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CN118307684B - 一种经脂肪酸链修饰的glp-1-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种经脂肪酸链修饰的glp-1-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118307684B CN202410742771.1A CN202410742771A CN118307684B CN 118307684 B CN118307684 B CN 118307684B CN 202410742771 A CN202410742771 A CN 202410742771A CN 118307684 B CN118307684 B CN 118307684B
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Abstract

本发明提供一种经脂肪酸链修饰的GLP‑1‑FGF21融合蛋白及其制备方法和应用。该融合蛋白中，在FGF21的C末端引入特定的突变位点后，采用Sortase‑A酶介导的分子修饰技术，对GLP‑1‑FGF21末端进行了脂肪酸链的修饰，经脂肪酸链修饰后可实现：GLP‑1‑FGF21半衰期延长；成纤维细胞活化蛋白酶（FAP）对FGF21的末端降解变慢；常温下水溶液中操作，低成本且快速制备GLP‑1‑FGF21融合蛋白。本发明的GLP‑1‑FGF21融合蛋白采用酶介导的分子修饰技术，具有显著的优势。

Description

一种经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及一种经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
人类成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21，FGF21）是一种由209个氨基酸组成的多肽，其中FGF21蛋白的N末端含有28个氨基酸构成的信号肽，因此经过信号肽剪切后形成的成熟FGF21由181个氨基酸组成。
FGF21在人类多种器官和组织中有表达，如肝脏、胰腺和脂肪组织中等。在人体中，FGF21可以分泌进入血液循环，并诱导肝脏、胰腺和脂肪组织中的多种信号通路和功能活动，进而实现对糖脂代谢的调节和对胰岛β细胞保护的生理功能。研究表明，在通过饮食诱导或者基因操作产生的肥胖小鼠中，注射FGF21蛋白能够显著的降低小鼠体重和血糖水平，同时小鼠血清中的甘油三酯（triglyceride）含量也显著降低。进一步的研究表明，FGF21可以改善肝脏的胰岛素敏感性，从而缓解葡萄糖不耐受。在更接近人类的哺乳类动物上的研究表明，FGF21可剂量依赖性地减少实验动物体重和体脂，如向患糖尿病的恒河猴施用FGF21，发现其空腹血浆葡萄糖和甘油三酯水平均有显著降低。此外，FGF21还能激活外分泌胰腺细胞和肝细胞信号通路，抑制肝糖原输出。
FGF21属于FGF（成纤维细胞生长因子）家族成员，然而，不同于大多数FGF所具有广谱的促有丝分裂的能力，FGF21并没有明显的促进细胞增殖的能力。有研究表明，FGF21转基因鼠在整个生命周期内，体内未发现肿瘤以及组织增生等异常状况。同时，药代动力学和药物安全性实验表明，超过药理学剂量的FGF21并不会出现低血糖症，这表明FGF21是一种潜在的理想治疗糖尿病以及肥胖等疾病的药物。
不同于大多数的FGF家族成员，FGF21激活下游信号通路需要同时通过FGF受体（Fibroblast growth factor receptors，FGFRs）和辅助受体β-klotho来实现，单 独 的β-klotho或者FGFR都不能激活FGF21信号。结构生物学研究表明，FGF21的结构可以分为两个部分，其中N端结构域主要FGFR的结合有关，而C端结构域则为一个相对柔性的序列，与β-klotho的结合有关。FGF21只有与β-klotho、FGFR形成一个三元复合体后，才能激活下游相关的信号通路，进而发挥其生物效应。
FGF21在控制血糖和降低体重等方面的生理功能为治疗相关疾病带来了希望，但是野生型FGF21存在着易被蛋白酶水解，分子量过小等缺点，其半衰期仅为0.5-2小时，不适合直接作为药物。同时，FGF21蛋白的C末端含有的负责和β-klotho受体结合的柔性区域，很容易被成纤维细胞活化蛋白酶（Fibroblast Activation Protein，FAP）降解，其主要降解位点为Pro171周围。当P171被FAP蛋白酶切割以后，FGF21分子将不能再与β-klotho辅助受体结合，进而导致FGF21分子失活。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的主要生物活性片段是衍生自胰高血糖素原肽的翻译后加工的30或31个氨基酸的多肽片段(GLP-1的氨基酸7-36或7-37)。在人体中， GLP-1是一种主要由肠道细胞所产生的激素，属于肠促胰素类。GLP-1受体激动剂是近年来的新型降糖药，通过激活GLP-1受体（GLP-1R），以葡萄糖浓度依赖的方式增强胰岛素分泌，抑制胰高糖素分泌，并能够延缓胃排空，通过中枢性的食欲抑制减少进食量，从而达到降低血糖作用。内源性GLP-1仅具有大约2分钟的半衰期，所以糖尿病人需要补充外源GLP-1以达到降血糖的目的。
