[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN118308318A - 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用 - Google Patents

一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118308318A
CN118308318A CN202211703332.7A CN202211703332A CN118308318A CN 118308318 A CN118308318 A CN 118308318A CN 202211703332 A CN202211703332 A CN 202211703332A CN 118308318 A CN118308318 A CN 118308318A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
plant
amino acid
seq
corn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211703332.7A
Other languages
English (en)
Inventor
漆小泉
马爱民
徐光�
冯来宝
吴文彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongke Nongfu Beijing Biotechnology Co ltd
Institute of Botany of CAS
Original Assignee
Zhongke Nongfu Beijing Biotechnology Co ltd
Institute of Botany of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongke Nongfu Beijing Biotechnology Co ltd, Institute of Botany of CAS filed Critical Zhongke Nongfu Beijing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211703332.7A priority Critical patent/CN118308318A/zh
Publication of CN118308318A publication Critical patent/CN118308318A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01115—Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase (2.4.1.115)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用。本发明提供了蛋白质或其相关生物材料在调控植物体内异荭草素含量中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因系细胞系；所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.1。本发明蛋白质编码基因在异荭草素代谢中发挥着重要作用。通过编辑该基因，可改变玉米中异荭草素含量。

Description

一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用。
背景技术
异荭草素(isoorientin)是一类重要的黄酮类化合物，该物质在抑制杂草生长等方面发挥着重要作用。在水稻中Os02g0589400蛋白能够催化异荭草素糖基化生成异荭草素-2”-O-吡喃葡萄糖苷(isoorientin-2”-O-glucopyranoside)。
但是关于禾本科作物(玉米)中Os02g0589400蛋白的同源基因是否能够调控异荭草素的含量仍然不是很清楚。
发明内容
本发明的目的是一个玉米糖基转移酶基因(Zm00001d006446基因)在生成异荭草素(isoorientin)中的应用。
第一方面，本发明要求保护蛋白质或其相关生物材料在调控植物体内异荭草素(isoorientin)含量中的应用。
所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
所述蛋白质为Zm00001d006446基因的编码蛋白，具体可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
在上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在上述蛋白质中，同一性指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
在所述应用中，所述蛋白质在所述植物体内的含量和/或活性降低，所述植物体内异荭草素含量升高。
进一步地，所述核酸分子(即Zm00001d006446基因)可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
在上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
在上述核酸分子中，所述同源性指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
第二方面，本发明要求保护一种培育体内异荭草素(isoorientin)含量升高的植物品种的方法。
本发明要求保护的培育体内异荭草素(isoorientin)含量升高的植物品种的方法，可包括使受体植物中蛋白质的表达量和/或活性降低的步骤。
所述蛋白质为Zm00001d006446基因的编码蛋白，具体可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
在上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在上述蛋白质中，同一性指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
第三方面，本发明要求保护一种培育体内异荭草素(isoorientin)含量升高的转基因植物的方法。
本发明要求保护的培育体内异荭草素(isoorientin)含量升高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达蛋白质的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比体内异荭草素(isoorientin)含量升高。
所述蛋白质为Zm00001d006446基因的编码蛋白，具体可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
在上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在上述蛋白质中，同一性指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
进一步地，所述核酸分子(即Zm00001d006446基因)可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
在上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
在上述核酸分子中，所述同源性指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
在所述方法中，对所述受体植物中能够表达所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达是通过CRISPR-Cas9技术实现的。
在本发明的具体实施方式中，通过CRISPR-Cas9技术对所述受体植物中能够表达所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达时的靶序列为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。
在上述各方面中，所述体内异荭草素含量具体指的是叶片内异荭草素含量。
在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物。
进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。
更进一步地，所述禾本科植物可为玉蜀黍属植物。
更加具体地，所述玉蜀黍属可为玉米。
在本发明的具体实施方式中，所述植物为玉米(KN5585)。
本发明通过CRISPR-Cas9技术构建了Zm00001d006446突变体。结果显示，与野生型相比，Zm00001d006446突变体中异荭草素(isoorientin)含量显著升高，说明玉米中Zm00001d006446在异荭草素代谢中发挥着重要作用。通过编辑该基因，可改变玉米中异荭草素含量。
附图说明
图1为Zm00001d006446突变体基因型。
图2为Zm00001d006446突变体玉米中异荭草素含量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Zm00001d006446在玉米中的作用研究
本实施例中所涉及到的Zm00001d006446基因的编码序列如SEQ ID No.2所示，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。
一、利用CRISPR/Cas技术创制Zm00001d006446玉米突变体
(1)利用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计gRNA靶点序列(Oligo)，该靶点序列后序列特征序列为NGG序列(即PAM序列)，靶点序列长度为20bp
