CN118272331B

CN118272331B - 一种烯还原酶突变体及其在(r)-香茅醛合成中的应用

Info

Publication number: CN118272331B
Application number: CN202410702566.2A
Authority: CN
Inventors: 张光祥; 姜君鹏; 赵伟; 张雅萍; 张永振; 黎源
Original assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Current assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Priority date: 2024-06-03
Filing date: 2024-06-03
Publication date: 2024-08-20
Anticipated expiration: 2044-06-03
Also published as: CN118272331A

Abstract

本发明公开了一种烯还原酶突变体及其在(R)‑香茅醛合成中的应用。本发明属于生物催化技术领域，所要解决的是现有烯还原酶催化合成(R)‑香茅醛技术存在的产品生产效率不高、光学纯度不高的问题。本发明公开的烯还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明提供的烯还原酶突变体能够高效催化柠檬醛生成(R)‑香茅醛，生产效率高达462.3 g L^‑1 d^‑1，产物(R)‑香茅醛的光学纯度(e.e.值)为99.0%，对于绿色高效制备(R)‑香茅醛具有重要工业应用价值。

Description

一种烯还原酶突变体及其在(R)-香茅醛合成中的应用

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种烯还原酶突变体，其编码核酸分子、重组载体、重组细胞，以及该烯还原酶突变体的制备方法和在制备(R)-香茅醛中的应用。

背景技术

(R)-香茅醛是合成重要香料L-薄荷醇的关键前体，也可用于合成羟基香茅醛和香茅醇酯等香料，广泛应用于食品、饮料、日用精细化工产品。目前工业上主要采用化学催化方法合成(R)-香茅醛，如日本高砂(Takasago)公司发明的手性BINAP-Rh⁺配位催化剂，但存在金属配体催化剂设计难，反应条件严苛，(R)-香茅醛的光学纯度不高等问题。通过生物催化法合成(R)-香茅醛，即由烯还原酶介导的对映归一性催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛技术具有工艺简单、反应条件温和、符合原子经济性、绿色环保的优点，极具应用价值。

发明专利CN113337450B公开了热带假丝酵母(Candida tropicalis)来源的烯还原酶HP3，催化转化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛反应20小时转化率达到99%以上，但e.e.值仅为95.4%，仍有提升空间。

现有烯还原酶参与的生物催化法制备(R)-香茅醛技术路线中，仍然存在关键酶—烯还原酶生产效率较低的问题，限制其工业规模应用。因此，通过基因组数据挖掘和定向进化等方法开发高催化效率的烯还原酶，绿色高效合成(R)-香茅醛具有重要工业应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化性能显著提升的烯还原酶，从而解决现有烯还原酶催化合成(R)-香茅醛技术存在的产品生产效率不高、光学纯度不高的问题。

具体地，本发明以来源于维斯假丝酵母菌(Candida viswanathii)的野生型烯还原酶CvDH(Candida viswanathiidehydrogenase)作为原始序列（其氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），对其进行定向进化，从而得到在催化性能方面显著改善的烯还原酶突变体CvDH-A181R。

在第一方面，本发明提供一种催化活性提高的烯还原酶突变体，其相对于SEQ IDNO: 2所示的野生型烯还原酶CvDH，第181位的氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸，该烯还原酶突变体命名为CvDH-A181R，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，该突变体可以高效催化底物柠檬醛生成(R)-香茅醛。

本发明提供的上述突变体可人工合成，也可通过先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物（例如大肠杆菌）或真核生物（例如酵母、高等植物）中表达获得。

在一些实施方案中，上述烯还原酶突变体是通过将含有其编码基因的重组表达载体转化进入大肠杆菌（例如E.coliBL21 (DE3) ）构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到。

在第二方面，本发明提供一种编码上述烯还原酶突变体的核酸分子。

在一些实施方案中，编码上述烯还原酶突变体的核酸分子如SEQ ID NO: 3所示。

本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用PCR仪扩增或人工合成的方法获得。

在第三方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子；

所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关基因，所述表达载体用于表达相关基因。

在一些实施方案中，上述重组载体为重组表达载体pET-26b(+)-CvDH-A181R。

在第四方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的核酸分子和/或重组载体。

在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述烯还原酶突变体。

在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：

将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到上述烯还原酶突变体。

进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，能满足重组载体可稳定地自行复制，并且其所携带基因可被有效表达即可，可以为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主E.coliBL21 (DE3）。

在一些实施方案中，所述重组细胞为E.coliBL21(DE3)/ pET-26b(+)-CvDH-A181R，是将重组表达载体pET-26b(+)-CvDH-A181R转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得的重组基因工程菌。重组基因工程菌表达烯还原酶突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本发明的烯还原酶突变体的培养基，例如LB培养基。

培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并在适当温度条件下诱导表达烯还原酶突变体。优选的培养方法为：将重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET-26b(+)-CvDH-A181R接种至装有含卡那霉素的LB液体培养基的试管中，37°C、220 rpm培养12 小时，按1-2%(v/v)的接种量转接至装有100 mL 含卡那霉素的LB液体培养基的500 mL摇瓶中，置于37°C、220 rpm培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为100-500 μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16°C条件下诱导16-24小时后，将培养液离心，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，获得重组细胞。

在第五方面，本发明提供一种制备烯还原酶的方法，包括：

1）对上述任一所述的重组细胞进行培养并诱导上述烯还原酶突变体CvDH-A181R表达；

2）从1）得到的培养物中分离上述烯还原酶突变体CvDH-A181R。

其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将烯还原酶突变体CvDH-A181R从培养物中分离出来的方法均为本领域常规方法。

在第六方面，本发明提供上述烯还原酶突变体、上述任一所述的核酸分子、上述任一所述的重组载体和/或上述任一所述的重组细胞在制备(R)-香茅醛中的应用，例如用于催化底物柠檬醛发生还原反应生成(R)-香茅醛。

在第七方面，本发明提供一种制备(R)-香茅醛的方法，包括：以上述烯还原酶突变体、上述任一所述的重组细胞和/或上述任一所述方法制备得到的烯还原酶突变体作为催化剂，催化柠檬醛进行还原反应，得到(R)-香茅醛。

在一些实施方案中，上述方法中，所述还原反应的底物为(E/Z)-柠檬醛、(E)-柠檬醛或(Z)-柠檬醛；

其中，(E/Z)-柠檬醛是(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，可以任意比例混合，例如摩尔比为100:1至1:100的(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，例如摩尔比为100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、1:1、1:20、1:40、1:60、1:80、1:100的(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，所述还原反应的pH为5-9，例如pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选pH8.5。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，所述还原反应的温度为30-50°C，例如30°C、35°C、40°C、45°C、50°C，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选35°C。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，使用NADPH和/或NADH作为辅因子进行所述还原反应；在一些实施方案中，通过酶促再生所述辅因子，例如通过葡萄糖脱氢酶再生所述辅因子；所述葡萄糖脱氢酶可以作为游离或固定化酶，或者以游离或固定化细胞的形式使用，可以单独制备，也可在表达上述烯还原酶的重组细胞中共表达葡萄糖脱氢酶。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，所述还原反应为水相-有机相双相反应体系。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，所述还原反应的投料包括：(E/Z)-柠檬醛、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、NADH、烯还原酶；

(E/Z)-柠檬醛的终浓度为50-500 mM，例如50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选500mM，(E/Z)-柠檬醛以用正己烷、正庚烷和/或乙酸乙酯配制为底物溶液的形式加入；

葡萄糖的添加量为(E/Z)-柠檬醛的1.0-1.10倍当量，例如1.0、1.02、1.04、1.06、1.08、1.10倍当量，优选1.02倍当量；

葡萄糖脱氢酶的终浓度为1-10 g/L，例如1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选2 g/L；

NADH的终浓度为0.1-0.3 mM，例如0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选0.2 mM。

在一些实施方案中，上述任一方法所述还原反应中，如果正己烷、正庚烷和/或乙酸乙酯的体积百分含量不足10%，需补入正己烷、正庚烷和/或乙酸乙酯使得其体积百分含量为10%-50%。

在一些实施方案中，上述任一方法所述还原反应使用的缓冲液为本领域常规缓冲液，如磷酸盐缓冲液，其浓度为50-500 mM，优选100 mM。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，包括用上述任一所述的重组细胞催化柠檬醛进行还原反应，得到(R)-香茅醛；

具体地，可以以上述重组细胞的冻干细胞或冻干粉作为催化剂进行全细胞催化生产(R)-香茅醛，冻干细胞或冻干粉的用量为0.66-13.16 g/g柠檬醛，例如，0.66、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.16 g/g柠檬醛，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，可以为0.99 g/g柠檬醛。其中，冻干粉是将上述任一所述的重组细胞进行破碎，获得细胞破碎液，再将细胞破碎液经冷冻干燥而得到，冻干细胞是将重组细胞不经破碎直接冻干得到。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，反应体系加入终浓度为50-500 mM的(E/Z)-柠檬醛、(E/Z)-柠檬醛1.0-1.10倍当量的葡萄糖、终浓度为1-10 g/L的葡萄糖脱氢酶、终浓度为0.1-0.3 mM的NADH和添加量为0.66-13.16 g/g(E/Z)-柠檬醛的上述任一所述重组细胞的冻干细胞、体积百分含量为10%-50%的正己烷、正庚烷和/或乙酸乙酯，在pH为5-9、浓度为50-500 mM的磷酸盐缓冲液中于30-50°C下进行搅拌反应。

应当理解的是，本发明所述的烯还原酶突变体CvDH-A181R可以以工程菌全细胞形式使用，也可以未经纯化的粗酶形式使用，也可以部分纯化或完全纯化的酶形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的烯还原酶突变体CvDH-A181R制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

在一些实施方案中，上述任一所述方法中，所述还原反应在搅拌或者振荡的环境下进行，例如在100-500 rpm搅拌下反应。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的烯还原酶突变体CvDH-A181R能够高效催化柠檬醛生成(R)-香茅醛，生产效率高达462.3 g L^-1d^-1，产物(R)-香茅醛的光学纯度(e.e.值)为99.0%，对于绿色高效制备(R)-香茅醛具有重要工业应用价值。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

pET-26b(+)为Novagen公司产品，产品目录号为69862-3CN。

橙花醛标准品（(Z)-柠檬醛）、香叶醛标准品（(E)-柠檬醛）为衢州市瑞尔丰化工有限公司产品。

(S)-香茅醛标准品为上海源叶生物科技有限公司产品，产品目录号为B29239。

(R)-香茅醛标准品为上海源叶生物科技有限公司产品，产品目录号为S28339。

实施例中使用的(E/Z)-柠檬醛为(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，为阿拉丁产品，E-柠檬醛和Z-柠檬醛的摩尔比为1:1。

实施例中使用的葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，基因序列如SEQ ID NO: 5所示。

实施例1：pET-26b(+)-CvDH-A181R的构建

以SEQ ID NO: 1所示的CvDH基因序列为模板，以CvDH-FP和CvDH-RP为引物进行PCR，得到含有CvDH基因的片段；BamHI和NotI双酶切含有CvDH基因的片段，得到基因片段；BamHI和NotI双酶切pET-26b(+)，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接，得到重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH，经全质粒测序，结果与预期一致。重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH中含有编码来源于维斯假丝酵母菌(Candida viswanathii)的野生型烯还原酶CvDH（NCBISequence ID: RCK57628.1）的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 1所示，其编码的野生型烯还原酶CvDH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

CvDH-FP：5’-cagtGGATCCATGACTATCGACGCTGAAAAATTCC-3’(SEQ ID NO: 7)；

CvDH-RP：5’-cagtGCGGCCGCCTAAACCAAAGCTGTAGGGAAG-3’(SEQ ID NO: 8)。

以重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH为模板，以CvDH-A181R-FP和CvDH-A181R-RP为引物进行全质粒PCR，引入A181R突变位点，得到重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH-A181R，将该质粒送测序，结果与预期一致。重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH-A181R中含有的烯还原酶突变体CvDH-A181R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其编码的烯还原酶突变体CvDH-A181R的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

CvDH-A181R-FP：5’-CAAGAAACCGTCTTGCTGCGGGATTCG-3’ (SEQ ID NO: 9)；

CvDH-A181R-RP：5’-CAGCAAGACGGTTTCTTGCAGCGTTAGG-3’ (SEQ ID NO: 10)。

与SEQ ID NO: 2所示的野生型烯还原酶CvDH相比，烯还原酶突变体CvDH-A181R第181位的氨基酸由丙氨酸突变为精氨酸。

实施例2：野生型CvDH表达菌株和突变体CvDH-A181R表达菌株的构建

将实施例1获得的突变体重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH-A181R，通过化学转化的方式转入表达宿主E. coliBL21(DE3)中，涂布含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，得到表达突变体CvDH-A181R的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-26b(+)-CvDH-A181R。

按照同样方法获得表达野生型CvDH的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-26b(+)-CvDH，区别仅在于将重组表达质粒pET-26b(+)-CvDH-A181R替换为pET-26b(+)-CvDH。

实施例3：酶的制备

将实施例2获得的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-26b(+)-CvDH-A181R接种至装有含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的试管中，于37°C、220 rpm培养12小时，之后按1%(v/v)的接种量转接至装有100 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的500 mL摇瓶中，于37°C、220 rpm培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，加入终浓度为300 μM的诱导剂IPTG，于16°C诱导培养20小时，将诱导培养的菌液于9000 rpm离心10分钟，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将静息细胞直接冻干得到突变体CvDH-A181R的冻干细胞，或经超声破碎后冻干得到冻干粉，并于4℃保存。

按照同样方法获得野生型CvDH的冻干细胞和冻干粉，区别仅在于将重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-26b(+)-CvDH-A181R替换为E.coliBL21(DE3)/pET-26b(+)-CvDH。

实施例4：酶催化制备(R)-香茅醛

将实施例3中制得的突变体酶CvDH-A181R作为生物催化剂应用于(R)-香茅醛的制备反应。

100 mL反应体系：500 mM (E/Z)-柠檬醛（(E/Z)-柠檬醛以用正己烷配制为浓度3M底物溶液的形式加入），510 mM葡萄糖（以葡萄糖水溶液形式加入），2 g/L葡萄糖脱氢酶，0.2 mM NADH（以NADH水溶液形式加入），补入正己烷使得体系中正己烷的体积百分含量为20%，实施例3中获得的突变体CvDH-A181R的冻干细胞7.5 g（相当于0.99 g/g (E/Z)-柠檬醛），100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.5）补齐至100 mL，于35°C条件下200 rpm搅拌反应4小时。

反应式如下：

反应结束后，取1 mL反应液加入等体积乙酸乙酯，反复颠倒混合后，于10000 rpm离心10 min，取出上清液，再次加入等体积的乙酸乙酯，按上述方法萃取，将两次收集的上清溶液混合，加入无水硫酸钠干燥，将干燥后的样品于10000 rpm离心10 min，取适量上清萃取液经气相色谱分析，检测(E/Z)-柠檬醛和香茅醛的含量。

气相色谱检测方法为：HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，分流比10:1，进样温度：220°C；FID检测器温度：250°C；载气：氮气，54 mL/min；空气流量：400 mL/min；氢气流量：30 mL/min；柱流速：1 mL/min；进样体积：1 μL；起始柱温为100°C，维持2 min，以10°C/min速率升温至150°C维持4 min。以外标法得到香茅醛和柠檬醛（(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛）的含量。

香茅醛标准品（混旋香茅醛，购自阿拉丁，产品目录号为C118628-1ml）、橙花醛标准品、香叶醛标准品的保留时间分别为3.687 min、4.609 min、4.920 min。

反应液中，香茅醛的保留时间为3.687 min。

产物香茅醛对映选择性检测使用β-DEX225气相毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)，分流比100:1；进样温度：220°C；FID检测器温度：250°C；载气：氮气，34 mL/min；空气流量：400 mL/min；氢气流量：40 mL/min；柱流速：1 mL/min；进样体积：1 μL；起始柱温为95°C，维持35 min，以5°C/min速率升温至160°C维持2 min，以10°C/min速率升温至200°C维持5min。以外标法得到(S)-香茅醛和(R)-香茅醛的含量。

(S)-香茅醛标准品和(R)-香茅醛标准品的保留时间分别为25.058 min和25.145min。

反应液中，(S)-香茅醛和(R)-香茅醛的保留时间分别为25.058 min和25.145min。

经计算，底物(E/Z)-柠檬醛转化率（转化率=(反应物初始的量-反应物剩余的量)/反应物初始的量×100%）为99.9%，产物(R)-香茅醛的生产效率（生产效率=反应生成的产物的量/(反应体积*反应时间)）为462.3 g L^-1d^-1，产物(R)-香茅醛的光学纯度(e.e.值)为99.0%。

按照同样方法使用野生型CvDH的冻干细胞进行(R)-香茅醛制备反应，区别仅在于将突变体CvDH-A181R冻干细胞替换为野生型CvDH冻干细胞。经计算，底物(E/Z)-柠檬醛转化率为53%，产物(R)-香茅醛的生产效率为245.3 g L^-1d^-1，产物(R)-香茅醛的光学纯度(e.e.值)为99.0%。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种烯还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

2.编码权利要求1所述的烯还原酶突变体的核酸分子。

3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组细胞，其包含权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3所述的重组载体；

所述重组细胞为非动物或植物品种。

5.一种制备烯还原酶的方法：包括：

1）对权利要求4所述的重组细胞进行培养并诱导权利要求1所述的烯还原酶突变体表达；

2）从1）得到的培养物中分离权利要求1所述的烯还原酶突变体。

6.权利要求1所述的烯还原酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体和/或权利要求4所述的重组细胞在制备(R)-香茅醛中的应用。

7.一种制备(R)-香茅醛的方法，包括：以权利要求1所述的烯还原酶突变体、权利要求4所述的重组细胞和/或权利要求5所述方法制备得到的烯还原酶作为催化剂，催化柠檬醛进行还原反应，得到(R)-香茅醛。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述还原反应的底物为(E/Z)-柠檬醛、(E)-柠檬醛或(Z)-柠檬醛。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述还原反应的体系pH为5-9。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：所述还原反应的温度为30-50°C。