CN118240788A - 酶活性提高的硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酶活性提高的硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因与应用，属于生物技术领域，其特征在于所述硫酸软骨素合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述突变体编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.3的第418位为苯丙氨酸，利用所述的硫酸软骨素合酶在合成硫酸软骨素糖链中的应用。本发明的有益效果是：硫酸软骨素合酶PmCS突变体，在大肠杆菌中具有较高的重组表达水平，相较PmCS略有提升，提高了硫酸软骨素合成中GalNAc转移合成效率，极大地促进了硫酸软骨素生物合成的应用化发展，促进了糖胺聚糖类药物的研究发展。

Description

酶活性提高的硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因与应用

技术领域：

本发明涉及一种硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因与应用，具体涉及来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteuuella multocida)的硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因与它们在硫酸软骨素合成中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

软骨素(Chondroitin,简称CH)，是一种重要的糖胺聚糖，由D-β-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺形成重复二糖单位所构成，也是脊椎动物体内合成硫酸软骨素(Chondroitinsulfate,简称CS)的前体。CS是一种具有代表性的硫酸化糖胺聚糖(GAG)，以蛋白聚糖的形式广泛存在于细胞表面和细胞外/细胞周围基质中，其中至少一条CS侧链共价连接到一组核心蛋白上。CS不仅与细胞分裂，形态发生和神经元可塑性等多种生理事件有关，还与骨骼疾病，脑损伤后的神经胶质瘢痕形成以及病毒和细菌感染等病理过程相关。CS在医学上的主要用途是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，可以止痛抗炎，促进软骨再生，是一种十分重要的生物技术领域药物。

目前商业化CS主要来源于牛气管、猪鼻中隔、鸡龙骨、鱼翅和鱼软骨，工业生产主要采用浓碱法、酶法提取。然而天然提取的方法安全性低，产业化水平低，环境污染严重。并且产品质量由于原材料差异大不易控制，在生产过程中容易引入其他糖胺聚糖杂质，严重制约其在临床方面的应用。因此，建立一种有效方法来生产非动物组织来源的，结构均一确定的CS在生物技术领域是十分必要的。

与化学合成法相比，化学酶法合成策略因具有立体选择性强，产率高，反应温和，产品质量均一稳定，生产过程相对简单，对于药物研制具有重要意义，有望发展成为一种理想的硫酸软骨素寡糖的合成新技术。化学酶法所使用工具酶是推动该策略进一步发展的制约步骤。

尽管来源于多杀巴斯德杆菌的硫酸软骨素合酶基因及其制造和使用方法已被报道(United States Patent 7569386)，但此法是以寡糖为底物，得到的产物是具有广泛分子量分布(100～400kDa)的不同链长的CS混合物，临床应用存在挑战，同时受制于此硫酸软骨素合酶活性弱的影响，亦难以用于大规模工业化生产。

经过多年研究，本人意外发现了一种全新来源的硫酸软骨素合酶，该酶来源于尿放线杆菌(Actinobacillus Ureae)，同时具备乙酰半乳糖胺转移酶GalNAc-T和葡萄糖醛酸转移酶GlcA-T两种转移酶活性，除了其天然底物UDP-GalNAc外，还可以利用独特的糖基供体UDP-GalNAz转移至非还原端为GlcA的硫酸软骨素糖链上，从而合成糖链结构中带有叠氮基团的非天然的硫酸软骨素寡糖，因此就上述方案申请了发明专利并获得了授权，其中专利号为201910358812.6国家发明专利，主题名称为一种硫酸软骨素合酶及其编码基因与应用，通过本法获得硫酸软骨素合酶具有较高的酶活性，尤其是在低温条件下，在10℃时，酶转化率将近100％，但是在30-40℃时，酶转化率约为17％，此外该法获得硫酸软骨素合酶的酶表达量较低，仅为15mg/L，不能满足工业扩大生产的需要，

