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CN118201953A - 新型干扰素变体及其双功能融合分子 - Google Patents

新型干扰素变体及其双功能融合分子 Download PDF

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CN118201953A
CN118201953A CN202280070328.3A CN202280070328A CN118201953A CN 118201953 A CN118201953 A CN 118201953A CN 202280070328 A CN202280070328 A CN 202280070328A CN 118201953 A CN118201953 A CN 118201953A
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CN
China
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seq
ifn
amino acid
acid sequence
cancer
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Pending
Application number
CN202280070328.3A
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严海
王武毅
克里斯托弗·斯图尔德
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Remd Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Remd Biotherapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

公开了双功能融合分子，该双功能融合分子包含附接至疾病组织靶向生物制品或肿瘤相关抗原(TAA)靶向生物制品的具有降低的生物活性的突变多肽配体；其中靶向生物制品或TAA靶向生物制品将突变配体引导至在其表面上表达所述靶向生物制品结合的抗原以及所述配体的受体的细胞。

Description

新型干扰素变体及其双功能融合分子
相关专利申请
本申请要求于2021年8月18日提交的美国临时申请第63/234,498号和于2022年6月1日提交的美国临时申请第63/347,871号的权益，所述临时申请的每一项通过引用以其整体并入本文。
技术领域
干扰素(IFN)是通过细胞响应于病毒而自然地产生的可溶性蛋白。干扰素包括I型干扰素(例如干扰素-α(IFN-α)和干扰素-β(IFN-β))和II型干扰素(例如干扰素-γ(IFN-γ))。尽管首次描述了其抑制病毒复制的能力，但是IFN-α具有表现出抗增殖作用、诱导凋亡(Rodriguez-Villanueva J和TJ McDonnell,Int J Cancer,61:110,1995)和诱导肿瘤细胞中的肿瘤抑制基因P53(Takaoka A等人,Nature,424:516,2003)的多种特性。IFN-α是用于治疗多种癌症的第一重组蛋白，并且IFN-α已经被FDA批准用于治疗若干种癌症，包括黑素瘤、肾细胞癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和毛细胞白血病。IFN-α、聚乙二醇化IFN-α和共有IFN(干扰素alfacon-1)也被FDA批准用于治疗丙型肝炎(HCV)病毒和/或乙型肝炎(HBV)病毒的慢性感染。
所有I1型IFN都被共有的受体IFN-αR识别，该共有的受体IFN-αR包括两种跨膜蛋白IFN-αR1和IFN-αR2。I型干扰素(IFN)信号传导驱动许多自身免疫性疾病，特别是系统性红斑狼疮(SLE)的病理学，并且可以经由全血中存在的I型IFN-诱导型转录物来追踪，所述转录物提供I型IFN基因标志。通过实例的方式，Yao等人(Hum Genomics Proteomics 2009,pii:374312)描述了IFNα/β21-基因标志的鉴定及其作为I型IFN相关疾病或病症的生物标志物的用途。IFN-α对肿瘤细胞的“直接”作用是通过IFN-α直接结合这些细胞上的I型IFN受体并刺激凋亡、终末分化或减少增殖来介导的。不幸的是，I型干扰素受体也存在于大多数非癌性和非病毒感染的细胞中。IFN-α对这样的细胞上的这种受体的全身活化引起许多促炎细胞因子和趋化因子的表达，导致毒性。这样的毒性阻止了以对癌细胞发挥最大抗增殖和促凋亡活性的水平向受试者给药IFN-α，并且IFN-α治疗癌症的用途已经受到其短半衰期和相关的全身毒性的限制(Weiss K,Semin Oncol,25:9,1998；Jones GJ和Itri LM,Cancer,57:1709,2006)。全身性IFN-α疗法的局限性已经导致对将IFN-α安全且有效地递送到肿瘤或病毒感染的部位的替代策略的探索。
癌症免疫疗法是给予使用免疫系统攻击癌症的癌症治疗的名称，并且正在从全局和非特异性模拟免疫系统的疗法迅速发展到更有针对性地活化免疫系统的单个组分，导致增加的效力和降低的毒性。主要焦点是抑制存在于肿瘤或抗原呈递细胞的表面上的程序性死亡配体1(PD-L1)和存在于活化的淋巴细胞的表面上的程序性死亡1(PD-1)之间的相互作用的疗法。程序性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的成员，该CD28受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。通过与其两个主要配体PD-L1(B7-H1)或PD-L2(B7-DC)结合，PD-1下调T细胞活化，该T细胞活化将通常在通过T细胞调节因子识别在肿瘤细胞上MHC的背景下表达的肿瘤抗原的情况下发生。在癌症中，PD-L1/PD-1途径可以保护肿瘤免受细胞毒性T细胞的影响，最终通过使肿瘤微环境中的细胞毒性T细胞灭活来抑制抗肿瘤免疫应答，并防止淋巴结中新T细胞的引发和活化以及随后向肿瘤的募集(Chen和Irving,Clin Cancer Res.,18:6580-6587,2012)。
PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中介导有效的抗肿瘤活性(美国专利第8,008,449号和第7,943,743号)，并且PD-1/PD-L1相互作用的Ab抑制剂用于治疗癌症已经成为许多类型癌症的标准治疗(参见，例如，Topalian等人,Curr Opin Immunol.,24:207-212,2012；Brahmer等人,N Engl J Med.,366(26):2455-65,2012；Garon等人,N Engl JMed,372:2018-2028,2015；Philips等人,Int.Immunol.,27(1):39-46,2015；Migden等人,NEngl JMed,379:341-351,2018)。已经在肿瘤浸润性T细胞上发现PD-1表达，并且已经在许多鼠和人类癌症，包括人类肺癌、卵巢癌和结肠癌以及多种骨髓瘤中的肿瘤细胞和肿瘤内的髓样细胞上发现PD-L1表达，并且由例如Bristol-Myers Squibb(纳武利尤单抗)、Merck(帕博利珠单抗)、Regeneron(西米普利单抗(cemiplimab))、Roche(阿替利珠单抗)、AstraZeneca(度伐利尤单抗)开发的抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体已经被FDA批准用于治疗多种癌症适应症。PD-1途径阻断剂的耐受性及其独特的作用机制使其成为组合方案开发的理想支柱。最近在黑素瘤患者中组合CTLA-4和PD-1阻断的临床数据示出，与单独阻断任一检查点相比增加的客观肿瘤应答的比率，支持组合检查点阻断可能导致增加的临床益处的观点(Wolchok等人,N Engl J Med,366:2443-54,2012)。Yervoy和Opdivo的组合已经被批准用于治疗某些患有黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌和肾细胞癌的患者。
PD-1/PD-L1免疫检查点还参与慢性病毒感染，包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。由于病毒感染引起的肝脏的慢性炎症导致肝细胞上PD-L1的表达，这支持了由于经由通过由免疫细胞表达的PD-1的负信号传导下调抗病毒免疫应答而引起的感染的持续存在。PD-1和PD-L1阻断抗体正在用于慢性HBV和HCV感染的临床上进行测试，并且已经示出有希望的活性。这些抗体的提议的作用机制是恢复感染部位处的功能失调的免疫细胞的抗病毒活性。
本发明涉及双功能融合分子，该双功能融合分子包含附接至疾病组织靶向生物制品或肿瘤相关抗原(TAA)靶向生物制品(例如，抗PD-L1抗体)的具有降低的生物活性的突变多肽配体(例如，突变IFN-α)，其中靶向生物制品或TAA靶向生物制品将突变配体引导至在其表面上表达所述靶向生物制品结合的抗原以及所述配体的受体的细胞。重要的是，因为突变多肽配体具有降低的生物活性，所以所得到的融合分子具有降低的脱靶活性和脱靶毒性。更重要的是，靶向生物制品对突变配体的靶向恢复了突变配体的活性，其中活性恢复的程度显然与细胞上靶向生物制品的水平相关。
因此，本发明的融合分子通过提供具有比先前描述的治疗窗口更大浓度的治疗窗口的双功能融合分子来推进现有技术。
本发明的公开内容
在一个方面中，本发明涉及共有IFN-α(con-IFN-α)的突变变体的产生。这些变体具有氨基酸取代，该氨基酸取代降低了它们对IFN-αR1和IFN-αR2受体复合物(IFN-αR)的亲和力，并降低或消除了活化IFN-αR表达细胞的能力，但保留了结合IFN-αR的能力以及结合和活化IFN-αR受体复合物的能力。在多种实施方案中，突变体con-IFN-α具有选自以下的生物活性：野生型con-IFN-α的生物活性的小于70％；野生型con-IFN-α的生物活性的小于60％；野生型con-IFN-α的生物活性的小于50％；野生型con-IFN-α的生物活性的小于40％；野生型con-IFN-α的生物活性的小于30％；野生型con-IFN-α的生物活性的小于20％；或从其推断的野生型con-IFN-α(即编码序列已经突变以获得突变体IFN的野生型con-IFN-α)的生物活性的小于10％。
在另一个方面中，本发明涉及使用这些突变的con-IFN-α变体来构建双功能融合分子，该双功能融合分子包含附接至疾病组织靶向部分或肿瘤相关抗原(TAA)靶向部分的突变的con-IFN-α变体，其中靶向部分将突变的con-IFN-α变体引导至在其表面上表达所述靶向部分结合的抗原以及所述配体的受体的细胞。在多种实施方案中，靶向部分靶向在IFN受体表达细胞上表达的标志物。在多种实施方案中，靶向部分被引导至组织特异性标志物。在多种实施方案中，组织是癌症组织。在多种实施方案中，双功能融合分子包含呈抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、抗体片段、双抗体、蛋白或肽的形式的靶向部分，该靶向部分与癌症组织中富集的分子，诸如肿瘤相关抗原抗体(TAA Ab)结合。
在另一个方面中，本发明涉及使用这些突变的con-IFN-α变体来构建双功能融合分子，该双功能融合分子包含附接至疾病组织靶向部分或肿瘤相关抗原(TAA)靶向部分的突变的con-IFN-α变体，其中靶向部分将突变的con-IFN-α变体引导至在其表面上表达所述靶向部分结合的抗原以及所述配体的受体的细胞。在多种实施方案中，靶向部分靶向在IFN受体表达细胞上表达的标志物。在多种实施方案中，靶向部分被引导至病毒感染的组织特异性标志物。在多种实施方案中，组织是肝炎病毒感染的肝脏。在多种实施方案中，双功能融合分子包含呈抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、抗体片段、双抗体、蛋白或肽的形式的靶向部分，该靶向部分与病毒感染的肝组织中富集的分子结合。
在多种实施方案中，融合分子包含I型干扰素分子。在多种实施方案中，融合分子包含干扰素-α(IFN-α)分子。在多种实施方案中，融合分子包含干扰素-β(IFN-β)分子。在多种实施方案中，融合分子包含共有干扰素-α(con-IFN-α)分子。在多种实施方案中，融合分子包含I型干扰素突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的con-IFN-α分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的con-IFN-α突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的con-IFN-α突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的人类IFN-α2b分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的人类IFN-α2b突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的人类IFN-α5分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的人类IFN-α5突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的人类IFN-α5突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的人类IFN-α6分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的人类IFN-α6突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的人类IFN-α6突变体分子。在多种实施方案中，融合分子包含具有SEQID NO:14的氨基酸序列的人类IFN-α6突变体分子。
在多种实施方案中，融合分子包含选自由以下组成的组的TAA Ab：完全人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、结合抗原的抗体片段、Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体、单抗体和双抗体。在多种实施方案中，抗体是嵌合抗体。在多种实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在多种实施方案中，抗体是完全人类单克隆抗体。在多种实施方案中，TAA Ab是人类抗PD-L1 Ab。在多种实施方案中，TAA Ab是人类抗PD-1Ab。在多种实施方案中，TAAAb是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:16中列出的重链序列的抗PD-L1。在多种实施方案中，TAA Ab是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:17中列出的重链序列的抗PD-L1。在多种实施方案中，TAA Ab是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中列出的重链序列的抗PD-L1异二聚体。
在多种实施方案中，融合分子是重组表达的融合分子。在多种实施方案中，融合分子包含直接附接至靶向部分的干扰素分子。在多种实施方案中，融合分子包含经由肽接头附接至靶向部分的IFN分子。在多种实施方案中，接头可以是相对地不含二级结构的在5个、10个、15个、20个、30个、40个或更多个氨基酸之间的人工序列。在多种实施方案中，接头是在10个、15个、20个、30个、40个或更多个氨基酸之间的刚性接头肽，该刚性接头肽展示出α-螺旋构象并且可以充当蛋白结构域之间的刚性间隔物。在多种实施方案中，肽接头是富含G/S的接头。在多种实施方案中，肽接头是α-螺旋接头。在多种实施方案中，肽接头是甘氨酸接头。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:20中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:21中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:22中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:23中列出的序列。
在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α2b融合分子(“FP-01”)，该抗PD-L1Ab-IFN-α2b融合分子(“FP-01”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的IFN-α2b分子，该IFN-α2b分子直接与具有SEQ IDNO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-IFN-α2b(R149A)融合分子(“FP-02”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α2b(R149A)融合分子(“FP-02”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的IFN-α2b(R149A)分子，该IFN-α2b(R149A)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α5融合分子(“FP-03”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α5融合分子(“FP-03”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的IFN-α5分子，该IFN-α5分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α5(R150A)融合分子(“FP-04”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α5(R150A)融合分子(“FP-04”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的IFN-α5(R150A)分子，该IFN-α5(R150A)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-IFN-α5(A146D)融合分子(“FP-05”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α5(A146D)融合分子(“FP-05”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的IFN-α5(A146D)分子，该IFN-α5(A146D)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-06”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-06”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-07”)，该抗PD-L1Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-07”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α(R150A)分子，该con-IFN-α(R150A)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-08”)，该抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-08”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D)分子，该con-IFN-α(A146D)分子直接与具有SEQ IDNO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146K)融合分子(“FP-09”)，该抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146K)融合分子(“FP-09”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的con-IFN-α(A146K)分子，该con-IFN-α(A146K)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α6融合分子(“FP-10”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α6融合分子(“FP-10”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的IFN-α6分子，该IFN-α6分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α6(R150A)融合分子(“FP-11”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α6(R150A)融合分子(“FP-11”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的IFN-α6(R150A)分子，该IFN-α6(R150A)分子直接与具有SEQID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α6(A146D)融合分子(“FP-12”)，该抗PD-L1Ab-IFN-α6(A146D)融合分子(“FP-12”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的IFN-α6(A146D)分子，该IFN-α6(A146D)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-IFN-α6(A146K)融合分子(“FP-13”)，该抗PD-L1 Ab-IFN-α6(A146K)融合分子(“FP-13”)包含具有SEQ IDNO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的IFN-α6(A146K)分子，该IFN-α6(A146K)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-14”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-14”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:22中列出的序列的肽接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-15”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-15”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:23中列出的序列的肽接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-16”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-16”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:22中列出的序列的肽接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-17”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-17”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:23中列出的序列的肽接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-18”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-18”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:22中列出的序列的肽接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-19”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-19”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQID NO:22中列出的序列的肽接头和具有SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列的第二重链与具有SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合，形成异二聚体抗体分子。在多种实施方案中，融合分子是抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-20”)，该抗PD-L1 Ab-con-IFN-α融合分子(“FP-20”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的con-IFN-α分子，该con-IFN-α分子使用具有SEQ ID NO:22中列出的序列的肽接头和具有SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列的第二重链与具有SEQID NO:19中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合，形成异二聚体抗体分子。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含在药学上可接受的赋形剂或运载体中的作为活性成分的本发明的双功能融合分子。在多种实施方案中，药物组合物被配制成用于经由选自由以下组成的组的途径施用：皮下注射、腹膜内注射、肌肉内注射、胸骨内注射、静脉内注射、动脉内注射、鞘内注射、脑室内/心室内注射(intraventricular injection)、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或经由输注。
在另一个方面中，本公开内容涉及用于检测和/或监测患有I型干扰素介导的疾病或病症的受试者的生物标志物的鉴定和使用。在多种实施方案中，疾病或病症选自由以下组成的组：癌症、感染性疾病、免疫病症、炎性疾病或状况以及自身免疫性疾病。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的癌症或癌症转移的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一种实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的癌症或癌症转移的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，所述第二疗法选自由以下组成的组：细胞毒性化学疗法、免疫疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法和干细胞移植。在多种实施方案中，组合疗法可以包括向受试者施用治疗有效量的免疫疗法，该免疫疗法包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激性分子或共抑制性分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3、CD40、CD47、SIRPα、ICOS、Siglec 8、Siglec 9、Siglec 15、TIGIT和VISTA的激动性抗体、拮抗性抗体或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗(blinatumomab)的治疗；涉及施用生物响应调节物诸如TNF家族、IL-1、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增的和/或TCR转基因的抗肿瘤T细胞)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；和使用免疫刺激剂诸如Toll-样受体(TLR：TLR7、TLR8和TLR 9)激动剂CpG和咪喹莫特(imiquimod)的治疗；其中组合疗法提供增加的对肿瘤细胞的效应细胞杀伤，即，当被共施用时，在IFN变体和免疫疗法之间存在协同作用。
在多种实施方案中，癌症选自由以下组成的组：B细胞淋巴瘤；肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；支气管癌；结肠直肠癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃癌；卵巢癌；膀胱癌；脑癌或中枢神经系统癌症；外周神经系统癌症；食道癌；宫颈癌；黑素瘤；子宫癌或子宫内膜癌；口腔或咽部的癌症；肝癌；肾癌；胆道癌；小肠癌或阑尾癌；唾液腺癌；甲状腺癌；肾上腺癌；骨肉瘤；软骨肉瘤；脂肪肉瘤；睾丸癌；和恶性纤维组织细胞瘤；皮肤癌；头颈癌；淋巴瘤；肉瘤；多发性骨髓瘤；以及白血病。
在多种实施方案中，个体先前对用抗癌疗法的治疗有响应，但是在停止治疗后遭受复发(下文称为“复发性癌症”)。在多种实施方案中，个体患有抵抗性或难治性癌症。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的感染性疾病的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一种实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HBV感染的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一种实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HBV感染的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，该第二疗法选自由以下组成的组：使用核苷类似物或核苷酸类似物(nucleo(t)side analogs)的治疗，所述核苷类似物或核苷酸类似物诸如富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir alafenamide，TAF)、拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil)、恩替卡韦(Entecavir，ETV)、替比夫定(Telbivudine)、AGX-1009、恩曲他滨(emtricitabine)、克拉夫定、利托那韦、dipivoxil、洛布卡韦、泛昔洛韦(famvir)、FTC、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α和更昔洛韦、besifovir(ANA-380/LB-80380)和tenofovir-exaliades(TLX/CMX157)；使用其他抗病毒药物诸如siRNA、反义寡核苷酸、衣壳组装调节剂(capsid assembly modulator)和聚合酶抑制剂的治疗；使用免疫调节疗法的治疗，所述免疫调节疗法诸如TLR7激动剂、TLR8激动剂、STING激动剂、RIG-I激活剂、PD-1阻断抗体、PD-L1阻断抗体、TIM-3阻断抗体、LAG-3阻断抗体和CTLA-4阻断抗体；使用针对HBV抗原的治疗性疫苗的治疗；以及使用过继细胞疗法的治疗，所述过继细胞疗法诸如HBV特异性CAR-T细胞疗法、HBV特异性TCR-T细胞疗法和其他HBV特异性细胞疗法。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HCV感染的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一种实施方案中，受试者是人类受试者。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HCV感染的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，该第二疗法选自由以下组成的组：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、直接作用抗病毒剂、利巴韦林(ribavirin)和聚乙二醇化干扰素。在多种实施方案中，第二疗法选自由以下组成的组：Mavyet(格卡瑞韦(glecaprevir)/哌仑他韦(pibrentasvir))、Epclusa(索磷布韦(sofosbuvir)/维帕他韦(velpatasvir))、Vosevi(索磷布韦/维帕他韦/伏西瑞韦(voxilaprevir))、Harvoni(来迪派韦(ledipasvir)/索磷布韦)、Sovaldi(索磷布韦)和Zepatier(艾尔巴韦(elbasvir)/格拉瑞韦(grazoprevir))。
在其他方面中，本公开内容提供了编码本公开内容的融合分子的多核苷酸；包含编码本公开内容的融合分子的多核苷酸的载体；任选地，可操作地连接到由用载体转化的宿主细胞识别的控制序列；包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本公开内容的融合分子的多核苷酸；用于产生本公开内容的融合分子的工艺，该工艺包括培养包括包含编码本公开内容的融合分子的多核苷酸的载体的宿主细胞，使得多核苷酸被表达；以及任选地，从宿主细胞培养基中回收融合分子。
附图简述
图1是示出在这些研究中测试的抗体-IFN融合蛋白的分子结构的一组图。A.包含在抗体重链的C-末端处直接与IFN分子融合的抗体。B.包含在抗体重链的C-末端处用肽接头与IFN分子融合的抗体。C.包含使用knob-into-hole和工程化二硫键技术的异二聚体抗体，其中只有一条重链在C-末端处用肽接头与IFN分子融合。
图2是描绘细胞生长抑制测定的结果的线形图。使用CellTiter 96AQueous非放射性细胞增殖测定(Promega)测量细胞生长抑制。
图3是描绘MHC-1表达测定的结果的线形图。将OVCAR-3细胞在生长培养基(细胞对照)或添加样品(REMD290、IFN-α2b或融合蛋白)的生长培养基中孵育持续2天。通过使用PE抗人类HLA-A抗体、PE抗人类HLA-B抗体、PE抗人类HLA-C抗体(样品MFI)或不使用抗体(背景MFI)的FACS来确定MHC-I表达。
图4是描绘PD-L1表达测定的结果的线形图。将OVCAR-3细胞在生长培养基(细胞对照)或添加样品(REMD290、IFN-α2b或融合蛋白)的生长培养基中孵育持续2天。通过使用REMD290(样品MFI)或不使用抗体(背景MFI)的FACS，并且然后通过FITC山羊抗人类IgG第二抗体来确定PD-L1表达。
用于实施本发明的方式
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。在多种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是氨基酸的α碳通过肽键连接的氨基酸的链。因此在链的一个末端(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基基团，而在链的另一个末端(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基基团。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指在肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基基团，或指在该肽中的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基基团)。类似地，术语“羧基末端”是指在肽的羧基末端上的游离羧基基团，或在该肽中的任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。
本公开内容的多肽包括已经以任何方式和出于任何原因被修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其他物理化学特性或功能特性。
如本文使用的氨基酸“取代”是指用不同的氨基酸替换多肽中亲本多肽序列的特定位置处的一个氨基酸。氨基酸取代可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法来产生。例如，单个氨基酸取代或多于一个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的一个或更多个结构域以外的一部分多肽中进行)。“保守氨基酸取代”是指在多肽中氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六组各自包含彼此为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
“非保守氨基酸取代”是指这些类别之一的成员取代为来自另一个类别的成员。在进行这样的改变中，根据多种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸已经被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白的相互作用的生物学功能中的重要性(参见例如Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131)。已知某些氨基酸可以被具有相似的亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然保留相似的生物学活性。在基于亲水指数进行改变中，在多种实施方案中，包括了其亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在多种实施方案中，包括在±1内的那些，并且在多种实施方案中，包括在±0.5内的那些。
本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行相似的氨基酸的取代，特别是在从而产生的生物学上有功能的蛋白或肽被意在用于在如本文公开的免疫学实施方案中使用的情况中。在多种实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻的氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原性，即，与蛋白的生物学特性相关。
以下亲水性值已经被指定至这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-0.1)；谷氨酸(+3.0.+-0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变中，在多种实施方案中，包括其亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在多种实施方案中，包括在±1内的那些，并且在多种实施方案中，包括在±0.5内的那些。示例性氨基酸取代在表1中列出。
示例性氨基酸取代在表1中列出。
表1
技术人员将能够使用公知技术确定如本文列出的合适的多肽变体。在多种实施方案中，本领域技术人员可以通过靶向被认为对于活性不重要的区域来鉴定可以被改变而不破坏活性的分子的适合区域。在其他实施方案中，技术人员可以鉴定在相似多肽间保守的分子的残基和部分。在另外的实施方案中，即使可能对生物活性或对结构重要的区域也可以经历保守氨基酸取代，而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
此外，本领域技术人员可以回顾鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这样的比较，技术人员可以预测对应于相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的多肽中的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对这样预测的重要氨基酸残基进行化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可以分析相似多肽中与该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域技术人员可以预测多肽的氨基酸残基在其三维结构方面的排列。在多种实施方案中，本领域技术人员可以选择不对预测在多肽表面上的氨基酸残基进行根本改变(radical changes)，因为此类残基可能参与与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个期望的氨基酸残基处包含单个氨基酸取代的测试变体。然后可使用本领域技术人员已知的活性测定筛选变体。这样的变体可被用于收集关于合适变体的信息。例如，如果人们发现，对特定氨基酸残基的改变导致破坏的、不期望地减少的或不合适的活性，则可以避免具有这样的改变的变体。换句话说，基于从这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应避免在该处单独的或与其他突变组合的进一步取代的氨基酸。
如本文使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指如与对应的全长蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在多种实施方案中，片段的长度可以是例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在多种实施方案中，片段的长度还可以是例如，至多1000个、至多900个、至多800个、至多700个、至多600个、至多500个、至多450个、至多400个、至多350个、至多300个、至多250个、至多200个、至多150个、至多100个、至多50个、至多25个、至多10个或至多5个氨基酸。片段还可以在其任一个或两个末端处包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白的氨基酸的序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
如本文使用的术语“多肽变体”、“杂合多肽”和“多肽突变体”是指包含这样的氨基酸序列的多肽，在该氨基酸序列中，相对于另一个多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、从该氨基酸序列缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在多种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开内容的杂合体包括融合蛋白。
如本文描述的，单个突变将通过野生型IFN的序列内特定氨基酸位置处的特定氨基酸取代来标识。例如，对于提供为SEQ ID NO:6的人类IFN-α2b，包含在氨基酸57处取代全长野生型组氨酸的酪氨酸的突变被标识为H57Y。
多肽的“衍生物”是已经被化学修饰的多肽，化学修饰例如缀合至另一个化学部分诸如例如聚乙二醇、白蛋白(例如，人类血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。
术语“％序列同一性”与术语“％同一性”在本文中可互换地使用并且是指当使用序列比对程序比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本文使用的，80％同一性与通过定义的算法确定的80％序列同一性意指相同的意思，并且意指给定序列与另一长度的另一序列至少80％相同。在多种实施方案中，％同一性选自，例如，与给定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在多种实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
术语“％序列同源性”与术语“％同源性”在本文中可互换使用并且是指当使用序列比对程序比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，如本文使用的，80％同源性与通过定义的算法确定的80％序列同源性意指相同的意思，并且因此给定序列的同源物具有相对于给定序列的长度大于80％的序列同源性。在多种实施方案中，％同源性选自例如与给定的序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同源性。在多种实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。
可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于在互联网在NCBI的网站上公开地可得的一套BLAST程序，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。另参见Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990(特别参考公开的默认设置，即参数w＝4、t＝17)和Altschul等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997。当相对于GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列评价给定的氨基酸序列时，通常使用BLASTP程序进行序列搜索。BLASTX程序优选用于针对在GenBank蛋白序列和其他公开数据库中的氨基酸序列搜索在所有阅读框中已经被翻译的核酸序列。使用开放空位(gap)罚分为11.0和延伸空位罚分为1.0的默认参数并且使用BLOSUM-62矩阵运行BLASTP和BLASTX两者。
除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总概率(P(N))，该最小总概率提供在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总概率为例如小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，则该核酸被认为与参考序列相似。
如本文使用的术语“修饰”是指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何操作或对多肽的翻译后修饰(例如糖基化)。
术语“治疗性蛋白”是指具有一种或更多种治疗活性和/或生物活性的蛋白、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明所涵盖的治疗性蛋白包括但不限于蛋白、多肽、肽、抗体和生物制品(术语肽、蛋白和多肽在本文中可互换地使用)。具体地设想，术语“治疗性蛋白”涵盖本发明的融合分子。
如本文使用的术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个最初编码不同蛋白的基因的融合多肽分子，其中融合蛋白的组分通过肽键直接彼此连接或通过肽接头彼此连接。如本文使用的术语“融合”是指通过肽键直接连接的组分或经由一个或更多个肽接头连接的组分。
“接头”是指共价地或通过离子、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，例如在5’末端处与一个互补的序列杂交并且在3’末端处与另一个互补的序列杂交，因此连接两个非互补的序列的核酸分子。“可裂解的接头”是指可以被降解或以其他方式切断以使通过该可裂解的接头连接的两个组分分离的接头。可裂解的接头通常被酶，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。可裂解的接头还可以通过环境因素，诸如例如温度、pH、盐浓度等的改变来裂解。
如本文使用的术语“肽接头”是指包含一个或更多个氨基酸，通常为约2个-20个氨基酸的肽。肽接头是本领域已知的或在本文中被描述。合适的非免疫原性的接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常是1和10之间，通常2和4之间的数字。
如本文使用的，癌症是指可能干扰身体器官和系统的正常功能的任何不受控制的细胞生长，并且包括原发性肿瘤和转移性肿瘤两者。从其原始位置迁移并播撒重要器官的原发性肿瘤或癌症最终可以通过受影响的器官的功能退化导致受试者死亡。转移是一种癌细胞或一组癌细胞，不同于原发肿瘤的位置，由癌细胞从原发性肿瘤播散到身体的其他部位引起。转移可能最终导致受试者死亡。例如，癌症可以包括良性癌症和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。
术语“肿瘤相关抗原”(TAA)是指，例如，相对于大多数正常细胞，由癌细胞选择性表达或在癌细胞中过表达的细胞表面抗原。如本文使用的术语“TAA变体”和“TAA突变体”是指包含氨基酸序列(其中相对于另一个TAA序列，一个或更多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、从该氨基酸序列中缺失和/或被取代到该氨基酸序列中)的TAA。在多种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的长度的数目可以是例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸。
如本文使用的，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ECM)。肿瘤微环境中的组分可以调节肿瘤细胞的生长，例如它们进展和转移的能力。肿瘤微环境也可以受到肿瘤释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受的影响。
“药物组合物”是指适用于动物中的药学用途的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的运载体。“药理学有效量”指有效产生预期药理学结果的剂的量。“药学上可接受的运载体”是指任何标准的药物运载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖的水性溶液，和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂和/或辅料。合适的药物运载体和制剂在Remington’s PharmaceuticalSciences,第21版2005,Mack Publishing Co,Easton中描述。“药学上可接受的盐”是指可以被配制成用于药学用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。
如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗的个体的疾病的自然过程的临床干预，并且临床干预可以用于预防来进行或者在临床病理过程期间进行。期望的治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。如本文使用的，“减轻”疾病、病症或状况意指降低疾病、病症或状况的症状的严重程度和/或发生频率。另外，本文中提及“治疗”包括提及治愈性、缓解性和预防性治疗。
如本文使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗特定病症、状况或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的化合物或组合物的量。提及NHL和其他癌症或其他不需要的细胞增殖，有效量包括足以实现以下的量：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度抑制、延缓、减缓并且优选地停止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度减缓并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度减轻一种或更多种与癌症相关的症状。有效量可以以一次或更多次施用来施用。
“辅助背景”是指其中个体有增生性疾病史，特别是癌症史，并且通常(但不一定)对治疗(包括但不限于手术(诸如手术切除)、放射疗法和化学疗法)有响应的临床背景。然而，由于其增生性疾病(诸如癌症)史，这些个体被认为有发展该疾病的风险。“辅助背景”中的治疗或施用是指随后的治疗模式。风险程度(即，处于辅助背景中的个体被认为是“高风险”还是“低风险”)取决于若干因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
措辞“施用”或“引起施用(cause to be administered)”是指由医学专业人员(例如医师)或控制患者的医疗护理的人员采取的控制和/或允许向患者施用所讨论的剂/化合物的行动。引起施用可以包括诊断和/或确定合适的治疗方案，和/或为患者开特定的剂/化合物的处方。这样的开处方可以包括例如起草处方形式、注释医疗记录等。当本文中描述施用时也设想了“引起施用”。
如本文使用的，提及本发明的融合分子与一种或更多种其他治疗剂的术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“与...组合(in combinationwith)”旨在意指并且的确指以下且包括以下：当这样的组分被一起配制成在基本上同时将所述组分释放至所述个体的单一剂型时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的这样的组合同时施用至需要治疗的个体；当这样的组分彼此分开配制成在基本上同时被所述个体服用的单独的剂型，届时所述组分基本上同时释放至所述个体时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的这样的组合基本上同时施用至需要治疗的个体；当这样的组分彼此分开配制成以每次施用之间的显著的时间间隔被所述个体在连续时间服用的单独的剂型，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述个体时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的这样的组合依次施用至需要治疗的个体；以及，当这样的组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，届时它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠释放至所述个体，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的这样的组合依次施用至需要治疗的个体。
术语“患者”、“个体”和“受试者”可以互换地使用，并且指哺乳动物，优选人类或非人类灵长类动物，但也指家养哺乳动物(例如犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如马科动物、牛科动物、猪、绵羊(ovine))。在多种实施方案中，患者可以是在医院、精神病护理机构如门诊或其他临床环境中的医师或其他医务人员的护理下的人类(例如，成年男性、成年女性、青少年男性、青少年女性、男性儿童、女性儿童)。在多种实施方案中，患者可以是免疫功能低下的患者或免疫系统减弱的患者，包括但不限于患有原发性免疫缺陷、AIDS的患者；服用某些免疫抑制药物的癌症患者和移植患者；以及患有影响免疫系统的遗传性疾病(例如，先天性无丙种球蛋白血症、先天性IgA缺乏症)的患者。在多种实施方案中，患者患有免疫原性癌症，包括但不限于膀胱癌、肺癌、黑素瘤和报道具有高突变率的其他癌症(Lawrence等人,Nature,499(7457):214-218,2013)。
术语“免疫疗法”是指癌症治疗，其包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激性分子或共抑制性分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3、SIRP、CD40、CD47、Siglec8、Siglec 9、Siglec 15、TIGIT和VISTA的激动性抗体、拮抗性抗体或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节物诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用卡介苗(BCG)的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因的抗肿瘤T细胞)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；以及使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。
“抵抗性或难治性癌症”是指不响应于先前的抗癌疗法的肿瘤细胞或癌症，所述先前的抗癌疗法包括例如化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法。肿瘤细胞在治疗开始时可以具有抵抗性或难治性，或者在治疗期间可以变得具有抵抗性或难治性。难治性肿瘤细胞包括在治疗开始时对治疗没有响应或最初短时间段对治疗有响应但失去响应的肿瘤。难治性肿瘤细胞也包括对抗癌疗法治疗有响应但对后续轮疗法失去响应的肿瘤。为了本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括表现为被抗癌疗法治疗抑制但在停止治疗后长达5年(有时长达10年或更长时间)复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化学治疗剂、单独的放射、单独的靶向疗法、单独的免疫疗法、单独的手术或其组合。为了便于描述而非限制，应理解，难治性肿瘤细胞与抵抗性肿瘤是可互换的。
如本文使用的，“特异性结合”意指对抗原的结合是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。免疫球蛋白结合特定抗原的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术例如表面等离子体共振(SPR)技术来测量。
如本文使用的术语“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(KD)来呈现，解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别为koff和kon)的比率。用于测量亲和力的一种特殊方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文使用的，术语“降低的结合”是指各自相互作用的亲和力的降低，如例如通过SPR测量的。相反，“增加的结合”是指各自相互作用的结合亲和力的增加。
如本文使用的术语“聚合物”通常包括但不限于均聚物；共聚物，诸如例如嵌段、接枝、无规和交替共聚物；和三元共聚物；以及它们的混合物和变化形式(modifications)。此外，除非另外明确限定，否则术语“聚合物”应包括材料的所有可能的几何构型。这些构型包括但不限于全同立构、间同立构和无规对称。
“多核苷酸”是指包含核苷酸单元的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括这样的类似物，该类似物包含非天然存在的碱基、以除天然存在的磷酸二酯键以外的连接与其他核苷酸衔接(engage)的核苷酸、或包含通过除了磷酸二酯键以外的连接附接的碱基的核苷酸。因此，核苷酸类似物包括例如并且不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以例如使用自动化的DNA合成仪合成。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这还包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文使用常规符号描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手末端为5’-末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称作5’-方向。向新生RNA转录物添加核苷酸的5’至3’方向被称作转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链被称作“编码链”；在具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列的DNA链上并且位于RNA转录物的5’-末端的5’的序列被称作“上游序列”；在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且在编码RNA转录物的3’-末端的3’的序列被称作“下游序列”。
“载体”是可以用于将与其连接的另一个核酸引入到细胞中的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的核酸区段连接到其中的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，其中另外的DNA区段可以被引入到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体(episomalmammalian vector))。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以指导选择的多核苷酸的表达的一种类型的载体。
“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调控序列可以例如直接对被调控的核酸发挥其作用，或通过一种或更多种其他分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用发挥其作用。调控序列的实例包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。调控序列的另外的实例描述于例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego；Calif.以及Baron等人,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06中。如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。
“宿主细胞”是可以用于表达本公开内容的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者宿主细胞可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养的细胞，该核酸然后可以在宿主细胞中被表达。短语“重组宿主细胞”可以用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含核酸但不以期望的水平表达该核酸的细胞，除非调控序列被引入到宿主细胞中，使得调控序列变成与该核酸可操作地连接。将理解，术语宿主细胞不仅是指特定的受试者细胞，而且还指这样的细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以由于，例如突变或环境影响而在随后世代中发生，这样的子代实际上可以与亲本细胞不相同，但仍然被包括在如本文使用的该术语的范围内。
术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽或多核苷酸)是这样的分子：该分子凭借其起源或衍生的来源(1)不与在其天然状态中伴随其的、天然地缔合的组分缔合，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。因此，化学合成的、或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中表达的分子将是与其天然缔合的组分“分离”的。也可以通过使用本领域熟知的纯化技术分离使分子基本上不含天然缔合的组分。分子纯度或同质性可以通过本领域熟知的许多手段来测定。例如，多肽样品的纯度可以使用本领域中熟知的技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和对凝胶进行染色以使多肽可视化来测定。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域中熟知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
当样品的至少约60％至75％表现为单一种类的多肽时，蛋白或多肽是“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白可以是单体的或多体的(multimeric)。基本上纯的多肽或蛋白将通常包含约50％、60％、70％、80％或90％ W/W的蛋白样品，更通常约95％，并且优选地将超过99％纯。蛋白纯度或同质性可以通过本领域中熟知的许多手段来指示，该手段诸如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后是用本领域中熟知的染色剂对凝胶进行染色后使单个多肽条带可视化。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域中熟知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
如本文使用的术语“异源”是指非天然的或在自然界不存在的组成或状态，所述组成或状态例如可以通过用源自另一来源的组分或状态替换现有的天然组成或状态来实现。类似地，在除了其中蛋白天然地表达的生物体之外的生物体中的蛋白表达构成异源表达系统和异源蛋白。
除非上下文另外明确指出，如本文和所附的权利要求中使用的单数形式“一种/一个”、“或”和“该/所述”包含复数指代物。应理解，本文描述的本公开内容的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“主要由这些方面和实施方案组成”。
本文中，提及“约”值或参数包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
干扰素和干扰素突变体
在本公开内容的融合分子中，TAA抗体的N-末端或C-末端，或抗原结合片段重链或轻链将用若干种设想的干扰素或干扰素突变体中的一种进行遗传构建。干扰素包括I型干扰素(例如IFN-α、IFN-β)以及II型干扰素(例如IFN-γ)。如本文使用的术语“干扰素”是指全长干扰素或干扰素片段(截短的干扰素)或干扰素突变体(截短的干扰素和干扰素突变体在本文中统称为‘修饰的干扰素’)，其基本上保留了全长野生型干扰素的生物活性(例如，保留了全长野生型干扰素的至少50％生物活性，例如至少约60％、70％、80％、90％或更多生物活性中的任何一种)，包括本领域所教导的干扰素的任何生物类似物(biosimilar)、生物仿制药(biogeneric)、后续生物制品或后续蛋白形式。干扰素可以来自基本上任何哺乳动物物种。在多种实施方案中，干扰素来自选自由以下组成的组的物种：人类、马科动物、牛科动物、啮齿动物、猪、兔形动物、猫科动物、犬科动物、鼠、山羊、绵羊、非人类灵长类动物等。多种这样的干扰素已经在文献中广泛描述，并且是本领域普通技术人员熟知的(参见，例如，Pestka,Immunological Reviews,202(1):8-32,2004)。FDA批准的干扰素包括，例如，-A(Roche)、A(Schering)、(Biogen,Inc.)、(Chiron Corporation)和(EMD Serono和Pfizer)。
共有干扰素(con-IFN-α)(也称为“IFN-alfacon-1”)，一种非天然重组干扰素，是被工程化为包含人类中非等位基因IFN-α亚型中最频繁出现的氨基酸以形成共有分子的第二代细胞因子(Blatt等人,J Interferon Cytokine Res.,16:489-99,1996)。Con-IFN-α在体外示出比非等位基因IFN-α亚型更高的生物学和抗病毒能力，并且FDA批准的(InterMune,Inc)已经在国际上用于治疗患有慢性丙型肝炎(HCV)感染的患者。
在多种实施方案中，TAA抗体-IFN融合分子包含干扰素或修饰的干扰素，该干扰素或修饰的干扰素拥有具有相同氨基酸序列但未附接至抗体的野生型干扰素的内源性活性的例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％。
在多种实施方案中，TAA抗体-IFN融合分子将包含干扰素或修饰的干扰素，该干扰素或修饰的干扰素拥有具有相同氨基酸序列但未附接至抗体的野生型干扰素的内源性活性的例如小于10％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％、小于95％、小于96％、小于97％、小于98％、小于99％、小于100％。
干扰素活性可以例如使用现有技术中描述的多种抗病毒测定和抗增殖测定(参见，例如，美国专利第8,563,692号、美国专利公布第20130230517号、美国专利公布第20110158905号、PCT WO/2014/028502和PCT WO/2013/059885)以及下文实施例部分中描述的测定来评估。
在多种实施方案中，当与具有相同氨基酸序列、未附接至抗体的干扰素相比时，TAA抗体-IFN融合分子对表达抗体结合的TAA的细胞相比于不表达TAA的细胞将示出至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍的选择性。
在多种实施方案中，设想使用突变的con-IFN-α。本文中设想用于使用的单点突变包括但不限于氨基酸残基中的一系列主要单点突变，基于NMR结构的公布的信息，这些突变被认为对IFN-α与IFN-αR1的结合亲和力是重要的，假设单点突变可以改变结合亲和力，但将不完全敲除con-IFN-α的活性，因此尽管在高得多的浓度仍保持抗增殖特性。这将潜在地提高包含与干扰素-α突变体融合的抗体的融合分子的治疗指数。如本文描述的，单个突变将通过在提供为SEQ ID NO:1的con-IFN-α的序列内特定氨基酸位置处的特定氨基酸取代来标识。例如，包含在氨基酸150处取代全长野生型精氨酸的丙氨酸的突变被标识为R150A。
在本公开内容的多种实施方案中，TAA抗体-IFN融合分子包括包含一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失的干扰素突变体。鉴定这样的修饰的干扰素分子的手段对于本领域技术人员是常规的。在一种说明性方法中，产生截短和/或突变的IFN-α文库并对其进行IFN-α活性筛选。产生多肽变体文库的方法是本领域技术人员熟知的。然后可以根据本领域技术人员已知的标准方法来筛选所得到的文库成员。因此，例如，可以通过测量针对特定测试病毒的抗病毒活性来测定IFN-α活性。用于测定IFN-α活性的试剂盒是商购可得的(参见，例如，Neutekbio,Ireland的ILITETMαβ试剂盒)。
在多种实施方案中，干扰素包含与在下文提供为SEQ ID NO:1的野生型con-IFN-α序列共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观测同源性(observed homology)的氨基酸序列。在一些实施方案中，干扰素具有小于在下文提供为SEQ ID NO:1的con-IFN-α的约70％、75％、80％、85％、90％或95％的活性中的任何一种：
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:1)。
在多种实施方案中，干扰素是con-IFN-α突变体分子，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基150处的精氨酸被丙氨酸替换(R150A)。这种con-IFN-α突变体分子在下文中被称为“con-IFN-α(R150A)”。con-IFN-α(R150A)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:2：CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:2)。
在多种实施方案中，干扰素是con-IFN-α突变体分子，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基146处的丙氨酸被天冬氨酸替换(A146D)。这种con-IFN-α突变体分子在下文中被称为“con-IFN-α(A146D)”。con-IFN-α(A146D)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:3：CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:3)。
在多种实施方案中，干扰素是con-IFN-α突变体分子，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基146处的丙氨酸被赖氨酸替换(A146K)。这种con-IFN-α突变体分子在下文中被称为“con-IFN-α(A146K)”。con-IFN-α(A146K)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:4：CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRKEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:4)。
在多种实施方案中，干扰素是con-IFN-α突变体分子，其中SEQ ID NO:1的氨基酸残基146处的丙氨酸被天冬氨酸替换(A146D)，并且SEQ ID NO:1的氨基酸残基150处的精氨酸被丙氨酸替换(R150A)。这种con-IFN-α突变体分子在下文中被称为“con-IFN-α(A146D和R150A)”。con-IFN-α(A146D和R150A)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:5：
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMASFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:5)。
在多种实施方案中，干扰素包含与在下文提供为SEQ ID NO:6的人类IFN-α2b序列(在下文称为“IFN-α2b”)共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观测同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，干扰素具有小于在下文提供为SEQ ID NO:6的IFN-α2b的约70％、75％、80％、85％、90％或95％的活性中的任何一种：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:6)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α2b突变体分子，其中SEQ ID NO:6的氨基酸残基149处的精氨酸被丙氨酸替换(R149A)。这种IFN-α2b突变体分子在下文中被称为“IFN-α2b(R149A)”。IFN-α2b(R149A)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:7：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:7)。
在多种实施方案中，干扰素包含与在下文提供为SEQ ID NO:8的人类IFN-α5序列(在下文称为“IFN-α5”)共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观测同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，干扰素具有小于在下文提供为SEQ ID NO:8的IFN-α5的约70％、75％、80％、85％、90％或95％的活性中的任何一种：
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:8)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α5突变体分子，其中SEQ ID NO:8的氨基酸残基150处的精氨酸被丙氨酸替换(R150A)。这种IFN-α5突变体分子在下文中被称为“IFN-α5(R150A)”。IFN-α5(R150A)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:9：
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:9)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α5突变体分子，其中SEQ ID NO:8的氨基酸残基146处的丙氨酸被天冬氨酸替换(A146D)。这种IFN-α5突变体分子在下文中被称为“IFN-α5(A146D)”。IFN-α5(A146D)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:10：
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:10)。
在多种实施方案中，干扰素包含与在下文提供为SEQ ID NO:11的人类IFN-α6序列(在下文称为“IFN-α6”)共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观测同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，干扰素具有小于在下文提供为SEQ ID NO:11的IFN-α6的约70％、75％、80％、85％、90％或95％的活性中的任何一种：
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:11)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α6突变体分子，其中SEQ ID NO:11的氨基酸残基150处的精氨酸被丙氨酸替换(R150A)。这种IFN-α6突变体分子在下文中被称为“IFN-α6(R150A)”。IFN-α6(R150A)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:12：
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:12)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α6突变体分子，其中SEQ ID NO:11的氨基酸残基146处的丙氨酸被天冬氨酸替换(A146D)。这种IFN-α6突变体分子在下文中被称为“IFN-α6(A146D)”。IFN-α6(A146D)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:13：
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:13)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α6突变体分子，其中SEQ ID NO:11的氨基酸残基146处的丙氨酸被赖氨酸替换(A146K)。这种IFN-α6突变体分子在下文中被称为“IFN-α6(A146K)”。IFN-α6(A146K)的氨基酸序列在下文提供为SEQ ID NO:14：
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRKEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:14)。
在多种实施方案中，干扰素是IFN-α2b突变体分子，该IFN-α2b突变体分子具有SEQID NO:6中列出的氨基酸序列并且包含选自以下的一个或更多个单点突变：L15A、A19W、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35E、Q40A、H57A、H57S、H57Y、E58A、E58N、E58S、Q61A、Q61S、D114R、L117A、R120A、R125A、R125E、K131A、E132A、K133A、K134A、R144A、R144D、R144E、R144G、R144H、R144I、R144K、R144L、R144N、R144Q、R144S、R144T、R144V、R144Y、A145D、A145E、A145G、A145H、A145I、A145K、A145L、A145M、A145N、A145Q、A145R、A145S、A145T、A145V、A145Y、M148A、R149A、S152A、L153A、N156A、R162A或E165D。
在多种实施方案中，干扰素是con-IFN-α突变体分子，该con-IFN-α突变体分子具有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列并且包含选自以下的一个或更多个单点突变：L15A、A19W、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35E、Q40A、H58A、H58S、H58Y、E59A、E59N、E59S、Q62A、Q62S、D115R、L118A、R121A、R126A、R126E、K132A、E133A、K134A、K135A、R145A、R145D、R145E、R145G、R145H、R145I、R145K、R145L、R145N、R145Q、R145S、R145T、R145V、R145Y、A146D、A146E、A146G、A146H、A146I、A146K、A146L、A146M、A146N、A146Q、A146R、A146S、A146T、A146V、A146Y、M149A、R150A、S153A、L154A、N157A、R163A或E166D。
设想用于使用的另外的干扰素突变体包括以下中描述的那些：例如，美国专利第9,611,322号(Wilson等人)、美国专利第8,258,263号(Morrison等人)、美国专利第9,492,562号(Tavernier等人)、美国专利第10,259,854号(Grewal等人)，为了其中提供的干扰素突变体和序列，其中的每一篇据此通过引用以其整体并入。在多种实施方案中，干扰素包含与野生型IFN-α序列共有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的观测同源性的氨基酸序列，所述野生型IFN-α序列选自由以下组成的组：IFN-α5(NP_002160.1)、IFN-α6(NP_066282.1)、IFN-α7(NP_066401.1)、IFN-α8(NP_002161.2)、IFN-α10(NP_002162.1)、IFN-α16(NP_002164.1)、IFN-α17(NP_067091.1)、IFN-α21(NP_002166.2)和con-IFN-α(DB00069)。
靶向部分-肿瘤相关抗原抗体
本发明的方法利用分离的非天然存在的遗传工程化的双功能融合分子，该双功能融合分子包含附接至至少一个靶向部分的至少一种干扰素或干扰素突变体分子，该靶向部分具有与感兴趣的靶(例如抗原、受体)特异性结合的识别结构域。在多种实施方案中，感兴趣的靶(例如抗原、受体)可以在一种或更多种免疫细胞上发现，所述免疫细胞可以包括但不限于T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、B细胞、树突细胞或其亚群。在多种实施方案中，识别结构域与感兴趣的靶(例如抗原、受体)特异性结合，并且有效地直接或间接募集一种或更多种免疫细胞。在多种实施方案中，感兴趣的靶(例如抗原、受体)可以在一种或更多种肿瘤细胞上发现。在一些实施方案中，双功能融合蛋白包含两个或更多个靶向部分。在多种实施方案中，双功能融合蛋白可以直接或间接募集免疫细胞，例如，在一些实施方案中，募集到治疗部位(例如，具有一种或更多种疾病细胞或为治疗效果待被调节的细胞的部位)。在多种实施方案中，本发明的双功能融合蛋白可以直接或间接将免疫细胞，例如可以杀伤和/或抑制肿瘤细胞的免疫细胞，募集到作用部位(诸如，通过非限制性实例的方式，肿瘤微环境)。
在多种实施方案中，本发明的双功能融合蛋白能够改变免疫细胞的平衡以有利于肿瘤的免疫攻击或者可用于涉及改变免疫细胞的平衡以有利于肿瘤的免疫攻击的方法。例如，本发明的双功能融合蛋白可以改变临床重要性部位处的免疫细胞的比率以有利于可以杀伤和/或抑制肿瘤的细胞(例如T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、B细胞、树突细胞或其亚群)而不利于保护肿瘤的细胞(例如髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)；肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或其亚群)。在一些实施方案中，本发明的双功能融合蛋白能够增加效应T细胞与调节性T细胞的比率。
各种各样的肿瘤相关抗原和肿瘤标志物已经在文献中描述，并且是本领域普通技术人员熟知的。本发明的方法中使用的TAA Ab-IFN融合分子可以包含对本领域中描述的任何肿瘤相关抗原特异的抗体或结合抗原的抗体片段，包括本领域中描述的任何TAA的任何生物类似物、生物仿制药、后续生物制品或后续蛋白形式。TAA可以是技术人员希望针对其诱导免疫应答的任何肽、多肽、蛋白、核酸、脂质、糖类或小有机分子或其任何组合。
在多种实施方案中，设想用于使用的TAA包括但不限于表2中提供的那些。每个相关的参考文献出于标识所提及的肿瘤标志物的目的通过引用并入本文。
表2
说明性肿瘤标志物
前述标志物中的任何一种都可以用作用于本发明的融合分子的TAA靶。在多种实施方案中，设想用于在本公开内容的融合分子构建体和方法中使用的一种或更多种TAA、TAA变体或TAA突变体选自或源自表3中提供的列表。
表3
产生与本文描述的TAA结合的抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，用于产生与靶向抗原多肽特异性结合的单克隆抗体的方法可以包括向小鼠施用一定量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含有效刺激可检测的免疫应答的靶向抗原多肽，从小鼠获得产生抗体的细胞(例如，来自脾的细胞)并且使产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，以及测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生与靶向抗原多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。在获得后，杂交瘤可以在细胞培养物中繁殖，任选地在其中源自杂交瘤的细胞产生与靶向抗原多肽特异性结合的单克隆抗体的培养条件中繁殖。单克隆抗体可以从细胞培养物纯化。然后，用于测试抗原/抗体相互作用以鉴定特别期望的抗体的多种不同的技术是可获得的。
可以使用产生或分离具有必需的特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从文库选择重组抗体的方法，或依赖于对能够产生人类抗体的完整贮库(full repertoire)的转基因动物(例如小鼠)进行免疫接种的方法。参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),90:2551-2555,1993；Jakobovits等人,Nature,362:255-258,1993；Lonberg等人,美国专利第5,545,806号；以及Surani等人,美国专利第5,545,807号。
抗体可以以多种方式被工程化。它们可以被制备为双特异性抗体、异二聚体抗体、单链抗体(包括小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical)或SMIPsTM)、Fab和F(ab’)2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合化的、去免疫的(deimmunized)或完全人类的。多个出版物列出了许多类型的抗体和工程化这样的抗体的方法。例如，参见美国专利第6,355,245号、第6,180,370号、第5,693,762号、第6,407,213号、第6,548,640号、第5,565,332号、第5,225,539号、第6,103,889号和第5,260,203号。
嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。例如，用限制性酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以去除编码鼠Fc的区域，并且取代为编码人类Fc恒定区的基因的等效部分(参见Robinson等人,国际专利公布PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,国际申请WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利第4,816,567号；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人,Science,240:1041-1043,1988；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol.,139:3521-3526,1987；Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),84:214-218,1987；Nishimura等人,Canc.Res.,47:999-1005,1987；Wood等人,Nature,314:446-449,1985；和Shaw等人,J.Natl Cancer Inst.,80:1553-1559,1988)。
本领域中已经描述了用于使抗体人源化的方法。在一些实施方案中，除了非人类CDR之外，人源化抗体还具有从非人类来源引入的一个或更多个氨基酸残基。人源化可以基本上按照Winter及同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Riechmann等人,Nature,332:323-327,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988)，通过将高变区序列取代为人类抗体的相应序列进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于一个完整人类可变区已被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能地一些框架区残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
Queen等的美国专利第5,693,761号公开了对Winter等对于使抗体人源化的改进，并且基于这样的前提：将亲合力(avidity)损失归因于人源化框架的结构基序方面的问题，其由于空间不相容性或其他化学不相容性，干扰CDR折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决该问题，Queen教导了使用线性肽序列与待人源化的小鼠抗体的框架序列密切同源的人类框架序列。因此，Queen的方法关注于比较物种之间的框架序列。通常，将所有可得的人类可变区序列与特定小鼠序列进行比较，并计算在对应的框架残基之间的百分比同一性。选择具有最高百分比的人类可变区以提供用于人源化项目的框架序列。Queen还教导了，在人源化框架中保留对于支持能够结合的构象中的CDR至关重要的来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的。从分子模型评价潜在的重要性。用于保留的候选残基通常是在线性序列中与CDR相邻或物理地在任何CDR残基的内的那些。
在其他方法中，一旦获得低亲合力人源化构建体，特定框架氨基酸残基的重要性通过将单个残基恢复(reversion)至小鼠序列并测定抗原结合由实验确定，如由Riechmann等人,1988所描述的。用于鉴定框架序列中的重要氨基酸的另一种示例方法由Carter等,美国专利第5,821,337号和Adair等,美国专利第5,859,205号公开。这些参考文献公开了框架中特定Kabat残基位置，其在人源化抗体中可能需要用对应的小鼠氨基酸取代以保持亲合力。
被称作“框架改组(framework shuffling)”的另一种使抗体人源化的方法依赖于生成组合文库，该组合文库具有符合读框地(in frame)融合至单个人类种系框架的池中的非人类CDR可变区(Dall’Acqua等人,Methods,36:43,2005)。然后，筛选文库以鉴定编码保留良好结合的人源化抗体的克隆。
在制备人源化抗体中待使用的人类可变区(轻链和重链两者)的选择对降低抗原性是非常重要的。根据被称为“最佳拟合”的方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变区的序列。然后，接受最接近啮齿动物序列的人类序列作为用于人源化抗体的人类框架区(框架区)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296,1993；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901,1987)。另一种方法使用来源于特定亚组的轻链可变区或重链可变区的所有人类抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可以用于若干种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),89:4285,1992；Presta等人,J.Immunol.,151:2623,1993)。
取代到人类可变区中的非人类残基的选择可以被多种因素影响。这些因素包括例如氨基酸在特定位置中的稀有性、与CDR或抗原相互作用的可能性和参与轻链可变结构域界面和重链可变结构域界面之间的界面的可能性。(参见例如美国专利第5,693,761号、第6,632,927号和第6,639,055号)。分析这些因素的一种方法是通过使用非人类序列和人源化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以该方式，非人类残基可以被选择并且取代为人类可变区残基，以便于实现期望的抗体特征，诸如对一个或更多个靶抗原的增加的亲和力。
本领域中已经描述了用于制备完全人类抗体的方法。通过实例的方式，用于产生TAA抗体或其抗原结合片段的方法包括以下步骤：在噬菌体上合成人类抗体的文库、用TAA或其抗体结合部分筛选文库、分离与TAA结合的噬菌体和从噬菌体获得抗体。通过另一个实例的方式，用于制备用于在噬菌体展示技术中使用的抗体的文库的一种方法包括以下步骤：用TAA或其抗原性部分对包括人类免疫球蛋白基因座的非人类动物进行免疫接种以产生免疫应答、从经免疫接种的动物提取产生抗体的细胞、从提取的细胞分离编码本公开内容的抗体的重链和轻链的RNA、逆转录RNA以产生cDNA、使用引物扩增cDNA、并且将cDNA插入到噬菌体展示载体中，使得抗体在噬菌体上表达。本公开内容的重组抗TAA抗体可以以该方式获得。
再一次，通过实例的方式，本公开内容的重组人类抗TAA抗体还可以通过筛选重组组合抗体文库来分离。优选地，文库是使用从B细胞分离的mRNA制备的人类VL和VH cDNA生成的scFv噬菌体展示文库。用于制备和筛选这样的文库的方法是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统,目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号240612)。还存在可以在生成和筛选抗体展示文库中使用的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利第5,223,409号；PCT公布第WO 92/18619号、第WO 91/17271号、第WO 92/20791号、第WO 92/15679号、第WO 93/01288号、第WO 92/01047号、第WO 92/09690号；Fuchs等人,Bio/Technology,9:1370-1372(1991)；Hay等人,Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85,1992；Huse等人,Science,246:1275-1281,1989；McCafferty等人,Nature,348:552-554,1990；Griffiths等人,EMBO J.,12:725-734,1993；Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896,1992；Clackson等人,Nature,352:624-628,1991；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),89:3576-3580,1992；Garrad等人,Bio/Technology,9:1373-1377,1991；Hoogenboom等人.,Nuc.Acid Res.,19:4133-4137,1991；和Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),88:7978-7982,1991)，全部通过引用并入本文。
人类抗体还通过用人类IgE抗原对非人类转基因动物进行免疫接种来产生，该非人类转基因动物在其基因组中包含一些或所有人类免疫球蛋白重链和轻链基因座，例如XenoMouseTM动物(Abgenix,Inc./Amgen,Inc.-Fremont,Calif.)。XenoMouseTM小鼠是包含人类免疫球蛋白重链和轻链基因座的大的片段并且在小鼠抗体产生方面是缺陷的工程化小鼠系。参见例如，Green等人,Nature Genetics,7:13-21,1994和美国专利第5,916,771号、第5,939,598号、第5,985,615号、第5,998,209号、第6,075,181号、第6,091,001号、第6,114,598号、第6,130,364号、第6,162,963号和第6,150,584号。XenoMouseTM小鼠产生完全人类抗体的成人样人类贮库(adult-like human repertoire)，并且生成抗原特异性人类抗体。在一些实施方案中，通过在酵母人工染色体(YAC)中引入人类重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的、种系配置片段，XenoMouseTM小鼠包含人类抗体V基因贮库的大约80％。在其他实施方案中，XenoMouseTM小鼠还包含大约所有的人类λ轻链基因座。参见Mendez等人,Nature Genetics,15:146-156,1997；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495,1998；和WO 98/24893。
在多种实施方案中，本公开内容的融合分子利用选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、双抗体、嵌合化的或嵌合的抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、完全人类抗体或其抗原结合片段、CDR接枝的抗体或其抗原结合片段、单链抗体、Fv、Fd、Fab、Fab’或F(ab’)2以及合成的或半合成的抗体。
在多种实施方案中，本公开内容的融合分子利用抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段以例如至少约1×10-3M、至少约1×10-4M、至少约1×10-5M、至少约1×10-6M、至少约1×10-7M、至少约1×10-8M、至少约1×0-9M、至少约1×10-10M、至少约1×10-11M或至少约1×10-12M的解离常数(KD)与TAA结合。在多种实施方案中，本公开内容的融合分子利用抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段以在例如至少约1×10-3M至至少约1×10-4M、至少约1×10-4M至至少约1×10-5M、至少约1×10-5M至至少约1×10-6M、至少约1×10-6M至至少约1×10-7M、至少约1×10-7M至至少约1×10-8M、至少约1×10-8M至至少约1×10-9M、至少约1×10-9M至至少约1×10-10M、至少约1×10-10M至至少约1×10-11M或至少约1×10-11M至至少约1×10-12M的范围内的解离常数(KD)与TAA结合。
在多种实施方案中，本公开内容的融合分子利用交叉竞争与TAA上的相同表位结合的抗体或抗原结合片段作为参考抗体，该参考抗体包含本文提供的参考文献和序列列表中列出的重链可变区和轻链可变区。
据报道，许多免疫检查点蛋白抗原在多种免疫细胞上表达，包括例如SIRP(在巨噬细胞、单核细胞、树突细胞上表达)、CD47(在肿瘤细胞和其他细胞类型上高度表达)、VISTA(在单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞上表达)、CD152(由活化的CD8+T细胞、CD4+T细胞和调节性T细胞表达)、CD279(在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达，由活化的T细胞(CD4和CD8两者)、调节性T细胞、活化的B细胞、活化的NK细胞、无反应性T细胞、单核细胞、树突细胞表达)、CD274(在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞上表达)和CD223(由活化的T细胞、调节性T细胞、无反应性T细胞、NK细胞、NKT细胞和浆细胞样树突细胞表达)(参见例如，Pardoll,D.,Nature Reviews Cancer,12:252-264,2012)。结合被确定为免疫检查点蛋白的抗原的抗体是本领域技术人员已知的。例如，本领域已经描述了多种抗CD276抗体(参见，例如，美国专利公布第20120294796号(Johnson等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗CD272抗体(参见，例如，美国专利公布第20140017255号(Mataraza等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗CD152/CTLA-4抗体(参见，例如，美国专利公布第20130136749号(Korman等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗LAG-3/CD223抗体(参见，例如，美国专利公布第20110150892号(Thudium等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗CD279/PD-1抗体(参见例如，美国专利第7,488,802号(Collins等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗PD-L1抗体(参见例如，美国专利公布第20130122014号(Korman等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了多种抗TIM-3抗体(参见，例如，美国专利公布第20140044728号(Takayanagi等人)及其中引用的参考文献)；并且本领域已经描述了多种抗B7-H4抗体(参见，例如，美国专利公布第20110085970号(Terrett等人)及其中引用的参考文献)。为了其中教导的特定抗体和序列，这些参考文献中的每一篇据此通过引用以其整体并入。
在多种实施方案中，IFN融合配偶体可以是表现出与存在于免疫细胞的表面上的免疫检查点蛋白抗原结合的抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、抗体片段、双抗体、或蛋白或肽。在多种实施方案中，免疫检查点蛋白抗原选自由以下组成但不限于以下的组：CD279(PD-1)、CD274(PDL-1)、CD276、CD272、CD152、CD223(LAG-3)、CD40、SIRPα、CD47、OX-40、GITR、ICOS、CD27、4-1BB、TIM-3、B7-H3、B7-H4、TIGIT和VISTA。
接头
在多种实施方案中，融合分子是重组表达的融合分子。在多种实施方案中，融合分子包含直接附接至靶向部分的干扰素分子。在多种实施方案中，融合分子包含经由肽接头附接至靶向部分的IFN分子。在多种实施方案中，接头可以是相对地不含二级结构的在5个、10个、15个、20个、30个、40个或更多个氨基酸之间的人工序列。在多种实施方案中，接头是在10个、15个、20个、30个、40个或更多个氨基酸之间的刚性接头肽，该刚性接头肽展示出α-螺旋构象并且可以充当蛋白结构域之间的刚性间隔物。在多种实施方案中，肽接头是富含G/S的接头。在多种实施方案中，肽接头是α-螺旋接头。在多种实施方案中，肽接头是甘氨酸接头。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:20中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:21中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:22中列出的序列。在多种实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:23中列出的序列。
在多种实施方案中，本公开内容的融合分子将包含表4中列举的抗体和干扰素分子组合。
表4
TAA Ab-IFN融合分子的实例
多核苷酸
在另一个方面中，本公开内容提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含编码本公开内容的IFN、IFN变体、IFN融合蛋白或IFN变体融合蛋白的多核苷酸。主题核酸可以是单链的或双链的。这样的核酸可以是DNA或RNA分子。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。编码IFN多肽的基因组DNA获取自基因组文库，该基因组文库对许多物种是可获得的。合成的DNA从化学合成重叠的寡核苷酸片段然后组装片段以重构编码区和侧翼序列的部分或全部而可获得。可以从指导mRNA的高水平合成的原核表达载体，诸如使用T7启动子和RNA聚合酶的载体获得RNA。cDNA获取自从分离自表达IFN的多种组织的mRNA制备的文库。本公开内容的DNA分子包括全长基因以及多核苷酸及其片段。全长基因还可以包含编码N末端信号序列的序列。这样的核酸可以例如在用于制备新型IFN变体的方法中使用。
在多种实施方案中，分离的核酸分子包含本文描述的多核苷酸，并且还包含编码本文描述的至少一种异源蛋白的多核苷酸。在多种实施方案中，核酸分子还包含编码本文描述的接头或铰链接头的多核苷酸。
在多种实施方案中，本公开内容的重组核酸可以可操作地连接至表达构建体中的一种或更多种调控核苷酸序列。调控序列是本领域所认知的并且被选择以指导IFN变体的表达。相应地，术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调控序列在Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)中描述。通常，所述一种或更多种调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活序列。本公开内容设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或者组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体诸如质粒上，或者表达构建体可以插入染色体中。在多种实施方案中，表达载体包含可选择的标记基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择的标记基因是本领域熟知的并且将随着使用的宿主细胞变化。
在本公开内容的另一个方面中，主题核酸在表达载体中提供，所述表达载体包含编码IFN变体并可操作地连接到至少一种调控序列的核苷酸序列。术语“表达载体”是指用于从多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。适于在宿主细胞中表达的载体是容易地可得的并利用标准重组DNA技术将核酸分子插入到载体中。这样的载体可以包括各种各样的表达控制序列，当被可操作地连接至DNA序列时，所述表达控制序列控制该DNA序列的表达，并可以在这些载体中使用以表达编码IFN变体的DNA序列。这样的有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期启动子和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒介导的早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达由T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶例如PhoS的启动子、酵母a-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。应理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白的类型的因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、以及由载体编码的任何其他蛋白诸如抗生素标记的表达。
本公开内容的重组核酸可以通过将克隆的基因或其一部分连接到适于在原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中来产生。用于产生重组IFN多肽的表达媒介物包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞诸如大肠杆菌中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体包含利于载体在细菌中增殖的原核序列以及在真核细胞中表达的一种或更多种真核转录单元两者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体为适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些被来自细菌质粒诸如pBR322的序列修饰，以利于在原核细胞和真核细胞两者中复制和药物抗性选择。可选地，病毒诸如牛乳头瘤病毒的衍生物(BPV-1)或Epstein-Barr病毒的衍生物(pHEBo、pREP衍生的和p205)可以用于蛋白在真核细胞中的瞬时表达。其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可见于下文基因疗法递送系统的描述中。在质粒的制备方面和宿主生物体的转化方面所采用的各种方法是本领域熟知的。对于适于原核细胞和真核细胞两者的其他表达系统以及一般的重组程序，参见Sambrook、Fritsch和Maniatis的Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)第16和17章。在一些情形下，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这样的杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(诸如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(诸如pAcUW1)以及pBlueBac衍生的载体(诸如含有B-gal的pBlueBac III)。
在多种实施方案中，载体将被设计成用于在CHO细胞中产生主题IFN变体，诸如Pcmv-Script载体(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)和pCI-neo载体(Promega,Madison,Wis.)。将明显的是，主题基因构建体可以被用于引起主题IFN变体在培养增殖的细胞中表达，例如以产生用于纯化的蛋白，包括融合蛋白或变体蛋白。
本公开内容还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包含编码一种或更多种主题IFN变体的氨基酸序列的核苷酸序列。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如，本公开内容的IFN变体可以在细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
相应地，本公开内容还涉及产生主题IFN变体的方法。例如，可以在允许发生IFN变体的表达的适当条件下培养用编码IFN变体的表达载体转染的宿主细胞。IFN变体可以从含有IFN变体的细胞分泌和从含有IFN变体的细胞和培养基的混合物分离。可选地，IFN变体可以保留在细胞质中或保留在膜级分中，并收获、裂解细胞和分离蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域熟知的。
本公开内容的多肽和蛋白可以根据本领域技术人员所熟知的蛋白纯化技术来纯化。这些技术在一个层面上包括蛋白级分和非蛋白级分的粗分级。已经将肽或多肽与其他蛋白分离后，可以利用色谱技术和电泳技术进一步纯化感兴趣的肽或多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。如本文使用的术语“分离的多肽”或“纯化的多肽”意图指可与其他组分分离的组合物，其中多肽被纯化至相对于其天然可获得状态的任何程度。因此纯化的多肽还指脱离其可能天然存在的环境的多肽。通常，“纯化的”将指已经经历分级以去除多种其他组分的多肽组合物，并且该组合物基本上保留了其表达的生物活性。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的肽或多肽组合物，其中多肽或肽形成组合物的大部分组分，诸如构成组合物中的蛋白的约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％或更多。
适合用于纯化的多种技术对于本领域技术人员将是熟知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等或通过热变性沉淀然后离心；层析，诸如亲和层析(蛋白-A柱)、离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石、疏水相互作用层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术的组合。如本领域一般已知的，认为进行多种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍得到用于制备基本上纯化的多肽的合适方法。
药物组合物
在另一个方面中，本公开内容提供了一种药物组合物，该药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白。这样的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知并理解的，并且已被广泛描述(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro编著,Mack PublishingCompany,1990)。可以包括药学上可接受的载体以用于改变、保持或维持，例如，pH、摩尔渗透压浓度、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、组合物的吸收或渗透的目的。这样的药物组合物可以影响多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。合适的药学上可接受的载体包括但不限于，氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(complexing agent)(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖和其他糖类(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；盐形成抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克、PEG、山梨醇酐酯(sorbitanesters)、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨醇)；张度增强剂(诸如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇和山梨醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。
药物组合物中的主要媒介物或载体实质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是可能用用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料补充的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。其他的示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本公开内容的一种实施方案中，可以通过将选择的具有期望程度的纯度的组合物与任选的制剂用剂(formulation agent)(Remington'sPharmaceutical Sciences,同上)混合来制备组合物以便以冻干的块状物或水性溶液形式储存。另外，可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖将治疗组合物配制为冻干物。最佳的药物组合物将取决于例如意图的施用途径、递送形式和期望的剂量由本领域普通技术人员确定。
当设想肠胃外施用时，治疗性药物组合物可以呈在药学上可接受的媒介物中包含期望的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白的无热原、肠胃外可接受的水性溶液的形式。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中多肽被配制为合适储存的无菌、等渗溶液。在多种实施方案中，适于可注射施用的药物制剂可以在水性溶液，优选地在生理上相容的缓冲液诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理缓冲盐水中配制。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。此外，活性化合物的悬浮液可以被制备为合适的油性注射悬浮液。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度并允许制备高度浓缩的溶液的剂。
在多种实施方案中，可以使用胶体分散系统将治疗性药物组合物配制为用于靶向递送。胶体分散系统包括大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统，基于脂质的系统包括水包油乳液、胶束、混合的胶束和脂质体。在脂质体产生中有用的脂质的实例包括磷脂酰化合物，诸如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。示例性磷脂包括卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶向还可以基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性并且是本领域已知的。
在多种实施方案中，设想了药物组合物的口服施用。以该形式施用的药物组合物可以使用或不使用固体剂型诸如片剂和胶囊的复合中通常使用的那些载体配制。在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，本公开内容的一种或更多种治疗化合物可以与一种或更多种药学上可接受的载体诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙(dicalcium phosphate)和/或以下中的任一种混合：(1)填料或增量剂(extender)，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。还可以采用相似类型的固体组合物，其使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂作为软填充和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其他的溶剂、增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、增香剂和防腐剂。
在多种实施方案中，设想了将药物组合物局部施用(topical administration)至皮肤或施用至黏膜。局部制剂还可以包含已知作为皮肤或角质层渗透增强剂有效的很多种剂中的一种或更多种。这些剂的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮。还可以包含另外的剂以使制剂在化妆品上可接受。这些剂的实例是脂肪、蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还可以包含角质软化剂(keratolytic agent)，诸如本领域已知的那些角质软化剂。实例是水杨酸和硫磺。用于局部或经皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏剂(ointments)、糊剂、霜剂(creams)、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。除了本公开内容的主题化合物(例如，con-IFN-α突变体)之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶可以包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。
本文中设想的用于使用的另外的药物组合物包括在持续递送或控制递送的制剂中包含多肽的制剂。用于配制多种其他持续递送或控制递送工具诸如脂质体运载体、生物可侵蚀的微粒或多孔珠和贮库型注射剂的技术也是本领域技术人员已知的。
待被治疗上使用的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和治疗目标。本领域技术人员将理解，用于治疗的适当剂量水平将因此部分地取决于所递送的分子、多肽所用于的适应症、施用途径、以及患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和状况(年龄和总体健康)而变化。相应地，临床医师可以调整剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。典型的剂量可以取决于上文提及的因素而在从约0.001mg/kg至最多约100mg/kg或更多的范围内。多肽组合物可以优选地注射或静脉内施用。长效药物组合物可以取决于特定制剂的半衰期和清除速率每三天至每四天、每周或每两周施用。给药频率将取决于使用的制剂中的多肽的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现期望的效果的剂量。因此组合物可以作为单剂量或作为随时间的多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)或作为持续的输注施用。常规地进行适当剂量的进一步改进。适当的剂量可以通过使用适当的剂量-响应数据来确定。
药物组合物的施用途径根据已知方法，例如口服；通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径，髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下或腹膜内或瘤内注射；以及鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式；通过持续释放系统或通过植入装置。当期望时，组合物可以通过团注(bolus)注射施用，或通过输注持续施用，或通过植入装置施用。可选地或另外地，组合物可以经由期望的分子已经吸附或包封至其上的膜、海绵状物或另一种适当的材料的植入来局部施用。当使用植入装置时，可以将该装置植入到任何合适的组织或器官中，并且期望的分子的递送可以经由扩散施用、缓释团注或持续施用。
治疗用途
在另一个方面中，本公开内容提供了治疗I型干扰素介导的病症的方法，该I型干扰素介导的病症选自由以下组成的组：癌症、感染性疾病、免疫病症、炎性疾病或状况以及自身免疫性疾病。
如本文使用的，癌症是指可能干扰身体器官和系统的正常功能的任何不受控制的细胞生长，并且包括原发性肿瘤和转移性肿瘤两者。从其原始位置迁移并播撒重要器官的原发性肿瘤或癌症最终可以通过受影响的器官的功能退化导致受试者死亡。转移是一种癌细胞或一组癌细胞，不同于原发肿瘤的位置，由癌细胞从原发性肿瘤播散到身体的其他部位引起。转移可能最终导致受试者死亡。例如，癌症可以包括良性癌症和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。
在另一个方面中，本公开内容提供了治疗受试者的癌细胞的方法，该方法包括向所述受试者施用在药学上可接受的载体中的治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本公开内容的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白，其中这样的施用抑制癌细胞的生长和/或增殖。具体地，本公开内容的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白可用于治疗以癌症为特征的病症。这样的病症包括但不限于实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官的癌症、消化道的癌症、尿道的癌症、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌以及它们的远端转移，淋巴瘤，肉瘤，多发性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的实例包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道的癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonary blastoma)。脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫的肉瘤。消化道的肿瘤包括但不限于肛癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。尿道的肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌和尿道癌。眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜胚细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合性肝细胞胆管癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌(Merkel cellskin cancer)和非黑素瘤皮肤癌。头颈癌包括但不限于鼻咽癌以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)和中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、各种淋巴细胞白血病、各种髓细胞性白血病和毛细胞白血病。在多种实施方案中，癌症将是具有TGF-β家族成员(诸如激活蛋白A、肌生成抑制蛋白、TGF-β和GDF15)的高表达的癌症，例如胰腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑素瘤、白血病、肺癌、前列腺癌、脑癌、膀胱癌和头颈癌。
在多种实施方案中，本发明的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白可以用于促进癌性肿瘤细胞的生长抑制和/或增殖。这些方法可以抑制或防止所述受试者的癌细胞的生长，诸如例如以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。因此，在癌症是实体瘤的情况下，该调节可以将实体瘤的尺寸减小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
癌细胞增殖的抑制可以通过基于细胞的测定来测量，诸如溴脱氧尿苷(BRDU)掺入(Hoshino等人,Int.J.Cancer 38,369,1986；Campana等人,J.Immunol.Meth.107:79,1988)；[3H]-胸苷掺入(Chen,J.,Oncogene 13:1395-403,1996；Jeoung,J.,J.Biol.Chem.270:18367-73,1995)；染料阿尔玛蓝(从Biosource International可得)(Voytik-Harbin等人,In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46,1998)。通过软琼脂中的集落形成测定(诸如通过对在软琼脂顶部形成的癌细胞集落的数量计数)来评估癌细胞的锚定非依赖性生长(参见实施例和Sambrook等人,Molecular Cloning,Cold SpringHarbor,1989)。
可以通过监测受试者(例如动物模型或人类受试者)中的癌症生长来评估受试者中癌细胞生长的抑制。一种示例性监测方法是致瘤性测定。在一个实例中，异种移植物包括来自预先存在的肿瘤或来自肿瘤细胞系的人类细胞。肿瘤异种移植物测定是本领域中已知的，并在本文描述(参见，例如，Ogawa等人,Oncogene 19:6043-6052，2000)。在另一种实施方案中，使用中空纤维测定法监测致瘤性，中空纤维测定法在美国专利第5,698,413号中描述，该专利通过引用以其整体并入本文。
通过比较调节物处理下与阴性对照条件下(通常没有调节物处理)的癌细胞增殖、锚定非依赖性生长或癌细胞生长来计算抑制的百分比。例如，其中癌细胞或癌细胞集落的数量(集落形成测定)，或PRDU或[3H]-胸苷掺入是A(在调节物处理下)和C(在阴性对照条件下)，抑制百分比将是(C-A)/C×100％。
源自人类肿瘤并可用于在体外和体内研究中使用的肿瘤细胞系的实例包括但不限于B淋巴母细胞细胞系(例如，Daudi细胞系)；白血病细胞系(例如，CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、RPM1-8226、SR、P388和P388/ADR)；非小细胞肺癌细胞系(例如，A549/ATCC、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522和LXFL 529)；小细胞肺癌细胞系(例如，DMS114和SHP-77)；结肠癌细胞系(例如COLO 205、HCC-2998、HCT-116、HCT-15、HT29、KM12、SW-620、DLD-1和KM20L2)；中枢神经系统(CNS)癌细胞系(例如，SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251、SNB-78和XF 498)；黑素瘤细胞系(例如，LOX IMVI、MALME-3M、M14、SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、RPMI-7951和M19-MEL)；卵巢癌细胞系(例如，IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8和SK-OV-3)；肾癌细胞系(例如，786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF 393、SN12C、TK-10、UO-31、RXF-631和SN12K1)；前列腺癌细胞系(例如，PC-3和DU-145)；乳腺癌细胞系(例如，MCF7、NCI/ADR-RES、MDA-MB-231/ATCC、HS 578T、MDA-MB-435、BT-549、T-47D和MDA-MB-468)；和甲状腺癌细胞系(例如，SK-N-SH)。
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内肝细胞癌(HCC)的主要原因并且是亚洲最重要的原因。所有慢性HBV感染中的75％发生在亚洲，并且中国台湾的患病率为15％-20％，其中多于90％的成年群体在过去已经感染HBV(Chen等人,J.Formos.Med.Assoc.(2007)106(2):148-55)。目前临床上批准的治疗选项是核苷类似物或核苷酸类似物和干扰素-α。核苷类似物或核苷酸类似物控制但不能治愈乙型肝炎，并且需要昂贵的长期治疗，这潜在地与抵抗性病毒的出现有关。干扰素-α疗法受到副作用的限制，并且仅在15％-20％的患者中治愈。该病毒基于其包膜蛋白上存在的抗原表位分为诱导不同抗体应答的四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)，并且根据基因组的总核苷酸序列变异分为(至少)八种基因型(A-I)。基因型具有不同的地理分布，并且用于追踪病毒的演化和传播。基因型之间的差异影响疾病的严重程度、病程和并发症的可能性，以及对治疗和可能的疫苗接种的响应。此外，存在基因亚型，例如A1-A5。在中欧和美国，主要基因型是A2。然而，只有1％的受感染的人类携带A2基因亚型，而大多数患者携带基因型B、C或D的HBV。已经示出，常规的HBV疫苗提供了比其他基因型或基因亚型((sub)genotype)更好的针对与疫苗中包含的HBV抗原相同的基因型或基因亚型的HBV的保护。
在另一个方面中，本公开内容提供了治疗受试者的HBV感染的方法，该方法包括向所述受试者施用在药学上可接受的载体中的治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本公开内容的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白，其中这样的施用保护细胞免受病毒感染。
在多种实施方案中，本发明的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白可以用于保护细胞免受病毒攻击。这些方法可以抑制或防止所述受试者的病毒感染，诸如例如以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
对病毒攻击的保护可以通过用药物处理细胞并且然后用HBV攻击细胞并监测感染率来测量。感染率可以通过测量乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV DNA的表达来评估。
可以用于监测药物处理和病毒攻击后的感染率的细胞的实例包括但不限于人类胎儿肝细胞、人类成年肝细胞、原代树鼩肝细胞、HepaRG细胞、诱导多能干细胞衍生的人类肝细胞和NTCP-过表达的肝癌细胞系(参见，例如，Xu等人,Virology Journal 18(1):105,2021)。
在多种实施方案中，本发明的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白可以用于处理HBV感染的细胞。这些方法可以治疗所述受试者的病毒感染，诸如例如以至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
HBV感染的细胞的抗病毒治疗的效力可以通过用药物处理HBV感染的细胞并且然后测量HBV感染的标志物来测量。感染可以通过测量HBsAg和HBV DNA的表达来评估。
可以用于监测HBV感染的细胞的抗病毒处理的细胞的实例包括但不限于HepG2.2.15细胞、HepAD38细胞、HepDE19细胞和HepDES19细胞(参见，例如，Xu等人,Virology Journal18(1):105,2021)。
丙型肝炎是一种血液传播的感染性病毒疾病，该疾病由属于黄病毒科的肝病毒属的被称为HCV的RNA病毒引起。包膜HCV病毒体包含正链RNA基因组，该正链RNA基因组在单一的、不间断的开放阅读框中编码所有已知的病毒特异性蛋白。开放阅读框包含大约9500个核苷酸并且编码约3000个氨基酸的单个大多聚蛋白。该多聚蛋白包括核心蛋白，包膜蛋白E1和E2，膜结合蛋白p7，和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。迄今为止，已知至少六种不同的HCV基因型(每种基因型中具有若干种亚型)。在北美，HCV基因型1a占主导地位，其次是HCV基因型1b、2a、2b和3a。在美国，HCV基因型1、2和3是最常见的，其中约80％的丙型肝炎患者具有HCV基因型1。在欧洲，HCV基因型1b占主导地位，其次是HCV基因型2a、2b、2c和3a。HCV基因型4和5几乎仅仅在非洲发现。患者的HCV基因型在确定患者对疗法的潜在响应和这样的疗法所需的持续时间方面具有临床重要性。
慢性HCV感染与进行性肝脏病理，包括肝硬化和肝细胞癌相关。在过去，用聚乙二醇干扰素-α联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎，其效力和耐受性有很大限制。最近，格卡瑞韦-哌仑他韦被批准用于治疗未经治疗的无肝硬化个体的慢性HCV感染，持续时间仅为八周。此外，所有其他目前批准的治疗，索磷布韦、来迪派韦、维帕他韦、伏西瑞韦、达拉他韦(daclatasvir)、艾尔巴韦、格拉瑞韦、司美匹韦(simeprevir)都被指示用于慢性HCV的治疗。虽然许多药物被指示用于慢性HCV的治疗，但迄今为止没有药物被指示用于HCV的急性治疗。此外，由于世界卫生组织的目标是到2030年前消除作为公共威胁的HCV，因此，对于治疗急性HCV感染的新的疗法和治疗选项存在需求，其中持续时间进一步缩短以达到依从性，而不会对效力、病毒突破、抗性、复发性病毒血症、病毒学复发或再感染具有负面影响。
存在两种主要用于治疗丙型肝炎的治疗方案：单一疗法(使用干扰素剂—“常规的”或长效聚乙二醇化干扰素)和组合疗法(使用干扰素剂和利巴韦林)。注射到血流中的干扰素通过增强对HCV的免疫应答起作用；并且口服的利巴韦林被认为通过阻止HCV复制起作用。单独服用的利巴韦林不能有效地抑制HCV水平，但干扰素/利巴韦林组合比单独的干扰素更有效。通常，丙型肝炎用聚乙二醇化干扰素α和利巴韦林的组合治疗持续24周或48周的时间段，这取决于HCV基因型。急性HCV感染也可以被定义为在ALT>10X ULN的6个月内。确定ALT和ULN的方法是本领域已知的。
在另一个方面中，本公开内容提供了治疗受试者的HCV感染的方法，该方法包括向所述受试者施用在药学上可接受的载体中的治疗有效量(作为单一疗法或在组合疗法方案中)的本公开内容的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白，其中这样的施用保护细胞免受病毒感染。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指将使被治疗的病症的一种或更多种症状缓解至一定程度的被施用的治疗剂的量。治疗有效剂量可以通过确定EC50从细胞培养物测定初始地评估。然后，可以配制剂量以在动物模型中实现包括如在细胞培养物中确定的EC50的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更精确地确定人类中有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过HPLC测量。确切的组合物、施用途径和剂量可以由单独的医师鉴于受试者的状况来选择。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望的应答(例如，治疗应答或预防应答)。例如，可以施用单次团注，可以随时间施用若干个分次剂量(多个或重复或维持)并且剂量可以根据治疗情境的迫切需要所指示的按比例减少或增加。为了便于施用和剂量的一致性，配制呈剂量单位形式的胃肠外组合物是特别有益的。如本文使用的剂量单位形式是指合适作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理分散的单位；每一个单位包含与需要的药物运载体一起的被计算产生期望的治疗作用的预先确定的量的活性化合物。本公开内容的剂量单位形式的规格将主要由抗体的独特特征和待实现的特定治疗作用或预防作用决定。
因此，技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，根据治疗领域中熟知的方法调整剂量和给药方案。即，最大可耐受剂量可以被容易地确定，并且向受试者提供可检测的治疗益处的有效量也可以被确定，向受试者提供可检测的治疗益处而施用每个剂的时间要求同样可以被确定。因此，尽管在本文中例举了某些剂量和施用方案，这些实例绝不限制在实践本公开内容时可以向受试者提供的剂量和施用方案。
应注意，剂量值可以随着待减轻的状况的类型和严重程度而变化，并且可以包括单个剂量或多于一个剂量。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用组合物或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。此外，本公开内容的组合物的剂量方案可以基于多个因素，包括疾病的类型、受试者的年龄、体重、性别、医学状况、状况的严重程度、施用途径和使用的特定抗体。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规地确定。例如，剂量可以基于药代动力学或药效动力学参数调整，该参数可以包括临床作用诸如毒性作用和/或实验值。因此，本公开内容包括如由技术人员确定的受试者内的剂量递增(intra-subject dose-escalation)。确定适当的剂量和方案是相关技术领域中熟知的并且将被理解为一旦提供本文所公开的教导，则由技术人员掌握。
本公开内容的con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白的治疗有效量或预防有效量的示例性的非限制性日剂量范围可以为0.001mg/kg体重至100mg/kg体重、0.001mg/kg体重至90mg/kg体重、0.001mg/kg体重至80mg/kg体重、0.001mg/kg体重至70mg/kg体重、0.001mg/kg体重至60mg/kg体重、0.001mg/kg体重至50mg/kg体重、0.001mg/kg体重至40mg/kg体重、0.001mg/kg体重至30mg/kg体重、0.001mg/kg体重至20mg/kg体重、0.001mg/kg体重至10mg/kg体重、0.001mg/kg体重至5mg/kg体重、0.001mg/kg体重至4mg/kg体重、0.001mg/kg体重至3mg/kg体重、0.001mg/kg体重至2mg/kg体重、0.001mg/kg体重至1mg/kg体重、0.010mg/kg体重至50mg/kg体重、0.010mg/kg体重至40mg/kg体重、0.010mg/kg体重至30mg/kg体重、0.010mg/kg体重至20mg/kg体重、0.010mg/kg体重至10mg/kg体重、0.010mg/kg体重至5mg/kg体重、0.010mg/kg体重至4mg/kg体重、0.010mg/kg体重至3mg/kg体重、0.010mg/kg体重至2mg/kg体重、0.010mg/kg体重至1mg/kg体重、0.1mg/kg体重至50mg/kg体重、0.1mg/kg体重至40mg/kg体重、0.1mg/kg体重至30mg/kg体重、0.1mg/kg体重至20mg/kg体重、0.1mg/kg体重至10mg/kg体重、0.1mg/kg体重至5mg/kg体重、0.1mg/kg体重至4mg/kg体重、0.1mg/kg体重至3mg/kg体重、0.1mg/kg体重至2mg/kg体重、0.1mg/kg体重至1mg/kg体重、1mg/kg体重至50mg/kg体重、1mg/kg体重至40mg/kg体重、1mg/kg体重至30mg/kg体重、1mg/kg体重至20mg/kg体重、1mg/kg体重至10mg/kg体重、1mg/kg体重至5mg/kg体重、1mg/kg体重至4mg/kg体重、1mg/kg体重至3mg/kg体重、1mg/kg体重至2mg/kg体重或1mg/kg体重至1mg/kg体重。应注意到，剂量值可以随着待减轻的状况的类型和严重程度而变化。还应理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用组合物或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的剂量范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
本公开内容的药物组合物的毒性和治疗指数可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序，例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定。毒性剂量和治疗有效剂量之间的剂量比是治疗指数，并且治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物通常是优选的。
施用con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白药物组合物的给药频率取决于疗法的性质和被治疗的特定疾病。受试者可以以规律间隔治疗，诸如每周两次、每周地或每月地，直到实现期望的治疗结果。示例性给药频率包括但不限于：无间断地每周一次；每2周一次；每3周一次；无间断地每周一次，持续2周，然后每月一次；无间断地每周一次，持续3周，然后每月一次；每月一次；每两个月一次；每3个月一次；每4个月一次；每5个月一次；或每6个月一次，或每年一次。
组合疗法
在另一个方面中，本公开内容提供了一种用于治疗受试者的癌症或癌症转移的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，所述第二疗法包括但不限于免疫疗法、细胞毒性化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法和干细胞移植。例如，这样的方法可以被用于预防性癌症预防、防止手术后癌症复发和转移，以及作为其他常规癌症疗法的辅助手段。本公开内容认识到，常规癌症疗法(例如，化学疗法、放射疗法、光疗法、免疫疗法和手术)的有效性可以通过本文描述的组合方法的使用来增强。
大量的常规化合物已经被证明具有抗赘生活性。这些化合物已经被用作化学疗法中的药剂以缩小实体瘤、预防转移和进一步生长、或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中的恶性T细胞的数目。尽管化学疗法在治疗多种类型的恶性肿瘤中是有效的，但许多抗赘生化合物诱导不期望的副作用。已经显示，当将两种或更多种不同的治疗组合时，治疗可以协同地起作用，并且允许降低每种治疗的剂量，从而降低每种化合物在较高的剂量产生的有害副作用。在其他情况下，对于治疗是难治性的恶性肿瘤可以响应于两种或更多种不同治疗的组合疗法。
在多种实施方案中，第二抗癌剂，诸如化学治疗剂将被施用至患者。示例性化学治疗剂的列表包括但不限于，柔红霉素、更生霉素(dactinomycin)、多柔比星、博莱霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、苯达莫司汀、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春花碱、依托泊苷、替尼泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、喷司他丁、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、普拉曲沙、米托蒽醌、己烯雌酚(DES)、氟达拉滨(fluradabine)、异环磷酰胺、羟基脲、紫杉烷(hydroxyureataxanes)(诸如紫杉醇和多西他赛(doxetaxel))和/或蒽环类抗生素，以及剂的组合，诸如但不限于DA-EPOCH、CHOP、CVP或FOLFOX。在多种实施方案中，这样的化疗剂的剂量包括但不限于约10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、75mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、210mg/m2、220mg/m2、230mg/m2、240mg/m2、250mg/m2、260mg/m2和300mg/m2中的任一种。
在多种实施方案中，本公开内容的组合疗法方法还可以包括向受试者施用治疗有效量的免疫疗法，该免疫疗法包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激性分子或共抑制性分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3、SIRP、CD47、CD40、Siglec 8、Siglec 9、Siglec 15、TIGIT和VISTA的激动性抗体、拮抗性抗体或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节物诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用卡介苗(BCG)的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用T细胞、嵌合抗原受体(CAR)-T细胞或iPS诱导的T细胞或iPS诱导的CAR-T细胞的治疗；使用NK细胞、CAR-NK细胞或iPS诱导的NK细胞或iPS诱导的CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增的和/或TCR转基因的抗肿瘤T细胞)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；和使用免疫刺激剂诸如Toll-样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗；其中组合疗法提供增加的对肿瘤细胞的杀伤，即，当被共施用时，在con-IFN-α变体和免疫疗法之间存在协同作用。
集中于利用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的免疫疗法已经被探索得非常成功(参见例如，Blattman和Greenberg,Science,305:200,2004；Adams和Weiner,Nat Biotech,23:1147,2005的综述)。这样的肿瘤抗原特异性的消耗性抗体的几个实例是(抗Her2/neu mAb)(Baselga等人,J Clin Oncology,Vol 14:737,1996；Baselga等人,Cancer Research,58:2825,1998；Shak,Semin.Oncology,26(Suppl12):71,1999；Vogal等人J Clin Oncology,20:719,2002)；和(抗CD20mAb)(Colombat等人,Blood,97:101,2001)。遗憾的是，虽然明显地它们已在肿瘤治疗方面取得了显著的成绩，但作为单一疗法，它们通常仅在约30％的个体中有效，并且仅有部分响应。此外，许多个体在用这些包含抗体的方案治疗后最终变为难治性或复发性的。
使用针对共刺激性分子或共抑制性分子(免疫检查点)的激动性抗体、拮抗性抗体或阻断性抗体的治疗已经成为被广泛研究和临床评价的领域。在正常生理条件下，免疫检查点对于维持自身耐受(self-tolerance)(即防止自身免疫)和在免疫系统对病原感染进行应答时保护组织免受损伤至关重要。现在还清楚的是，肿瘤选取(co-opt)某些免疫检查点途径作为免疫耐受(immune resistance)(特别是针对肿瘤抗原特异性T细胞的免疫耐受)的主要机制(PardollDM.,Nat Rev Cancer,12:252-64,2012)。因此，利用针对免疫检查点分子的抗体，包括例如CTLA-4(伊匹单抗(ipilimumab))、PD-1(纳武利尤单抗；帕博利珠单抗；西米普利单抗)和PD-L1(阿替利珠单抗；度伐利尤单抗；阿维鲁单抗(avelumab))(参见，例如，Philips和Atkins,International Immunology,27(1)；39-46,2014年10月)，以及OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIGIT、TIM-3和VISTA(参见，例如，Sharon等人,Chin J Cancer.,33(9):434-444,2014年9月；Hodi等人,N Engl J Med,2010；Topalian等人,N Engl J Med,366:2443-54)的治疗作为治疗患有增生性疾病诸如癌症的患者，并且特别是患有难治性癌症和/或复发性癌症的患者的新的替代免疫疗法正在被评估或者已经被FDA批准。
使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的治疗是一种免疫疗法，其中在实验室中分离患者自身的T细胞，用识别特定抗原或蛋白的合成受体重定向并且重输注到患者体内。CAR是合成分子，最少包含：(1)抗原结合区，通常源自抗体，(2)将CAR锚定到T细胞中的跨膜结构域，和(3)1个或更多个细胞内T细胞信号传导结构域。CAR以不依赖于人类白细胞抗原(HLA)的方式将T细胞特异性重定向至抗原，并且克服了与T细胞耐受相关的问题(Kalos M和June CH,Immunity,39(1):49-60,2013)。围绕CAR-T细胞疗法的新一波令人兴奋的事件始于2011年8月，当时宾夕法尼亚(Penn)大学的研究人员公布了一份报告，报告针对3个患有难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者，他们在接受了单次剂量的针对CD 19的CAR T细胞后得到了长期缓解(Porter DL等人,N Engl J Med.,365(8):725-733,2011)。在ALL、NHL和多发性骨髓瘤的成功临床试验之后，五种CAR-T疗法已经被FDA批准。这些疗法包括Abecma、Breyanzi、Kymriah、Tecartus和Yescarta，并且除了靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的Abecma之外，所有疗法都靶向恶性B细胞上表达的CD19抗原。许多制药和生物技术公司正在临床上开发和测试下一代CAR-T细胞疗法，并且被设计成提高第一代细胞疗法的毒性、效力和可制造性(参见，例如，Sterner和Sterner,Blood Cancer Journal 11:69,2021；Larson和Maus,Nature Reviews Cancer 21:145-161,2021)。
与供体T细胞相比，已知自然杀伤(NK)细胞介导抗癌作用，而没有诱发移植物抗宿主病(GvHD)的风险。相应地，同种异体反应性NK细胞现在也是作为癌症细胞疗法的合适且强有力的效应细胞的相当感兴趣的焦点。已经建立了若干种人类NK细胞系，例如NK-92、HANK-1、KHYG-1、NK-YS、NKG、YT、YTS、NKL和NK3.3(Kornbluth,J.等人,J.Immunol.134,728-735,1985；Cheng,M.等人,Front.Med.6:56,2012)，并且已经产生了多种表达CAR的NK细胞(CAR-NK)。使用表达CAR的NK细胞(CAR-NK)的免疫疗法是研究和临床评价的活跃领域(参见例如，Glienke等人,Front Pharmacol,6(21):1-7,2015年2月)。
双特异性T细胞接合分子构成一类双特异性单链抗体，用于针对病原性靶细胞的细胞毒性T细胞的多克隆活化和重定向。对于癌细胞上的表面靶抗原和T细胞上的CD3是双特异性的。能够将任何种类的细胞毒性T细胞与癌细胞连接，而不依赖于T细胞受体特异性、共刺激或肽抗原呈递。一组独特的特性对于任何其他种类的双特异性抗体构建体尚未被报道，即，在不需要T细胞共刺激的情况下，在低T细胞数目下针对靶细胞具有优异的潜能和功效(Baeuerle等人,Cancer Res,69(12):4941-4,2009)。到目前为止，已经构建了针对许多不同靶抗原的BiTE抗体，所述靶抗原包括CD19、EpCAM、Her2/neu、EGFR、CD66e(或CEA、CEACAM5)、CD33、EphA2、MCSP(或HMW-MAA)(同上)、BCMA、CLDN18.2、DLL3、FLT3、MUC17和PSMA。目前，FDA批准的唯一抗体是Blincyto(贝林妥欧单抗(blinatumomab))，但许多抗体正在早期临床试验中进行测试。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的感染性疾病的方法，该方法包括施用与第二剂/第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，该第二剂/第二疗法选自由以下组成的组：阿巴卡韦(Abacavir)、伐昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、安普那韦(Amprenavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、西多福韦(Cidofovir)、达芦那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、地达诺新(Didanosine)、二十二烷醇、依非韦伦(Efavirenz)、艾维雷韦(Elvitegravir)、恩曲他滨、恩夫韦肽(Enfuvirtide)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦和膦甲酸钠(Foscarnet)。在一些实施方案中，抗感染剂是抗细菌剂，包括但不限于头孢菌素类抗生素(头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢菌素、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯和头孢比罗)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星(cipro)、左氧氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和多西环素)；青霉素类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、青霉素V、双氯西林、羧苄西林、万古霉素和甲氧西林)；单内酰胺类抗生素(氨曲南)；和碳青霉烯类抗生素(厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。在一些实施方案中，抗感染剂包括抗疟剂(例如，氯喹、奎宁、甲氟喹、伯氨喹、多西环素、蒿甲醚/本芴醇、阿托伐醌/氯胍和磺胺多辛/乙胺嘧啶)、甲硝唑、替硝唑、伊维菌素、双羟萘酸噻嘧啶和阿苯达唑。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HCV的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，该第二疗法选自由以下组成的组：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、直接作用抗病毒剂、利巴韦林和聚乙二醇化干扰素。在多种实施方案中，第二疗法选自由以下组成的组：Mavyet(格卡瑞韦/哌仑他韦)、Epclusa(索磷布韦/维帕他韦)、Vosevi(索磷布韦/维帕他韦/伏西瑞韦)、Harvoni(来迪派韦/索磷布韦)、Sovaldi(索磷布韦)和Zepatier(艾尔巴韦/格拉瑞韦)。利巴韦林的示例性制剂包括和利巴韦林的示例性前药是具有化学名称为1-β-D-呋喃核糖基-1,2,4-三唑-3-甲脒的taribavirin。利巴韦林和taribavirin可以按照本领域熟知的利巴韦林和taribavirin施用来施用。例如，利巴韦林或taribavirin可以以从约5mg至约1500mg的总日剂量施用。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于治疗受试者的HBV的方法，该方法包括施用与第二疗法组合的治疗有效量的本发明的药物组合物，该第二疗法选自由以下组成的组：使用核苷类似物或核苷酸类似物的治疗，所述核苷类似物或核苷酸类似物诸如富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦(ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨、克拉夫定、利托那韦、dipivoxil、洛布卡韦、泛昔洛韦、FTC、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α和更昔洛韦、besifovir(ANA-380/LB-80380)和tenofovir-exaliades(TLX/CMX157)；使用其他抗病毒药物诸如siRNA、反义寡核苷酸、衣壳组装调节剂和聚合酶抑制剂的治疗；使用免疫调节疗法的治疗，所述免疫调节疗法诸如TLR7激动剂、TLR8激动剂、STING激动剂、RIG-I激活剂、PD-1阻断抗体、PD-L1阻断抗体、TIM-3阻断抗体、LAG-3阻断抗体和CTLA-4阻断抗体；使用针对HBV抗原的治疗性疫苗的治疗；以及使用过继细胞疗法的治疗，所述过继细胞疗法诸如HBV特异性CAR-T细胞疗法、HBV特异性TCR-T细胞疗法和其他HBV特异性细胞疗法。
在多种实施方案中，组合疗法包括以相同的药物组合物或以单独的药物组合物同时施用con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物和第二疗法或第二剂组合物。在多种实施方案中，con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物和第二疗法或第二剂组合物被相继地施用，即con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物在施用第二疗法或第二剂组合物之前或之后施用。在多种实施方案中，con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白和第二疗法或第二剂组合物的施用是同时进行的，即con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物和第二疗法或第二剂组合物的施用期彼此重叠。在多种实施方案中，con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物和第二疗法或第二剂组合物的施用是非同时进行的。例如，在多种实施方案中，在施用第二疗法或第二剂组合物之前，终止con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物的施用。在多种实施方案中，在施用con-IFN-α突变体或双功能con-IFN-α突变体融合蛋白组合物之前，终止第二疗法或第二剂组合物的施用。
提供以下实施例以更充分地说明本公开内容，但不应解释为限制本公开内容的范围。
实施例1
PD-L1 Ab-IFN突变体融合构建体的构建与产生
IFN-α2b(登录#P01563)、IFN-α5(登录#P01569)和IFN-α6(登录#P05013)的序列获自Uniprot数据库。共有人类白细胞IFN(Con-IFN)的序列获自美国专利第US4695623号(通过引用以其整体并入)。被设计成减弱对I型IFN受体(IFNAR)的亲和力的IFN-α2b序列中的突变在美国专利第9492562号(R149A)(通过引用以其整体并入)和美国专利第9611322号(A145D和A145K)(通过引用以其整体并入)中描述。抗PD-L1 mAb(REMD290)的序列获自PCT专利申请PCT/US2017/068369(通过引用以其整体并入)。使用“knob-into-hole”促进异二聚体形成的抗体重链突变的序列在例如Merchant等人,Nat.Biotechnol.,16:677-681,1998中描述。经由工程化二硫键促进异二聚体形成的抗体重链突变的序列在美国专利第8,765,412号中描述。
使用本领域普通技术人员熟知和理解的技术，通过将IFN序列添加到抗体重链序列的C-末端来构建抗体-IFN融合蛋白的序列。例如，共有干扰素突变体分子(SEQ ID NO:2)被表达为与抗PD-L1抗体重链(SEQ ID NO:16)的C-末端融合，并与抗PD-L1轻链(SEQ IDNO:15)共表达以形成抗PD-L1 Ab-con-IFN-α突变体融合蛋白。
靶蛋白的基因序列被优化用于哺乳动物表达并被合成。然后将靶序列克隆到表达载体pTT5。然后将300mL CHO-3E7细胞瞬时转染，并且将细胞在摇瓶中培养持续5-7天。在培养之后，收获细胞培养基，并且将融合蛋白用蛋白A树脂纯化。用SDS-PAGE和SEC-HPLC检查纯化蛋白的质量。最终材料在10mM组氨酸、8％蔗糖、0.01％聚山梨醇酯80、pH 5.5中以高于1mg/ml的浓度配制，并在-80℃储存。
实施例2
使用干扰素-α报告物测定确定PD-L1 Ab-IFN-α突变体融合蛋白的IFN活性
使用测量在IFN-α响应性启动子的控制下分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的表达的IFN-α报告物测定系统，来确定PD-L1 Ab-IFN-α突变体融合蛋白的IFN活性。发现基于HEK293的报告细胞系表达低水平的PD-L1，因此为了评估真正的非靶向活性，将REMD290PD-L1 Ab预孵育以阻断细胞上的任何PD-L1，因此唯一的结合是在IFN和IFNAR之间。为了确定靶向活性，报告细胞系不与PD-L1 Ab预孵育。
IFN-α报告物测定方案如下：(1)将IFN-α报告细胞添加到96孔板中，并且然后与PD-L1Ab或不与PD-L1 Ab一起孵育持续2小时；(2)将预先稀释的融合蛋白和IFN-α2b添加到孔中，并且然后孵育过夜；(3)将QUANTI-Blue溶液添加到每个孔中，并且然后孵育持续4小时；以及(4)在655nm处获取吸光度读数。
检查了表5中列出的20个构建体。EC50比率1表示PD-L1阴性细胞(非靶向细胞)上与野生型IFN-α2b相比IFN活性减弱的倍数，而EC50比率2表示PD-L1阳性细胞(靶向细胞)上与野生型IFN-α2b相比IFN活性增强的倍数。靶向指数是比率1和比率2的乘积，表明融合蛋白的安全窗口的相对水平。
表5
在PD-L1阴性报告细胞和PD-L1阳性报告细胞上与野生型IFN-α2b相比PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白的活性
实施例3
PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白的稳定性
将融合蛋白在4℃或-80℃储存持续80天，并且然后通过如上文所描述的报告物测定测量生物活性。融合蛋白保留了生物活性，如表6中示出的。
表6
在4℃储存80天之后保留PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白的活性
实施例4
PD-L1的表达增加PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白在肿瘤细胞生长抑制中的效能
使用CellTiter 96AQueous非放射性细胞增殖测定测量IFN-α2b或融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用。方案如下：(1)将Daudi NIH肿瘤细胞添加到96孔板中，并且在生长培养基(细胞对照)或添加预先稀释的IFN-α2b或融合蛋白的生长培养基中孵育持续5天。无细胞的生长培养基被用作背景对照；(2)将MTS添加到每个孔中，并且然后孵育持续4小时；(3)在490nm处获取吸光度读数；以及(4)最大生长百分比被计算如下：(样品信号-背景信号)/(细胞对照信号-背景信号)*100。
亲本Daudi细胞不表达PD-L1。通过将人类PD-L1基因转染到Daudi细胞中来产生表达PD-L1的Daudi/PD-L1细胞系。检查表7中列出的九种构建体对Daudi细胞(PD-L1阴性)和Daudi/PD-L1细胞(PD-L1阳性)两者的生长抑制。EC50比率1、EC50比率2和靶向指数如实施例2中所定义。所测试的融合蛋白之间的靶向指数存在大差异。
表7
与野生型IFN-α2b相比PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白对Daudi细胞和Daudi/PD-L1细胞的活性
Daudi/PD-L1#2和Daudi/PD-L1#4是表达不同水平的PD-L1的转染的Daudi细胞系。如表8中描绘的，PD-L1表达显著增强了融合蛋白对Daudi细胞的抑制活性，并且增强水平与PD-L1表达水平相关。
表8
实施例5
PD-L1 Ab-IFN突变体融合蛋白抑制OVCAR3细胞生长
OVCAR-3卵巢癌细胞表达低水平的PD-L1。细胞用滴定浓度的IFN-α2b、FP-07、FP-08在37℃/5％ CO2处理持续5天，或者不经处理。使用CellTiter 96AQueous非放射性细胞增殖测定(Promega)测量细胞生长抑制。FP-08处理导致最强生长抑制(相对于IFN-α2b为62.8pM，EC50＝1.12pM)。FP-07处理示出低得多的有效生长抑制活性。FP-07和FP-08以不同的减弱的IFN活性抑制OVCAR-3细胞生长(参见图2)。
MHC-1表达测定：将OVCAR-3细胞在生长培养基(细胞对照)或添加样品(REMD290、IFN-α2b或融合蛋白)的生长培养基中孵育持续2天。通过使用PE抗人类HLA-A抗体、PE抗人类HLA-B抗体、PE抗人类HLA-C抗体(样品MFI)或不使用抗体(背景MFI)的FACS来确定MHC-I表达。倍数增加被计算如下：(样品MFI-背景MFI)/(细胞对照MFI-背景MFI)。与细胞对照相比，用IFN-α2b和FP-08处理导致细胞表面上MHC-I的类似增加的水平，并且FP-07处理仅导致略微增加的MHC-I表达。FP-07和FP-08增加OVCAR-3细胞中的MHC-I表达。增加的MHC-I表达可以使肿瘤细胞更具免疫原性，即更好地被CD8+T细胞识别(参见图3)。
PD-L1表达测定：将OVCAR-3细胞在生长培养基(细胞对照)或添加样品(REMD290、IFN-α2b或融合蛋白)的生长培养基中孵育持续2天。通过使用REMD290(样品MFI)或不使用抗体(背景MFI)的FACS，并且然后通过FITC山羊抗人类IgG第二抗体来确定PD-L1表达。倍数增加被计算如下：(样品MFI-背景MFI)/(细胞对照MFI-背景MFI)。用FP-08和IFN-α2b的处理导致PD-L1表达的轻微增加，而FP-07没有增加PD-L1表达。增加的PD-L1水平可以有助于增强PD-L1定向融合蛋白对肿瘤细胞的靶向作用(参见图4)。
本文公开和请求保护的所有物品和方法鉴于本公开内容均可被制备和执行，无需过度实验。尽管已根据优选的实施方案描述了本公开内容的物品和方法，但对于本领域技术人员将明显的是，变化形式可被应用到所述物品和方法而不偏离本公开内容的精神和范围。对于本领域技术人员明显的是，所有这样的变化和等效物，无论是现存的或以后开发的，都被认为是在由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围之内。说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本公开内容所属领域的普通技术人员的水平。出于所有目的，所有专利、专利申请和出版物通过引用以其整体并入本文，并且其程度如同每个单独的出版物具体地并且单独地被指示出于任何和所有目的通过引用以其整体并入。本文例证地描述的本公开内容可在本文未具体地公开的任何一个或更多个要素不存在的条件下被合适地实践。因此，应理解，尽管本公开内容已通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，但是本领域技术人员可寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在由所附的权利要求限定的本公开内容的范围内。
序列表
在所附的序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列按37 C.F.R.1.822中规定的使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的单字母编码示出。
SEQ ID NO:1是野生型共有IFN氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是共有IFN(R150A)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是共有IFN(A146D)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是共有IFN(A146K)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是共有IFN(A146D和R150A)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是野生型IFN-α2b氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是IFN-α2b(R149A)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是野生型IFN-α5氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是IFN-α5(R150A)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是IFN-α5(A146D)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是野生型IFN-α6氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是IFN-α6(R150A)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是IFN-α6(A146D)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是IFN-α6(A146K)突变体氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是编码抗PD-L1抗体的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是编码抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是编码抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是编码含有“knob”的抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是编码含有“hole”的抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20-23是肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是肽前导序列的氨基酸序列。
序列表
野生型共有IFN序列
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:1)
共有IFN(R150A)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:2)
共有IFN(A146D)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:3)
共有IFN(A146K)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRKEIMRSFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:4)
共有IFN(A146D和R150A)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMASFSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:5)
野生型IFN-α2b序列
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:6)
IFN-α2b(R149A)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:7)
野生型IFN-α5序列
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:8)
IFN-α5(R150A)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:9)
IFN-α5(A146D)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACMMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:10)
野生型IFN-α6序列
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:11)
IFN-α6(R150A)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMASFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:12)IFN-α6(A146D)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRDEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:13)
IFN-α6(A146K)突变体氨基酸序列
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQKAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEACVMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRKEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:14)
编码抗PD-L1抗体的轻链的氨基酸序列
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKTSQDVNTAVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:15)
编码抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVAYFYVGNGYTDYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGLPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:16)
编码抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVAYFYVGNGYTDYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGLPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:17)
编码含有knob的抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVAYFYVGNGYTDYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGLPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:18)
编码含有hole的抗PD-L1抗体的重链的氨基酸序列QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTSYSINWVRQAPGKGLEWVAYFYVGNGYTDYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGLPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:19)
肽接头的氨基酸序列
SGGGGS(SEQ ID NO:20)
肽接头的氨基酸序列
AEAAAKEAAAKAGS(SEQ ID NO:21)
肽接头的氨基酸序列
GGGGGGGG(SEQ ID NO:22)
肽接头的氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)
肽前导序列的氨基酸序列
MGWSWILLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:24)。

Claims (39)

1.一种分离的融合蛋白，包含1)突变的共有IFN-α(con-IFN-α)变体多肽和2)靶向部分，其中与由SEQ ID NO:6表示的多肽相比，所述con-IFN-α变体多肽表现出对IFN-αR1和IFN-αR2受体复合物(IFN-αR)降低的活性和亲和力；其中所述靶向部分恢复所述con-IFN-α变体多肽对靶向细胞的降低的亲和力。
2.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的con-IFN-α突变体分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：靶向在IFN受体表达细胞上表达的标志物的靶向部分；靶向组织特异性标志物的靶向部分；以及靶向癌组织的靶向部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：靶向HBV感染的组织的靶向部分以及靶向HCV感染的组织的靶向部分。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分选自由以下组成的组：完全人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、异二聚体抗体、结合抗原的抗体片段、Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体、单抗体和双抗体。
6.根据权利要求5所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:16中列出的重链序列的人类抗PD-L1 Ab。
7.根据权利要求5所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:17中列出的重链序列的人类抗PD-L1 Ab。
8.根据权利要求5所述的分离的融合蛋白，其中所述靶向部分是具有SEQ ID NO:15中列出的轻链序列和SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中列出的重链序列的异二聚体人类抗PD-L1 Ab。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述分离的融合蛋白包含经由肽接头附接至所述靶向部分的con-IFN-α变体多肽。
10.根据权利要求9所述的分离的融合蛋白，其中所述肽接头具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。
11.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-07”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-07”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α(R150A)分子，所述con-IFN-α(R150A)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
12.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-08”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-08”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D)分子，所述con-IFN-α(A146D)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
13.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146K)融合分子(“FP-09”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146K)融合分子(“FP-09”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的con-IFN-α(A146K)分子，所述con-IFN-α(A146K)分子直接与具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
14.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-14”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-14”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α(R150A)分子，所述con-IFN-α(R150A)分子使用具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
15.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-15”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(R150A)融合分子(“FP-15”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α(R150A)分子，所述con-IFN-α(R150A)分子使用具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
16.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-16”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-16”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D)分子，所述con-IFN-α(A146D)分子使用具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
17.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-17”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D)融合分子(“FP-16”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D)分子，所述con-IFN-α(A146D)分子使用具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
18.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D和R150A)融合分子(“FP-18”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D和R150A)融合分子(“FP-18”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D和R150A)分子，所述con-IFN-α(A146D和R150A)分子使用具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头与具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合。
19.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(R150A)异二聚体融合分子(“FP-19”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(R150A)异二聚体融合分子(“FP-19”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的con-IFN-α(R150A)分子，所述con-IFN-α(R150A)分子使用具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二成对抗体重链与具有SEQID NO:19中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合，而没有融合的IFN。
20.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合分子是抗PD-L1Ab-con-IFN-α(A146D和R150A)异二聚体融合分子(“FP-20”)，所述抗PD-L1 Ab-con-IFN-α(A146D和R150A)异二聚体融合分子(“FP-20”)包含具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的轻链以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的con-IFN-α(A146D和R150A)分子，所述con-IFN-α(A146D和R150A)分子使用具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二成对抗体重链与具有SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列的重链的C-末端融合，而没有融合的IFN。
21.一种药物组合物，包含与药学上可接受的赋形剂或运载体混合的根据权利要求1-20中任一项所述的分离的融合蛋白。
22.一种用于治疗受试者的I型干扰素介导的病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求21所述的药物组合物；其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：癌症、感染性疾病、免疫病症、炎性疾病或状况以及自身免疫性疾病。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病症是癌症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括选自由以下组成的组的第二疗法：细胞毒性化学疗法、免疫疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法和干细胞移植。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述免疫疗法选自由以下组成的组：使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激性分子或共抑制性分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3、CD40、CD47、SIRPα、ICOS、Siglec 8、Siglec 9、Siglec 15、TIGIT和VISTA的激动性抗体、拮抗性抗体或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节物诸如TNF家族、IL-1、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增的和/或TCR转基因的抗肿瘤T细胞)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；和使用免疫刺激剂诸如Toll-样受体(TLR：TLR7、TLR8和TLR9)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗；其中所述组合疗法提供增加的对肿瘤细胞的效应细胞杀伤，即，当被共施用时，在所述分离的融合蛋白和所述免疫疗法之间存在协同作用。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：B细胞淋巴瘤；肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；支气管癌；结肠直肠癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃癌；卵巢癌；膀胱癌；脑癌或中枢神经系统癌症；外周神经系统癌症；食道癌；宫颈癌；黑素瘤；子宫癌或子宫内膜癌；口腔或咽部的癌症；肝癌；肾癌；胆道癌；小肠癌或阑尾癌；唾液腺癌；甲状腺癌；肾上腺癌；骨肉瘤；软骨肉瘤；脂肪肉瘤；睾丸癌；和恶性纤维组织细胞瘤；皮肤癌；头颈癌；淋巴瘤；肉瘤；多发性骨髓瘤；以及白血病。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述受试者先前对用抗癌疗法的治疗有响应，但是在停止治疗后遭受复发(下文称为“复发性癌症”)。
28.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述受试者具有抵抗性或难治性癌症。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述病症是HBV。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法还包括选自由以下组成的组的第二疗法：使用核苷类似物或核苷酸类似物的治疗，所述核苷类似物或核苷酸类似物诸如富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦(ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨、克拉夫定、利托那韦、dipivoxil、洛布卡韦、泛昔洛韦、FTC、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α和更昔洛韦、besifovir(ANA-380/LB-80380)和tenofovir-exaliades(TLX/CMX157)；使用其他抗病毒药物诸如siRNA、反义寡核苷酸、衣壳组装调节剂和聚合酶抑制剂的治疗；使用免疫调节疗法的治疗，所述免疫调节疗法诸如TLR7激动剂、TLR8激动剂、STING激动剂、RIG-I激活剂、PD-1阻断抗体、PD-L1阻断抗体、TIM-3阻断抗体、LAG-3阻断抗体和CTLA-4阻断抗体；使用针对HBV抗原的治疗性疫苗的治疗；以及使用过继细胞疗法的治疗，所述过继细胞疗法诸如HBV特异性CAR-T细胞疗法、HBV特异性TCR-T细胞疗法和其他HBV特异性细胞疗法。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述组合疗法提供增加的抗病毒活性，即，当被共施用时，在所述分离的融合蛋白和所述组合疗法之间存在协同作用。
32.根据权利要求22所述的方法，其中所述病症是HBV。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法还包括选自由以下组成的组的第二疗法：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、直接作用抗病毒剂、利巴韦林和聚乙二醇化干扰素。在多种实施方案中，所述第二疗法选自由以下组成的组：Mavyet(格卡瑞韦/哌仑他韦)、Epclusa(索磷布韦/维帕他韦)、Vosevi(索磷布韦/维帕他韦/伏西瑞韦)、Harvoni(来迪派韦/索磷布韦)、Sovaldi(索磷布韦)和Zepatier(艾尔巴韦/格拉瑞韦)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合疗法提供增加的抗病毒活性，即，当被共施用时，在所述分离的融合蛋白和所述组合疗法之间存在协同作用。
35.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白。
36.一种表达载体，包含根据权利要求35所述的核酸分子。
37.一种宿主细胞，包含根据权利要求36所述的核酸分子或根据权利要求34所述的表达载体。
38.一种产生根据权利要求1至20中任一项所述的融合蛋白的方法，包括在促进所述融合蛋白的表达的条件下培养根据权利要求35所述的宿主细胞和回收所述融合蛋白。
39.一种分离的融合蛋白，通过根据权利要求38所述的方法产生。
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