Zm00001d006446的靶序列1如下：5'-CATCCTCCGCAGGCTCCGCC-3'(SEQ ID No.3)。
对应的退火引物如下：
Oligo1-F：5'-CATCCTCCGCAGGCTCCGCCCGG-3'；
Oligo1-R：5'-CCGGGCGGAGCCTGCGGAGGATG-3'。
Zm00001d006446的靶序列2如下：5'-GCCACTAGCGACCTCCCGCC-3'(SEQ ID No.4)。
对应的退火引物如下：
Oligo2-F：5'-GCCACTAGCGACCTCCCGCCCGG-3'；
Oligo2-R：5'-CCGGGCGGGAGGTCGCTAGTGGC-3'。
其中，下划线部分为PAM序列。
(2)载体线性化。用Bsa l酶切pCXB053载体(由未米生物科技(江苏)有限公司提供，记载于“Hai-Jun Liu et al.High-Throughput CRISPR/Cas9 MutagenesisStreamlines Trait Gene Identification in Maize.The Plant Cell,Vol.32:1397–1413,May 2020”一文)。酶切反应体系为：1μg pCXB053质粒、5μL Bsa l酶缓冲液、1μL Bsal，加ddH2O补充反应体系至50μL。酶切反应条件为：37℃酶切1小时。然后将酶切产物用PCR凝胶回收试剂盒进行回收。
(3)两个gRNA的连接：以线性化pCXB053载体为模板，用引物P190292-F/R进行PCR扩增，实现2个gRNA的连接，P190292-F/R引物序列如下：
P190292-F：5’-CAATGGTCTCAATTG-ATCCTCCGCAGGCTCCGCC-GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’(两个-之间的序列为19bp靶序列1，从第二个碱基开始，共19bp)。
P190292-R：5’-TTGGGGTCTCTAAAC-CCACTAGCGACCTCCCGCC-CAATTCGGTGCTTGCGGCTC-3’(两个-之间的序列为19bp靶序列2，从第二个碱基开始，共19bp)。
PCR扩增长度约为650bp。
(4)Bsa l酶切(3)中PCR产物，并用T4DNA连接酶将酶切产物与线性化pCXB053载体进行连接。连接反应体系如下：酶切PCR产物4μl；线性化载体模板2μl；T4 DNA连接酶1μl；T4DNA连接酶buffer 2μl；H2O 1μl。16℃连接1h后冰箱放置3h或者过夜。
(5)将所得重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Kanamycin的LB平板(Kanamycin浓度为50μg/mL)进行筛选。
(6)将阳性克隆进行PCR鉴定并测序。测序引物为：5'-TCAAACAAGTGTGACAAAAA-3'。
(7)将阳性克隆质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，用含有Rifampin和Kanamycin抗性的YEB平板(100mg/L Rif，100mg/L Kan)进行筛选。挑取单菌落于YEB液体培养基中(100mg/L Rif，100mg/L Kan)。然后将培养获得的菌液进行测序。测序引物为：5'-TCAAACAAGTGTGACAAAAA-3'。
(8)玉米遗传转化。将获得的阳性克隆菌液浸染新鲜剥离的1mm左右的玉米(KN5585)幼胚。待长出转基因苗后，用bar基因及靶标位点引物筛选阳性植株。引物如下：
Bar-F1：5'-CCATCGTCAACCACTACATCGAGACA-3'；
Bar-R1：5'-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGT-3'。
扩增大小269bp。
检测靶标位点(编辑类型)引物：
J210255-A-F：5'-AGAGTCGCTCCCCTCTGATT-3'；
J210255-A-R：5'-GAACCTGCAGGACATGGGAA-3'。
扩增大小568bp。
经PCR测序后确定阳性植株编辑类型。测序引物：J210255-A-F：AGAGTCGCTCCCCTCTGATT。
经检测，获得三个突变株。其中CrZm01、CrZm02突变株在靶点1和靶点2之间108bp序列缺失，CrZm03突变株在靶点1和靶点2之间104bp序列缺失(图1)。
二、Zm00001d006446突变体化合物检测
(1)取材：分别取步骤一构建得到的转基因玉米(CrZm01、CrZm02和CrZm03)和野生型玉米(KN5585)四叶期叶片，每个突变体材料各含四个生物学重复。取样后立即置于液氮中冷冻，然后用低温真空冷冻机干燥。待样品完全干燥后准确称取20mg于2.0mL Eppendorf管中。加入一粒不锈钢钢珠，用MM400球磨仪(Roach，Germany)振动频率为20Hz，打磨10min。
(2)代谢物提取。将样品用球磨仪打碎后，加入1mL预存于-20℃的提取液(甲醇)及5μL伞形酮内酯(2mg/mL)(内标)，37℃220rpm振荡提取2h。然后将提取液12,000rpm高速离心10min。吸取上清500μL于Agilent进样瓶中，然后用UPLC-MS(Agilent 1290UPLC-6540Q-TOF)进行检测。流动相A相：0.1％甲酸水溶液，％表示体积百分含量；B相：乙腈。洗脱梯度：0-2min：5％B-10％B，2-12min：10％B-25％B，12-18min：25％B-70％B，18-23min：70％B-90％B，23-25min：90％B-100％B，25-30min：100％B，后运行5min，％均表示体积百分含量。流速0.3mL/min，柱温：40℃，进样量：5μL。采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，载气为高纯氮气，压力40psi，温度325℃。
(3)Zm00001d006446突变体化合物含量分析
化合物异荭草素的分子量为449.1085(M+H+)的色谱图，通过比较野生型和突变体材料中异荭草素色谱峰的峰面积，获得各个材料中异荭草素的相对含量。
结果显示：与野生型玉米(KN5585)相比，Zm00001d006446突变体(CrZm01、CrZm02和CrZm03)中异荭草素(isoorientin)含量显著升高(图2，P<0.05)，说明玉米中Zm00001d006446基因在异荭草素代谢中发挥着重要作用。通过编辑该基因，可改变玉米中异荭草素含量。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质或其相关生物材料在调控植物体内异荭草素含量中的应用；
所述相关生物材料为能够表达所述蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表5达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；
所述蛋白质为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
0(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质在所述植物体内的含5量和/或活性降低，所述植物体内异荭草素含量升高。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以0上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.一种培育体内异荭草素含量升高的植物品种的方法，包括使受体植物中蛋白质的表达量和/或活性降低的步骤；
所述蛋白质为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
5(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后0得到的融合蛋白。
5.一种培育体内异荭草素含量升高的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达蛋白质的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比体内异荭草素含量升高；
所述蛋白质为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于玉米具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：对所述受体植物中能够表达所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达是通过CRISPR-Cas9技术实现的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过CRISPR-Cas9技术对所述受体植物中能够表达所述蛋白质的核酸分子进行抑制表达时的靶序列为SEQ ID No.3和/或SEQ IDNo.4。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；
进一步地，所述禾本科植物为玉蜀黍属植物；
更进一步地，所述玉蜀黍属为玉米。
CN202211703332.7A 2022-12-29 2022-12-29 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用 Pending CN118308318A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211703332.7A CN118308318A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211703332.7A CN118308318A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118308318A true CN118308318A (zh) 2024-07-09

