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CN118206620A - 一种多肽标签及其应用 - Google Patents

一种多肽标签及其应用 Download PDF

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CN118206620A
CN118206620A CN202211583731.4A CN202211583731A CN118206620A CN 118206620 A CN118206620 A CN 118206620A CN 202211583731 A CN202211583731 A CN 202211583731A CN 118206620 A CN118206620 A CN 118206620A
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polypeptide
car
nucleic acid
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马承宁
李加国
刘祥箴
孙艳
钱其军
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Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Cell Therapy Group Pharmaceutical Technology Co ltd
Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
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Abstract

本发明涉及多肽标签及其应用，具体提供一种多肽标签，其具有：(1)SEQ ID NO:1‑11中任一项所示的序列，或(2)与(1)的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的序列。所述标签可有助于T细胞体外特异活化扩增、分离富集、体内活化扩增、关闭活性及清除等。

Description

一种多肽标签及其应用
技术领域
本发明属于医学生物领域，具体涉及一种多肽标签以及携带该标签的CAR、CAR-T细胞及应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗技术是肿瘤免疫细胞治疗的一个领域。CAR-T细胞在细胞表面表达融合蛋白，使T淋巴细胞能够以非MHC限制的方式识别特定抗原，增强其识别和杀死肿瘤的能力。一般来说，CAR包括结合激活配体的胞外结构域、参与与“靶”细胞形成免疫突触的跨膜结构域和通过激活T细胞相关转录反应对胞外结构域结合作出反应的胞内结构域。
嵌合抗原受体(CAR)的结构是以色列埃什哈尔研究团队于1989年提出的。自那时以来，已经证实显示CAR结构细胞表面蛋白的T细胞在肿瘤免疫治疗中具有良好的效果。第一代CAR受体含有单链可变片段(scFv)，细胞内激活信号通过CD3ζ(CD3z)信号链传递。然而，第一代CAR受体缺乏提供T细胞共刺激信号的结构域，这导致CAR-T细胞仅发挥短暂作用，在体内时间短，细胞因子分泌较少。第二代CAR受体引入共刺激信号分子的细胞内结构域，包括例如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、DNAX激活蛋白10(DAP10)和其他增强T细胞增殖和细胞因子分泌的结构域。IL-2、IFN-γ和GM-CSF的产生增加，从而打破肿瘤微环境的免疫抑制，例如激活诱导的细胞死亡(AICD)。第三代CAR受体在共刺激结构CD28和ITAM信号链之间加入次级共刺激分子，如4-1BB，从而产生三信号CAR受体。目前，治疗中常用的CAR结构是第二代CAR，其结构可分为以下四部分：抗体单链可变区(scFv)、铰链区、跨膜区和细胞内刺激信号肽。铰链区域有助于形成正确的构象和二聚体，影响CAR与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。
选择合适的肿瘤抗原作为靶点是设计安全有效的CAR-T的关键。目前正在开发多种类型的CAR-T细胞用于血液系统恶性肿瘤的治疗，包括使用抗CD19、抗CD20、抗Kappa轻链、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70和其他抗体构建CAR修饰T细胞的疗法。在这些已经进行了抗肿瘤研究中，抗CD19和抗CD20单克隆抗体是最常用的抗体。
然而，CAR-T细胞虽具有很强的杀伤血液肿瘤细胞的能力，但在实体瘤的肿瘤微环境(TME)中，其活性很容易受到抑制。这一结果源于CAR-T细胞回输患者后在体内的扩增、存续、肿瘤浸润以及抵抗肿瘤微环境等方面的问题。例如，CAR-T细胞进入体内后可能与实体瘤细胞缺少直接充分的接触，导致回输后无法大量活化扩增，从而影响治疗效果。另外，目前缺少合适的手段对CAR-T细胞进入体内后的进展和去向进行检测。此外，在缺乏控制过度活化的CAR-T细胞或消除这些CAR-T细胞的方法的情况下，CAR-T细胞持续且不受控制地增殖和激活，可能引起致命的靶外毒性、细胞因子释放综合症或神经毒性。
此外，目前基于CAR-T细胞的治疗依赖于回输患者前CAR-T细胞的体外增殖。虽然目前CAR-T技术平台可利用抗CD3/28刺激因子或对应抗原刺激实现体外扩增，但其扩增的特异性和稳定性有限，不能稳定有效富集高特异的阳性CAR-T细胞，导致如下问题：1)体外激活/扩增过程效率低或不稳定：核酸电转和抗CD3/28激活都会导致获得细胞的CAR阳性率低；使用抗原刺激的方法会导致不同抗原效果不稳定；2)使用抗原包被刺激的方法通常是非密闭式操作，难以对接自动化设备；3)体外扩增培养时间太长、回输剂量大、成本高。
发明内容
本发明首先提供一种多肽标签，所述多肽标签包含人正常细胞表达蛋白的胞外域序列或胞外域序列的截短部分，或者它们的突变体；
优选地，所述人正常细胞表达蛋白选自BCMA、BAFFR、CD20、CD40，更优选为BCMA；
优选地，多肽标签具有：
(1)SEQ ID No:1-11中任一项所示的序列，或
(2)与(1)的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，所述多肽标签还包括位于N端或C端的用于与其他多肽共价连接的连接片段(接头)。
在一个或多个实施方案中，所述接头是(GGGGS)N，N为1-10的整数，优选的接头为GGGGS(SEQ ID No.13的第154-171位)。
在一个或多个实施方案中，所述多肽标签还包含位于N端的信号肽。
本发明提供一种融合蛋白，其特征在于，包含上述多肽标签和功能多肽。
在一个或多个实施方案中，所述多肽标签位于功能多肽内部；优选地，所述多肽标签与所述抗原受体结构域连接，所述多肽标签位于所述抗原受体结构域的N端或C端，优选为C端。
在一个或多个实施方案中，所述多肽标签还能够与功能多肽外部连接，即与功能多肽分离形成独立的多肽标签。优选地，多肽标签通过切分序列及信号肽序列与功能多肽的C端连接，且多肽标签的C端连接有表达辅助序列；优选地，所述切分序列包含编码弗林蛋白酶识别位点的序列和2A元件，所述辅助序列包括跨膜锚定部分以及胞外标签与跨膜结构的间隙部分；优选地，所述切分序列为T2A(SEQ ID No.15)或FT2A(SEQ ID No.16)，所述信号肽为S3(SEQ ID No.17)或S5(SEQ ID No.18)或Sg(SEQ ID No.19)或Sk(SEQ ID No.20)，所述跨膜锚定部分为BTM(SEQ ID No.21)，所述胞外标签与跨膜结构的间隙部分为BGAP(SEQID No.22)。
在一个或多个实施方案中，所述功能多肽是一嵌合抗原受体，其序列包括如下区域：
(1)胞外区，包含抗原受体结构域和铰链区；
(2)跨膜区；
(3)胞内区，包括信号传导结构域和/或共刺激域。
在一个或多个实施方案中，所述胞外区的抗原受体结构域包含针对肿瘤抗原的结合分子，例如针对肿瘤抗原的配体、抗体或其抗原结合片段。优选地，所述肿瘤抗原选自下组：BCMA、BAFFR、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD86、CD81、CD123、cd171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、VEGFR-2、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、CD44V6、CEA、CA125、CD151、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R，gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2，HVEM、MAGE-A、mesothelin(MSLN)、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、CD79b和Notch-1-4。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区来自以下蛋白的部分胞外或跨膜结构域：CD8、CD28、CD3、CD15、CD16、CD40、CD27。优选的，铰链区为CD8铰链。CD8铰链的序列如SEQ IDNo.12第1-55位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，(2)中的跨膜区选自：CD28、CD8、CD134、4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD226、CD27和CD40中任一种的跨膜区。优选的，跨膜区为CD28跨膜区或CD8跨膜区。CD28跨膜区的序列如SEQ ID No.12第56-83位氨基酸所示，CD8跨膜区的序列如SEQ ID No.25第266-310位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号传导结构域包括但不限于：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12的信号传导结构域。优选的，所述信号传导结构域是CD3ζ的信号传导结构域；其序列如SEQ ID No.12第125-236位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、TNFRSF13B、TNFRSF18、CD134肿瘤坏死因子超家族中的任意一种或多种的组合。较佳地，所述共刺激域是CD28或4-1BB；其序列分别如SEQ ID No.12第84-124位、SEQ ID No.25第335-376位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述的融合蛋白从N端到C端包含或依次为：肿瘤抗原的结合分子、多肽标签、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域，或：肿瘤抗原的结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域、切分序列、标签信号肽、多肽标签和表达辅助序列。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
