为200bp至500bp，但也可为更大)的片段连接、亚克隆或“插入”在两个寡核苷酸衔接子(衔接子序列)之间。这随后可进行扩增和测序。初始样品DNA片段被称为“插入序列”。另选地，“标签化”可用于将样品DNA附接到衔接子。在标签化中，双链DNA同时被片段化并且用衔接子序列和PCR引物结合位点标记。组合反应消除了在文库制备期间对单独的机械剪切步骤的需求。在用衔接子序列修饰之前，还可有利地对靶多核苷酸进行大小分级。
如本文所用，“衔接子”序列包含短序列特异性寡核苷酸，其作为文库制备的一部分连接到测序文库中每个DNA(或RNA)片段的5'端和3'端。
如技术人员将理解的，双链核酸通常将由两个互补的多核苷酸链形成，所述两个互补多核苷酸链由通过磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸构成，但可另外包含一个或多个核糖核苷酸和/或非核苷酸化学部分和/或非天然存在的核苷酸和/或非天然存在的主链键。具体地讲，双链核酸可包括非核苷酸化学部分，例如在一条或两条链的5'端处的接头或间隔区。作为非限制性示例，双链核酸可包括甲基化核苷酸、尿嘧啶碱基、硫代磷酸酯基团，也可包括肽偶联物等。可包括此类非DNA或非天然修饰以便赋予核酸一些期望的特性，例如以实现与固体载体的共价附接、非共价附接或金属配位附接，或用作间隔区以将裂解位点定位成与固体载体相距最佳距离。单链核酸由一个此类多核苷酸链组成。在多核苷酸链仅与互补链部分杂交(例如，长多核苷酸链与短核苷酸引物杂交)的情况下，其在本文中仍可被称为单链核酸。
本公开的一些实施方案涉及一种包含多个文库DNA复合物的DNA文库，每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和含一定数量的辅助结合位点的支架，这些辅助结合位点适于附接至图案化固体载体的文库DNA结合区域上的一定数量的捕获部分，
其中文库多核苷酸包含插入序列和衔接子区域；
其中衔接子区域包含聚类序列，每个辅助结合位点包含互补捕获部分，其中聚类序列和互补捕获部分是正交的；并且
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于文库DNA结合区域中的捕获部分的数量。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，文库DNA复合物还包含在聚类序列和支架之间的间隔区域。在一些此类实施方案中，间隔区域包含接头。在进一步的实施方案中，接头包括PEG接头。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，文库多核苷酸还包含索引序列(例如，i5)、第一测序结合位点(例如，SBS3)、第二测序结合位点(例如，SBS12)和/或第二索引序列(例如，i7)。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，衔接子区域包含P5、P7、P15或P17序列，或与P5、P7、P15或P17序列互补或至少部分互补的序列(即，P5'、P7'、P15'或P17'序列)。在一些实施方案中，本文所述的文库DNA复合物的P5/P7或P15/P17序列(或其互补序列)可附接至包含一定数量的辅助结合位点的支架，每个辅助结合位点包含与衔接子区域中的序列正交的寡核苷酸序列(例如，PX')。这种辅助结合位点寡核苷酸序列用于将DNA复合物附接至固体载体上的捕获部分。固体载体上的对应捕获部分(例如，接种引物或接种寡核苷酸)(例如，PX)各自包含与辅助结合位点的寡核苷酸序列互补或至少部分互补的序列。接种引物序列和辅助结合位点的互补序列的非限制性示例可包括美国序列号63/128,663中公开的那些，诸如以下：
(SEQ ID NO.7)PX'：
CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT
(SEQ ID NO:8)PX
AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG
(SEQ ID NO:9)PA
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG
(SEQ ID NO:10)cPA(PA')
CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC
(SEQ ID NO:11)PB
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT
(SEQ ID NO:12)cPB(PB')
AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG
(SEQ ID NO:13)PC
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT
(SEQ ID NO:14)cPC(PC')
AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT
(SEQ ID NO:15)PD
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC
(SEQ ID NO:16)cPD(PD')
GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，DNA文库是双链文库。在其他实施方案中，DNA文库是单链文库。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、具有瓶刷结构的单链DNA、通过滚环扩增产生的单链DNA、或多肽支架、或它们的组合。在一些进一步的实施方案中，文库DNA复合物的每个互补捕获部分包含可与图案化固体载体的文库结合区域上的捕获部分杂交的寡核苷酸序列。例如，固体载体上的每个捕获部分包含PX接种引物序列，并且文库DNA复合物的每个互补捕获部分包含与PX互补的PX'序列，这允许捕获部分与辅助结合位点之间的杂交。
在本文所述的DNA文库的一些实施方案中，文库DNA链被修饰以具有一定数量的辅助结合位点，这些辅助结合位点能够被捕获在固体载体的表面处(例如，被本文所述的DNA结合区域的捕获部分捕获)。有两种用于制备修饰的DNA文库的示例性工作流程：(A)基于PCR的文库和(B)无PCR的文库。在一些实施方案中，文库DNA的化学官能化可以在聚类之前通过一轮PCR扩增来共价掺入(基于PCR的文库)或通过修改现有的工作流程步骤(包括文库制备期间的衔接子杂交)来添加(无PCR的文库)。
除了与聚类引物(诸如P5'/P7'或P15'/P17')互补的序列之外，还可将另外的序列添加到文库链中。索引序列(也称为条形码或标签序列)是独特的短DNA序列，其在文库制备期间被添加到每个DNA片段中。独特的序列允许许多文库合并在一起并同时测序。在最终数据分析之前，基于它们的条形码，通过计算鉴定并分类来自合并文库的测序读取。当使用小基因组进行工作或靶向感兴趣的基因组区域时，文库多路复用也是有用的技术。与条形码的多路复用可指数地增加在单次运行中分析的样品的数量，而不会显著增加运行成本或运行时间。标签序列的示例见于WO 2005/068656，该文献的内容全文以引用方式并入本文。标签可以在第一次读取结束时通过与索引读取引物杂交来读取，或者在第二次读取结束时通过使用表面引物作为索引读取引物P7来读取。本发明不受每个簇的读数数量(例如，每个簇两个读数)的限制：每个簇三个或更多个读数可简单地通过在簇重新成群/链重新合成步骤之前或之后重新杂交第一延伸测序引物和重新杂交第二引物来获得。还可使用单索引或双索引。使用单索引，可使用多达48个独特的6碱基索引，以产生多达48个独特标记的文库。使用双索引，可组合使用多达24个独特的8碱基索引1序列和多达16个独特的8碱基索引2序列，以产生多达384个独特标记的文库。还可使用索引对，使得每个i5索引和每个i7索引仅使用一次。使用这些独特的双索引，有可能识别和过滤索引的跳读，从而在多路复用样本中提供甚至更高的置信度。
测序结合位点是测序和/或索引引物结合位点，并且指示测序读取的起始点。在测序过程期间，测序引物与模板链上的测序结合位点的一部分退火(即，杂交)。DNA聚合酶与该位点结合，并将互补的核苷酸逐个碱基地掺入到生长的相反链中。在一个实施方案中，测序过程包括第一测序读取和第二测序读取。第一测序读取可包括第一测序引物(读取1测序引物)与第一测序结合位点(例如SBS3')的结合，随后是互补链的合成和测序。这导致插入序列的测序。在第二步中，索引测序引物(例如i7测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12)，从而导致索引序列的合成和测序(例如i7引物的测序)。第二测序读取可包括索引测序引物(例如i5测序引物)与模板上的第一测序结合位点的互补序列(例如SBS3)的结合，以及索引序列(例如i5)的合成和测序。在第二步中，结合到引物(例如i7测序引物)的互补序列的第二测序引物(读取2测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12')，从而导致在反向方向上的插入序列的合成和测序。
一旦形成双链核酸模板文库，通常将使该文库经受变性条件以提供单链核酸。适合的变性条件对于技术人员而言将是显而易见的，参考标准分子生物学方案(Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring HarborLaboratory Press，NY；Current Protocols，Ausubel等人编辑)。在一个实施方案中，使用化学变性，诸如NaOH或甲酰胺。在另一个实施方案中，通过加热使DNA热变性。
变性后，可以使单链模板文库在游离溶液中接触到包含表面捕获部分(例如，P5和P7引物)的固体载体上。该固体载体通常是流通池，尽管在另选的实施方案中，可使用另选的固体载体在流通池外进行接种和聚类。
除了图3所述的捕获机制之外，本文还描述了将文库DNA复合物固定至固体载体的DNA结合区域的另选实施方案。在一个实施方案中，单链或双链文库DNA复合物可包含多个生物素部分(即，辅助结合位点)，其可与固体载体的表面上的抗生物素蛋白部分形成非共价结合。另选地，固体载体可包含生物素捕获部分，并且可用多个抗生物素蛋白部分(例如，链霉抗生物素蛋白)官能化文库DNA。也可使用其他非共价相互作用。这些非共价相互作用可包括本文所述的离子键、氢键、疏水相互作用、π-π相互作用、范德华相互作用和主客体相互作用中的一种或多种。当使用非共价相互作用时，相互作用的类型没有特别限制，条件是相互作用(总体上)足够强以使模板在延伸期间保持附接到固体载体。非共价相互作用也可足够弱，使得一旦模板的拷贝在表面引物上延伸，就可以从固体载体上去除模板。
许多方法可用于在文库DNA中包括一个或多个生物素部分或者将一个或多个生物素部分添加到文库DNA。例如，可商购获得生物素化的核苷酸以用于通过聚合酶掺入DNA分子中，并且可商购获得试剂盒以用于将生物素部分添加到多核苷酸或多肽中。也可以将生物素残基添加到氨基酸或修饰的氨基酸或者核苷酸或修饰的核苷酸中。表1中所示的连接化学还可以用于将生物素基团添加到蛋白质的诸如羧酸基团、胺基团或硫醇基团上。若干生物素连接酶也可用于酶促靶向生物素化，诸如多肽(例如，多肽中包括的AviTag氨基酸序列GLNDIFEAQKIEWHE的赖氨酸残基)的酶促靶向生物素化。基因工程化的抗坏血酸盐过氧化物酶(APEX)也可用于修饰生物素，以允许富含电子的氨基酸(诸如酪氨酸以及可能的色氨酸、半胱氨酸或组氨酸)的生物素化。
在另一个示例中，包括氨基酸序列DSLEFIASKLA的多肽可被生物素化(在序列中存在的两个S残基的更靠N末端)，其是Sfp磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶催化的利用辅酶A(CoA)缀合的小分子共价附接到其上的基底。例如，包括该序列的多肽可以通过利用CoA-生物素缀合物共价附接到其上而被生物素化。该系统还可以用于附接表1中鉴定的许多其他类型的结合部分或结构，以用于形成如本文所公开的使支架结合到DNA分子或多肽或其他分子的结合位点。例如，与表1中鉴定的反应对部分中的任一种缀合的CoA可以通过Sfp磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶共价附接到含有上述序列的多肽，从而允许包括互补结合配偶体的另一种组合物与其结合。
其他酶可用于将结合部分添加到多肽。例如，硫辛酸连接酶可以添加硫辛酸分子或者包括表1中鉴定的结合部分(诸如炔烃或叠氮化物基团)的修饰的硫辛酸分子可以共价连接到多肽中包括的氨基酸序列DEVLVEIETDKAVLEVPGGEEE或GFEIDKVWYDLDA中的赖氨酸残基的侧基的胺。在另一个示例中，其中包括或旨在与其结合的支架、模板多核苷酸或其他多肽或DNA分子可包括或附接到活性丝氨酸水解酶。氟代膦酸盐分子共价连接到丝氨酸水解酶的活性位点中的丝氨酸残基。包括表1中鉴定的结合部分(诸如叠氮化物基团或脱硫生物素基团)的氟代膦酸盐分子的可商购获得的类似物是可以与抗生物素蛋白结合的生物素的类似物。因此，此类基团可以共价附接到包括在或附接到如本文所公开的支架中所用或附接的多肽或DNA分子中的丝氨酸水解酶，并且此类结合部分或结构可以通过附接合适的修饰的氟代膦酸盐分子来共价添加到其上，以在此类蛋白质上为来自表1的互补结合配偶体(诸如叠氮化物-炔烃、叠氮化物-膦、叠氮化物-环辛炔、叠氮化物-降冰片烯或脱硫生物素-抗生物素蛋白结合)产生结合位点。
在另一个实施方案中，文库DNA复合物可通过共价键附接至固体载体。固体载体的表面包含多个叠氮基部分(例如，PAZAM涂覆的表面的叠氮基基团)。单链或双链文库DNA复合物被修饰以包括多个DBCO官能团作为辅助结合位点。文库DNA通过DBCO和叠氮基基团的反应与表面共价结合，从而形成当使用共价键时，键可以是稳定的，使得模板保持附接到固体载体。共价键的非限制性示例包括亚烷基键、亚烯基键、亚炔基键、醚键(例如，乙二醇、丙二醇、聚乙二醇)、胺键、酯键、酰胺键、碳环或杂环键、基于硫的键(例如，硫醚、二硫化物、聚硫化物或亚砜键)、缩醛、半缩醛胺醚、缩醛胺、亚胺、腙、基于硼的键(例如，硼醇酸和硼酸/酯)、基于硅的键(例如，甲硅烷基醚、硅氧烷)和基于磷的键(例如，亚磷酸酯、磷酸酯)。
在一些实施方案中，共价键可以是可逆共价键，使得一旦文库DNA的拷贝在表面引物上延伸，就可从固体载体上去除模板。在其他实施方案中，共价键可以是不可逆的键。
可使用用于将功能部分添加到文库多核苷酸或表面引物的任何合适的生物缀合方法。具有功能部分或结构的修饰的核苷酸可商购获得，并且用于将它们附接或包括到聚合物、核苷酸或多核苷酸的方法也是已知的。在一端具有来自表1中列出的一对互补结合配偶体的部分或结构并且具有来自表1中列出的另一对互补结合配偶体的部分或结构的双功能接头分子也可商购获得。文库多核苷酸或聚类寡核苷酸可与这种接头的一端结合，使得初始部分或结构被另一部分(即，存在于接头的另一端上的部分或结构)有效替代。
例如，双功能接头可在一端具有来自表1中列出的那些部分的部分，诸如NHS-酯基团。其可在另一端具有另一基团，诸如叠氮基基团。这些端可通过接头(诸如连接序列中的一个或多个PEG基团、烷基链、它们的组合等)彼此连接。如果文库多核苷酸具有胺基团，则双功能接头的NHS-酯端可与胺基团结合，从而使游离的叠氮基端可用于与带有叠氮基基团的结合配偶体(例如，炔烃、膦、环辛烯或降冰片烯等)的第一多个结合位点结合。在一端包括在表1中鉴定的用于形成一种类型的结合位点或功能部分的部分并且在另一端包括在表1中鉴定的用于形成另一类型的结合位点或功能部分的不同部分的双功能接头的许多其他示例可商购获得。
在另一个示例中，文库DNA复合物可包括多个第一多肽序列作为辅助结合位点，并且固体载体的捕获部分可具有能够与文库DNA复合物的第一多肽序列共价结合的第二多肽序列。此类对的非限制性示例包括SpyTag/SpyCatcher系统、Snap-tag/O6-苄基鸟嘌呤系统和CLIP-tag/O2-苄基胞嘧啶系统。类似地，表面引物寡核苷酸和基底的第二多个结合位点可具有第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列。可获得互补SpyTag/SpyCatcher系统对和编码它们的多核苷酸的氨基酸序列。序列的示例在表1中提供。可获得SpyTag序列和SpyCatcher序列的若干氨基酸位点突变以包括在重组多肽中。Snap-tag是功能性O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，并且CLIP-tag是Snap-tag的修饰版本。编码Snap-tag、CLIP-tag、SpyCatcher的核苷酸序列可商购获得以用于亚克隆和包括在工程化多肽序列中。
另选地，文库DNA复合物可通过酶促催化形成共价键而与固体载体的捕获部分彼此共价附接。例如，文库DNA复合物和捕获部分可包括能够通过分选酶介导的偶联彼此共价附接的基序，例如一者上的LPXTG氨基酸序列和另一者上的寡聚甘氨酸亲核序列(具有例如3至5个甘氨酸的重复序列)。然后可进行分选酶介导的转肽作用，以使文库DNA复合物在DNA结合区域处共价附接。
在另一个示例中，文库DNA复合物可包含肽序列，该肽序列可作为卷曲螺旋基序的互补对与固体载体上的肽序列(捕获部分)结合。卷曲螺旋基序是一些多肽的结构特征，其中两个或更多个多肽链各自形成α-螺旋二级结构，并且α-螺旋卷曲在一起以形成紧密的非共价键。卷曲螺旋序列可包括七肽重复序列，即七个氨基酸HPPHCPC的重复模式(其中H表示疏水性氨基酸，C通常表示带电氨基酸，并且P表示极性的亲水性氨基酸)。七肽重复序列的示例在亮氨酸拉链卷曲螺旋中发现，其中七肽的第四个氨基酸通常为亮氨酸。
前述生物素化组合物(以促进与包括抗生物素蛋白序列的多肽(诸如包括在或附接到另一种组合物中的抗生物素蛋白多肽)结合或者以其他方式将官能团添加到多肽作为支架的一部分、附接到支架、作为辅助物的一部分或附接到辅助物或模板多核苷酸，以用于在支架与模板多核苷酸之间或在支架与辅助物之间进行结合)方法中的任何一种可用于允许或促进在如本文所公开的此类组分之间进行结合。
扩增
作为简单的示例，在文库DNA复合物附接至固体载体的DNA结合区域之后(例如，经由辅助结合位点与接种引物的杂交)，可随后进行固相扩增。扩增的第一步是引物延伸步骤，其中使用模板将核苷酸添加到固定聚类引物的3'端以产生完全延伸的互补链。然后通常将模板从固体载体上洗掉。互补链将在其3'端包括能够与固定在固体载体上的第二引物分子桥接并结合的聚类引物结合序列(即，P5'或P7')。另外轮次的扩增(类似于标准PCR反应)使得形成与固体载体结合的模板分子的簇或集落。
在一些实施方案中，文库DNA复合物作为双链模板被捕获在DNA结合区域上。随后立即发生侵入和链置换。可以注意到，不需要第一链合成步骤，因为文库DNA模板已经是双链的。在置换后，原始文库模板链可桥接到互补聚类引物上。另外，可延伸置换的链。在一些实施方案中，当文库DNA复合物的辅助结合位点包含寡核苷酸序列(例如，PX')时，此类寡核苷酸序列在聚类期间不被复制。然后通过簇扩增延伸这些链并测序。
固体载体
本公开的一些方面涉及一种用于测序的固体载体，该固体载体具有图案化表面，该图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；
并且
其中捕获部分与聚类寡核苷酸正交，并且每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm，或约20nm至约50nm。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，图案化表面包括多个纳米孔，并且纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的一个文库DNA结合区域。在一些其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是图案化表面上的纳米孔或捕获垫。
图4A至图4C各自示出了根据本公开的实施方案的固体载体的剖视图。在每幅图中，剖视图示出了离散的或被间隙区域分开的DNA结合区域。在图4A中，包含表面结合的接种引物410(即，捕获部分)的DNA结合区域在较小的纳米孔402A内，该较小的纳米孔位于接枝有聚类寡核苷酸420和430的较大纳米孔401A内部。间隙区域403A不含有接种引物或聚类引物。文库DNA复合物404A包含具有一定数量的辅助结合位点406A的支架405A。文库DNA复合物404A通过接种引物410与辅助结合位点406A的相互作用而附接至DNA结合区域，每个辅助结合位点包含与接种引物410互补的寡核苷酸序列。存在比接种引物410更多的辅助结合位点406A。因此，所有接种引物410用于与辅助结合位点406A杂交，从而排除第二DNA复合物在相同DNA结合区域处结合。在图4B中，含有接种引物410的DNA结合区域是超小纳米孔401B阵列的一部分，该超小纳米孔是离散的或被间隙区域402B分开。聚类寡核苷酸420和430被接枝在间隙区域402B上。与图4A类似，包含具有一定数量的辅助结合位点405B的支架404B的文库DNA复合物403B通过接种引物410与辅助结合位点405B的相互作用而附接至DNA结合区域，每个辅助结合位点包含与接种引物410互补的寡核苷酸序列。在图4C中，含有接种引物410的DNA结合区域在捕获垫401C上，并且聚类寡核苷酸420和430在间隙区域402C中。包含具有一定数量的辅助结合位点405C的支架404C的文库DNA复合物403C通过接种引物410与辅助结合位点405C的相互作用而附接至DNA结合区域，每个辅助结合位点包含与接种引物410互补的寡核苷酸序列。对于图4A至图4C中的每个文库DNA复合物，辅助结合位点可分别经由任选的接头407A、407B或406C附接至支架405A、404B或404C，或者是支架的部分。在进一步的实施方案中，支架可通过在文库多核苷酸的官能团440和支架上的互补结合配偶体之间形成非共价或共价相互作用而附接至文库多核苷酸(插入序列和/或衔接子序列)。
