CN118221826B - 一种结合人cd33和cd3的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，涉及生物医药技术领域，本发明所提供的结合人CD33和CD3的双特异性抗体，利用人体自身的T细胞来杀伤CD33阳性的细胞，以达到治疗髓系白血病的目的，在K193的基础上设计了新的双特异性抗体分子，该分子结构的双特异抗体是在标准IgG1分子结构的轻链的C端通过亲水性连接子连接低亲和力的CD3ε‑ScFv单链抗体，从而达到优先与CD33靶标结合的目的，同时识别CD33阳性的髓系白血病细胞和人体自身的T细胞，这种特异性使EK333F成为一种高度定向的治疗药物，能够将T细胞导向攻击白血病细胞，同时减少对正常细胞的不必要影响。

Description

一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体。

背景技术

急性髓细胞白血病(AML)是一种以白血病细胞克隆性扩增为特征的遗传异质性疾病。尽管人们对急性髓细胞白血病的生物学有了更深入的了解，并且最近又批准了治疗急性髓细胞白血病的新药，但标准细胞毒性化疗的5年总生存率仍仅为30％，因此迫切需要新的疗法。

近年来，以T细胞为基础的免疫治疗作为治疗各种恶性肿瘤的一种有前途的免疫治疗方法受到了广泛关注。AML细胞对功能性免疫细胞的细胞毒效应非常敏感，双特异性T细胞接合器为AML的治疗提供了有效的手段。

CD33分子是一种唾液酸结合Ig样凝集素(Siglec)跨膜糖蛋白,分子量67KD，由364个氨基酸组成，特异性表达于造血系统细胞表面,基因位于人的第19号染色体上。它是免疫球蛋白超家族的一个成员,有两个免疫球蛋白样胞外结构域,同时也是唾液酸黏附免疫球蛋白样凝集素家族的第四个成员,与唾液酸黏附酶、CD22及髓磷脂结合糖蛋白共同组成了黏附素家族。研究表明，CD33是髓系细胞的特异性白血病抗原,在造血干细胞中不存在而表达在造血细胞亚群中。

CD33在90％的急性髓系白血病(AML)细胞中有表达，虽然在髓系造血祖细胞中也有表达，但在正常造血干细胞中没有表达，研究证明靶向清除CD33阳性细胞后经过培养可以恢复其造血功能。所以，CD33成为AML特异性免疫治疗的理想靶点，进而CD33单抗或双抗的筛选及利用成为医学界研究的热点。

CD33单抗通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)及补体依赖的细胞毒性(complementdependentcytotoxicity,CDC)等介导细胞毒性而产生抗肿瘤效应。免疫治疗发展早期，曾利用鼠抗CD33单抗M195、P67.7及HIM3-4等研究发现它们能激活补体介导的细胞毒作用、诱导细胞内吞和巨噬细胞趋化等，但由于鼠源抗体的免疫原性限制了其重复使用。随着抗体人源化技术和抗体工程的发展，得以成功构建出人源化的抗体，克服了免疫原性的缺点，取得良好的临床治疗效果。

近年来，抗体与毒素及药物结合形成抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate,ADC)，增强了抗体的细胞毒性作用。目前，有多种抗CD33抗体药物已经上市或正在临床试验中。

GO(Gemtuzumabozogamicin)是人源化抗CD33单克隆抗体与强效抗肿瘤抗生素－乙酰刺胞霉素偶联物，其中单克隆抗体约含98％的人源氨基酸序列，其余源自鼠科动物。与白血病细胞表面CD33抗原结合，进入细胞后释放刺胞霉素，对白血病细胞有明显的杀灭作用，从而单独或联合其他化疗药物治疗白血病。

2000年5月GO被美国食品及药品监督管理局(FDA)正式批准作为单药治疗年龄大于60岁首次复发的CD33+AML患者。这些患者不符合标准化疗的条件，但由于缺乏临床益处和不良事件增加，批准后的确认性临床试验被提前终止而自愿退出市场。然而，GO在2017年重新获得批准，当时进一步的研究表明，如果使用分次剂量的药物，将GO添加到标准化疗中会有好处。

CD3是存在于所有T淋巴细胞表面的一种标志。CD3别名T3或Leu-4。有3个亚型，分别为CD3δ、CD3ε和CD3γ。CD3δ和CD3ε的分子量均为20kD，CD3γ的分子量为26kD，它表达于T淋巴细胞、胸腺细胞及NK细胞膜的表面。在正常外周血淋巴细胞上有61％～85％表达，在胸腺细胞上有60％～85％表达。它属于免疫球蛋白超家族。CD3是T淋巴细胞受体(TCR)复合体的组成部分，与α/β和γ/δ的T淋巴细胞受体(TCR)形成复合体，是传导与肽/MHC结合的TCR信号的主要膜抗原。TCR在细胞表面的表达、抗原识别及信号转导中是必不可少的。

CD3是T淋巴细胞表面特异分子，通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。CD3的单克隆抗体可以诱导或阻止T淋巴细胞活化。在抗CD28抗体或IL-2存在下，抗CD3抗体可诱导T淋巴细胞的凋亡。CD3是外周血中成熟T淋巴细胞的最好标志物(marker)之一，测定CD3+T淋巴细胞对评价免疫缺陷病(T淋巴细胞缺乏症)、白血病、淋巴瘤(T淋巴细胞型)的分型诊断具有重要意义。抗CD3单克隆抗体可用于器官移植或骨髓移植时的免疫抑制治疗，还可用于重症自身免疫性疾病的免疫调节治疗，以去除T淋巴细胞。美国专利4,361,549记载了一种鼠源性杂交细胞系，用于生产针对发现于正常人T细胞和皮肤T淋巴瘤细胞的抗原的单克隆抗体OKT3，另外在美国专利5,885,573中，记载了将鼠源性的OKT3转移到人类抗体框架中构建的人源化单抗，以期降低其在人体应用时的免疫原性，减少人抗鼠抗体(HAMA)反应的发生概率。OKT3是美国FDA在1986年批准的第一个用于治疗器官移植急性期排斥的鼠源性单克隆药物，也是全世界第一个经政府药品管理当局批准使用的单克隆抗体药物。鼠源性OKT3单抗治疗的主要缺陷是由于T细胞和FcγR承载细胞之间的交叉连接导致的细胞因子释放所引起的T细胞活化以及HAMA反应，OKT3在市场上使用了10多年之后终被人源化的抗体以及新的小分子免疫抑制剂所取代。另一方面，OKT3或其他抗CD3抗体可用作刺激T细胞活化与增殖的免疫增强剂，在体外细胞培养中抗CD3单抗、与抗CD28抗体或白细胞介素-2联合应用以诱导T细胞增殖。OKT3还进一步单独或作为双特异性抗体的组分用于将细胞毒T细胞靶向于肿瘤细胞和病毒感染细胞。到目前为止，用抗体作为招募T细胞试剂的方法被若干发现所阻碍。首先，具有T细胞高亲和力的天然或改造的抗体常常不会激活它们所结合的T细胞；其次，T细胞低亲和力的天然或改选的抗体在引发T细胞介导的细胞裂解能力方面通常是效果欠佳或是无效的，因此选择一种具有合适亲和力的抗CD3单抗是十分重要的。

国内外已有数家企业研究开发CD33-CD3ε双特异抗体，目前已经有4种针对CD33的双特异性抗体正在1期临床试验中进行评估。

AMG330(研发机构：Amgen)是一种短效BiTE分子，需要以2～4周为一个周期持续静脉(IV)输注。临床前研究表明，BiTE模式的抗CD33x抗CD3结构即使在靶细胞上的低CD33抗原密度下也具有细胞毒性，使其成为靶向广泛的CD33+白血病(包括AML)的候选。

截至2022年11月，临床研究已入组96人，临床试验数据显示，55例复发或难治性(r/r)AML患者已被纳入1期试验(NCT02520427)，以评估AMG330的安全性并确定其最大耐受剂量。42例可评价患者中有8例(19％)对AMG330有反应，其中3例完全缓解(CR)，4例完全缓解伴血液不完全恢复(CRi)，1例无白血病状态(MLFS)。1期试验结果表明，AMG330剂量高达720μg/天，可提供可接受的安全性、药物耐受性和抗白血病活性的早期证据，并支持进一步剂量递增研究提供试验依据。

AMG673(研发机构：Amgen)是一种半衰期延长的BiTE结构，结合了CD33和CD3的结合特异性，融合到单个IgGFc区域的N末端。AMG673在人类体内的预期终末半衰期预计将增加到21天。AMG673以14天为一个周期，在第1天和第5天进行2次短时间静脉输注。截至2022年3月，AMG673的1期试验(NCT03224819)中有30名患者入组，27名可评估患者中有11名(41％)有母细胞减少，其中5名患者母细胞减少率超过50％。27例(4％)可评估患者中有1例获得CR。1期试验结果表明：AMG673剂量高达72μg的初步数据提供了该分子具有可接受的安全性、药物耐受性和抗白血病活性的早期证据。AMV564(研发机构：AmphivenaTherapeutics,Inc)是一种四价抗CD33x抗CD3串联型diabody(TandAb)结构，以14天间隔周期持续静脉输注。因为AMV564是四价的，有两个CD3结合位点和两个CD33结合位点，这种药物对两个靶点的亲和力都增加了。AMV564具有比单价双特异性抗体更高的分子量，因此半衰期更长。临床前的体外和体内研究已经证明AMV564能够以剂量依赖性的方式诱导CD33+AML细胞系的有效细胞毒性。

AMV564目前正在1期试验(NCT03144245)中进行评估，截止到2021年05月，已有36名患者参与了这项研究。35例可评价患者中有3例(9％)有客观响应，1例有CR，1例有CRi，1例有部分缓解(PR)。35例可评价患者中有17例(49％)母细胞减少。

JNJ-67561244(研发机构：Janssen)是一种全人IgG4-PAA双特异性抗体，能够结合CD33的C2结构域和CD3诱导T细胞募集和肿瘤细胞毒性。JNJ-67571244特异性结合CD33表达细胞，并介导针对AML细胞系和原发性患者样本的特异性体外T细胞依赖性细胞毒性。

JNJ-67571244在食蟹猴中耐受性良好，最高可达30mg/kg。JNJ-67571244介导了细胞系和原代样品的有效细胞毒性，无论其SNP基因型状态如何，这表明与其他V结合抗体相比具有潜在的治疗益处。JNJ-67571244目前正在复发/难治性AML和高危骨髓增生异常综合征患者中进行1期临床试验(NCT03915379)，还没有关于JNJ-67561244的临床数据报道。

但是传统的双特异性抗体的特异性不高，在攻击白血病细胞的同时也会对正常细胞产生不必要的影响，在治疗过程中一定概率会引发非特异性的免疫反应，由于缺乏高度特异性，这些抗体可能攻击正常细胞，而不仅仅是白血病细胞，这导致了所谓的"非特异性毒性"，即正常组织受到损害，导致治疗效果不佳，需要更高的剂量才能达到疗效，从而增加了患者的不适和风险，同时传统的双特异性抗体在特定的亲和力或连接效应器上的选择有所缺陷，可能导致过度激活T细胞或其他不良反应，如果双特异性抗体选择的亲和力过高或连接效应器过强，它们可能导致T细胞的过度激活，可能引发强烈的免疫反应，包括细胞因子释放综合症，降低治疗的安全性，因此亟需一种可提供高度定向的治疗的同时以低亲和力方式进行结合的结合人CD33和CD3的双特异性抗体。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，解决现有技术中存在的双特异性抗体的特异性不高，会对正常细胞产生不必要的影响，在特定的亲和力或连接效应器上的选择有所缺陷的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现，本发明提供了一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，包括：

1)特异性结合细胞膜抗原CD33的IgG抗体；

2)结合T细胞表面抗原CD3分子的单链抗体；

所述识别CD3分子的单链抗体通过亲水性的连接肽和CD33抗体轻链的C末端相连；

所述双特异性抗体结构为：

并且，

所述Linker1：GSTSGSGKPGSGEGSTKGGS；

Linker2：GGGGSGGGGSGGGGS；

其中，所述VH-CH1-Hinge Region-CH2-CH3氨基酸序列为序列5；

所述VL-Cκ-Linker1-VH(CD3)-Linker2-VL(CD3)氨基酸序列见序列6。

本发明进一步地设置为：所述的识别CD3分子的单链抗体结构采用ScFv的形式，是针对人CD3ε的，可以来源目前公知的各种单克隆抗体的可变区基因序列，包括但不限于OKT3、X35-3、WT31、WT32、SPv-T3b、TR-66、11D8、12F6、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特异性抗体；

本发明进一步地设置为：所述的识别CD33分子重链可变区序列和抗人CD33单抗轻链序列，所述单抗轻链含kappa链Cκ区，可以来源目前公知的各种单克隆抗体的可变区基因序列，或使用本公司自行构建的抗CD33单抗重链、轻链可变区的序列；

本发明进一步地设置为：所述含引导肽的重链所含的核苷酸序列、氨基酸序列如序列1、序列2所示；

含引导肽的轻链所含的核苷酸序列、氨基酸序列如序列3、序列4所示；

不含引导肽重链所含的氨基酸序列如序列5所示；

不含引导肽轻链所含的氨基酸如序列6所示；

本发明还提供一种双特异性抗体的制备方法，采用基因重组技术制备，使用不同种类型式的哺乳类动物细胞表达载体，使用在CHO细胞中进行表达，CHO细胞的培养采用化学成分限定培养基，培养过程中不添加激素及各种动物来源的蛋白质或其水解物；

本发明进一步地设置为：将含双特异性抗体基因的单一质粒载体采用单一内切酶酶切进行线性化；

转染CHO细胞后获得阳性克隆株，然后进行生物反应器培养，产物分泌到培养液上清中；

利用离子交换色谱介质或亲和色谱联合离子交换色谱进行纯化，得到可特异性结合人CD33和CD3的双特异性抗体；

本发明进一步地设置为：所述的双特异性抗体用于治疗复发性、难治性髓性白血病的治疗药物，是一种T细胞依赖性的杀死髓性白血病病细胞的免疫治疗药物；

本发明还提供上述任何一项双特异性抗体的药物组合物；

本发明进一步地设置为：所述的药物组合物，可以制成液体制剂，也可以制成冻干制剂，可以使用持续性输液泵持续给药，也可采用脉冲形式的输液泵定时给药，推荐使用静脉内给药，也可以采用皮下注射给药；

本发明进一步地设置为：所述的液体制剂、冻干制剂，液体制剂稳定剂配方包含：

乙酸：0.2～0.4g/L

L-甲硫氨酸：1.0～20g/L

L-组氨酸：1.0～2.0g/L

吐温-20：0.2～1.0g/L

蔗糖：50～150g/L。

(三)有益效果

本发明提供了一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体。具备以下有益效果：

本发明EK333F是一种靶向CD33和CD3的双特异性抗体，通过它可以达到利用人体自身的T细胞来杀伤CD33阳性的细胞，以达到治疗髓系白血病的目的。

本发明EK333F双特异性抗体是一种靶向CD33和CD3的双特异性抗体，在使用EK333F进行为期7-10天低剂量缓慢诱导治疗之后，再使用适当剂量的EK333F抗体进行治疗，给复发性/难治性髓性白血病患者提供一种可选择的治疗方法。

EK333F的分子结构与目前已进入临床研究阶段的其它双特异性抗体有着本质的不同，有着靶向性更好的优点，同时采用本发明低亲和力的CD3ε-ScFv作为连接效应器-T细胞的弱结合分子，即便是每个EK333F分子中含有两个CD3结合位点，也不能像OKT3那样激活T细胞。

本发明在研究开发EK333F时，起初也借鉴了本公司K193的分子结构(专利号201711131955.0)，但K193所针对的是CD19靶点，此类的B细胞表达B7的量较高，容易激活T细胞，而CD33阳性的髓性白血病细胞表达B7的量较少，前期的NSG小鼠动物实验显示治疗效果欠佳，因此，我们在K193的基础上设计了新的双特异性抗体分子，结构如图1所示。这种分子结构的双特异抗体是在标准IgG1分子结构的轻链的C端通过亲水性连接子连接低亲和力的CD3ε-ScFv单链抗体，从而达到优先与CD33靶标结合的目的。

综上所述，本申请所提供的EK333F是一种靶向CD33和CD3的双特异性抗体，同时识别CD33阳性的髓系白血病细胞和人体自身的T细胞，这种特异性使EK333F成为一种高度定向的治疗药物，能够将T细胞导向攻击白血病细胞，同时减少对正常细胞的不必要影响。

同时本申请提出的治疗方法，包括为期7-10天的低剂量缓慢诱导治疗，然后使用适当剂量的EK333F抗体进行治疗，该治疗方法结合了双特异性抗体的使用，以及特定的治疗时间和剂量，为复发性/难治性髓性白血病患者提供了一种新的治疗选择。

在分子结构上，EK333F的分子结构采用低亲和力的CD3ε-ScFv作为连接效应器，与T细胞结合的亲和力较弱。有助于防止过度激活T细胞，从而减少不良反应，同时确保了对CD33靶标的优先结合。

解决了现有技术中存在的双特异性抗体的特异性不高，会对正常细胞产生不必要的影响，在特定的亲和力或连接效应器上的选择有所缺陷的问题。

附图说明

图1为本发明EK333F的结构图；

图2为质粒DGV-EK333F-Line线性化琼脂糖电泳图谱；

图3为EK333F双特异抗体亲和层析纯化图谱；

图4为EK333F双特异抗体亲和层析纯化后HPLC-SEC色谱图；

图5为EK333F双特异抗体阴离子交换层析纯化图谱；

图6为EK333F双特异抗体离子交换层析纯化后HPLC-SEC色谱图；

图7为EK333F双特异抗体超滤后HPLC-SEC色谱图；

图8为EK333F双特异抗体与CD33阳性细胞的结合活性；

图9为EK333F双特异抗体与T细胞的结合活性；

图10为EK333F双特异抗体在CD33阳性细胞存在时高效激活T细胞的能力；

图11为动物活体成像发光信号强度的变化与EK333F剂量的关系；

图12为动物活体成像照片显示EK333F的治疗效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

请参阅图1-图12，本发明提供了一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，即EK333F，通过它可以达到利用人体自身的T细胞来杀伤CD33阳性的细胞，以达到治疗髓系白血病的目的。

本发明EK333F双特异性抗体是一种靶向CD33和CD3的双特异性抗体，在使用EK333F进行为期7-10天低剂量缓慢诱导治疗之后，再使用适当剂量的EK333F抗体进行治疗，给复发性/难治性髓性白血病患者提供一种可选择的治疗方法。

EK333F的分子结构与目前已进入临床研究阶段的其它双特异性抗体有着本质的不同，有着靶向性更好的优点，同时采用本发明低亲和力的CD3ε-ScFv作为连接效应器-T细胞的弱结合分子，即便是每个EK333F分子中含有两个CD3结合位点，也不能像OKT3那样激活T细胞。

本发明在研究开发EK333F时，起初也借鉴了本公司K193的分子结构(专利号201711131955.0)，但K193所针对的是CD19靶点，此类的B细胞表达B7的量较高，容易激活T细胞，而CD33阳性的髓性白血病细胞表达B7的量较少，前期的NSG小鼠动物实验显示治疗效果欠佳，因此，我们在K193的基础上设计了新的双特异性抗体分子，结构如图1所示。

这种分子结构的双特异抗体是在标准IgG1分子结构的轻链的C端通过亲水性连接子连接低亲和力的CD3ε-ScFv单链抗体，从而达到优先与CD33靶标结合的目的。

EK333F双特异抗体使用CHO细胞表达系统进行表达，通过对化学成分限定培养基进行优化后，抗体的单位产量已达到1.5克/升以上。

本发明提供一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，所述双特异性抗体由特异性识别人髓系白细胞表面CD33分子和人CD3分子构成，它是将抗人CD33分子重链可变区基因与人IgG CH1及Fc区基因相连接，其中将含抗人CD33单抗轻链(含kappa链Cκ区)的基因通过亲水性连接肽Linker1和抗人CD3单链抗体重链基因相连接，再通过亲水性连接肽Linker2连接抗人CD3单链抗体轻链基因；

所述双特异性抗体结构如下：

Linker1：GSTSGSGKPGSGEGSTKGGS；

Linker2：GGGGSGGGGSGGGGS；

VH-CH1-Hinge Region-CH2-CH3的氨基酸序列见序列5；

VL-Cκ-linker1-VH(CD3)-linker2-VL(CD3)的氨基酸序列见序列6；

其中含编码引导肽基因序列的重链所含的核苷酸序列见序列1，相对于结构式的第1-70个核苷酸的位置；

CD33重链可变区序列、人IgG1 CH1和Fc序列相对于第71-1408个核苷酸的位置；

含引导肽序列的重链所含的氨基酸序列如序列2所示；

引导肽序列相对于第1-19个氨基酸。第20～135个氨基酸为VH(CD33)，第136～233个氨基酸为人IgG1 CH1，第237～465个氨基酸为IgG1 Fc；

含编码引导肽基因序列的轻链所含的核苷酸序列见序列3，相对于第1-73核苷酸的位置；

CD33轻链可变区相对于第74-406核苷酸的位置；

人IgG1 Cκ相对于第407-727核苷酸的位置；

连接肽相对于第728-787、1163-1207个核苷酸的位置；

VH(CD3)相对于第788-1162个核苷酸的位置；VL(CD3)相对于第1208-1534的位置。

含引导肽序列的轻链氨基酸序列如序列4所示，引导肽序列相对于第1-20个氨基酸；

第21～238个氨基酸为VH(CD33)+IgG1 Cκ，第239～258个氨基酸为连接肽GSTSGSGKPGSGEGSTKGGS、第384～398个氨基酸为连接肽(G4S)3，第259～383个氨基酸为VH(CD3)，第399～507个氨基酸为VL(CD3)。

不含引导肽重链所含氨基酸的序列如序列5所示。

不含引导肽轻链所含的氨基酸序列如序列6所示。

其中所述的特异性识别人CD33抗原的Fab结构片段可以来源于公知的各种鼠源性抗人CD33单克隆抗体的轻链、重链可变区的序列，或其他已知的人源话CD33单抗的可变区序列，或使用本公司自行构建的抗CD33单抗重链、轻链可变区的序列。

其中所述的识别CD3分子的单链抗体结构采用ScFv的形式，是针对人CD3ε的，可以来源目前公知的各种单克隆抗体的可变区基因序列，包括但不限于OKT3、X35-3、WT31、WT32、SPv-T3b、TR-66、11D8、12F6、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特异性抗体。

本发明进一步提供本发明双特异性抗体的制备方法，所述双特异性抗体采用基因

重组技术制备，可以使用各种形式的哺乳类动物细胞表达，优选使用CHO细胞进行表达，CHO细胞的培养采用化学成分限定培养基，培养过程中不添加激素及各种毒物来源的蛋白质或其水解物。

本发明所述的制备方法，包括将含双特异性抗体基因的单一质粒载体采用单一内切酶酶切进行线性化，转染CHO细胞后获得阳性克隆株，生物反应器中培养，产物分泌到培养液上清中，利用离子交换色谱介质或亲和色谱联合离子交换色谱进行纯化，得到可特异性结合人CD33和CD3的双特异性抗体。

本发明提供的双特异性抗体是用于治疗复发性/难治性髓性白血病的治疗药物，是一种T细胞依赖性的杀死髓性白血病病细胞的免疫治疗药物。

本发明进一步提供含有本发明双特异性抗体的药物组合物。所述的药物组合物，可以制成液体制剂，也可以制成冻干制剂，可以使用持续性输液泵持续给药，也可采用脉冲形式的输液泵定时给药，推荐使用静脉内给药，也可以采用皮下注射给药。

采用本发明的技术构建的双功能抗体在CHO细胞中成功的实现了高水平的稳定表达，并通过液相色谱等纯化方法，得到高纯度的双功能抗体，并针对该抗体开发出了多种液体制剂；采用本发明给出的液体制剂配方，双特异性抗体在0.1-30mg/ml浓度范围内在2-8℃避光存放的条件下质量稳定。

本发明提供了可产生高亲和力的肿瘤靶向分子抗体和具有相对弱结合能力的CD3抗体，二者通过适宜长度的亲水性肽链相连接，为抗体特异性结合部分提供了充分的自由伸展的空间，该分子结构具有良好的热稳定性，较少产生聚合体，最大限度的保证了抗体分子的稳定性及优良的结合能力，优良的液体制剂配方及稳定的分子结构为方便临床安全给药提供了保障。

现有技术中的4种针对CD33双特异性抗体与本发明分子结构图比较，见表1：

表1：本发明分子结构与已有4种CD33双特异性抗体比较

实施例1

质粒表达载体的构建

质粒SGV-K33H(pKC2+CD33VH+hIgG1 CH1+Hinge Region+hIgG1 Fc)和SGV-EK333FL的构建(pKC1+CD33Vk+hIgG1 Cκ+Anti-Human-CD3-ScFv)的构建。

将质粒SGV-K3331H(含Anti-Humanized CD33 VH序列)、pKC2(载体序列)以及IgGCT-1(hIgG1 CH1+Hinge Region+hIgG1 Fc序列)通过相应的限制性内切酶处理后，获得酶切产物CD33VH-HindIII/SalI、IgGCT-SalI/EcoRI和pKC2-HindIII/EcoRI，将三个酶切产物进行连接，转化DH5α和筛选获得阳性克隆SGV-K33H(pKC2+CD33VH+hIgG1 CH1+HingeRegion+hIgG1 Fc)。

使用引物VSNF1和CKL3R以及L3M3F和M3VR分别从含有人源化抗CD33单抗轻链质粒SGV-K3331L中扩增出片段CD33VL+hIgG1 Cκ并引入KOZAK序列和轻链信号肽序列以及从含有人源化抗CD33单抗重链质粒SGV-K3331H中扩增出片段Anti-Human-CD3-ScFv(含Linker2((G4S)3)序列并引入Linker1(GSTSGSGKPGSGEGSTKGGS)；将质粒pKC1(载体序列)通过限制性内切酶处理后，获得酶切产物pKC1-HindIII/EcoRI；将两个片段桥接后再与pKC1-HindIII/EcoRI进行同源重组，获得质粒SGV-EK333FL。将不同克隆送测序公司(北京六合华大基因科技有限公司)进行测序并挑选出完全正确的克隆进行下一步试验。

表2：引物序列

DGV-EK333F的构建：

使用限制性内切酶NotI和PvuI处理SGV-K33H和SGV-EK333FL，获得酶切产物K33H-N/P和EK333FL-N/P，通过连接酶将两个酶切产物进行连接，转化DH5α并筛选获得阳性克隆DGV-EK333F，大量提取质粒DGV-EK333F并使用限制性内切酶PvuI进行线性化处理和苯酚抽提纯化，获得线性化质粒DGV-EK333F-Line，线性化质粒琼脂糖电泳照片见附图3。

实施例2

稳定克隆株的建立、筛选

在无菌层流工作台内，将基因脉冲发生器Xcell(Bio-Rad)的穿孔电压设定为300V、900μF、指数脉冲，取出间隙为4mm一次性电击杯，加入40μg直线化的质粒DNA(100μl)及0.7mlCHO K1细胞(GSKO)悬液，将电穿孔仪的电阻设为无穷大，通过电转染的方法将线性化后的质粒193HVkP-直转染至CHOK1细胞中，将电击杯内的细胞转移至三角培养瓶内，加入CD CHO培养液，于36～37℃、5％CO2摇床上培养，135转/分钟，培养24小时之后，低速离心收集细胞，更换为含50μM MSX的CD CHO培养液(不含谷氨酰胺)，通过有限稀释法获得单克隆细胞株，之后通过ELISA的方法(鼠抗人κ链单克隆抗体+表达产物K33+羊抗人IgG-HRP)筛选出表达量较高的克隆株并进行传代培养，最终获得5个克隆株，依据培养上清中抗体表达量，结合细胞生长情况选择表达量最高的进行亚克隆；再次通过有限稀释法获得单克隆细胞株，之后采用相同的ELISA方法筛选出表达量较高的克隆株并进行传代培养，最终获得5个克隆株，选择表达量最高的克隆株(命名为EK333F)进行扩大培养。

实施例3

EK333F发酵和纯化

将获得的EK333F克隆株接种到含500ml CD CHO培养液的2L或3L三角瓶内，于36～37℃、5％CO2摇床上培养，130～140转/分钟，培养3～6天之后，转种生物反应器培养。

反应器培养条件：反应器初始接种密度：50万～200万，培养温度32～37℃，pH6.5～7.5，搅拌转数50～120转/分钟，溶氧50％±20％，培养期间采用间歇补料方式进行补料(补料如：糖、培养基或碱液等)，培养时间12～18天，当活细胞密度降至60％～70％之间时，收获。

收获的培养液，10000r/min高速离心30分钟，去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清，然后经亲和层析凝胶(如Protein At Bead LX)纯化，亲和层析经预解离及解离过程，解离液浓度为0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH2.0～4.5)，亲和层析后蛋白纯度达到96％以上，亲和层析解离图谱详见附图3，纯度图谱见附图4；再经阴离子交换层析凝胶如DEAESepharose Fast Flow(详见附图5)纯化后，纯度可达到99％以上，纯度图谱见附图6；纯化液体经超滤浓缩，用稳定剂溶液充分置换后，形成原液。

实施例4

EK333F原液稳定剂配方：

乙酸：0.2～0.4g/L

L-甲硫氨酸：1.0～20g/L

L-组氨酸：1.0～2.0g/L

吐温-20：0.2～1.0g/L

蔗糖：50～150g/L

纯化后液体即为EK333F双特异性抗体。双特异性抗体用40mM PBS(含0.5MNa2SO4，pH6.5)作为流动相，在岛津LC-20AT HPLC TSK 3000SW xl(7.8*300mm)色谱柱上进行双特异性抗体纯度分析，检测结果表明，纯度不低于95％，聚合物含量小于5％，未发现可见的杂质峰出现，结果详见附图7。

实施例5

CD33-CD3双特异性抗体与CD33阳性细胞的结合活性试验

U937细胞表面表达CD33抗原，识别CD33的抗体可以特异性的与细胞表面的CD33抗原相结合。采用流式细胞仪检测CD33-CD3双特异抗体样品EK333F与U937细胞CD33位点特异性结合情况。本实验选用K333抗体(Fab-ScFv)溶液、CD33抗体K33溶液作为对照样品，其中EK333F分子含CD33、CD3双结合位点，K333仅含CD33、CD3单一结合位点，K33是人CD33位单抗。采用流式细胞仪(NovoCyte 3130，艾森生物(杭州)有限公司)检测EK333F抗体与U937细胞CD33位点特异性结合活性。

用0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)稀释EK333F抗体至起始蛋白质浓度3mg/ml，取1块96孔U型板，向B行1～3孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，作为空白对照孔。向C、D、E行1～11孔、F～H行1～3孔分别加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，随后向C12、D12、E12孔中加入抗体含量稀释至3mg/ml的EK333F抗体75μl，移液器吸取C12、D12、E12孔中抗体溶液25μl，按3倍梯度从右向左依次稀释至列C1、D1、E1孔，混匀后移到F3、G3、H3孔，继续梯度稀释至F1、G1、H1孔，混匀后吸出25μl，废弃，保持每孔体积50μl。稀释范围3mg/ml～0.627ng/ml，共15个稀释度。制备细胞密度为5.0×106cells/ml的细胞悬液，分别向上述样品孔加入U937细胞悬液100μl，混匀置于室温反应60分钟后，离心后小心吸出上清弃去。

除空白对照B2孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl外，其余各孔均加入稀释至2μg/ml的鼠抗人IgG-κ链单抗50μl，混匀置于室温反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。向空白对照B1孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，向样品孔加入稀释好的FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)50μl，混匀置于室温避光反应30分钟后，离心小心吸出上清弃去。向各孔分别加入170μl 0.02mol/L PBS(pH 7.4)，将孔内细胞重悬并混匀。设定流式细胞仪门内上样量10000个，样本流速为高速，测定细胞荧光值，统计荧光值(扣除空白对照荧光值)。

用GraphPad Prism5.0软件计算EK333F抗体的EC50值为2.406×10-9mol/L，对照样品K333双功能抗体、CD33抗体K33的EC50值分别为1.074×10-8mol/L和8.220E-10mol/L，EK333F与U937细胞结合活性优于K333蛋白。K33单抗与CD33的结合活性优于EK333F(见图8)。

实施例6

流式细胞计测定EK333F抗体与T细胞的结合活性

为了测试EK333F双特异性抗体与T细胞表面分子CD3结合的能力，我们对获得的双特异性抗体进行流式细胞术分析(FACS)。

Jurkat细胞为T淋巴细胞，其细胞表面有CD3抗原，可以特异性的与细胞表面的CD3抗原相结合。采用流式细胞仪检测双特异抗体样品EK333F与Jurkat细胞CD3位点特异性结合情况。本实验选用K333抗体溶液、OKT3抗体溶液作为对照样品，其中EK333F是四聚体，K333是二聚体，EK333F分子量是K333的分子量的2.7倍，OKT3是CD3位点单抗。采用流式细胞仪(NoveCyte 3130，艾森生物(杭州)有限公司)检测EK333F抗体与Jurkat细胞CD3位点特异性结合活性。

用0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)稀释EK333F抗体至起始蛋白质浓度300μg/ml，取1块96孔U型板，向B行1～3孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，作为空白对照孔。向C、D、E行1～11孔分别加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，随后向C12、D12、E12孔中加入抗体含量稀释至300μg/ml的抗体溶液75μl，用移液器吸取C12、D12、E12孔中抗体溶液25μl，按3倍梯度从右向左依次稀释至列C1、D1、E1孔，混匀后吸出25μl，废弃，保持每孔体积50μl。稀释范围300μg/ml～1.694ng/ml，共12个稀释度。制备细胞密度为2.0×106cells/ml的细胞悬液，分别向上述样品孔加入Jurkat细胞悬液100μl，混匀置于37℃反应60分钟后，离心后小心吸出上清弃去。

除空白对照B2孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl外，其余各孔均加入稀释至2μg/ml的鼠抗人IgG-κ链单抗50μl，混匀置于室温反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。向空白对照B1孔加入0.02mol/L PBS(pH 7.4，含1％BSA)50μl，向样品孔加入稀释好的FITC标记的羊抗鼠IgG(1:100)50μl，混匀置于37℃避光反应60分钟后，离心小心吸出上清弃去。向各孔分别加入170μl 0.02mol/L PBS(pH 7.4)，将孔内细胞重悬并混匀。设定流式细胞仪门内上样量10000个，样本流速为高速，测定细胞荧光值，统计荧光值(扣除空白对照荧光值)。用GraphPad Prism5.0软件计算EK333F抗体的EC50值。EK333F、K333、OKT3

EC50值分别为8.585E-09、2.216E-09、和4.379E-10(mol/L)，EK333F双特异性抗体与Jurkat细胞结合活性测定(图9)。

实施例7

流式细胞计测定EK333F双特异性抗体激活T细胞的活性(CD69)

用10％FCS1640培养液将EK333F抗体稀释至系列浓度(6.4pg/ml～500μg/ml)分别加入48孔细胞培养板中。用10％FCS1640培养液将Jurkat细胞调整密度至3×106个/ml，U937细胞调整细胞密度为3×105个/ml，取Jurkat细胞与U937细胞等体积混匀(效靶比例为10：1)，取混合细胞悬液200μl/孔加入到48孔细胞培养板；同时设置无B细胞对照组，即将系列稀释的抗体溶液与密度为3×106个/ml的Jurkat细胞溶液各200μl/孔加入48孔细胞培养板。然后在10％CO2、37℃培养箱内培养18小时，后取150μl共培养物，离心去上清液后与Anti-Human CD69PE(clone：FN50，LOT：2264967，eBioscience)混合样品6μl(1:1)避光反应120min后，离心弃上清，用0.02mol/L PBS(pH 7.4)重悬细胞，使用流式细胞仪测定细胞表达CD69的平均荧光强度，将所得结果经GraphPad Prism 5.0软件拟合处理，将所测各浓度作为横坐标，细胞平均荧光强度做纵坐标作图，分析经各浓度EK333F刺激后Jurkat细胞表面CD69分子的表达的量反应关系，拟合EC50值。在U937细胞存在的条件下EC50为2.927E-11(mol/L)，缺乏U937细胞时的EC50值仅为9.742E-09(mol/L)。由上述数据得知，在U937细胞存在的条件下EK333F激活T细胞的能力高出333倍。

在缺乏CD33阳性细胞存在的条件下，CD69的荧光值较低，即便是在EK333F达到500ng/ml的情况下，荧光值约为基础本底值的2.7倍，因此单独的EK333F不能很好的刺激T细胞进行活化。

由本试验结果可知经EK333F活化后的Jurkat细胞表面会大量表达CD69分子，这是EK333F抗体在U937细胞存在共同刺激下产生的共刺激作用，这两种条件缺一不可，单一条件下无法实现T细胞的高效活化。在CD33阳性细胞存在的前提下，在一定的浓度范围内，T细胞的激活(产生CD69分子的量)与EK333F的量呈对数正相关关系。EK333F在U937存在的条件下高效激活T细胞的测定见图10。

实施例8、

双功能抗体CD33-CD3(EK333F)在人急性早幼粒白血病细胞HL60人源化小鼠荷瘤模型上的抗肿瘤药效试验

1试验方法

1.1HSC-NPG人源化免疫系统小鼠模型的制备

4周龄NPG雌鼠，X-ray生物学辐照仪照射处理24h后尾静脉注射多份脐带血来源(mixed donor)的CD34+造血干细胞。移植20周后小鼠经眼眶采血，EDTA-Na2抗凝管收集血液样本，通过流式细胞术分析动物外周血中人源CD45、CD3阳性细胞的含量，评估人源化免疫重建效果。选择hCD45嵌合率大于25％的CD3+比例均匀的HuHSC-NPG用于建立荷瘤模型。

1.2HSC-NPG小鼠的HL60-luc-gfp细胞系荷瘤模型制作

培养HL60-luc-gfp肿瘤细胞至对数生长期，细胞浓度计数后将细胞悬液浓度调整至1×107个/mL。将40只人源化小鼠HSC-NPG小鼠称重，所有动物经尾静脉注射HL-60-luc-gfp细胞，每只小鼠注射0.2mL体积(接种细胞数为2×106个)。移植10天后，所有动物进行活体成像检测荷瘤情况，根据总光子数按分层随机化分组法进行分组，每组8只，雌性，共5组。

1.3尾静脉注射双功能抗体EK333F

五组分别为溶媒对照组(PBS)、EK333F低剂量给药组(1μg/只)、EK333F中剂量给药组(10μg/只)、EK333F高剂量给药组(30μg/只)和西达苯胺对照组。溶媒和EK333F给药途径为尾静脉注射，给药体积为0.1mL。西达苯胺给药途径为灌胃，给药体积为5mL/kg小鼠体重。

溶媒和EK333F的给药频率为每周2次，连续给药7周。EK333F高剂量组D7开始给药频率调整为每周1次。西达苯胺对照组的给药频率为每周3次，连续给药7周。

1.4动物观察

给药后30min内至少观察1次，给药后4h内严密观察动物对供试品的反应。非给药时间点，每天观察1次。观察指标包括临床症状(如动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等)、死亡情况。详细记录动物出现的症状以及症状的起始时间、严重程度、持续时间；详细记录动物的死亡情况(死亡时间、死亡动物数、濒死反应等)。

1.5小动物活体成像检测肿瘤

荷瘤后和给药后D7、D14、D21、D28、D35、D42和D50，小鼠经腹腔注射荧光素底物溶液(3mg/只)，10min后通过吸入异氟烷气体麻醉，转入活体成像仪暗箱中对全部存活动物或者死亡、濒死动物进行成像，设置自动曝光模式拍摄明场和暗场图片，同时自动检测发光光子强度。通过《Living4.3.1》软件采集和分析计算发光总光子数

1.6统计分析

体重数据和活体成像数据均以表示，采用Graphpad prism8.0统计分析软件分析数据。首先对数据进行正态分布及方差齐性检验。符合正态分布(p>0.20)及方差齐(p>0.10)：多组间比较采用单因素方差分析的LSD法进行多重比较，p<0.05认为有统计学意义；不符合正态分布或方差不齐：多组间比较采用非参数检验的Kruskal-Wallis H方法，如果Kruskal-wallis H检验结果显著(p<0.05)，再将数据进行秩转换后，进行多组间两两比较，p<0.05认为差异有统计学意义。

动物生存统计分析进行卡方检验，p<0.05认为差异有统计学意义。

活体成像总光子数的归一(Normalized)化处理：

相对水平＝(给药后的数值/给药前的数值)*100％。

肿瘤的抑制率＝(1-给药组总光子数/对照组总光子数)*100％。

2、结果

生物发光活体成像图像结果显示，对照组动物肿瘤荧光信号强度值均随着肿瘤细胞接种后时间的延长而增强，说明模型鼠的荷瘤在持续生长(图10)。在治疗后的各个成像时间点，溶媒对照组和西达苯胺对照组的动物的肿瘤发光信号均明显强于3个不同剂量EK333F治疗组；治疗组动物(G2-G5)在治疗后不同成像时间点肿瘤部位发光信号强度与溶媒对照组比较均有显著差异(图12)。在治疗3周后，EK333F治疗剂量越高，肿瘤抑制效果越好。通过将总光子数的数值均一化后计算肿瘤抑制率，治疗后D21时EK333F中剂量和高剂量治疗组肿瘤的抑制率均达到90％以上，并且量效关系明显，高剂量组的肿瘤抑制率最高(表3)。

表3：各治疗组肿瘤抑制率

Claims (5)

1.一种结合人CD33和CD3的双特异性抗体，其特征在于，包括：

1)特异性结合细胞膜抗原CD33的IgG抗体；

2)结合T细胞表面抗原CD3分子的单链抗体；

所述识别CD3分子的单链抗体通过亲水性的连接肽和CD33抗体轻链的C末端相连；

所述双特异性抗体结构为：

并且，

所述Linker1：GSTSGSGKPGSGEGSTKGGS；

Linker2：GGGGSGGGGSGGGGS；

所述VH-CH1-Hinge Region-CH2-CH3、VL-Cκ-Linker1-VH_CD3-Linker2-VL_CD3具有引导肽；

其中，所述VH-CH1-Hinge Region-CH2-CH3氨基酸序列由SEQ ID NO:1编码；

所述VL-Cκ-Linker1-VH_CD3-Linker2-VL_CD3氨基酸序列由SEQ ID NO:3编码。

2.一种如权利要求1所述的结合人CD33和CD3的双特异性抗体在制备治疗复发性、难治性髓性白血病的药物中的用途。

3.含有权利要求1所述的双特异性抗体的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，使用方法包括：制成液体制剂、制成冻干制剂、持续性输液泵持续给药。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其配方包含：

乙酸：0.2～0.4g/L

L-甲硫氨酸：1.0～20g/L

L-组氨酸：1.0～2.0g/L

吐温-20：0.2～1.0g/L

蔗糖：50～150g/L。