本发明还提供一种核酸分子，包含选自以下的序列：
(1)编码本文任一实施方案所述的多肽标签或融合蛋白的核酸序列，或其作为扩增引物或检测探针的片段，
(2)与(1)具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的变体，
(3)(1)或(2)的互补序列。
本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物：
(1)表达本文任一实施方案所述的多肽标签或融合蛋白，和/或
(2)包含本文所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，优选非病毒载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含、表达和/或分泌本文所述的多肽标签或融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包含本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物，或染色体中整合有所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。
本发明另一方面提供一种偶联有抗标签抗体的固相载体，所述抗标签抗体特异性识别本文所述的多肽标签。
在一个或多个实施方案中，所述抗体选自CN202110301079.1中的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种。NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367的氨基酸序列如SEQ ID No.27-31所示。
在一个或多个实施方案中，所述固相载体是磁性颗粒/微球。
在一个或多个实施方案中，所述偶联是通过化学方式直接连接、通过抗原-抗体的特异结合、通过生物素基团-亲和素基团的特异结合或其他间接连接。
本发明还提供一种细胞结合/标记/检测/刺激/分选试剂盒，用于刺激或分选表达本文所述的多肽标签或融合蛋白的细胞，所述试剂盒包含抗标签抗体或偶联有抗标签抗体的固相载体，所述抗标签抗体特异性识别本文所述的多肽标签。
在一个或多个实施方案中，所述抗体选自CN202110301079.1中的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述固相载体是磁颗粒/微球。
在一个或多个实施方案中，所述偶联是通过化学方式直接连接、通过抗原-抗体的特异结合、通过生物素基团-亲和素基团的特异结合或其他间接连接。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还包含和本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子或核酸构建物。
本发明另一方面提供制备T细胞的方法，包括：
(1)在T细胞中表达本文任一实施方案所述的多肽标签和融合蛋白的步骤，例如将本文任一实施方案所述的核酸构建物导入T细胞的步骤，和
(2)使用抗标签抗体或偶联有抗标签抗体的固相载体激活步骤(1)获得的T细胞以实现刺激或分选。
在一个或多个实施方案中，所述抗体选自CN202110301079.1中的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞是CD3+和/或CD28+T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在T细胞中表达嵌合抗原受体的步骤，例如将含有嵌合抗原受体编码序列的核酸构建物导入T细胞的步骤。
本发明另一方面提供一种药物组合物，包括本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子、核酸构建物、固相载体和宿主细胞中的任意一种或多种和药学上可接受的辅料。作为优选例，所述固相载体用于制备表达本文所述多肽标签或融合蛋白的T细胞。
本发明另一方面提供本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子、核酸构建物、宿主细胞、固相载体中的任意一种或多种在制备治疗肿瘤的药物中的用途。作为优选例，所述药物包含表达本文所述多肽标签或融合蛋白的T细胞在一个或多个实施方案中，所述T细胞由抗标签抗体或本文所述的偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选。
本发明还提供一种治疗肿瘤的方法，包括向患者给予表达本文所述多肽标签或融合蛋白的T细胞。
在一个或多个实施方案中，在一个或多个实施方案中，所述T细胞由抗标签抗体或本文所述偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选。所述方法还包括由抗标签抗体或所述偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选所述T细胞的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述抗体选自CN202110301079.1中的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种。
本发明还提供一种激活表达有本文所述多肽标签或融合蛋白的T细胞的方法，包括由抗标签抗体或本文所述的偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选所述T细胞的步骤。
附图说明
图1：BL标签(B-label)设计以及其高亲和力的VHH筛选检测。
A，基于截短BCMA-ECD的BL标签设计示意；
B，ELISA检测抗体(-Fc)与BL(BLΔ0/1/2/3/4以及BLΔ0mut)-M044融合肽的结合；
C，ELISA检测抗体(-Fc)与BLΔ0肽的结合；
D，ELISA检测BL(BLΔ0/2/5以及BLΔ0mut)(-Fc)与抗体NB-36的结合。
图2：ELISA检测抗体NB-36与BLΔ2D2G、BLΔ2L2G、BLΔ2I2G以及BLΔ0mut的结合。
图3：偶联NB-36抗体的微球与BL-CAR-T细胞结合的显微图像。通过Biotin作用偶联NB-36的Dynabeads:M2339-BLΔ0-CAR-T(Day13)＝1:1
图4：针对间皮素阳性癌细胞的(BL-)CAR载体和(BL-)CAR-T细胞构建。
A，针对间皮素阳性癌细胞的BL-CAR结构示意；
B-C，来源人其一的PBMC所制备的(BL-)CAR-T细胞体外制备数量扩增(B)以及CAR阳性率检测(C)；
D-E，来源人其二的PBMC所制备的(BL-)CAR-T细胞体外制备数量扩增(D)以及CAR阳性率检测(E)；
F，含点突变BL(BLΔ2D2G、BLΔ2L2G、BLΔ2I2G)的CAR-T细胞体外制备数量扩增；
图5：偶联NB-36抗体的微球体外激活和扩增BL-CAR-T细胞。
A，偶联NB-36的微球体外激活和扩增BL-CAR-T细胞原理示意；
B，受不同偶联抗体的微球体外激活和扩增的BL-CAR-T细胞体外制备数量扩增；
图6：包被配体刺激制备的BL-CAR-T细胞的验证、表征和质量控制。
A-E，包被的间皮素(mesothelin)或NB-36(加CD28抗体)激活的BLΔ0/2-CAR-T分型(CD4/8比率，A)、干性(Tem/Tcm比率，B)、激活(CD25阳性率，C)和耗竭表型(PD-1/TIM3阳性率，D、E)检测，来源人供体其一的PBMC；
F-J，包被的间皮素(mesothelin)或NB-36(加CD28抗体)激活的BLΔ0/2-CAR-T分型(CD4/8比率，F)、干性(Tem/Tcm比率，G)、激活(CD25阳性率，G)和耗竭表型(PD-1/TIM3阳性率，I、J)检测，来源人供体其二的PBMC；
图7：偶联抗体的微球刺激制备的BL-CAR-T细胞的验证、表征和质量控制。
A-H，偶联抗体的微球激活的BLΔ2-CAR-T的CAR阳性率(A)、激活(CD25/69阳性率，B、C)、分型(CD4/8比率，D)、耗竭(PD-1/TIM3/LAG-3阳性率，E-G)和干性(Tem/Tcm比率，H)表型检测；
图8：偶联抗体的微球刺激制备的点突变BL-CAR-T细胞的验证、表征和质量控制。
A-H，偶联抗体的微球激活的BLΔ2D2G/L2G/I2G-CAR-T的CAR阳性率(A)、激活(CD25/69阳性率，B、C)、分型(CD4/8比率，D)、耗竭(PD-1/TIM3/LAG-3阳性率，E-G)和干性(Tem/Tcm比率，H)表型检测；
图9：带BL标签的间皮素CAR-T细胞对间皮素阳性癌细胞的杀伤作用检测(XCelligence RTCA)。
A-B，常规激活的带BLΔ0标签MSLN-CAR-T细胞对卵巢癌细胞SK-OV3(A)/肺癌细胞NCI-H226(B)的杀伤作用检测；
C-D，偶联NB-36抗体的微球激活的带BLΔ2(或BLΔ2L2G)标签MSLN-CAR-T细胞对卵巢癌细胞SK-OV3(C)/肺癌细胞NCI-H226(D)的杀伤作用检测；
图10：独立BL标签-CAR载体和CAR-T细胞的构建。
A，两种不同形式的针对CD19/22阳性癌细胞的独立BL标签-CAR结构示意图；
B，上述CAR结构的序列组成示意；
C，不同结构(信号肽及切分序列)的独立BL标签-CD19/22CAR-T细胞制备过程扩增对比；
D，不同结构(信号肽及切分序列)的独立BL标签-CD19/22CAR-T细胞CAR阳性率及活化表型(CD25/69)检测对比；
图11：独立BL标签-CAR载体和CAR-T细胞验证、表征。
A-C，不同结构的独立BL标签-CD19/22CAR-T细胞制备过程扩增(A)、分型(CD4/CD8比率，B)及干性(Tcm/Tem比率，C)表型检测对比；
D，来源三个不同人供体的PBMC制备的独立BL标签-CD19/22CAR-T细胞CAR阳性率、BL阳性率及CD25、CD69阳性率检测；
具体实施方式
本发明公开了一种特异性多肽标签(BL)及带有该标签的嵌合抗原受体T细胞(BL-CAR-T)，其可用于CAR-T细胞特异活化扩增、标记-分离富集、关闭活性及清除，其表达的融合蛋白包含多肽标签和功能多肽，功能多肽是一嵌合抗原受体，其序列包括如下区域：(1)胞外区，包含抗原受体结构域和铰链区；(2)跨膜区；(3)胞内区，包括信号传导结构域和/或共刺激域。所述多肽标签位于功能多肽内部，或者，所述多肽标签与功能多肽外部连接，能够与功能多肽分离形成独立的多肽标签。所述多肽标签包含人细胞蛋白靶点的胞外域或胞外域的截短部分，优选地，多肽标签包含BCMA胞外域或胞外域的截短部分。
本发明的特异多肽标签，可用于非病毒载体和病毒载体，特别适用于非病毒载体。相对于病毒载体，非病毒载体转导效率通常较低，采用电转染也会对细胞造成一定的影响，因而需要采用特别的活化扩增手段。采用本发明的特异性多肽标签，可以解决非病毒载体制备CAR-T的活化扩增等问题。
此外，本发明还公开了包括上述标签的CAR-T表达载体及其构建方法、一种偶联有抗标签的抗体的固相载体(特异识别结合标签的微球)，以及该标签在CAR-T细胞制备和用于肿瘤治疗中的应用。本发明的带有标签的CAR-T细胞配合偶联有抗标签的抗体的固相载体使得BL-CAR-T细胞在体外培养制备过程中能够高效、特异活化扩增，在不影响细胞表型的前提下，对肿瘤杀伤效果良好，提高BL-CAR-T细胞治疗的特异性、有效性、安全性。
如本文所述，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种人工工程蛋白质，其结合特定分子，例如肿瘤细胞表面抗原，并刺激免疫细胞型效应细胞中的增殖程序。CAR通常按照从氨基到羧基的顺序包含抗原结合结构域(或称抗原受体结构域)，例如单链抗体的抗原结合区；可选(但通常存在)的铰链区域；跨膜区；和细胞内信号区域。
如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区域，该区域独立于其他区域折叠成特定结构。
“VHH”可指单个重链抗体(“VHH抗体”)的可变结构域，例如骆驼抗体。“单链抗体”(SCA)是单链多肽，通常包括许多相对保守的结构域，这些结构域在多肽折叠时结合在一起形成框架区域(FR区域)，以及可变区域，这些可变区域结合在一起形成可变的抗原结构域。因此，VHH抗体是一种SCA。根据该术语，存在于天然单重链抗体中的可变结构域，也将在本文中称为“VHH结构域”，以便将其与传统四链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“VH结构域”)和传统四链抗体中存在的轻链可变结构域(在本文中称为“VL结构域”)区分开来。分离的单可变结构域多肽优选具有其同源SCA的完全抗原结合能力并且在水溶液中稳定的多肽。稳定的抗原结合单链多肽包含一个或多个源自哺乳动物抗体域或类似于哺乳动物抗体域(例如VH域)的域(FR或可变区起源)，也包含在本文的“单链抗体”中。
术语“编码序列”在此定义为编码多肽产品(例如，CAR、单链抗体或其结构域)的氨基酸序列的核酸序列的一部分。编码序列的边界通常由编码mRNA 5’端开放阅读框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和编码mRNA 3’端开放阅读框下游的转录终止序列决定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA、重组核酸序列、RNA。
术语“Fc”(可结晶片段)是哺乳动物抗体的一部分，是指位于抗体分子“Y”结构柄末端的肽，包括抗体重链恒定区的CH2和CH3域，是许多分子和细胞相互作用的位点，提供哺乳动物抗体的一些生物效应。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原呈递细胞表面并与Th细胞上的共刺激分子受体结合以产生共刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要共刺激分子的信号。共刺激信号主要通过结合抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80传递给T细胞，CD86结合T细胞表面的CD28分子。B细胞接收共刺激信号，该信号可通过LPS等常见病原体成分、补体成分或激活的抗原特异性Th细胞表面蛋白CD40L传递。
术语“linker”(接头)是连接不同蛋白质或多肽的多肽片段，其目的是维持连接的蛋白质或多肽的空间关系，以维持蛋白质或多肽的功能或活性，例如通过解除配体结合的空间抑制。示例性连接物包括含有G和/或S的连接物，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指结合蛋白与配体的反应，例如抗体或抗原结合片段与它所指向的抗原之间的反应。在某些实施例中，特异性结合抗原的抗体(或特异于抗原的抗体)意味着抗体-抗原亲和力以小于约10-5M的结合常数Kd为特征，例如小于约10-6M,10-7M,10- 8M,10-9M或10-10M或更小。“特异识别”具有类似含义。
术语“有效量”是指可实现治疗、预防、缓解和/或缓解本文所述受试者的疾病或状况的剂量。
术语“疾病和/或状况”是指与本文所述疾病和/或状况相关联的受试者的身体状态。
术语“受试者”或“患者”可指接受本发明药物组合物以治疗、预防、改善和/或缓解本发明疾病或状况的患者或其他动物，尤其是哺乳动物，例如人、狗，猴子、牛、马等。
多肽标签和融合蛋白
本发明提供一种多肽标签，其可与其他序列融合以用于T细胞特异活化扩增、标记-分离富集、关闭活性及清除。
在一些实施方案中，多肽标签包含人正常细胞表达蛋白的胞外域序列或胞外域序列的截短部分，或其突变体。优选实施方案中，人正常细胞表达蛋白是人正常组织或血液中某一小类细胞所特定表达的蛋白，如BCMA，BAFFR，CD20，CD40等。
在一些实施方案中，该标签具有：SEQ ID No:1-11中任一项所示的序列，或与该序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的序列。所述多肽标签通过其N端或C端的连接片段(接头)与融合蛋白中的其他部分(例如功能多肽)连接。其中SEQ ID NO:2-7为截短序列，能够保留多肽标签的功能，同时避免对嵌合抗原受体的影响；SEQ ID NO:8-11为突变序列，是为了避免细胞或者人体内已有的抗体与多肽标签结合，使多肽标签的激活、标记-分离富集、关闭活性及清除更加可控。
在一些实施方案中，所述融合蛋白是包含多肽标签的嵌合抗原受体(CAR)，包含胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞外区包含抗原受体结构域和铰链区，所述胞内区包括信号传导结构域和/或共刺激域。多肽标签位于抗原受体结构域的N端或C端。多肽标签位于N端利于多肽标签激活，但会影响抗原受体结构域的结合，降低CAR-T治疗效果；多肽标签位于C端则不影响抗原受体结构域，但位于融合蛋白内部，激活可能存在难度，对多肽标签的截短或突变要求较高。本发明中主要考虑CAR-T的治疗效果，优选为C端。在一些实施方案中，通过选择特定的多肽标签(SEQ IDNo:1-11)，可以同时保证CAR-T的治疗效果和激活。
所述抗原受体结构域包含针对肿瘤抗原的结合分子，例如针对肿瘤抗原的配体、抗体或其抗原结合片段。肿瘤抗原及其结合分子的序列是本领域技术人员容易获得的。优选地，所述肿瘤抗原选自下组：BCMA、BAFFR、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD86、CD81、CD123、cd171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、VEGFR-2、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、CD44V6、CEA、CA125、CD151、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R，gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2，HVEM、MAGE-A、mesothelin(MSLN)、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、CD79b和Notch-1-4。
嵌合抗原受体的铰链区可选自本领域任何通常用作铰链的序列。示例性地，铰链区可来自以下蛋白的部分胞外或跨膜结构域：CD8、CD28、CD3、CD15、CD16、CD40、CD27。CD8铰链的序列如SEQ ID No.12第1-55位氨基酸所示。
嵌合抗原受体的跨膜区可选自：CD28、CD8、CD134、4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD226、CD27和CD40中任一种的跨膜区。示例性的CD28、CD8跨膜区的序列如SEQ ID No.12第56-83位、SEQ ID No.25第266-310位氨基酸所示。
本发明中，胞内信号传导结构域包括但不限于：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12的信号传导结构域中的任意一种或多种的组合。胞内共刺激域包括但不限于4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、TNFRSF13B、TNFRSF18、CD134肿瘤坏死因子超家族中的任意一种或多种的组合。可使用一种或多种这些信号传导结构域或共刺激域或其保留了传递信号的生物学功能的变体来构建本发明的嵌合免疫细胞辅助受体。示例性的CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.12第125-236位氨基酸所示。示例性的CD28、4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID No.12第84-124位、SEQ ID No.25第335-376位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述的融合蛋白从N端到C端包含或依次为：肿瘤抗原的结合分子、多肽标签、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
在另一些实施方案中，所述融合蛋白中所述多肽标签还能够与功能多肽外部连接，即与功能多肽分离形成独立的多肽标签。优选地，多肽标签通过切分序列及标签信号肽序列与功能多肽的C端连接，且多肽标签的C端连接有表达辅助序列。在一个或多个实施方案中，所述的融合蛋白从N端到C端包含或依次为：肿瘤抗原的结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域、切分序列、标签信号肽、多肽标签、表达辅助序列。
“标签信号肽”指引导多肽标签的信号肽，其位于多肽标签的N端。示例性信号肽或标签信号肽为S3(SEQ ID No.17)或S5(SEQ ID No.18)或Sg(SEQ ID No.19)或Sk(SEQ IDNo.20)。
“切分元件/序列”是指当在mRNA翻译、蛋白表达过程中，可诱导一个mRNA分子产生由切分元件划分开的两种不同的多肽的元件。切分元件可以是使一条转录产物产生多种蛋白的自剪切或共剪切的肽，例如2A元件，包括但不限于T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。切分元件也可以是能独立地起始翻译的序列，例如IRES元件。由切分元件(如2A元件)编码的氨基酸序列被称为“切分肽”或“切分序列(cleaving peptide)”。优选地，所述切分序列为T2A，序列见SEQ ID No.15，其N端或C端还可连接有能够被弗林蛋白酶识别位点的序列以获得更加干净的剪切末端，优选例如FT2A(即furin+T2A)，序列见SEQ ID NO:16。
“表达辅助序列”包括跨膜锚定部分以及胞外标签与跨膜结构的间隙部分。在一些实施方案中，所述跨膜锚定部分为BTM(SEQ ID No.21)，所述胞外标签与跨膜结构的间隙部分为BGAP(SEQ ID No.22)。应理解的是，本文所述各结构域、多肽、蛋白包括其功能片段。“功能片段”指保留了所需生物学功能的片段。例如，本文所述的胞内结构域的功能片段指保留了该共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的片段。适用于本发明的各胞外结构域的功能片段以及各胞内结构域的功能片段可由本领域技术人员结合本领域现有技术手段容易确定。
本文所述的“突变体”包括各结构域、多肽、蛋白的突变体，只要该突变体保留了所述结构域、多肽、蛋白各自相应的生物学功能即可。例如，适用于本发明的多肽标签的突变体包括与作为对比的多肽标签具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的胞外结构域的突变体包括与作为对比的胞外结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的跨膜区的突变体包括与作为对比的跨膜区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的胞内结构域的突变体包括与作为对比的胞内结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。或者，与作为对比的序列相比，本发明所述的突变体具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有beta-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明包括与前文所述多肽标签或融合蛋白相比具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失的突变体。这类突变体保留了本发明所述多肽标签或融合蛋白的生物学功能，包括但不限于CAR-T细胞特异活化扩增、标记-分离富集、关闭活性及清除的功能。
本文所述多肽可以是经过修饰的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
多核苷酸分子
本发明提供多核苷酸分子，其编码本发明所述的多肽标签或融合蛋白或其作为扩增引物或检测探针的片段。本发明也提供该编码序列的互补序列。该多核苷酸分子可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。
还提供是本发明多肽标签或融合蛋白的表达框，其为一种核酸构建体即含有启动子、多肽标签或融合蛋白编码序列和PolyA加尾信号序列。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。
编码融合蛋白的核酸分子可以是：包含多肽标签的嵌合抗原受体(CAR)蛋白的编码序列，包含嵌合抗原受体胞外区、跨膜区和胞内区的编码序列。所述胞外区编码序列包含抗原受体结构域和铰链区编码序列，所述胞内区包括信号传导结构域和/或共刺激域编码序列。多肽标签编码序列位于抗原受体结构域编码序列的5’端或3’端，优选为3’端。
编码融合蛋白的核酸分子还可以是：通过功能多肽(如嵌合抗原受体)的编码序列与多肽标签编码序列通过切分元件的编码序列连接，继而形成一核酸分子。示例性地，包含标签信号肽、多肽标签、表达辅助序列部分的独立表达的多肽标签的编码序列与CAR的编码序列可以通过切分元件(例如F2A、FT2A、P2A、T2A或E2A的编码序列或IRES)连接，二者在一个表达框内，由相同的启动子表达后，通过切分序列切割而形成单独的CAR蛋白和独立表达的多肽标签蛋白。
还提供一种载体，其含有本文所述的多核苷酸分子、表达框或核酸构建体。载体可以是质粒、粘粒、病毒和噬菌体。载体可以是病毒载体或非病毒载体，优选非病毒载体。载体可以是克隆载体、整合载体、也可以是表达载体。表达载体可以是转座子载体。在某些实施方案中，表达载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除本发明所述的多核苷酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。在某些实施方案中，所述重组表达载体采用本领域熟知的载体作为骨架载体。在某些实施方案中，本发明使用CN109988759A构建的pNB338B载体。
在一些实施方案中，同一载体同时编码本发明的融合蛋白和CAR。该载体可以是双顺反子。CAR的编码序列可设置在融合蛋白体编码序列5’或3’端。CAR和融合蛋白的表达可处于相同或不同调控序列的指导下。
在多核苷酸序列已知的情况下，可采用本领域常规的方法制备得到各多核苷酸分子，并构建相应的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory)。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。
宿主细胞
本文中，在表达异源核酸序列时，“宿主细胞”是能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。具体而言，本发明提供携带本发明所述多肽标签或融合蛋白和/或其编码序列的细胞。本发明的细胞优选为免疫细胞，包括T细胞(例如CD3+和/或CD28+T细胞)、CTL细胞、NK细胞、NKT细胞、CAR-T、CAR-NK、TCR-T、CIK、TIL、DN T细胞；和能引发效应功能的其他免疫细胞。
在一个或多个实施方案中，宿主细胞表达本文所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含功能多肽(嵌合抗原受体)和位于其内部或通过切分原件连接于其外部的多肽标签。
可将本发明的核酸构建物/重组表达载体转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。
携带本发明所述多肽标签或融合蛋白和/或其编码序列的细胞可使用抗标签抗体激活和/或分选。因此，本发明提供制备T细胞的方法，包括：(1)在T细胞中表达本文任一实施方案所述的多肽标签和融合蛋白的步骤，例如将本文任一实施方案所述的核酸构建物导入T细胞的步骤，和(2)使用抗标签抗体或偶联有抗标签抗体的固相载体激活步骤(1)获得的T细胞以实现激活或分选。所述抗标签抗体特异性识别本文所述的多肽标签。在一个或多个实施方案中，所述抗体选自CN202110301079.1中的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种，该文献通过引用全文纳入本文。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在T细胞中表达嵌合抗原受体的步骤，例如将含有嵌合抗原受体编码序列的核酸构建物导入T细胞的步骤。
抗标签抗体可以偶联固相载体以便于分选。示例性地，所述固相载体是磁性颗粒/微球；所述偶联是通过化学方式直接连接、通过抗原-抗体的特异结合、通过生物素基团-亲和素基团的特异结合或其他间接连接。
药物组合物
本发明另一方面提供一种药物组合物，包括本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子、核酸构建物、固相载体和宿主细胞中的任意一种或多种和药学上可接受的载体。本文中，“药物组合物”指用于给予个体的组合物且涵盖用于免疫治疗的细胞的组合物。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的辅料。术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。可通过熟知的常规方法配制包含这类辅料的组合物。
这些药物组合物可以合适剂量给予对象。可由主治医师和临床因素确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。
本发明的组合物可局部或全身性给予。在某些实施方式中，本发明提供的组合物(例如表达本发明所述的嵌合免疫细胞辅助受体的细胞)可通过胃肠道外给予，例如静脉内、动脉内、鞘内、真皮下或肌内给予。
方法和用途
本发明所述的融合蛋白、宿主细胞以及包含这些物质的药物组合物可用于预防、治疗或缓解癌症，尤其是癌细胞表面表达有相应肿瘤抗原的癌症，或用于制备用于预防、治疗或缓解癌症的药物。本发明另一方面提供本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子、核酸构建物和宿主细胞中的任意一种或多种在制备预防、治疗或缓解肿瘤的药物中的用途。作为优选例，所述药物包含表达本文所述多肽标签或融合蛋白的T细胞，使得所述T细胞可由抗标签抗体或本文所述的偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选。
此外，本发明提供一种预防、治疗或缓解癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的对象给予有效量的细胞，所述细胞携带本发明所述和/或由本发明所述方法生成的多肽标签、融合蛋白或T细胞。所述T细胞由抗标签抗体或本文所述偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选。因此所述方法还包括由抗标签抗体或所述偶联有抗标签抗体的固相载体激活和/或分选所述T细胞的步骤。
本文中，癌症包括各种实体瘤和血液肿瘤，包括但不限于肺癌(如非小细胞肺癌)，结肠癌，宫颈癌，肝癌，纤维肉瘤，红白血病，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，黑色素瘤和脑胶质瘤等。更具体的，本文癌症包括但不限于乳腺、前列腺、肺和结肠癌或上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤；生殖-泌尿道癌症，例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌；肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌、甲状腺癌等。给予本发明的组合物可用于癌症的所有阶段和类型，包括用于例如微小残留病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难以治疗的癌症。
本发明还提供一种细胞结合/标记/检测/刺激/分选试剂盒，用于刺激或分选表达本文所述的多肽标签或融合蛋白的细胞，所述试剂盒包含本文所述的抗标签抗体或偶联有抗标签抗体的固相载体，所述抗标签抗体特异性识别本文所述的多肽标签。所述检测试剂盒还可包含和本文任一实施方案所述的多肽标签、融合蛋白、核酸分子或核酸构建物。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1，BL标签设计以及其高亲和力的VHH筛选
本实施例描述了本发明的标签的识别和表征，以及该标签可识别结合NB-36等VHH抗体。为了让带有标签的CAR-T细胞用于治疗更安全，我们选择了人天然BCMA蛋白的细胞外序列来设计标签，如图1，A所示。BCMA-FL(184aa,sp|Q02223)，BCMA-EC(54aa,sp|Q02223|1-54)，BLΔ0-5分别代表人BCMA蛋白的全长序列、胞外域序列、截短序列，BLΔ0mut是BLΔ0的位点突变序列。具体序列分别如SEQ IDNo.1-8所示。对人BCMA蛋白的高亲和力VHH参见专利CN202110301079.1，如该专利所示，NB-36、100、257、102、367等具有更好的表达和亲和力；NB-36对BCMA抗原的亲和力高，KD值为2.92E-10；NB-36也对HEK293T-BCMA细胞系表现出良好的特异性结合亲和力。
ELISA(酶联免疫吸附试验)用于检测和筛选不同BL标签(BLΔ0/1/2/3/4/5和BLΔ0mut)的高亲和力VHH。BL标签融合肽(C端通过3×GGGGS接头连接M044，在WO2022143550A1中公开，并且在C-尾端带有Myc-His标签)是由Biointron公司(中国苏州)合成。融合肽通过抗Myc抗体固定在板底，并与不同的VHH-Fc孵育(人IgG4-Fc用作同型对照)。洗涤后，与HRP偶联的抗Fc抗体用作孵育和洗涤的二抗。最后加入HRP底物，通过酶标仪检测并定量分析。如图1，B所示，检测用所有VHH均可与BLΔ0/1/2融合肽结合(ELISA亲和力：NB-367>36>102>100)，NB-36、90、100、102、257、367特异性结合BLΔ3/4标签(与BLΔ0/1相比，NB-100/36/102/367显示对BLΔ3的结合丧失)。作为比较，正如我们预测的那样，所有VHH均未显示与BLΔ0mut融合肽结合。在图1，C-D的结果中，NB-36、100、102、367可以特异性结合BLΔ0。
通过表面等离子共振(SPR)检测BLΔ0融合肽与这些VHH的结合亲和力。检测人BCMA天然配体BAFF，APRIL对BLΔ0融合肽的结合亲和力用于确定BL标签的安全性。首先，将VHH-Fc(Biointron，中国苏州)通过预先固定有Protein-A的传感器芯片，并被Protein-A捕获。然后，使用五种不同浓度的BLΔ0融合肽作为流动相，结合时间和解离时间分别为30min和60min。使用Biacore评估软件2.0(GE，USA)分析开启率(Kon或Ka)、关闭率(Koff或Kb)和平衡常数(KD或Kd)。如表1所示，NB-36/101/367具有特定的亲和力；NB-36对BLΔ0融合肽的亲和力高，KD为3.63E-9。作为对照，BAFF、APRIL和BLΔ0融合肽之间没有特异性亲和力(“-”：未检测到)。
表1:配体或VHH与BLΔ0融合肽结合的动力学
基于上述结果汇总，NB-36、NB-102、NB367等可以与BCMA-FL、BCMA-EC、BLΔ0、BLΔ1、BLΔ2、BLΔ3、BLΔ4和BLΔ5结合(图1B，D)。此外，如图1C所示，NB-36与细胞系具有强结合力，EC50＝0.3829nM。这些结果表明，NB-36(以及NB-102、NB367等)以高亲和力结合BLΔ0/2/5，可用作BL标签结合抗体(BL-binding-VHH)，BLΔ0/2/5可用作CAR-T细胞上的标签。
实施例2，优化的位点突变BL标签及相关验证
实施例1中的表面等离子共振(SPR)结果表明BLΔ2未与BAFF/APRIL相互作用。为了将BL标签用于生物体内，需要对其结合非目的、非特异蛋白的能力进行限制。参考BossenC,Schneider P.BAFF,APRIL and their receptors:structure,function and signaling[C]//Seminars in immunology.Academic Press,2006,18(5):263-275.等文献，BΔ2区域中D15、L17、I22等为该肽/蛋白维持三维结构并发挥BAFF/APRIL等因子结合活性的重要氨基酸位点，将其分别突变即可能避免其与相关因子结合，这对BL体内应用的安全性有所提升。故我们设计了BLΔ2标签三个位点突变BLΔ2D2G、BLΔ2L2G和BLΔ2I2G(D15、L17、I22突变为G，SEQ ID No.9-11)。如图2所示，与BLΔ2特异结合的NB-36并不能与BLΔ2D2G、BLΔ2L2G和BLΔ2I2G结合，提示可能由于突变了关键活性氨基酸位点导致其与相关因子乃至先前筛选的抗体的结合皆大幅降低，其形成的BL-CAR-T可能需要进一步采用传统通用活化方式刺激活化，而该突变BL则可作为体内更安全的一个候选标签，成为下一代抗体筛选的靶标。
实施例3，偶联有抗标签的抗体的固相载体(BL标签结合微球)的构建和BL-CAR-T 细胞的标记分选
1mL(4×108)Dynabeads M-450Tosylactivated(Invitrogen,USA)/DynabeadBiotin Binder(Invitrogen,USA)用于约200μg抗标签抗体(Biotin Binder需采用生物素偶联的抗标签抗体)偶联以产生NB-36-beads(Dynabeads M-450Tosylactivated的直接偶联)或NB-36-SAbeads(Biotin Binder的生物素偶联)。将洗过的磁性微珠液放在磁铁中1分钟，然后丢弃上清液。从磁铁上取下试管，将微珠重新悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4-8.0)中，并在混合过程中加入200μg抗体(NB-36或生物素偶联的NB-36，同时含抗CD28)，以达到总耦合体积1mL。在室温下轻轻倾斜和旋转孵育16-24小时。将试管置于磁铁中1分钟，弃去上清液。加入1mL Buffer W(Ca2+和Mg2+游离磷酸盐缓冲盐水(PBS)，辅以0.1％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA，pH7.4)混合，在2℃至8℃下轻微倾斜和旋转孵育5分钟。将试管置于磁铁1分钟后去除上清液，从磁铁中取出并重复洗涤步骤一次。加入1mL BufferW，混合并在2℃至8℃下轻微倾斜和旋转孵育5分钟。从磁铁中取出磁珠并将包被的磁珠重新悬浮在Buffer W中。
将25μL预耦合、洗涤和重新悬浮的磁珠添加到1mL制备样品(1×107转染T细胞)中。轻微倾斜和旋转，在4℃下孵育20分钟。将试管置于磁铁中2分钟，然后弃去上清液。清洗磁珠结合的细胞2-4次。BL-CAR-T细胞的比例通过流式细胞术(Beckman，USA)检测，使用生物素偶联的间皮素(或生物素偶联的NB-36用于表达BL标签CAR-T的特异性检测)和PE偶联的链霉亲和素二抗(BD Bio.，美国)。如图3所示，Biotin-NB-36偶联Dynabead BiotinBinder磁珠可以有效地结合BL-CAR-T细胞：(M2339-BLΔ0-CAR-T：偶联磁珠＝1:1)。
实施例4.针对间皮素阳性癌细胞的BL-CAR载体和BL-CAR-T细胞构建
标签CAR基因从5’到3’分别由抗原受体结构域序列(肿瘤抗原的抗体)、BL标签序列、铰链和跨膜序列(CD28TM)、CD28或4-1BB细胞内共刺激信号域序列(CD28/4-1BB-IC)和CD3ζ激活域序列组成(图4，A)。在此，针对间皮素(mesothelin,MSLN)的抗原受体结构域M2339(VHH，针对MSLN的抗体)描述于专利公开WO2021130535A(在此以引用方式全文并入并用于所有目的)。根据该专利所述，M2339(VHH)以不同的亲和力与间皮素-full、间皮素I、间皮素Ⅱ+Ⅲ结构域结合。间皮素II+III结构域被M2339很好地识别，KD值为4.32E-11M，与完整的间皮素多肽具有相似的亲和力。标签CAR基因被antiCD19(CD19抗体)基因取代以生成非特异性的对照构建质粒(NS)。标签-CAR基因通过PCR扩增并克隆到piggyBac转座子载体pNB338B(参见专利CN109988759A)中，得到质粒。为了产生不同的标签CAR-T，构建了不同的载体，如表2所示。作为优选示例，SEQ ID No.14显示了M2339-BLΔ2载体的M2339-BLΔ2-CAR融合蛋白基因(SP-M2339-BLΔ2-CD8h-CD28TM-CD28IC-CD3ζ)。所有载体编码具有相同的铰链-跨膜-细胞内结构的蛋白，包含CD28和CD3ζ细胞内部分(SEQ ID No:12)。
表2.标签CAR载体
采自健康供体的人外周血单个核细胞(PBMC)购自AllCells(中国上海)。PBMC在添加了2％胎牛血清(FBS；Gibco,USA)的AIM-V CTS培养基(Gibco,USA)中于37℃在5％CO2加湿培养箱中培养0.5-1小时，然后收获并使用PBS洗涤两次。使用Amaxa Human T CellNucleofector Kit(Lonza,Switzerland)在电转器(Lonza,Switzerland)中根据其说明对PBMC进行计数和电转。此后，在含有2％ FBS和100U/mL重组人白细胞介素-2(IL-2)的AIM-VCTS培养基中6孔板中，用偶联有标签抗体的固相载体(BL结合微珠)刺激转染的T细胞(实施例5)或用提前包被于板底的抗间皮素或抗CD3加抗CD28抗体(5+5μg/mL)刺激4-5天，然后再培养7-9天以产生足够数量的效应T细胞。CAR对T细胞的转染效率通过流式细胞术(Beckman，USA)使用生物素偶联的间皮素(或生物素偶联的NB-36用于表达BL标签的BL-CAR-T特异表达检测)和PE缀合的链霉亲和素二抗(BD Bio.，美国)检测确定。
如图4，B、C、D、E所示，体外培养的BLΔ0/BLΔ2-CAR-T细胞通过包被NB-36-Fc(含antiCD28)活化5、8、13天可有效扩增，不同供体的PBMC转染后10-12达到高峰。这与由包被间皮素(加抗CD28)激活的经典M2339-CAR-T一致。此外，总产物T细胞的CAR阳性率也与特异性间皮素(加抗CD28)激活无显著差异。这些证明了BL-CAR-T细胞构建成功，并且使用包被的标签结合抗体进行的扩增有效。此外，BLΔ2-CAR-T三个位点突变中，制备(通过包被间皮素+抗CD28激活)结果表明BLΔ2-L2G形式的扩增和构建成功，而D2G和I2G形式的BL-CAR-T扩增较差，说明BLΔ2-L2G可作为提高体内安全性突变BL的优选方案应用于BL-CAR-T，如图4，F所示。
实施例5，偶联有抗标签抗体的固相载体(BL标签结合微球)体外激活和扩增BL- CAR-T细胞
在CAR-T细胞的体外培养过程中，BL-CAR-T细胞可以通过识别和结合偶联有抗标签抗体的固相载体(BL标签结合微球)的特异性激活来刺激，如图5A所示。在含有2％FBS和100U/mL重组人白细胞介素-2的AIM-V培养基中，用特异性BL标签结合微磁珠(磁珠：细胞分别为1:1(1x)、1:4(0.25x)或4:1(4x))在6孔板中刺激转染的T细胞4-5天，然后培养持续7-9天以产生足够数量的效应T细胞。为了验证微磁珠对BL-CAR-T细胞的快速激活和扩增，使用生物素偶联的间皮素(或生物素偶联的NB-36用于表达BL标签的BL-CAR-T特异表达检测)和PE偶联的链霉亲和素二抗(BDBio.，美国)标记并采用流式细胞仪(Beckman，USA)测定T细胞CAR基因的转导效率。
如图5，B所示，在存在该激活微珠(NB-36直接偶联微珠，或Biotin-NB-36偶联Biotin Binder/SA-微磁珠，皆同时偶联抗CD28)的情况下，不同供体PBMC所制备的BLΔ0/BLΔ2-CAR-T细胞在转染后10-12天可有效激活并扩增至数量峰值。这与常用的antiCD3/28dynabeads(Invitrogen,美国)的激活相一致，并且比包被的间皮素(加抗CD28)的特异性激活效果要显著提升，证明使用该抗LB标签激活微珠的扩增效果很好。磁珠：细胞为1:1(1x)比1:4(0.25x)或4:1(4x)显示出更好的激活效果。此外，总产物T细胞的CAR阳性率也与特异性包被间皮素(加抗CD28)激活一致，并且明显优于常用的非特异性刺激因子antiCD3/28dynabeads(图6，C)。这些结果证明了基于BL标签-对应的激活微珠的激活和富集CAR-T细胞是有效的。