本公开的一些附加方面涉及一种用于测序的固体载体，该固体载体具有图案化表面，该图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，这些辅助结合位点能够通过非共价或共价相互作用与文库DNA结合区域中的捕获部分结合；
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；并且
其中捕获部分与聚类寡核苷酸正交。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，固体载体还包含通过捕获部分附接至文库结合区域的多个文库DNA复合物。在一些此类实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被不超过三个文库DNA复合物(例如，一个或两个文库DNA复合物)占据。在进一步的实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的文库DNA结合区域各自被单个文库DNA复合物或仅单个优势文库DNA复合物占据。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，每个文库DNA复合物包含支架，其中该数量的辅助结合位点在支架上，并且文库多核苷酸通过与支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至支架。在一些此类实施方案中，支架包括纳米颗粒、树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架、或多肽支架、或它们的组合。在进一步的实施方案中，支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的单链DNA或通过滚环扩增(RCA)产生的单链DNA。用于文库制备的纳米颗粒固体载体已描述于美国公开第2021/0187469 A1号中，并且具有瓶刷结构的文库DNA复合物及其制备描述于美国序列号63/174,768中，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的非共价杂交而附接至支架。在其他实施方案中，文库多核苷酸通过与单个模板结合位点的共价结合而附接至支架。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。关于某些非共价和共价相互作用的附加公开内容详细描述于表1中以及文库DNA复合物的上下文中。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，每个捕获部分适于通过与文库DNA复合物上的一个或多个辅助结合位点的非共价相互作用来捕获文库DNA复合物。在一些此类实施方案中，每个捕获部分包含能够与文库DNA复合物上的一个辅助结合位点杂交的寡核苷酸接种序列。在进一步的实施方案中，寡核苷酸接种序列包含约5至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸或约20至约30个核苷酸。在其他实施方案中，每个捕获部分适于通过抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)-生物素相互作用来捕获文库DNA复合物。
在本文所述的固体载体的一些其他实施方案中，每个捕获部分适于通过与文库DNA复合物上的一个辅助结合位点形成共价结合来捕获文库DNA复合物。在一些此类实施方案中，共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。关于某些非共价和共价相互作用的附加公开内容详细描述于表1中以及文库DNA复合物的上下文中。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，固体载体是图案化流通池，在流通池的图案化表面上含有多个纳米孔。在一些进一步的实施方案中，纳米孔的至少一部分各自包括在纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。在其他实施方案中，每个文库DNA结合区域是流通池的图案化表面上的纳米孔或捕获垫。在一些实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm至约100nm。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm，或由前述值中的任意两个值限定的范围。在进一步的实施方案中，每个文库结合区域的大小、尺寸或直径为约20nm至约50nm。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，每个文库DNA结合区域包含约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个部分，或由任何两个前述值限定的范围。在进一步的实施方案中，每个文库DNA结合区域包含约约10至约100个捕获部分，或约20至约50个捕获部分。在一些实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约10至100,000。在进一步的实施方案中，聚类寡核苷酸与捕获部分的比率为约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或10,000，或由任何两个前述值限定的范围。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物。
在一些实施方案中，基底包括图案化表面。例如，基底可利用由基底或基质(例如，载玻片)组成的固体载体，该基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料的层或涂层被官能化，这些反应性基团允许共价附接到生物分子诸如聚类寡核苷酸和/或接种引物。此类载体的示例包括但不限于基底，诸如玻璃。在此类实施方案中，生物分子(例如，聚类引物或接种引物)可直接共价附接到中间材料，但中间材料本身可非共价附接到基底或基质(例如，玻璃基底)。另选地，可处理基底(诸如玻璃)以允许生物分子的直接共价附接；例如，玻璃可用盐酸处理，从而暴露玻璃的羟基基团，并且亚磷酸三酯化学物质被用于经由玻璃的羟基基团与核苷酸的磷酸酯基团之间的共价键将核苷酸直接附接到玻璃。在一个实施方案中，可用叠氮基基团官能化固体载体。在进一步的实施方案中，可通过中间材料诸如PAZAM涂覆引入叠氮基基团。