Family

ID=91724388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211703332.7A Pending CN118308318A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118308318A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112094838B (zh) 6-磷酸葡萄糖异构酶在调控植物淀粉含量和生物量中的应用
CN101591384A (zh) 一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用
CN108822195B (zh) 砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1及其应用
WO2020124319A1 (zh) 融合蛋白及其应用
CN101492689A (zh) 玉米c4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用
CN116507728A (zh) 大豆中的豆血红蛋白
CN111073868B (zh) 一种植物黄酮甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用
CN113637658A (zh) 基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用
CN102465136B (zh) 金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因及其编码的蛋白和应用
CN118308318A (zh) 一个玉米糖基转移酶基因在生成异荭草素中的应用
CN116120415B (zh) 种子重量及产量相关的蛋白GmPHD6及其相关生物材料和应用
CN106754989A (zh) 布渣叶黄烷酮‑2‑羟基化酶及其编码基因与应用
CN105671015A (zh) 山楂果实矢车菊素-3-羟基糖基转移酶及其编码基因与应用
CN115073573B (zh) 甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用
CN113736762B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
CN114605511B (zh) 新型烟草胺外排基因的克隆及其应用
CN114349833B (zh) 钙调素结合蛋白cold12在调控植物耐冷性中的应用
CN114349832B (zh) 钙调素结合蛋白cold13在调控植物耐冷性中的应用
US20060121564A1 (en) Novel expression vector suitable for expression of recombinant protein at low temperature
CN105349536A (zh) 一种烟草病程相关蛋白pr10基因的特异性pcr引物及其应用
CN113684195B (zh) 一种甾醇酯酶和其编码基因及其突变体
CN112011546A (zh) SlMS基因在调控番茄育性中的应用及方法
CN114621933B (zh) 一种accD突变蛋白及其应用
CN110066815A (zh) 海带α型碳酸酐酶基因Sjα-CA3及其编码蛋白和应用
CN112251462B (zh) 大豆GmHSFA2和GmHSP20a在增强植物开花期耐热性能中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination