CN118308273A - 一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂及其应用。益生菌剂含有约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）JYLJ‑01，约氏乳杆菌JYLJ‑01于2024年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.30431；约氏乳杆菌JYLJ‑01的表面包覆金属有机镀层。本发明提供的益生菌剂在抵抗抗生素的同时，能够在肠道定植，实现改善便秘的作用。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂及其应用。
背景技术
大量长时间服用抗生素，会造成患者肠道菌群的紊乱，消化道环境一直处于抗生素影响的状态，进而引起便秘等症状。大多数人一般选择食疗的方法去缓解症状，例如通过食用高纤维食物增加肠道内的水分和软度以促进排便，然而高纤维食物中可能含有较高的糖分，这种方法对于同时患有糖尿病等疾病的患者不适用。
服用益生菌是改善肠道菌群失衡的常用方法，但是普通工艺制备的益生菌产品无法抵抗抗生素，因此长期使用抗生素的便秘患者所服用的益生菌会被抗生素直接杀死，难以达到理想的肠道菌群改善效果，无法很好地解决因长期服用抗生素而导致的便秘问题。
基于此，提供一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂是十分必要的。
发明内容
针对普通益生菌产品无法抵抗抗生素，对长期服用抗生素人群的便秘症状改善效果不理想的技术问题，本发明提供一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂及其应用。本发明通过给益生菌加上一层金属有机框架的镀层，在抵抗抗生素的同时，能够在肠道定植，实现改善便秘的作用。
第一方面，本发明提供一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂，益生菌剂含有约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）JYLJ-01，约氏乳杆菌JYLJ-01于2024年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.30431；
约氏乳杆菌JYLJ-01的表面包覆金属有机镀层，金属有机镀层的制备方法如下：
将约氏乳杆菌JYLJ-01用羟甲基纤维素钠水溶液和甲基纤维素水溶液稀释成菌悬液，向菌悬液中加入CaCl2，混合均匀后静置，离心、洗涤即得。
进一步的，羟甲基纤维素钠水溶液和甲基纤维素水溶液的体积用量比为1：1。
进一步的，羟甲基纤维素钠水溶液的浓度为3~6g/L，优选为4~6g/L，进一步优选为5g/L；甲基纤维素水溶液的浓度为0.5~2g/L，优选为1.0~2.0g/L，进一步优选为1.0g/L。
进一步的，CaCl2以水溶液形式加入，CaCl2水溶液的浓度为30g/L。
进一步的，菌悬液的浓度为1.0×108~2.0×108CFU/mL。
第二方面，本发明提供一种上述益生菌剂在制备缓解或治疗便秘的药物中的应用，具体的，便秘由长期服用抗生素引起，抗生素选自克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林中的至少一种。
进一步的，缓解或治疗便秘的药物具有提高排便量、提高粪便水分及促进肠道蠕动的功效。
本发明的有益效果在于：
本发明首先筛选得到一种肠道定植好的益生菌约氏乳杆菌JYLJ-01，并利用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）与氯化钙反应，在细胞表面形成金属有机镀层，同时甲基纤维素（MC）与氯化钙作用发生盐析，进一步附着细胞表面，进入肠道后由于甲基纤维素的吸附作用，更容易实现肠道定植。
经实验验证，本发明提供的带有表面金属有机框架镀层的约氏乳杆菌JYLJ-01制剂对抗生素引起的便秘症状具有提高排便量和提高粪便水分、促进肠道快速蠕动等作用，无需与其他益生菌或益生元复配即可达到理想的改善效果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式中所使用的含0.5% CaCO3的MRS平板培养基的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、CaCO35g、琼脂15g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为6.8，121℃、0.1MPa下灭菌20min，倒入平皿中，冷却成固体。
本发明具体实施方式中所使用的MRS液体培养基的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为6.8，121℃、0.1MPa下灭菌20min，倒入平皿中，冷却即得。
实施例1
1、菌株分离纯化
（1）2023年5月，于山东省泰安市房村镇南阳关村采集酸萝卜样品，冷链运输回实验室制备样品；
（2）将1g样品加入到去离子水中，4℃搅拌振荡30min，稀释制成浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液，用涂布棒分别涂布到MRS平板培养基上，置于厌氧培养箱中37℃恒温静置培养48h。
（3）根据直径1-2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起，溶钙圈较大的菌落特征，挑选出27个单菌落，采用划线法接种至新的MRS平板培养基上，于37℃下厌氧条件下培养48h，重复上述操作三次，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏，作为备选菌株。
2、Caco-2细胞粘附能力筛选
选择肠道定植能力高的菌株，可以在改善肠道菌群紊乱方面有更强的竞争优势。
（1）将27株分离的菌株采用划线法培养，分别挑取一接种环单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，将所得菌液离心，收集菌体细胞，用去离子水洗涤两次，去除上清液，在菌泥中加入MEM培养液，得到浓度为1.0×109CFU/mL的菌悬液。
（2）在培养皿的每孔中放置一枚无菌盖玻片，然后加入2mL Caco-2细胞悬液（1.0×105CFU/mL），置于37℃、相对湿度为98%的二氧化碳培养箱中培养，约48h后细胞密度达80%，弃去培养液，使用MEM培养液清洗Caco-2细胞层以去除血清和抗体，重复两次，弃去培养液。
（3）向培养皿中加入菌悬液，每孔2mL。将培养皿置于37℃培养4h，之后弃去液体，用去离子水清洗细胞层，重复三次。Caco-2细胞层上粘附的菌体细胞使用4%的多聚甲醛固定20min。将培养皿中的盖玻片取出，放置于载玻片上，进行革兰氏染色。最后在显微镜下，随机选20个Caco-2细胞上粘附的菌体细胞进行计数，计算每个Caco-2细胞上粘附的菌体个数。
（4）检测结果
在27株菌中，有3株菌的平均粘附个数超过了20CFU/cell，具体如表1所示：
表1 3株菌的细胞粘附个数（CFU/cell）
将粘附效果最好的菌株JYLJ-01送至生工生物工程（上海）股份有限公司鉴定，使用的引物如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
该菌株被鉴定为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii。
该菌株JYLJ-01的基因序列为：
TGCAAGTCGAGCGAGCTTGCCTAGATGATTTTAGTGCTTGCACTAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTGAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGTCTAAGGT。
将约氏乳杆菌JYLJ-01送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2024年04月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.30431。
实施例2
采用划线法培养实施例1筛选得到的约氏乳杆菌JYLJ-01，分别挑取一接种环单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，将所得菌液离心，收集菌体细胞，用去离子水洗涤两次，去除上清液，得到菌泥。
将羧甲基纤维素钠溶于去离子水中，分别制备成3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L的羧甲基纤维素钠溶液。将甲基纤维素溶于去离子水中，分别制备成0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L的羧甲基纤维素钠溶液。将CaCl2溶于去离子水中，制备成30g/L的CaCl2溶液。
将羧甲基纤维素钠溶液和甲基纤维素溶液按照体积比1：1的比例与菌泥混合，漩涡震荡30s，得到2.0×108CFU/mL的菌悬液，再加入与菌悬液等体积的CaCl2溶液，漩涡震荡30s，然后静置90min，离心去除上清液，去离子水反复清洗两遍，再用去离子水重悬菌体。根据所选用的羧甲基纤维素钠溶液和甲基纤维素溶液浓度的不同，共配制得到16组菌悬液。将16组菌悬液分别取1mL加入4mL混合抗生素溶液（62.5mg/mL，按克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林质量比为2：2：1配制）中，震荡混匀，静置30min，作为实验组1-实验组16。
同时设置空白组和对照组。空白组为用去离子水稀释菌泥后得到5.0×107CFU/mL菌悬液，静置30min。对照组为将1mL空白组菌悬液加入4mL混合抗生素溶液（62.5mg/mL，按克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林质量比为2：2：1配制）中，震荡混匀，静置30min。
之后将各组溶液离心，去除上清液，菌泥用去离子水稀释、离心，反复清洗三遍，再用去离子水稀释后检测菌数，按照公式存活率=（检测菌数/初始菌数）×100%计算存活率，结果如表2所示。
表2 抗生素抵抗实验存活率
由表2可以看出，羧甲基纤维素钠溶液浓度为5.0g/L、甲基纤维素溶液浓度为1.0g/L时，约氏乳杆菌JYLJ-01的存活率最高，为73.2%；而对照组存活率为0%。说明通过羧甲基纤维素钠与钙离子反应生成网状结构，给益生菌菌体套上一层金属有机框架，使益生菌拥有抵抗抗生素杀伤的能力。同时，加入适当用量的甲基纤维素，发生盐析附着，能够进一步提高益生菌对抗生素的抵抗能力。
实施例3
按照实施例2试验得到的最佳羟甲基纤维素钠溶液和甲基纤维素溶液浓度，在菌株JYLJ-01、JYL7-013、JYL5-024表面包覆金属有机框架镀层，具体方法如下：
采用划线法培养实施例1筛选得到的菌株JYLJ-01、JYL7-013、JYL5-024，分别挑取一接种环单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，将所得菌液离心，收集菌体细胞，用去离子水洗涤两次，去除上清液，得到JYLJ-01菌泥、JYL7-013菌泥及JYL5-024菌泥。
将5.0g/L的羧甲基纤维素钠溶液和1.0g/L的甲基纤维素溶液按照体积比1：1的比例与菌泥混合，漩涡震荡30s，得到2.0×108CFU/mL的菌悬液，再加入与菌悬液等体积的30g/L CaCl2溶液，漩涡震荡30s，然后静置90min，离心去除上清液，去离子水反复清洗两遍后冷冻干燥、粉碎，制成实验组JYLJ-01菌剂、实验组JYL7-013菌剂及实验组JYL5-024菌剂。
同时配制对照组菌剂，将JYLJ-01菌泥、JYL7-013菌泥及JYL5-024菌泥重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液（菌数与加入CaCl2溶液后的菌悬液保持一致），冷冻干燥后粉碎，制成对照组JYLJ-01菌剂、对照组JYL7-013菌剂及对照组JYL5-024菌剂。
取SPF级C57BL/6J雌性小鼠（购自北京科澳协力公司），6周龄80只，适应性喂养1周，体重20.3g±1.2g，随机分为8个小组（空白组、模型组、对照组1-3、实验组1-3），每组10只小鼠。
空白组：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，持续7天。
模型组：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
对照组1：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃对照组JYLJ-01菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
对照组2：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃对照组JYL7-013菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