在其他实施方案中，可通过施加包含允许非共价附接到生物分子的基团的中间材料的层或涂层来“官能化”固体载体。在此类实施方案中，固体载体上的这些基团可与生物分子(例如多核苷酸)上的相应基团形成离子键、氢键、疏水相互作用、π-π相互作用、范德华相互作用和主-客体相互作用中的一者或多者。在固体载体上的基团与生物分子上的对应基团之间形成的相互作用可被配置为在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)引起固定或附接。例如，在固体载体上的基团和生物分子上的相应基团之间形成的相互作用可被配置为使得生物分子在扩增和/或测序期间保持附接到固体载体。在一个实施方案中，可官能化固体载体以引入抗生物素蛋白结合位点(例如，链霉抗生物素蛋白)。
在其他实施方案中，可通过施加包含允许经由金属配位键附接到生物分子的基团的中间体材料来“官能化”固体载体。在此类实施方案中，固体载体上的这些基团可包括配体(例如金属配位基团)，这些配体能够与生物分子上的金属部分结合。另选地或另外地，固体载体上的这些基团可包括金属部分，这些金属部分能够与生物分子上的配体结合。在配体与金属部分之间形成的金属-配位相互作用可被配置为在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)引起生物分子的固定或附接。例如，在固体载体上的基团和生物分子上的相应基团之间形成的相互作用可被配置为使得生物分子在扩增和/或测序期间保持附接到固体载体。
当提及将分子(例如，核酸)固定或附接到固体载体时，术语“固定”和“附接”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这两个术语旨在涵盖直接或间接、共价或非共价附接。在本发明的某些实施方案中，共价附接可能是优选的；在其他实施方案中，使用非共价相互作用的附接可以是优选的；在又一些实施方案中，使用金属配位键的附接可以是优选的。然而，分子(例如，核酸)通常在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或附接到载体。当提及将核酸附接到其他核酸时，则本文使用术语“固定”和“杂交”，并且一般是指互补核酸之间的氢键合。
在本文所述的固体载体的一些实施方案中，DNA结合区域的捕获部分和/或聚类寡核苷酸可通过聚合物(包括共聚物，可以是无规、嵌段、直链和/或支链共聚物)或水凝胶附接到基底的表面，所述聚合物或水凝胶中的每一者以任何次序或构型包含两个或更多个重复单体单元，并且可以是直链的、交联的或支链的或它们的组合。在一个示例中，该聚合物可能是一种杂聚物并且该杂聚物可包括丙烯酰胺单体，诸如或其取代的类似物。在一个示例中，聚合物是杂聚物并且还可包括含叠氮基的丙烯酰胺单体。胶可通过共价或非共价附接将聚合物或水凝涂覆在表面上。
在一些实施方案中，该杂聚物包括：
以及任选地其中每个Rz独立地为H或C1-4烷基。在一个示例中，使用的聚合物可包括诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(也称为PAZAM)的示例：
其中n为1至20,000范围内的整数，并且m为1至100,000范围内的整数。在一些示例中，该丙烯酰胺单体可包括叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体：在一些示例中，丙烯酰胺单体可包括N-异丙基丙烯酰胺
在一些实施方案中，杂聚物可包括以下结构：
其中x是在1至20,000范围内的整数，并且y是在1至100,000范围内的整数，或其中y是在1至20,000范围内的整数，并且x和z是整数，其中x和z的总和可在1至100,000的范围内，其中每个Rz独立地为H或C1-4烷基，并且分别地，x:y的比率可为约10:90至约1:99，或可为约5:95，或者(x:y):z的比率可为约85:15至约95:5，或可为约90:10(其中x:(y:z)的比率可为约1:(99)至约10:(90)，或可为约5:(95))。
测序应用
一些实施方案涉及使用通过本文所述的方法制备的具有图案化表面的基底来检测分析物的方法。在一些实施方案中，分析物选自核酸、多核苷酸、蛋白质、抗体、抗体的表位、酶、细胞、细胞核、细胞器或小分子药物。在一个实施方案中，分析物是多核苷酸。在一个实施方案中，检测包括确定多核苷酸的核苷酸序列。
使用核酸的一些实施方案可包括在基底上扩增核酸的步骤。许多不同的DNA扩增技术可与本文所述的基底结合使用。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多置换扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。在特定的实施方案中，用于扩增的一种或多种寡核苷酸引物可附接至基底(例如经由叠氮基硅烷层)。在PCR实施方案中，用于扩增的引物中的一者或两者可附接至基底。利用两种附接的引物的形式通常被称为桥扩增，因为双链扩增子在两个附接的侧接已被拷贝的模板序列的引物之间形成桥样结构。可用于桥扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利第5641658号、美国专利公布第2002/0055100号、美国专利第7,115,400号、美国专利公布第2004/0096853号；美国专利公布第2004/0002090号；美国专利公布第2007/0128624号；美国专利公布号2008/0009420中，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文。
PCR扩增也可用附接至基底的一种扩增引物和溶液中的第二引物进行。使用一种附接的引物和可溶性引物的组合的示例性形式是乳液PCR，如例如在Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145或美国专利公开第2005/0130173号或第2005/0064460号中描述，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文中。乳液PCR是该形式的示例，并且应当理解，为了本文所述方法的目的，乳液的使用是任选的，并且实际上几个实施方案不使用乳液。此外，引物不需要如在ePCR参考文献中所述直接附接至基底或固体载体，而是可以如本文所述附接至凝胶或聚合物涂层。
RCA技术可以被修改以用于本公开的方法。可以用于RCA反应的示例性组分和RCA产生扩增子的原理描述于例如Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)和US 2007/0099208 A1，这些文献中的每一篇以引用方式并入本文中。用于RCA的引物可以在溶液中或附接至凝胶或聚合物涂层。