生理功能上，GLP-1同FGF21具备很强的互补性，同时激活GLP-1R和FGFR可以更加有效的降低血糖、体重和血脂等，Qi Pan等将GLP-1与FGF21通过Fc连接，得到GLP-1-Fc-FGF21双重激动剂（EBio Medicine. 2021 Jan;63:103202.）。然而，前述GLP-1-Fc-FGF21双重激动剂操作方法复杂，其构建的融合蛋白分子量较大，影响其分子活性，且通常需要哺乳细胞表达，成本较高。
直接表达GLP-1和FGF21融合蛋白后，可通过引入适当的突变位点修饰FGF21的末端，例如使用脂肪酸链或者PEG修饰，达到延长半衰期，和屏蔽FAP蛋白酶对FGF21末端的降解。该方法虽可制备分子量较小的GLP-1-FGF21融合蛋白，但工艺中需要引入化学修饰步骤，工艺过程相对复杂，且需要在FGF21或GLP-1分子引入大量突变位点，以减少非特异性修饰。
因此，亟需开发工艺简单、低成本同时可延长GLP-1-FGF21半衰期、减慢FAP对FGF21末端降解的GLP-1-FGF21融合蛋白及其制备方法。
发明内容
本发明的目的是通过在FGF21的末端引入特定的突变位点后，使用Sortase-A酶介导的偶联方法，对GLP-1-FGF21末端进行了脂肪酸链的修饰，制备得到一种新的GLP-1-FGF21融合蛋白，该融合蛋白具备易制备，成本低，偶联效率高，同时可有效延长GLP-1-FGF21半衰期并减慢FAP对FGF21末端降解。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供一种经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1-FGF21融合蛋白包括GLP-1或其活性片段、连接子、FGF21变体或其活性片段，所述FGF21变体的C端包含-LPXTG基序且C端进行脂肪酸链修饰，其中，X为任意氨基酸，所述连接子为连接肽。
本发明的一种实施方式中，所述FGF21变体是在野生型人类FGF21蛋白序列基础上突变得到，所述野生型人类FGF21的序列如SEQ ID NO: 1所示。
进一步，为了减弱121位的脱氨基反应和167位的氧化反应，将SEQ ID NO: 1所示的序列第121位N替换为Q，第168位M替换为L，所述FGF21变体的序列如SEQ ID NO: 4所示，前述氨基酸的替换本身并不影响FGF21的活力或其它功能。
进一步，为了能够使Sortase-A酶识别FGF21，将SEQ ID NO: 4所示的序列中第166-177位任意连续的7个氨基酸替换为LPXTGGG，其中X代表任意天然氨基酸残基，其中替换后的序列如SEQ ID NO: 5-8所示。
本发明的一种较佳实施方式中，所述FGF21变体序列如SEQ ID NO: 8所示。
本发明的一种较佳实施方式中，所述GLP-1多肽选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13。
本发明的一种较佳实施方式中，所述脂肪酸链修饰是将脂肪酸链偶联在SEQ IDNO: 8所示序列的第180位氨基酸K的侧链NH2-上。
本发明的一种较佳实施方式中，所述连接肽为GGGSGGGGS（SEQ ID NO:14）、（GGGGS）n、（GGGGS）n、SGGGGSGGGG（SEQ ID NO:15）、GGGGGSGGGGSSGGGGS（SEQ ID NO:16）、GGGGSGGGGSGGGG（SEQ ID NO:17）、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS（SEQ ID NO:18）、GSPGSSSSGS（SEQID NO:19）、GSGSGSGS（SEQ ID NO:20）、GSGSGNGS（SEQ ID NO:21）、GGSGSGSG（SEQ ID NO:22）、GGSGSG（SEQ ID NO:23）、GGSG（SEQ ID NO:24）、GGSGNGSG（SEQ ID NO:25）、GGNGSGSG（SEQ ID NO:26）、GGNGSG（SEQ ID NO:27）或（GGGGGS）n，n可以是1-5之间的整数。
本发明的一种较佳实施方式中，所述连接肽为GGGGSGGGGS（SEQ ID NO:28）或（GGGGS）4（SEQ ID NO:29）。