为了解决硫酸软骨素合酶的酶表达量较低，仅为15mg/L，不能满足工业扩大生产的需要，本发明人查阅了大量文献，报道了一种硫酸软骨素合酶PmCS来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteuuellamultocida)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该文献报道的硫酸软骨素合酶在相同的检测水平条件下，硫酸软骨素合酶的酶表达量较高，达58mg/L；但是该硫酸软骨素合酶酶活较低，酶的转化率较低，不能满足生产的需求。

发明内容：

为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteuuella multocida)的硫酸软骨素合酶及其突变体编码基因，该硫酸软骨素合酶应用在于硫酸软骨素糖链的合成，能够有效的解决硫酸软骨素合酶的酶表达量不足和酶活较低不能适用于生产的问题。

本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：硫酸软骨素合酶，其特征在于所述硫酸软骨素合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变体编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

其中，所述突变体编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.3的第418位为苯丙氨酸。

一种重组载体，在质粒载体中插入所述的硫酸软骨素合酶的突变体编码基因。

根据本发明优选的，所述质粒载体为pET28a(+)。

一种重组菌株，将重组载体转化入宿主细胞中获得。

本发明中，含有目的基因的重组载体由南京金斯瑞公司合成。

一种重组菌株，是将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。

根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

一种硫酸软骨素合酶的用途，利用所述的硫酸软骨素合酶在合成硫酸软骨素糖链中的应用。所述硫酸软骨素合酶能够以GlcA-pNP作为起始受体，UDP-GalNAc作为供体，生成结构为GalNAc-GlcA-pNP的硫酸软骨素二糖；

作为本发明的优选方案，所述硫酸软骨素合酶还可以以GalNAc-GlcA-pNP作为受体，UDP-GlcA作为供体生成结构为GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的硫酸软骨素三糖。

本发明的有益效果是：

本发明公开的硫酸软骨素合酶PmCS突变体，在大肠杆菌中具有较高的重组表达水平，相较PmCS略有提升。

突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶同时具有GalNAc与GlcA的转移酶活性，在适宜条件下可以利用底物GlcA-pNP和UDP-GalNAc有效地合成硫酸软骨素二糖骨架，利用GalNAc-GlcA-pNP与UDP-GlcA生成硫酸软骨素三糖骨架。

本发明设计突变体PmCS(I418F)得到了比PmCS活性更高的突变体，提高了硫酸软骨素合成中GalNAc转移合成效率，极大地促进了硫酸软骨素生物合成的应用化发展，促进了糖胺聚糖类药物的研究发展。

附图说明：

图1为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体在大肠杆菌中可溶性表达纯化的SDS-PAGE检测结果图；

图中：M为Marker；其余条带为纯化得到的PmCS及其突变体的重组蛋白，I418F为PmCS(I418F)；

图2为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体的蛋白定量标准曲线；

图3为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体在大肠杆菌中的可溶表达量柱状图；

图4为硫酸软骨素合酶PmCS反应产物的HPLC色谱图；

图5为硫酸软骨素合酶PmCS及不同其突变体在GalNAc-GlcA-pNP合成中的酶活比较；

图6为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体反应产物GalNAc-GlcA-pNP经分离纯化后的HPLC色谱图；

图7为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体反应产物GalNAc-GlcA-pNP的质谱图；

图8为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体反应产物GlcA-GalNAc-GlcA-pNP经分离纯化后的HPLC色谱图；

图9为硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体反应产物GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的质谱图；

图10为硫酸软骨素合酶PmCS及相同位点的不同其突变体在GalNAc-GlcA-pNP合成中的酶活比较；

具体实施方式：

在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明的具体实施方式：

为了更好的理解本发明特以具体的实施例进行说明，值得强调的是该实施例的效果与本发明保护范围内的各种实施例，包括各自试剂及试剂的含量配比无实质性差异，均能够实现本发明所描述的效果及解决上述问题，其他组合在此不做累述；

发明人通过文献调研发现来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteuuella multocida)的硫酸软骨素合酶PmCS已被报道，但受制于此硫酸软骨素合酶活性较弱，难以用于结构均一确定的硫酸软骨素寡糖的生物合成。因此，发明人期望通过多种方式进行酶的定向进化，用以提高酶活。

发明人对于PmCS的氨基酸序列，进行序列同源分析，使用EMBL Clustal Omega工具进行多序列比对，并使用Jalview软件对于氨基酸序列高保守区域进行分析。同时使用Swiss-Model工具对PmCS进行蛋白质模拟建模，

设计了突变体PmCS(I418F)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

其中，突变体PmCS(I418F)与文献中的硫酸软骨素合酶PmCS其氨基酸序列如SEQID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，相比，区别在于所述突变体编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.3的第418位为苯丙氨酸；

本发明使用的GlcA-pNP、UDP-GalNAc、UDP-GlcA均采购于Sigma公司。所用PmCS及其突变体质粒均委托南京金斯瑞生物股份有限公司生产。使用的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。使用YMC的氨基柱进行HPLC检测，液相系统为日本岛津公司生产，紫外检测系统为SPD-20A。检测PmCS及其突变体催化产物经色谱柱分离后各组分在310nm和254nm的紫外吸收。

实施例1.

硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体的蛋白的表达与纯化

(1)表达菌株的构建：

硫酸软骨素合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中所述突变体编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.3的第418位为苯丙氨酸。

人工合成硫酸软骨素合酶PmCS的核苷酸序列，并将上述核苷酸序列插入到质粒载体pET28a(+)中，构建得到重组质粒pET28a(+)-PmCS，上述操作均由南京金斯瑞公司协助完成。

将南京金斯瑞公司生产的重组载体质粒pET28a(+)-PmCS转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上(同时进行阴性对照实验)，恒温箱37℃培养12h，筛选阳性转化子。

使用上述相同方法得到突变体PmCS(I418F)的阳性转化子。

(2)PmCS及其突变体重组蛋白的表达和纯化

挑取PmCS阳性转化子单菌落于25mL灭菌的LB培养基(100μg/mL卡那霉素)，37℃，225r/min过夜培养；将活化的菌液按照1％接种量接入1L LB培养基(100μg/mL卡那霉素)中，37℃，225r/min培养约3h至OD600约为0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于22℃，225r/min条件下诱导16～18h，然后收集菌体；

使用平衡缓冲液(20mM咪唑；0.5M NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝8.00)重悬，冰上超声破碎(工作15s，间歇45s，振幅33％，能量1500KJ，4℃)30min，将破碎后菌体12000rpm离心20min，收集上清；上清用0.22μm滤膜过滤，使用镍柱进行蛋白纯化，上样后用平衡缓冲液洗涤，然后用洗杂缓冲液(40mM咪唑；0.5M NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝8.00)洗掉杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(250mM咪唑；0.5M NaCl；20mM Tris-HCl，pH＝8.00)洗脱得到目的蛋白。纯化得到的蛋白质保存在20％甘油中，分装保存在-80℃冰箱。

按照上述相同方法纯化突变体PmCS(I418F)的重组蛋白。

通过SDS-PAGE对纯化后的PmCS及其突变体蛋白进行鉴定，如图1所示，PmCS及其突变体PmCS(I418F)均成功使用此法纯化得到重组蛋白，且相对纯度都达到了95％以上。

使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天P0006)对纯化得到的蛋白进行定量。取试剂盒中BSA蛋白标准溶液(5mg/mL)，分别配制0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL蛋白标准溶液。取5μL不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中，取5μL样品到96孔板的样品孔中，各孔加入250μL G250染色液，用酶标仪测定各孔595nm处的吸光度，根据标准曲线与使用样品体积计算出样品中的蛋白浓度。

PmCS蛋白定量的标准曲线如图2所示。经计算，PmCS在每升LB液体培养基的重组表达量可达58mg/L，按照上述相同方法测定突变体PmCS(I418F)的表达水平，结果如图3所示，发现该突变体相较PmCS表达水平略有提升，可达62mg/L。

为了更加直观的展现本发明的突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶催化活性的优势，对硫酸软骨素合酶PmCS和突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶催化活性进行比较，

具体地，用商业化GlcA-pNP(终浓度1mM)作为受体底物，UDP-GalNAc(终浓度1.5mM)作为供体底物进行反应，反应体系如表1所示；置于37℃水浴锅中反应3h，沸水加热5min使酶失活终止反应，反应液用0.22μm的滤膜过滤后进行HPLC检测，检测方法见表2，流动相流速为0.5mL/min，所得色谱结果如图4所示。

表1.PmCS及其突变体的催化活性的比较反应体系

表2.检测硫酸软骨素寡糖所使用HPLC分析方法

此外，通过使用同样的方法检测突变体PmCS(I418F)的GalNAc转移酶活性。由反应转化率及蛋白的使用量计算各蛋白的酶活，结果如图5所示，突变体PmCS(I418F)相较PmCS酶活有着显著提升，为原来的1.5倍，该突变体是高效催化硫酸软骨素糖链合成的有效工具酶。

为了更加直观的展现本发明的突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶在硫酸软骨素合成中的应用的优势，对硫酸软骨素合酶PmCS及其突变体在硫酸软骨素合成中的应用进行比较。

(1)硫酸软骨素二糖GalNAc-GlcA-pNP的合成与纯化

依照表1中的反应体系进行等比扩大，以制备足量的目标产物二糖。合成进度使用HPLC进行实时检测，检测方法见表2，根据实际情况补加一定的酶和原料。待底物转化率超过99％后，进行除酶：将样品冷却，加入等体积的冰乙醇，4℃保存30min，然后12000rpm离心10min。将上清旋蒸至体积仅有2ml左右，转移至使用0.1M碳酸氢铵平衡好的Bio-Gel P-2层析柱内(Φ2cm*80cm)进行层析纯化，0.1M碳酸氢铵等度洗脱，收集纯度＞90％的产物至收集管，进行离心浓缩或冻干。HPLC检测产物纯度，如图6所示，所得产物纯度＞99％。

(2)硫酸软骨素二糖GalNAc-GlcA-pNP的质谱确证

为确认上述产物结构为GalNAc-GlcA-pNP，对产物进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。MS的所有样品都是通过溶解在50％甲醇中制备的。MS实验在负离子模式下进行，喷雾电压为5kV，毛细管温度为275℃。

质谱分析结果如图7所示，MS图谱中得到了与GalNAc-GlcA-pNP(Mw＝518.14)脱去一个质子后分子量相符合的峰(517.02)，并且其二倍峰(1034.72)同时被检测到，证明产物GalNAc-GlcA-pNP的生成。

(3)硫酸软骨素三糖GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的合成与纯化

依照表3中的反应体系进行等比放大，以制备足够量的目标产物三糖。合成进度使用HPLC进行实时检测，检测方法见表2，并根据实际情况补加一定的酶和原料。待底物转化率超过99％后，进行除酶，随后使用P-2层析柱分离收集产物。HPLC检测产物纯度，如图8所示，所得产物纯度＞99％。

表3.硫酸软骨素三糖合成反应体系

(4)硫酸软骨素二糖GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的质谱确证

为确认产物结构为GlcA-GalNAc-GlcA-pNP，对产物进行MS分析。质谱分析结果如图9所示，MS图谱中得到了与GlcA-GalNAc-GlcA-pNP(Mw＝694.17)脱去一个质子后分子量相符合的峰(692.92)，证明产物GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的生成。

为了更加直观的展现本发明的工艺优势，特以本发明采用突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶和采用等效替换的方法进行对比，