MDA技术可以被修改以用于本公开的方法。MDA的一些基本原理和有用条件描述于例如Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人，Genome Research13:294-307(2003)；Walker等人，病毒检测的分子方法(Molecular Methods for VirusDetection)，美国学术出版社(Academic Press,Inc.),1995；Walker等人，Nucl.AcidsRes，第20卷：第1691-1696页(1992年)；US 5,455,166、US 5,130,238以及US 6,214,587，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文中。用于MDA的引物可以在溶液中或附接至凝胶或聚合物涂层。
在特定的实施方案中，可以使用上述示例的扩增技术的组合。例如，可以组合使用RCA和MDA，其中RCA用于在溶液中生成多联体扩增子(例如，使用溶液相引物)。然后扩增子可以使用附接至基底(例如，经由凝胶或聚合物涂层)的引物来用作MDA的模板。在该示例中，在组合的RCA和MDA步骤后产生的扩增子将附接至基底。
含有核酸阵列的本公开的基底可用于多种目的中的任一种目的。核酸的特别理想的用途是充当与具有互补序列的靶核酸杂交的捕获探针。靶核酸一旦与捕获探针杂交就可以被检测到，例如经由募集到捕获探针的标记。经由与捕获探针杂交来检测靶核酸的方法在本领域中是已知的，并且包括例如在美国专利第7,582,420号、第6,890,741号、第6,913,884号或第6,355,431号；或美国专利公布第2005/0053980A1号、第2009/0186349A1号或第2005/0181440A1号中描述的那些方法方法，这些专利中的每一篇通过引用并入本文中。例如，通过捕获探针与携带标记的靶探针的杂交，可以将标记募集至捕获探针。在另一个示例中，可通过使靶探针与捕获探针杂交来将标记募集至捕获探针，使得捕获探针可通过连接至标记的寡核苷酸(例如，经由连接酶活性)或通过添加标记的核苷酸(例如，经由聚合酶活性)来延伸。
在一些实施方案中，本文所述的基底可用于确定多核苷酸的核苷酸序列。在此类实施方案中，该方法可包括以下步骤：(a)在聚合酶(例如，DNA聚合酶)的存在下，使基底附接的多核苷酸/拷贝多核苷酸复合物与一种或多种不同类型的核苷酸接触；(b)将一种类型的核苷酸掺入到所述拷贝多核苷酸链中以形成延伸的拷贝多核苷酸；(c)对一个或多个延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；其中重复步骤(a)至步骤(c)，从而确定基底附接的多核苷酸的序列。
核酸测序可用于通过本领域已知的各种方法确定多核苷酸的核苷酸序列。在一种优选的方法中，利用边合成边测序(SBS)来确定附接至基底表面的多核苷酸的核苷酸序列(例如，经由本文所述的聚合物涂层中的任何一种聚合物涂层)。在这种方法中，向与多核苷酸聚合酶相关的模板多核苷酸提供一个或多个核苷酸。多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸掺入到与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。从与模板多核苷酸的一部分或与共价结合在模板多核苷酸的一端的通用或非可变核酸的一部分互补的寡核苷酸引物开始合成。当针对模板多核苷酸掺入核苷酸时，产生可检测的信号，该信号允许确定在测序过程的每个步骤期间已掺入哪个核苷酸。以此方式，可产生与模板多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列，从而允许确定模板多核苷酸的至少一部分的核苷酸序列。
流通池提供了用于容纳通过本公开的方法产生并且经受边合成边测序(SBS)或涉及在循环中重复递送试剂的其他检测技术的阵列的方便形式。例如，为了开始第一SBS循环，一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以流入/通过容纳通过本文所述方法制得的核酸阵列的流通池。可以检测其中引物延伸引起标记的核苷酸掺入的那些阵列位点。任选地，核苷酸还可以包括一旦将核苷酸添加到引物就终止进一步的引物延伸的可逆终止属性。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物，使得后续的延伸直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭试剂递送到流通池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在各个递送步骤之间进行。然后可以重复该循环n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适于与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于例如Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281和US2008/0108082，这些文献中的每一篇的全文均以引用方式并入本文中。
在采用流通池的上述方法的一些实施方案中，在单个流动步骤期间在流通池中仅存在单一类型的核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸可以选自由dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物组成的组。在采用流通池的上述方法的其他实施方案中，在单个流动步骤期间在流通池中存在多种不同类型的核苷酸。在此类方法中，核苷酸可以选自dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物。
通过检测在多核苷酸模板处或附近产生的信号来实现对于附接至存在于流通池中的基底表面上的聚合物涂层上的一个或多个多核苷酸在每个流动步骤期间掺入的一个或多个核苷酸的确定。在上述方法的一些实施方案中，可检测信号包括光学信号。在其他实施方案中，可检测信号包括非光学信号。在此类实施方案中，非光学信号包括在一个或多个多核苷酸模板处或附近的pH的变化。
本文已就核酸举例说明了本公开的基底的应用和用途。然而，应当理解，其他分析物可以附接到本文阐述的基底并对其进行分析。一种或多种分析物可以存在于本公开的基底中或基底上。本公开的基底特别可用于检测分析物，或用于与分析物进行合成反应。因此，待检测、表征、修饰、合成等的多种分析物中的任一种分析物可存在于本文所述的基底中或基底上。示例性分析物包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA或它们的类似物)、蛋白质、多糖、细胞、抗体、表位、受体、配体、酶(例如，激酶、磷酸酶或聚合酶)、小分子候选药物等。基底可包括来自分析物文库的多种不同种类。例如，种类可以是来自抗体文库的不同抗体、来自核酸文库的具有不同序列的核酸、来自蛋白质文库的具有不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子组合文库的候选药物等。
在一些实施方案中，分析物可被分布到基底上的特征，使得它们可被单独地分辨。例如，每个分析物的单个分子可存在于每个特征处。另选地，分析物可作为集落或群体存在，使得个别分子不一定被分辨。就仅含有单一种类的分析物而言，集落或群体可以是均质的(尽管为多拷贝)。以核酸为作为示例，基底上的每个特征可包括核酸的集落或群体，并且集落或群体中的每个核酸可具有相同的核苷酸序列(单链或双链)。此类集落可通过如本文先前所述的簇扩增或桥扩增产生。靶序列的多个重复可以存在于单个核酸分子中，诸如使用滚环扩增程序产生的多联体。因此，基底上的特征可以含有分析物的单个种类的多个拷贝。另选地，特征处的分析物的集落或群体可包括两种或更多种不同种类。例如，基底上的一个或多个孔可各自含有具有两种或更多种不同核酸种类(即，具有不同序列的核酸分子)的混合集落。混合集落中的两种或更多种核酸种类可以以不可忽略的量存在，例如，允许在混合集落中检测多于一种核酸。

Claims (52)

1.一种用于测序的固体载体，所述固体载体具有图案化表面，所述图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且所述间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；并且
其中所述捕获部分与所述聚类寡核苷酸正交，并且每个文库结合区域的大小为约10nm至约100nm。
2.根据权利要求1所述的固体载体，其中所述图案化表面包括多个纳米孔，并且所述纳米孔的至少一部分各自包括在所述纳米孔内部的一个文库DNA结合区域。
3.根据权利要求1所述的固体载体，其中每个文库DNA结合区域是纳米孔或捕获垫，从而在所述固体载体上形成图案化表面。
4.一种用于测序的固体载体，所述固体载体具有图案化表面，所述图案化表面包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获文库DNA复合物的捕获部分，并且所述间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，所述辅助结合位点能够通过非共价或共价相互作用与所述文库DNA结合区域中的所述捕获部分结合；
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；并且
其中所述捕获部分与所述聚类寡核苷酸正交。
5.根据权利要求4所述的固体载体，所述固体载体还包含通过所述捕获部分附接至所述文库结合区域的多个文库DNA复合物，其中至少50％的所述文库DNA结合区域各自被不超过三个文库DNA复合物占据。
6.根据权利要求5所述的固体载体，其中至少50％的所述文库DNA结合区域各自被仅一个文库DNA复合物或仅一个优势文库DNA复合物占据。
7.根据权利要求5或6所述的固体载体，其中每个文库DNA复合物包含支架，其中所述数量的辅助结合位点在所述支架上，并且所述文库多核苷酸通过与所述支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至所述支架。
8.根据权利要求7所述的固体载体，其中所述支架包括纳米颗粒、树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架或多肽支架。
9.根据权利要求7所述的固体载体，其中所述支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的单链DNA或通过滚环扩增(RCA)产生的单链DNA。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的固体载体，其中所述文库多核苷酸通过与所述单个模板结合位点的非共价杂交而附接至所述支架。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的固体载体，其中所述文库多核苷酸通过与所述单个模板结合位点的共价结合而附接至所述支架。
12.根据权利要求11所述的固体载体，其中所述共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的固体载体，其中所述捕获部分的至少一部分适于通过与所述文库DNA复合物上的一个或多个辅助结合位点的非共价相互作用来捕获所述文库DNA复合物。
14.根据权利要求13所述的固体载体，其中所述捕获部分的至少一部分各自包含能够与所述文库DNA复合物上的一个辅助结合位点杂交的寡核苷酸接种序列。
15.根据权利要求14所述的固体载体，其中所述寡核苷酸接种序列包含约10至约40个核苷酸。
16.根据权利要求13所述的固体载体，其中所述捕获部分的至少一部分适于通过抗生物素蛋白-生物素相互作用来捕获所述文库DNA复合物。
17.根据权利要求4至12中任一项所述的固体载体，其中所述捕获部分的至少一部分适于通过与所述文库DNA复合物上的辅助结合位点形成共价结合来捕获所述文库DNA复合物。
18.根据权利要求4至17中任一项所述的固体载体，其中所述固体载体是图案化流通池，在所述流通池的所述图案化表面上包含多个纳米孔。
19.根据权利要求18所述的固体载体，其中所述纳米孔的至少一部分各自包括在所述纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。
20.根据权利要求18所述的固体载体，其中所述文库DNA结合区域的至少一部分是纳米孔或捕获垫，从而在所述流通池上形成图案化表面。
21.根据权利要求4至20中任一项所述的固体载体，其中每个文库结合区域的大小为约10nm至约100nm。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的固体载体，其中所述文库DNA结合区域的至少一部分各自包含约1至200个捕获部分。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的固体载体，其中所述聚类寡核苷酸与所述捕获部分的比率为约10至100,000。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的固体载体，其中所述聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物。
25.一种制备测序用固体载体的图案化表面的方法，所述方法包括：
使包含多个文库DNA复合物的缓冲溶液与包括被间隙区域分开的多个文库DNA结合区域的所述图案化表面接触；
其中每个文库DNA结合区域包含一定数量的适于捕获一个文库DNA复合物的捕获部分，所述间隙区域的至少一部分包含聚类寡核苷酸，并且所述捕获部分与所述聚类寡核苷酸正交；