本发明的一种较佳实施方式中，所述GLP-1-FGF21融合蛋白的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 12所示。
本发明的第二方面提供一种经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白的制备方法，包括：1）获得所述GLP-1-FGF21融合蛋白，2）获得经脂肪酸链修饰的偶联多肽分子，并使用Sortase-A酶对所述GLP-1-FGF21融合蛋白进行脂肪酸链修饰。
本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸修饰的步骤包括：合成偶联多肽分子，将偶联多肽分子与脂肪酸链溶液混合，室温搅拌，得到偶联产物A。
进一步，所述脂肪酸修饰的步骤还包括：将所述偶联产物A与所述GLP-1-FGF21融合蛋白混合，加入Sortase -A 酶溶液，室温搅拌，得到所述经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白；可选地，进一步纯化所述经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白。
本发明的一种较佳实施方案中，所述偶联多肽如SEQ ID NO: 10所示，所述脂肪酸链修饰是将脂肪酸链偶联在SEQ ID NO: 10所示序列的第8位氨基酸K的侧链NH2-上。
本发明的第三方面提供包含所述的核酸分子或所述的表达载体的宿主细胞。
本发明的第四方面提供一种药物组合物，含有安全有效量的前述经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白或前述制备方法制备得到的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
本发明的第五方面提供一种所述经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白、所述的制备方法、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的宿主细胞在制备用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、肥胖症、代谢综合征和神经退行性疾病，特别是用于延缓或预防2型糖尿病中的疾病进展，治疗代谢综合征，治疗肥胖症或预防超重，用于减少食物摄入，增加能量消耗，降低体重，延缓从葡萄糖耐量受损(IGT)到2型糖尿病的进展；控制血糖、血脂；延缓从2型糖尿病到需要胰岛素的糖尿病的进展；调节食欲；诱发饱足感；预防减肥成功后的体重恢复；治疗与超重或肥胖症相关的疾病或状态；治疗贪食症；治疗暴食；治疗动脉粥样硬化、高血压、IGT、血脂异常、冠心病、脂肪肝，β-阻断剂中毒的治疗，用于抑制胃肠道的运动的药物中的应用。
本发明中所涉及的FGF21的所有氨基酸序列编号均以野生型FGF21（如SEQ ID NO:1所示）为准，在SEQ ID NO:1中第一个组氨酸残基位点编号为1，第二个为2，以此类推至最后一个氨基酸为181。
有益效果
本发明所提供的制备方法通过简单的Sortase-A酶介导的偶联技术，即可制备脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，该方法操作简单，无非特异性修饰，且在常温下水溶液中操作，降低了制备成本，节约了制备时间；同时，该制备方法所制得的脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白延长了GLP-1-FGF21的半衰期，大大减慢了FAP对FGF21末端的降解。
附图说明
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
图1是实施例3中四种不同的Sortase-A偶联后的FGF21蛋白C末端序列对比图，图中黑色加粗斜体部分为Sortase-A偶联后的序列。
图2是实施例4中使用Sortase-A酶对GLP-1-FGF21融合蛋白进行脂肪酸链修饰的过程示意图。
图3是实施例7中给药后小鼠体重变化。
图4是实施例7中给药后小鼠血糖值变化。
图5是实施例7中给药终点小鼠肝脏病理学切片对比图，其中图中A，B，C，D, E分别对应G1组，G2组，G3组，G4组和G5组小鼠，其中白色点状为脂肪组织。
图6是偶连脂肪酸链后完整GLP-1-FGF21融合蛋白的质谱鉴定图，其分子量为24128 Da。
具体实施方式
定义
除非另有说明，本申请中所用的术语含义如下。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。
表1：20种天然氨基酸缩写列表
本发明中的数值范围，是指给定范围中的各个整数，例如（GGGGS）n，n可以是1-5之间的整数，即n为1、2、3、4、5。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。
如本文所用，术语“连接子”是本领域已知的常用连接子或本发明中记载的，常用的连接子可以为（GGGS）n、（GGGGS）n、（GGGGGS）n。
如本文所用，术语“功能性变体”是指在亲本蛋白氨基酸序列基础上进行取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且仍基本保留至少一个亲本蛋白的生物学特性的蛋白或多肽。
如本文所用，术语“活性片段”是指在亲本蛋白基础上截短但仍基本保留至少一个亲本蛋白的生物学特性的蛋白或多肽。
如本文所用，术语“脂肪酸链”指的是一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链有机物，通式是C(n)H(2n+1)COOH。按碳链长度不同分类，它可被分成短链(含4～ 6个碳原子)脂肪酸；中链(含8～ 14个碳原子)脂肪酸；长链(含16～20个碳原子)脂肪酸和超长链(含20个或更多碳原子)脂肪酸四类。本发明中与重组蛋白偶联的“脂肪酸链”优选为式I所示的脂肪酸链：
-1inker-(CH2)x-COOH（式I）
其中的linker部分包括但不仅限于PEG(聚乙二醇)片段、氨基酸如谷氨酸等，(CH2)中x的数目介于10-20之间；优选的x介于16-20之间；进一步优选地为：
（式Ia）
其中，波浪线示出与FGF21氨基酸残基连接的位点。
进一步的，本发明中所述的脂肪酸链通过化学反应偶联在一段多肽序列上，序列包含“GGGX1X2X3X4SPSYKS”，其中X1，X2，X3和X4代表任意氨基酸或空白，但不包括赖氨酸残基。所述的氨基酸侧链通过化学反应偶联在从C末端数第二位的赖氨酸残基侧链上。
进一步优选地，所述的包含“GGGX1X2X3X4SPSYKS”多肽序列如SEQ ID NO: 10所示。
目前已上市的多种多肽药物均是通过增加脂肪酸侧链，实现与血浆白蛋白非共价结合的方式延长半衰期， 如诺和诺德公司的利拉鲁肽和索马鲁肽等。本发明利用纯化后的带-GGGSPSYKS-的FGF21突变体(FGF21-P4， SEQ ID NO:8)， 通过转肽酶Sortase-A酶催化的连接反应将包含“GGGX1X2X3X4SPSYKS”序列且在从C末端数第二位的赖氨酸残基侧链修饰有脂肪酸链的多肽序列与FGF21-P4相连接， 形成了脂肪酸链修饰的FGF21蛋白突变体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何核酸分子以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人、牛和狗。
如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1:FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白表达
1.1、表达质粒构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司分别合成能够表达如下所示编号为FGF21-1414（类野生型FGF21；突变位点121Q，168L；如SEQ ID NO:4所示）、FGF21-P1（SEQ ID NO:5）、FGF21-P2（SEQ ID NO:6）、FGF21-P3（SEQ ID NO:7）、FGF21-P4（SEQ ID NO:8）和GLP-1-FGF21-P4（SEQ ID NO:9）的蛋白的基因，并将基因克隆到pET21b载体中，然后转化到BL21（DE3）（采购自Merck）菌株中。
FGF21-1414是野生型FGF21的突变体，称为“类野生型FGF21”（121Q，168L），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，突变位点121Q与168L是为了减弱121位的脱氨基反应和167位的氧化反应，本身并不影响其活力或其它功能，因此，本发明的实施例中以突变体FGF21-1414作为对照，其实验结果代表野生型FGF21的结果，故本发明中所有序列均带有这两个突变位点。表2示出本发明中涉及的FGF21及其变体、GLP-1及其变体、GLP-1-FGF21-P4、偶联多肽的序列及编号。
表2. FGF21及其变体、GLP-1及其变体、GLP-1-FGF21-P4、偶联多肽的序列及编号
1.2、表达
过夜培养的种子按1: 50的体积比转接到含Kana抗性的500 mL TB培养基的三角瓶中，初始OD600大约为0.1，37℃，220 rpm，培养至OD600为2.0，加入IPTG（终浓度为0.5mmol / L），37 ℃、220 rpm过夜培养后收菌。蛋白以包涵体（inclusion body，IB）的形式表达。
实施例2: FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白的复性和纯化
2.1 包涵体变性溶解
使用8 M尿素和10 mM DTT溶解实施例1中经过细胞破碎和清洗得到的FGF21-1414、FGF21-P1、FGF21-P2、FGF21-P3、FGF21-P4、GLP-1-FGF21-P4包涵体。包涵体溶解在室温进行，时间为4小时。
2.2 复性
将以上溶解的包涵体溶液加入复性溶液中，复性溶液中含有2M 尿素，10 mMcysteine以及pH为8.0的20 mM Tris-Cl缓冲液，室温孵育过夜。复性期间需要连续搅拌，转速为200转/分钟。
2.3 FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白进行疏水作用层析Phenyl纯化
加入终浓度为2 M NaCl和20mM Tris-Cl缓冲液后流过疏水层析GE Capto Phenyl（购于GE），然后进行NaCl溶液梯度洗脱，梯度为2 M至0 M。根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存，此步可以捕获目的蛋白并去除一些杂蛋白。
2.4 FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白进行离子交换层析Source 30Q纯化
疏水作用层析后合并的蛋白10倍稀释后进行Source 30Q离子交换层析，采用NaCl溶液梯度洗脱，梯度为0 M到 1.0 M，以进一步去除核酸和一些蛋白高聚体以及杂蛋白。
2.5 FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白进行分子筛精细纯化
离子交换层析source 30Q纯化后将合并的蛋白浓缩，然后进行分子筛Superdex200精细纯化，PBS作为缓冲液，此步纯化的蛋白作为最终样品，编号分别为FGF21-1414、FGF21-P1、FGF21-P2、FGF21-P3、FGF21-P4、GLP-1-FGF21-P4。
纯化信息如表3所示，所有蛋白都达到了电泳纯的纯度。
表3 纯化得到的FGF21蛋白及GLP-1-FGF21融合蛋白浓度表
蛋白编号 浓度（mg/mL）
FGF21-1414 2.0
FGF21-P1 1.9
FGF21-P2 1.3
FGF21-P3 1.0
FGF21-P4 1.0
GLP-1-FGF21-P4 1.2
实施例3: 不同FGF21突变体细胞活性的筛选
为了确定使用Sortase-A酶进行偶联的合适方法，本发明首先对不同偶联后序列的活性进行了筛选。Sortase-A酶可以将两段多肽的N端和C端通过酶介导的方式连接起来，其具体原理为当一段多肽的C末端带有-LPXTG（X为任意氨基酸）序列时，Sortase-A酶可以识别该多肽C末端，且将末端G切掉，并将另外一段N端以GGG-起始的多肽连接，形成-LPXTGGG-序列，从而实现两段多肽的酶介导偶联。本发明中设计了四种不同的Sortase-A偶联后的FGF21蛋白C末端序列（如图1所示），并测试其细胞活性。
为了进一步验证本发明中的FGF21-1414及其突变体的活性，使用过量表达β-Klotho的HEK293细胞（细胞由康龙化成构建）测试了FGF21-1414及其突变体的对ERK信号通路的激活作用，具体实验步骤为使用DMEM+10%FBS+1*PS细胞培养基培养过表达β-Klotho的HEK293细胞，并在细胞培养至指数期时取20 μL细胞悬液加入白色384测定板中，加入适当的培养基和适当的细胞密度（5000/孔）中，置于37℃ 5% CO2下培养。FGF21-1414及其突变体在培养基中从3μM/6μM/15μM起始，3倍梯度稀释，在细胞实验板中加入10μl 化合物/孔。加入待测蛋白后的细胞置于37℃ 5% CO2培养箱中0.5小时。去除细胞上清液后加入16 μL细胞裂解缓冲液，在室温下振荡30~60 分钟。加入4 μL检测缓冲液中制备的预混抗体溶液，用封板模封好实验板，在室温下培养过夜后读取665nm和620nm处的荧光发射。结果如表4所示，该发明中所设计四种不同的Sortase-A偶联后的FGF21蛋白中，FGF21-P4具备同类野生型FGF21即FGF21-1414接近的细胞活性，可以供进一步的研究所用。
表4 四种不同的Sortase-A偶联后的FGF21蛋白细胞活性测试
FGF21-1414及突变体 在β-Klotho-ERK细胞活性（nM）
FGF21-1414 1.3
FGF21-P1 未检测到活性
FGF21-P2 未检测到活性
FGF21-P3 767.7
FGF21-P4 41.7
实施例4: 使用Sortase-A酶对GLP-1-FGF21融合蛋白进行脂肪酸链修饰
在该实施例中，我们使用Sortase-A酶对GLP-1-FGF21-P4进行了脂肪酸链修饰，具体操作步骤如图2所示。偶联多肽分子GGGSPSYKS由南京金斯瑞公司合成，具体修饰操作步骤如下：量取适量多肽分子GGGSPSYKS溶液（10mg/ml, pH值9.5）与脂肪酸链溶液（10mg/ml）以摩尔比1:1.2，体积比1:1（多肽分子不足体积用pH值9.5碳酸盐缓冲液补足）快速混匀，室温搅拌反应时间15-30min，得到偶联产物A。取适量GLP-1-FGF21-P4重组蛋白溶液（0.5-1.0mg/ml，pH值8.0），向其中加入摩尔数10倍于GLP-1-FGF21-P4的偶联产物A（即脂肪酸链修饰的偶联多肽分子）溶液，再向其中加入摩尔比为50:1（GLP-1-FGF21-P4：Sortase-A）的Sortase -A 溶液，最后加入50mM CaCl2溶液，使CaCl2在偶联反应体系的终浓度为5 mM, 室温搅拌反应16-24h后，终止偶联反应进行阴离子层析（GE Q-FF）纯化。终产品经碘染色SDS-PAGE分析，纯度在95%以上。偶连脂肪酸链后GLP-1-FGF21融合蛋白的质谱鉴定结果如图6所示。
实施例5: 经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白细胞活性实验
为了进一步验证经脂肪酸链修饰后的GLP-1-FGF21-P4-FA（FA=Fatty Acid，脂肪酸）的细胞活性，我们对该分子的细胞活性进行了检测，具体方法同实施例3中描述的方法保持一致，具体结果见表5。
表5 经脂肪酸链修饰后的GLP-1-FGF21-P4-FA细胞活性测试
GLP-1-FGF21及突变体 在β-Klotho-ERK细胞活性（nM）
GLP-1-FGF21-1414 1.3
GLP-1-FGF21-P4 16.2
GLP-1-FGF21-P4-FA 2.7
通过上述细胞活性实验可得知，融合有GLP-1的GLP-1-FGF21-P4融合蛋白同FGF21-P4的细胞活性类似，但经过脂肪酸链修饰后的GLP-1-FGF21-P4-FA活性大大增强，并达到类野生型FGF21即 FGF21-1414的类似活性，这可能是因为脂肪酸链的修饰改变了FGF21的构象并增强了其对受体的亲和力。
实施例6: FAP蛋白酶对经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白的酶切实验
FAP是体内存在的一种蛋白酶，它能特异性地切割FGF21第171-172之间的氨基酸，造成注射进体内或使体内存在的FGF21的C端不完整，进而不能与体内β-klotho受体结合，失去活性和组织特异性。本实施例利用此特性，进行体外FAP（购自百普赛斯，货号FAP-H5244）酶切实验，测试GLP-1-FGF21-P4分子被脂肪酸链修饰后是否具备减缓FAP蛋白酶水解的特性。实验按照文献（http://dx.doi.org/10.1016/j.molmet.2016.07.003）进行，结果如表6所示，当阴性对照FGF21-1414完全被FAP酶切完毕时（即100%被酶切时），GLP-1-FGF21-P4-FA仅有大约20%~30%被酶切，该过程不受HSA（人血清白蛋白）存在与否的影响。
表6 FAP蛋白酶对野生型GLP-1-FGF21-1414和突变体GLP-1-FGF21-P4-FA的酶切实验
实施例7: 经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21-P4-FA在DIO小鼠模型的药效实验
为了进一步验证该发明中的本发明中GLP-FGF21突变体融合蛋白的活性，我们选取了其中一个FGF21突变体融合蛋白GLP-1-FGF21-P4-FA，并使用6-7周龄的ob/ob小鼠（SPF级，常州卡文斯实验动物有限公司），适应期结束后，高脂饲料饲养3周，进入给药阶段，给药周期为4周。动物进入实验期后，持续7周喂养高脂饲料建立肥胖DIO小鼠模型。具体给药方案如下：
G1组为普通饲料饲养的动物（即Lean Mice），作为对照，共10只。
同时对高脂饲料饲养的动物进行分组，Day1作为给药的第一天，给药前血清TC 、LDL-C、空腹血糖、体重数据作为分组依据，将动物分为5组，每组10只，具体分组信息如下：G1组model（vehicle对照组，即ob/ob-Neg Ctr），G2组model（Semaglutide对照组, 30nmol/kg, sc, q3d），G3组model（GLP-1-FGF21-P4-FA实验组, 10nmol/kg, sc, q3d） ，G4组model（GLP-1-FGF21-P4-FA实验组, 30nmol/kg, sc, q3d），G5组model（GLP-1-FGF21-P4-FA实验组, 60nmol/kg, sc, q3d）。并持续监测血糖和体重的变化，第30天时，检测各组小鼠肝脏病理学变化，以测试分子对肝脏以及脂代谢的影响，结果如表5和图3~图5所示。
表7 不同给药组给药前后第24天总胆固醇TC和低密度脂蛋白LDL-C对比表
通过上述数据分析表明，GLP-1-FGF21-P4-FA在血糖、体重和脂代谢均显著优于对照分子Semaglutide，并具备明显剂量依赖性。
以上，详细描述了本发明的较佳具体实施例，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (27)

1.一种经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1-FGF21融合蛋白包括从N端到C端依次为GLP-1多肽或其活性片段、连接子、FGF21变体或其活性片段，所述FGF21变体或其活性片段的C端包含-LPXTG基序或其它任意可被Sortase-A酶识别的基序，所述FGF21变体或其活性片段的C端与偶联多肽连接，且所述偶联多肽的C端包含脂肪酸链修饰，其中，X为任意氨基酸，所述连接子为连接肽，所述偶联多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO: 10所示。
2.如权利要求1所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述FGF21变体是在野生型人类FGF21蛋白序列基础上突变得到，所述野生型人类FGF21的序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.如权利要求1所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述FGF21变体的序列如SEQ ID NO: 4所示。
4.如权利要求2所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述突变包括将SEQ ID NO: 1所示的序列第121位N替换为Q以及第168位M替换为L，所述FGF21变体的序列如SEQ ID NO: 4所示。
5.如权利要求1所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述FGF21变体序列如SEQ ID NO: 5-8中任一项所示。
6.如权利要求2所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述FGF21变体序列如SEQ ID NO: 5-8中任一项所示。
7.如权利要求1所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，所述FGF21变体序列如SEQ ID NO: 8所示。
8.如权利要求2所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，所述FGF21变体序列如SEQ ID NO: 8所示。
9.如权利要求5所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1多肽选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13。
10.如权利要求6所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1多肽选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13。
11.如权利要求9所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述脂肪酸链修饰是将脂肪酸链偶联在SEQ ID NO: 8所示序列的第180位氨基酸K的侧链NH2-上。
12.如权利要求10所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述脂肪酸链修饰是将脂肪酸链偶联在SEQ ID NO: 8所示序列的第180位氨基酸K的侧链NH2-上。
13.如权利要求1-12中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为GGGSGGGGS（SEQ ID NO:14）、（GGGGS）n、SGGGGSGGGG（SEQ ID NO:15）、GGGGGSGGGGSSGGGGS（SEQ ID NO:16）、GGGGSGGGGSGGGG（SEQ ID NO:17）、GGGGSGGGGSGGGSGGGGS（SEQ ID NO:18）、GSPGSSSSGS（SEQ ID NO:19）、GSGSGSGS（SEQ IDNO:20）、GSGSGNGS（SEQ ID NO:21）、GGSGSGSG（SEQ ID NO:22）、GGSGSG（SEQ ID NO:23）、GGSG（SEQ ID NO:24）、GGSGNGSG（SEQ ID NO:25）、GGNGSGSG（SEQ ID NO:26）、GGNGSG（SEQID NO:27）或（GGGGGS）n，n是1-5之间的整数。