实施例6，BL-CAR-T细胞的验证、表征和质量控制
在标签CAR-T细胞扩增后，对修饰的T细胞进行了一系列测试验证和表征，包括激活表型(CD25、CD69阳性比例)、耗竭表型(PD-1、TIM3阳性比例)、CD3阳性细胞中CD4/8阳性比例、效应记忆T(Tem，CCR7-和CD62L-)/中央记忆T细胞(Tcm，CCR7+和CD62L+)在记忆T细胞(Tm，CD45RO+)中的比例。CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、PD-1、TIM3、CD45RA、CCR7、CD62L在T细胞表面的阳性比例通过流式细胞术确定，按照染色试剂的说明使用每种荧光素偶联抗体(BDBio.，USA)进行染色。
如图6所示，不同的供体来源的PBMC制备并通过包被NB-36或间皮素(加抗CD28)激活的BLΔ0/BLΔ2-CAR-T细胞的CD4/8比值在0.23到0.78之间变化，中央记忆T细胞占多数。此外，通过包被NB-36或间皮素(加抗CD28)激活的BLΔ0/BLΔ2-CAR-T细胞的CD25、PD-1和TIM3阳性比例与通过包被间皮素(加抗CD28)激活的经典M2339-CAR-T细胞保持一致。这表明包被配体激活的BLΔ0/BLΔ2-CAR-T细胞表型与无标签的CAR-T一致，即BL标签不影响CAR-T细胞的分型、干性、激活和耗竭。
图7检测了由不同偶联抗体微珠激活的BLΔ2-CAR-T的CAR阳性率、活化、干性以及耗竭表型，证明偶联NB-36的微珠对BLΔ2-CAR-T细胞的激活和富集是有效的，并且产生了良好的表型。
对于突变的BLΔ2-CAR-T细胞，如图8，(7天、13天)通过包被间皮素(加抗CD28)激活BLΔ2L2G-CAR-T细胞的CD25、PD-1、TIM3阳性比例和CD4/8比例以及效应/中央记忆T细胞比例均与野生型BLΔ2-CAR-T细胞一致。而且，BLΔ2L2G-CAR-T细胞表型与体外CAR-T细胞培养/构建的结果一致(实施例5)。这些表明BLΔ2L2G的位点突变标签不影响CAR-T的分型、干性、激活和耗竭。
实施例7，标签CAR-T细胞对癌细胞的毒性杀伤作用
靶肿瘤细胞人卵巢癌细胞SK-OV3和人肺癌细胞NCI-H226(ATCC，USA)的，在补充有10％胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM或RPMI-1640(Gibco，USA)培养基中，在37℃、5％CO2的空气中培养。通过基于阻抗的xCELLigence RTCA TP仪器(ACEA Bio.，USA)测定细胞毒性/杀伤效果。将靶肿瘤细胞以每孔10,000个细胞接种在可测定阻抗的96孔板底(ACEA Bio.，USA)中，并在细胞培养箱中的RTCA TP仪器上培养过夜(超过16小时)。然后加入制备好的转化T细胞(效应细胞)，与靶肿瘤细胞以不同比例(E:T)孵育约72-120小时(终点取决于杀伤效率)。分别以4:1、1:1、1:4三种不同的E:T比较效应细胞对靶肿瘤细胞的细胞溶解作用。实验过程中，肿瘤细胞活力指数值与其贴壁密切相关，细胞贴壁程度越低则效应细胞毒性越高。RTCA系统每5分钟采集一次该数据。实时毒性杀伤曲线由系统软件自动生成。实验还使用了终点数据(共培养72小时)计算每个转化T细胞的特异性细胞溶解(％)[特异性细胞溶解＝(仅肿瘤细胞的细胞指数-与肿瘤细胞共培养的转化T细胞的细胞指数)/仅肿瘤细胞的细胞指数]。
如图9，A、B所示，M2339-CAR-T(由包被的间皮素加抗CD28抗体激活)、M2339-BLΔ0-CAR-T(由包被的间皮素加抗CD28抗体激活)和M2339-BLΔ0-CAR-T(由包被的NB-36加抗CD28抗体激活)对靶肿瘤细胞SK-OV3和NCI-H226有很强的特异性杀伤作用，而CD19-CAR-T细胞(由CD19加抗CD28抗体激活)作为非特异性T细胞(N.S.)对SK-OV3和NCI-H226没有明显的细胞杀伤作用。在不同的E:T下，M2339-BLΔ0-CAR-T的EC50值与经典M2339-CAR-T相同，对SK-OV3 EC50为0.028(E:T＝4:1)、0.024(E:T＝1:1)以及0.022(E:T＝1:4)；对NCI-H226EC50为0.028(E:T＝4:1)、0.024(E:T＝1:1)及0.022(E:T＝1:4)。
如图9，C、D所示，比较不同方式激活M2339-BLΔ2-CAR-T对靶肿瘤细胞的杀伤效果。结果表明，偶联NB-36的微球(直接偶联或通过Botin-SA偶联)激活的M2339-BLΔ2-CAR-T对靶肿瘤细胞SK-OV3和NCI-H226的细胞杀伤作用与经典的包被间皮素加抗CD28抗体激活方式相同无显著差异，并且在对SK-OV3细胞上比常用的抗CD3/28dynabeads激活方式具有一定的统计学上的显著优势。
实施例8.用于CD19/22阳性癌症细胞的带独立BL标签的CAR载体和CAR-T细胞构建
为了实现CAR阳性细胞的轻松标记及分选，我们还基于上述BL标签和标签结合微珠开发了带有独立型BL标签(sBL)的CAR结构。图10A、B和表3描述了sBL-CAR-T载体的构建。C1922表示一可同时靶向CD19和CD22的CAR结构域序列，包含抗CD19的VHH抗体结构域序列1902以及通过接头与其连接的抗CD22的VHH抗体结构域序列2205(SEQ ID No.25：22-265)。对于独立BL标签的表达，BL标签序列与CAR结构部分序列C1922-H-TM-IC(SEQ ID No.25：22-488)以分割序列T2A(简称“T”，SEQ ID No.15)或Furin-T2A(简称“FT”，SEQ ID No.16)分开，并由另一个信号肽(SP)序列引导。S3是人IgM-Vh4蛋白(O95973)的天然信号肽，S5是人azurocidin蛋白(P20160)的天然信号肽，Sg是人GMCSFRa蛋白(P15509)的天然信号肽，Sk是人IgK蛋白(P01624)天然信号肽。SEQ ID No.17-20列出了这些序列。为了在表达后将独立的BLΔ2标签肽锚定在细胞膜上，我们在BLΔ2序列后添加人BCMA蛋白的跨膜部分(BTM，SEQ ID No:22)组成BLΔ2-M序列(“M”代表BTM)，见SEQ ID No.23。此外，为了使BLΔ2和BTM的表达、折叠和定位更加理想，我们设计将天然BCMA蛋白的胞外间隙部分(BGAP，SEQ ID No:21)加入到BLΔ2序列和BTM中形成BLΔ2-GM序列(“GM”代表BGAP-BTM)，参见SEQ ID No.24。作为优选例，SEQ ID No.26显示了C1922-FTS3-BLΔ2-GM载体的独立BLΔ2-C1922-CAR基因。载体其他部分的设计同实施例4。
表3.带独立BLΔ2标签的CAR载体
名称 CAR部分(C1922-H-TM-IC) 切分+信号肽 独立标签部分 骨架
C1922(Ctrl.) C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ - - pNB338B
C1922-T-BLΔ2-M(noFurin-S3) C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ T2A BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-S3-BLΔ2-M(noFurin-T2A) C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ S3 BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-F-BLΔ2-M(noT2A-SP) C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FT-BLΔ2-M(noSP) C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S3 BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTS3-BLΔ2-M C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S3 BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTS3-BLΔ2-M C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S3 BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTS3-BLΔ2-GM C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S3 BLΔ2-BGAP-BTM pNB338B
C1922-FTS5-BLΔ2-M C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S5 BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTS5-BLΔ2-GM C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-S5 BLΔ2-BGAP-BTM pNB338B
C1922-FTSg-BLΔ2-M C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-Sg BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTSg-BLΔ2-GM C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-Sg BLΔ2-BGAP-BTM pNB338B
C1922-FTSk-BLΔ2-M C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-Sk BLΔ2-BTM pNB338B
C1922-FTSk-BLΔ2-GM C1922-CD8h-CD8TM-41BBIC-CD3ζ Furin-T2A-Sk BLΔ2-BGAP-BTM pNB338B
(BL-)CAR表达载体和CAR-T细胞构建过程同实施例4。值得注意的是，标签结合微珠的激活方式(实施例5)不能用于激活带独立BL的CAR-T细胞。使用生物素偶联的CD19(或生物素偶联的NB-36用于表达BL标签的CAR-T检测)和PE偶联的链霉亲和素二抗(BDBio.，美国)标记并采用流式细胞仪(Beckman，USA)测定T细胞CAR基因的转导效率。