对比例1：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，PmCS氨基酸替换位点不同，氨基酸种类替换不同；

具体地：分别为252位组氨酸替换为谷氨酰胺，264位缬氨酸替换为丙氨酸，304位异亮氨酸替换为甘氨酸，418位异亮氨酸替换为苯丙氨酸，461位缬氨酸替换为苏氨酸，其酶活性测定方法参照本实施方法，比较结果详见图5；

由图5可知，

252位组氨酸替换为谷氨酰胺后，PmCS(H252Q)的硫酸软骨素合酶与原始核苷酸序列的PmCS的硫酸软骨素合酶酶活差异性不大；

此外PmCS(V264A)的硫酸软骨素合酶和PmCS(I304G)的硫酸软骨素合酶与原始核苷酸序列的PmCS的硫酸软骨素合酶酶活相比有所降低，且降低幅度不同；尤其是PmCS(V461T)的硫酸软骨素合酶的酶活极低，不满足生产需要，

由此可见，PmCS的氨基酸替换位点与酶活性之间不存在必然关系。

为了更加直观的展现本发明的工艺优势，特以本发明采用突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶和采用等效替换的方法进行对比，

对比例2：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，PmCS氨基酸替换位点相同，氨基酸种类替换不同；

具体地：分别将418位异亮氨酸替换为丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸，其酶活性测定方法参照本实施方法，比较结果详见图10；

由图10可知，PmCS的的418位氨基酸替换为其他氨基酸后，均存在不同幅度的酶活降低，现只有替换为苯丙氨酸后其酶活性存在显著提升，为原来的1.5倍。

尤其是PmCS(I148A)的硫酸软骨素合酶的酶活极低，不满足生产需要，

由此可见，PmCS的相同氨基酸替换位点的不同氨基酸替换种类与酶活性之间也不存在必然关系。

综上所述：

本发明公开的硫酸软骨素合酶PmCS突变体，在大肠杆菌中具有较高的重组表达水平，相较PmCS略有提升。

突变体PmCS(I418F)的硫酸软骨素合酶同时具有GalNAc与GlcA的转移酶活性，在适宜条件下可以利用底物GlcA-pNP和UDP-GalNAc有效地合成硫酸软骨素二糖骨架，利用GalNAc-GlcA-pNP与UDP-GlcA生成硫酸软骨素三糖骨架。

本发明设计突变体PmCS(I418F)得到了比PmCS活性更高的突变体，提高了硫酸软骨素合成中GalNAc转移合成效率，极大地促进了硫酸软骨素生物合成的应用化发展，促进了糖胺聚糖类药物的研究发展。

Claims (9)

1.一种硫酸软骨素合酶，其特征在于所述硫酸软骨素合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素合酶，其特征在于所述突变体编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO.3的第418位为苯丙氨酸。

3.一种硫酸软骨素合酶的用途，其特征在于，利用如权利要1或2所述的硫酸软骨素合酶在合成硫酸软骨素糖链中的应用。

4.根据权利要求3所述的硫酸软骨素合酶的用途，其特征在于所述硫酸软骨素合酶能够以GlcA-pNP作为起始受体，UDP-GalNAc作为供体，生成结构为GalNAc-GlcA-pNP的硫酸软骨素二糖。

5.根据权利要求3所述的硫酸软骨素合酶的用途，其特征在于所述硫酸软骨素合酶能够以GalNAc-GlcA-pNP作为受体，UDP-GlcA作为供体生成结构为GlcA-GalNAc-GlcA-pNP的硫酸软骨素三糖。

6.一种重组载体，其特征在于在质粒载体中插入如权利要求1或2所述的硫酸软骨素合酶的突变体编码基因。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述质粒载体为pET28a(+)。

8.一种重组菌株，其特征在于将权利要求6所述的重组载体转化入宿主细胞中获得。

9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。