14.如权利要求13所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，所述连接肽为GGGGSGGGGS（SEQ ID NO:28）或（GGGGS）4（SEQ ID NO:29）。
15.如权利要求1-12中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1-FGF21融合蛋白的序列如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 12所示。
16.如权利要求13所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1-FGF21融合蛋白的序列如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 12所示。
17.如权利要求14所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1-FGF21融合蛋白的序列如SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 12所示。
18.如权利要求1-17中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：1）获得所述GLP-1-FGF21融合蛋白，2）获得经脂肪酸链修饰的偶联多肽分子，并使用Sortase-A酶对所述GLP-1-FGF21融合蛋白进行脂肪酸链修饰。
19.如权利要求18所述的GLP-1-FGF21融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述脂肪酸修饰的步骤包括：合成偶联多肽分子，将偶联多肽分子与脂肪酸链溶液混合，室温搅拌，得到偶联产物A。
20.如权利要求19所述的GLP-1-FGF21融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述脂肪酸修饰的步骤还包括：将所述偶联产物A与所述GLP-1-FGF21融合蛋白混合，加入Sortase-A酶溶液，室温搅拌，得到所述经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白。
21.如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述偶联多肽如SEQ ID NO: 10所示，所述脂肪酸链修饰是将脂肪酸链偶联在SEQ ID NO: 10所示序列的第8位氨基酸K的侧链NH2-上。
22.一种药物组合物，其特征在于，含有安全有效量的如权利要求1-17中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白以及药学上可接受的载体。
23.一种药物组合物，其特征在于，含有安全有效量的权利要求18-21中任一项所述制备方法制备得到的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白以及药学上可接受的载体。
24.如权利要求1-17中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白在制备用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、肥胖症、代谢综合征或神经退行性疾病的药物中的应用。
25.如权利要求18-21中任一项所述的制备方法在制备用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病、肥胖症、代谢综合征或神经退行性疾病的药物中的应用。
26.如权利要求1-17中任一项所述的经脂肪酸链修饰的GLP-1-FGF21融合蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于延缓或预防2型糖尿病中的疾病进展，治疗代谢综合征，治疗肥胖症或预防超重，降低体重；控制血糖、血脂；预防减肥成功后的体重恢复；治疗贪食症；治疗暴食；治疗动脉粥样硬化、高血压、IGT、血脂异常、冠心病、脂肪肝，β-阻断剂中毒的治疗或用于抑制胃肠道的运动。
27.如权利要求18-21中任一项所述的制备方法在制备药物中的应用，所述药物用于延缓或预防2型糖尿病中的疾病进展，治疗代谢综合征，治疗肥胖症或预防超重，降低体重；控制血糖、血脂；预防减肥成功后的体重恢复；治疗贪食症；治疗暴食；治疗动脉粥样硬化、高血压、IGT、血脂异常、冠心病、脂肪肝，β-阻断剂中毒的治疗或用于抑制胃肠道的运动。
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