如图10C，比较不同形式的带独立BL的CAR-T细胞的制备及基础表型。C1922-FTS3-BLΔ2-M/GM、C1922-FTS5-BLΔ2-M、C1922-FTSk-BLΔ2-M、C1922-S3-BLΔ2-M(无Furin-T2A)、C1922-F-BLΔ2-M(无T2A-信号肽)CAR-T的扩增和激活表型(CD25/69+比例)(以包被的CD19加抗CD28激活)与对照组无标签的C1922-CAR-T(以包被的antiCD3/CD28激活)基本一致，且CAR阳性比例显著高于对照组。
如图11所示，比较不同结构的独立BL-CAR-T细胞(除标记αCD3/28组是以包被的antiCD3/CD28激活外都以包被的CD19加抗CD28激活)，显示来源于三个供体的PBMC制备的CAR-T的综合结果。(以包被的CD19加抗CD28激活的)C1922-FTS3-BLΔ2-M/GM、C1922-FTSg-BLΔ2-M/GM、C1922-F-BLΔ2-M(无T2A-SP)的CAR-T细胞的扩增和激活、CD4/8比率记忆表型表现良好，同时只有C1922-FTS3-BLΔ2-GM、C1922-FTSg-BLΔ2-GM表现出显着较高的标签表达(与CAR阳性比例基本相同)。这些结果说明缺少BGAP的“-M”形式可能对标签表达存在关键问题，而BGAP对于独立的BL标签是必要的。最后，对独立BL标签CAR结构的优选决定是C1922-FT3-BLΔ2-ET CAR。
*统计分析
使用T检验用于评估两个独立组之间的差异。单因素方差分析用于比较三个或更多独立组之间是否存在任何统计学上的显着差异。双向方差分析用于确定两个名义预测变量对连续结果变量的影响。所有统计分析均使用Graphpad Prism 7版软件(LaJolla,CA)进行。所有带有误差条的数据均以平均值±标准差表示。统计学显着性差异认为：P≥0.05(无显著性差异，ns)，P<0.05(*)，P<0.01(**)，P<0.001(***)，P<0.0001(****)。
本文序列
>1.BCMA-EC(PRT,54aa)：MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
>2.BLΔ0(PRT,23aa)：MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIP
>3.BLΔ1(PRT,20aa)：MAGQCSQNEYFDSLLHACIP
>4.BLΔ2(PRT,18aa)：GQCSQNEYFDSLLHACIP
>5.BLΔ3(PRT,15aa)：SQNEYFDSLLHACIP
>6.BLΔ4(PRT,13aa)：NEYFDSLLHACIP
>7.BLΔ5(PRT,13aa)：CSQNEYFDSLLHA
>8.BLΔ0mut(PRT,23aa)：MLQMAGQSSQNEYFGSLLHASIP
>9.BLΔ2D2G(PRT,18aa)：GQCSQNEYFGSLLHACIP
>10.BLΔ2L2G(PRT,18aa)：GQCSQNEYFDSGLHACIP
>11.BLΔ2I2G(PRT,18aa)：GQCSQNEYFDSLLHACGP
>12.C-terminal to(BL-)CAR region in CAR fusion protein(CD8h-CD28TM-CD28IC-CD3z)(PRT,236aa)：FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
>13.M2339-BLΔ2-CAR fusion protein(SP-M2339-BLΔ2-CD8h-CD28TM-CD28IC-CD3z)(PRT,406aa)：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGQCSQNEYFDSLLHACIPFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
>14.M2339-BLΔ2-CAR fusion protein gene(SP-M2339-BLΔ2-CD8h-CD28TM-CD28IC-CD3z)(DNA,1221bp)：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAAGTGCAGTTAGTGGCCTCTGGGGGGGGCCTGGTGCAACCTGGGGGCAGTCTGAGACTGAGCTGTGCCCTGTCTGGCTTCACCCTGAGAGAGCTGGATGAGTTTGCCATTGGCTGGTTCAGACAAGCCCCTGGCAAGGAGAGAGAGGGGGTGAGCTGCATCTCTGGCACTGGGGGCATCACCCACTATGCTGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGATAATAGCAAAACCACAGTGTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACAGCTGTGTACTACTGTGCTGCAGATGAGAGATGCACAGACAGACTGATCAGACCACCCACCTACTGGGGCCAAGGCACTCAAGTGACAGTGAGCTCTGGGGGAGGTGGCTCTGGCCAGTGCAGCCAGAACGAGTACTTCGACAGCCTGCTGCACGCCTGCATCCCCTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
>15.T2A(PRT,18aa)：EGRGSLLTCGDVEENPGP
>16.FurinT2A(PRT,24aa)：RKRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
>17.S3(PRT,19aa)：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
>18.S5(PRT,19aa)：MTRLTVLALLAGLLASSRA
>19.Sg(PRT,22aa)：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
>20.Sk(PRT,20aa)：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG
>21.BGAP(PRT,31aa)：CQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
>22.BTM(PRT,23aa)：ILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL
>23.Separated BLΔ2 linked with BTM peptide(BLΔ2M)(PRT,41aa)：GQCSQNEYFDSLLHACIPILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL
>24.Separated BLΔ2 linked with BGAPBTM peptide(BLΔ2GM)(PRT,72aa)：GQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL
>25.C1922-CAR with separated BLΔ2 fusion protein(C1922-FTS3-BLΔ2-GM)(PRT,603aa)：MALPVTALLLPLALLLHAARPSEVQLVESGGGSVQPGDSLRLSCVISGRALSDHHVGWYRQAPGQGRDVIAGQLYDAAHYADSVKGRFTISIDNTKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCNNLINPWPWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVAPVESGGDLVQAGGSLRLSCVTSVDTFEKYPIGWYRQAPGKERELVAAISPSGGLYYADAGKGRFTISRSNARKVVYLHGRGLEPEDTAVYYCNTHPYGTLSTWGRGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRKRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMKHLWFFLLLVAAPRWVLSGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL
>26.C1922-CAR with separated BLΔ2 fusion protein gene(C1922-FTS3-BLΔ2-GM)(DNA,1812bp)：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCAGCGTGCAGCCCGGCGACAGCCTGAGGCTGAGCTGCGTGATCAGCGGCAGGGCCCTGAGCGACCACCACGTGGGCTGGTACAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCAGGGACGTGATCGCCGGCCAGCTGTACGACGCCGCCCACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCATCGACAACACCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAACCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCAACAACCTGATCAACCCCTGGCCCTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGGCCCCCGTGGAGAGCGGCGGCGACCTGGTGCAGGCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGTGACCAGCGTGGACACCTTCGAGAAGTACCCCATCGGCTGGTACAGGCAGGCCCCCGGCAAGGAGAGGGAGCTGGTGGCCGCCATCAGCCCCAGCGGCGGCCTGTACTACGCCGACGCCGGCAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGAGCAACGCCAGGAAGGTGGTGTACCTGCACGGCAGGGGCCTGGAGCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCAACACCCACCCCTACGGCACCCTGAGCACCTGGGGCAGGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCAGAAAGAGAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTGGCCAGTGCAGCCAGAACGAGTACTTCGACAGCCTGCTGCACGCCTGCATCCCCTGTCAACTTCGATGTTCTTCTAATACTCCTCCTCTAACATGTCAGCGTTATTGTAATGCAAGTGTGACCAATTCAGTGAAAGGAACGAATGCGATTCTCTGGACCTGTTTGGGACTGAGCTTAATAATTTCTTTGGCAGTTTTCGTGCTAATGTTTTTGCTATGA