对照组3：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃对照组JYL5-024菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
实验组1：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃实验组JYLJ-01菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合液（62.5mg/mL，按克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林质量比为2：2：1常温条件下超声10min配制，现配现用，下同）；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合液（125mg/mL，按克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林质量比为2：2：1常温条件下超声10min配制，现配现用，下同）。
实验组2：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃实验组JYL7-013菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
实验组3：每天早上10:00灌胃0.4mL生理盐水，并同时灌胃实验组JYL5-024菌剂（总菌数为5.0×106CFU），持续7天。在1-4天，灌胃低浓度抗生素混合悬液；在5-7天，灌胃高浓度抗生素混合悬液。
（1）粪便性状分级
将实验第7天灌胃后的小鼠放入笼内，笼子的底层放滤纸，记录1h内小鼠的粪便性状并按照分级表（表3）进行打分，确定级别后根据性状打分至小数点后一位。打分结果如表4所示。
表3 粪便性状分级评分表
表4 小鼠粪便性状分级（分，x±s）
注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。
经观察，模型组鼠大便性状呈颗粒硬团，干结表面不平整，分数低于对照组，说明造模成功。三个对照组粪便性状与模型组相比没有显著差异。三个实验组与模型组相比均有显著性差异，其中实验组1尤为明显，说明金属有机框架镀层制备的约氏乳杆菌JYLJ-01对抗生素环境有一定的抵抗作用，并能发挥改善小鼠便秘的作用。
（2）排便量与粪便含水率
分别收集第7天灌胃后6h内的粪便，对每只小鼠的排便数量进行计数统计；收集每组小鼠的所有粪便，用烘箱105℃，烘干3h至恒重，计算粪便含水率。具体结果如表5所示。
表5 排便量与粪便含水率
注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。
由表5可以看出，模型组排便量明显少于空白组，含水率明显偏低，说明造模成功。对照组与模型组对比没有明显差异，实验组与模型组有明显差异，且实验组1差异显著，说明金属有机框架镀层制备的约氏乳杆菌JYLJ-01对抗生素环境有一定的抵抗作用，并能发挥提高排便量和提高粪便水分的作用。
（3）小肠墨汁推进率
抗生素灌胃第7天下午17:00开始给小鼠禁食，禁食16h至第二天早上9:00，对小鼠进行墨汁灌胃，灌胃量按照每10g体重灌胃0.2mL。灌胃0.5h后脱颈处死，解剖测量小肠全长及幽门到墨汁推进位置的长度（即墨汁推进距离），根据公式推进率=墨汁推进距离/小肠全长×100%计算出墨汁推进率，结果如表6所示。
表6 小肠墨汁推进率（%，x±s）
注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。
由表6可以看出，模型组的墨汁推进率明显低于空白组；对照组与模型组无明显差异；实验组与模型组有显著差异，且实验组1效果明显，说明金属有机框架镀层制备的约氏乳杆菌JYLJ-01对抗生素环境有一定的抵抗作用，并能促进肠道的快速蠕动。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一种能够抵抗抗生素、改善便秘的益生菌剂，其特征在于，益生菌剂含有约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）JYLJ-01，约氏乳杆菌JYLJ-01于2024年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.30431；
约氏乳杆菌JYLJ-01的表面包覆金属有机镀层，金属有机镀层的制备方法如下：
将约氏乳杆菌JYLJ-01用羟甲基纤维素钠水溶液和甲基纤维素水溶液稀释成菌悬液，向菌悬液中加入CaCl2，混合均匀后静置，离心、洗涤即得。
2.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，羟甲基纤维素钠水溶液和甲基纤维素水溶液的体积用量比为1：1。
3.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，羟甲基纤维素钠水溶液的浓度为3~6g/L，甲基纤维素水溶液的浓度为0.5~2g/L。
4.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，羟甲基纤维素钠水溶液的浓度为4~6g/L，甲基纤维素水溶液的浓度为1.0~2g/L。
5.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，羟甲基纤维素钠水溶液的浓度为5g/L，甲基纤维素水溶液的浓度为1.0g/L。
6.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，CaCl2以水溶液形式加入，CaCl2水溶液的浓度为30g/L。
7.如权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，菌悬液的浓度为1.0×108~2.0×108CFU/mL。
8.一种如权利要求1~7任一项所述的益生菌剂在制备缓解或治疗便秘的药物中的应用，其特征在于，便秘由长期服用抗生素引起，抗生素选自克拉霉素、头孢氨苄、阿莫西林中的至少一种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，缓解或治疗便秘的药物具有提高排便量、提高粪便水分及促进肠道蠕动的功效。
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