其中每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和一定数量的辅助结合位点，并且每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于每个文库DNA结合区域中的捕获部分的数量；以及
通过所述文库DNA复合物的所述辅助结合位点和文库DNA结合区域的所述捕获部分之间的非共价或共价相互作用，将所述多个文库DNA复合物附接至所述图案化表面的所述文库DNA结合区域。
26.根据权利要求25所述的方法，其中至少50％的所述文库DNA结合区域各自被不超过三个文库DNA复合物占据。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中至少50％的所述文库DNA结合区域各自被仅一个文库DNA复合物或仅一个优势文库DNA复合物占据。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，所述方法还包括扩增所述文库多核苷酸。
29.根据权利要求28所述的方法，其中由所述扩增产生的至少50％的簇是单克隆簇。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述固体载体包括流通池。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述流通池具有包括多个纳米孔的图案化表面，并且所述纳米孔的至少一部分各自包括在所述纳米孔内部的单个文库DNA结合区域。
32.根据权利要求30所述的方法，其中每个所述文库DNA结合区域是纳米孔或捕获垫，从而在所述流通池上形成图案化表面。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中每个文库结合区域的大小为约10nm至约100nm，或约20nm至约50nm。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中每个文库DNA复合物包含支架，其中所述数量的辅助结合位点在所述支架上，并且所述单个文库多核苷酸通过与所述支架上的单个模板结合位点的非共价或共价相互作用而附接至所述支架。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述支架包括纳米颗粒、树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、单链DNA支架或多肽支架。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述文库多核苷酸通过与所述单个模板结合位点的非共价杂交或通过与所述单个模板结合位点的共价结合而附接至所述支架。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述捕获部分的至少一部分各自包含寡核苷酸接种序列，并且每个文库DNA复合物通过所述文库DNA复合物上的一个或多个辅助结合位点与所述寡核苷酸接种序列的杂交而附接至所述文库DNA结合区域。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸接种序列包含约10至约40个核苷酸。
39.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述捕获部分的至少一部分各自包含抗生物素蛋白部分，所述文库DNA复合物上的所述辅助结合位点的至少一部分各自包含生物素部分，并且所述文库DNA复合物通过抗生物素蛋白-生物素相互作用来附接至所述文库DNA结合区域。
40.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中每个文库DNA复合物通过共价结合来附接至所述文库DNA结合区域，所述共价结合选自由以下项组成的组：胺-NHS酯键合、胺-亚氨酸酯键合、胺-五氟苯基酯键合、胺-羟甲基膦键合、羧基-碳化二亚胺键合、硫醇-马来酰亚胺键合、硫醇-卤代乙酰基键合、硫醇-吡啶基二硫化物键合、硫醇-硫代磺酸酯键合、硫醇-乙烯基砜键合、醛-酰肼键合、醛-烷氧基胺键合、羟基-异氰酸酯键合、叠氮化物-炔键合、叠氮化物-膦键合、反式环辛烯-四嗪键合、降冰片烯-四嗪键合、叠氮化物-环辛炔键合、叠氮化物-降冰片烯键合、氧代胺-醛键合、SpyTag-SpyCatcher键合、Snap-tag-O6-苄基鸟嘌呤键合、CLIP-tag-O2-苄基胞嘧啶结合和分选酶-偶联键合。
41.根据权利要求25至40中任一项所述的方法，其中所述文库DNA结合区域的至少一部分各自包含约1至200个捕获部分。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的方法，其中所述聚类寡核苷酸与所述捕获部分的比率为约10至100,000。
43.根据权利要求25至42中任一项所述的方法，其中所述聚类寡核苷酸包含P5和P7引物，或P15和P17引物。
44.一种包含多个文库DNA复合物的DNA文库，每个文库DNA复合物包含单个文库多核苷酸和含一定数量的辅助结合位点的支架，所述辅助结合位点适于附接至图案化固体载体的文库DNA结合区域上的一定数量的捕获部分，
其中所述文库多核苷酸包含插入序列和衔接子区域；
其中所述衔接子区域包含聚类序列，每个辅助结合位点包含互补捕获部分，其中所述聚类序列和所述互补捕获部分是正交的；并且
其中每个文库DNA复合物上的辅助结合位点的数量多于所述文库DNA结合区域中的捕获部分的数量。
45.根据权利要求44所述的DNA文库，其中所述文库DNA复合物还包含在所述聚类序列和所述支架之间的间隔区域。
46.根据权利要求44或45所述的DNA文库，其中所述间隔区域包含接头。
47.根据权利要求46所述的DNA文库，其中所述接头包括PEG接头。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的DNA文库，其中所述文库多核苷酸还包含索引序列、第一测序结合位点、第二测序结合位点和/或第二索引序列。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的DNA文库，其中所述衔接子区域包含P5、P7、P15或P17序列，或与P5、P7、P15或P17序列互补的序列。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的DNA文库，其中所述文库是双链文库。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的DNA文库，其中所述支架包括DNA树枝状大分子、具有瓶刷结构的聚合物、具有瓶刷结构的单链DNA、通过滚环扩增产生的单链DNA、或多肽支架、或它们的组合。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的DNA文库，其中所述文库DNA复合物的每个互补捕获部分包含可与所述图案化固体载体的所述文库结合区域上的所述捕获部分杂交的寡核苷酸序列。
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