>27.NB-36：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWARRPPGKGLEWVSDIYPDGSTTYADSMKGRFTISRDNAKNTVYLEIYSLKPEDTAVYYCVIGRRGYAMGDRRLRGQGTQVTVSS
>28.NB-100：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWARQAPGKGLEWVSSIYPDGTAYYADSMKGRFAISRDNARNTVYLQMNSLKPEDTALYQCAVGRWYEQRKKEPGLWGQGTQVTISS
>29.NB-102：QVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPSAMSWARQAPGKGFEWVSTIYPDGRTYYSDSMKGRFTISRDNAKNTVYLQMHSLKPEDTALYYCGIGRWYENREKEKDLWGQGTQVTVSS
>30.NB-257：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPSAMSWARQAPGKGFEWVSSIYSDGRAYYADTMKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCGIGRWYEKREKEKGFWGQGTQVTVSS
>31.NB-367：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPSAMSWARRAPGKGLEWVSSIYGEGSTVYADSMKDRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVGRWYEGRQYEHDYWGQGTLVTVSS

Claims (22)

1.一种多肽标签，其特征在于，包含：
(1)SEQ ID NO:1-11中任一项所示的序列，或：
(2)与(1)的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的序列。
2.如权利要求1所述的多肽标签，其特征在于，所述多肽标签还包括位于N端或C端的用于与其他多肽共价连接的连接片段，
优选地，所述接头是(GGGGS)N，N为1-10的整数。
3.一种融合蛋白，其特征在于，包含多肽标签和功能多肽，
所述多肽标签包含人正常细胞表达蛋白的胞外域序列或胞外域序列的截短部分，或它们的突变体；
所述功能多肽是一嵌合抗原受体，其序列包括如下区域：
(1)胞外区，包含抗原受体结构域和可选的铰链区；
(2)跨膜区；
(3)胞内区，包括信号传导结构域和/或共刺激域。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述人正常细胞表达蛋白选自BCMA、BAFFR、CD20、CD40，优选为BCMA；更优选地，所述多肽标签为权利要求1或2的多肽标签。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽标签位于功能多肽内部，
优选地，所述多肽标签与所述抗原受体结构域连接，所述多肽标签位于所述抗原受体结构域的N端或C端，优选为C端。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽标签与功能多肽外部连接，能够与功能多肽分离形成独立的多肽标签，
优选地，多肽标签通过切分序列与功能多肽的N端或C端连接，所述多肽标签和所述切分序列之间还包括信号肽序列；
优选地，多肽标签通过切分序列与功能多肽的C端连接，且多肽标签的C端连接有表达辅助序列；
优选地，所述切分序列包含编码弗林蛋白酶识别位点的序列和2A元件，所述辅助序列包括跨膜锚定部分以及胞外标签与跨膜结构的间隙部分；
优选地，所述切分序列为T2A(SEQ ID No.15)或FT2A(SEQ ID No.16)，所述信号肽为S3(SEQ ID No.17)或S5(SEQ ID No.18)或Sg(SEQ ID No.19)或Sk(SEQ ID No.20)，所述跨膜锚定部分为BTM(SEQ ID No.21)，所述胞外标签与跨膜结构的间隙部分为BGAP(SEQ IDNo.22)。
7.根据权利要求3-6任一项所述的融合蛋白，其特征在于，
所述抗原受体结构域包含针对肿瘤抗原的结合分子；优选地，所述肿瘤抗原选自下组：BCMA、BAFFR、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD86、CD81、CD123、cd171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、VEGFR-2、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、CD44V6、CEA、CA125、CD151、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R，gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2，HVEM、MAGE-A、mesothelin(MSLN)、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、CD79b和Notch-1-4；
所述铰链区选自以下蛋白的部分胞外或跨膜结构域：CD8、CD28、CD3、CD15、CD16、CD40、CD27；
所述跨膜区选自：CD28、CD8、CD134、4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-4Rα、IL-7Rα、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD226、CD27和CD40中任一种的跨膜区；
所述胞内信号传导结构域包括但不限于：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12的信号传导结构域，
所述胞内共刺激域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、TNFRSF13B、TNFRSF18、CD134肿瘤坏死因子超家族中的任意一种或多种的组合。
8.根据权利要求3-6任一项所述的融合蛋白，其特征在于，从N端到C端包含或依次为：
抗原受体结构域、多肽标签、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域，或者：
抗原受体结构域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号传导结构域、切分序列、标签信号肽、多肽标签和表达辅助序列。
9.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示。
10.一种核酸分子，其特征在于，包含选自以下的序列：
(1)编码权利要求1或2所述的多肽标签或权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白的核酸序列，或其作为扩增引物或检测探针的片段，
(2)与(1)具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的变体，
(3)(1)或(2)的互补序列。
11.一种核酸构建物，其特征在于：
(1)表达权利要求1或2所述的多肽标签或权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白，和/或
(2)包含权利要求10所述的核酸分子。
12.如权利要求11所述核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是载体，例如非病毒载体。
13.如权利要求11所述核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。
14.一种宿主细胞，其特征在于，包含、表达和/或分泌权利要求1或2所述的多肽标签或权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白；
优选地，所述宿主细胞包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的核酸构建物，或染色体中整合有权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的核酸构建物。
更优选地，宿主细胞是免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。
15.一种固相载体，其特征在于，该固相载体是一种具有或不具有磁性的颗粒或微球，且具有结合权利要求1所述多肽标签的功能。
16.如权利要求15所述固相载体，其特征在于，偶联有抗标签抗体，该抗标签抗体特异性识别权利要求1所述的多肽标签，
优选地，所述抗体选自氨基酸序列分别如SEQ ID NO:27-31所示的NB-36、NB-100、NB-102、NB-257、NB-367中的一种或多种。
17.如权利要求15所述固相载体，其特征在于，所述偶联是通过化学方式直接连接、通过抗原-抗体的特异结合、通过生物素基团-亲和素基团的特异结合或其他间接连接。
18.一种细胞标记/检测/刺激/分选试剂盒，其特征在于，用于结合、标记、刺激、分选或检测权利要求14所述的宿主细胞。
19.如权利要求18所述试剂盒，其特征在于，包含权利要求15-17任一项所述的固相载体。
20.如权利要求18所述试剂盒，其特征在于，还包含权利要求1或2所述的多肽标签，或权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白，或权利要求10所述的核酸分子，或权利要求11-13中任一项所述的核酸构建物。
21.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的辅料，以及选自以下的一种或多种：权利要求1或2所述的多肽标签、权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11-13中任一项所述的核酸构建物、权利要求14所述的宿主细胞以及权利要求15-17中任一项所述的固相载体。
22.权利要求1或2所述的多肽标签、权利要求3-9中任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11-13中任一项所述的核酸构建物、权利要求14所述的宿主细胞以及权利要求15-17中任一项所述的固相载体中的任意一种或多种在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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