CN118178408A - Ptc124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物医疗技术领域的PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，旨在解决现有技术中对于无义突变导致的疾病，通过无义抑制药物增加全长蛋白质的相对含量，但此类药物具有较大的耳毒性和肾毒性，限制了其应用等问题，本发明提出PTC124可以作为治疗血小板无力症的药物中的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
血小板无力症(Glanzmann’s thrombasthenia,GT)是一种严重的出血性疾病，患者往往自幼发病，持续终生，可表现为阴道出血、鼻出血、消化道出血、黄体破裂出血等，甚至发生颅内出血，导致死亡。血小板无力症的病理机制是由于17号染色体的ITGA2B或ITGB3基因突变，导致血小板膜表面糖蛋白αIIbβ3的缺陷，进而血小板聚集功能异常。由无义突变引起的血小板无力症目前尚无有效治疗方法。
数据库(https://glanzmann.mcw.edu/)显示导致GT的突变位点中67％位于ITGA2B基因，33％位于ITGB3基因。因此，ITGA2B基因突变是血小板无力症的主要病因。
无义突变产生提前终止密码子(Premature termination codon,PTC)可能导致三种分子缺陷：(1)产生截短蛋白(Truncated protein)；(2)通过NMD通路降解含PTC的转录产物；(3)通过无义相关的可变剪接(nonsense-associated altered splicing，NAS)通路，改变剪接方式，去除含PTC的外显子。三者均会引起编码蛋白质或量的缺陷，导致疾病表型。其中NMD在无义突变的病理机制中发挥关键作用。
NMD是真核细胞在进化过程中形成的一种重要的转录后监控机制。它通过多种细胞成分识别含PTC的异常mRNA并对其进行降解，有效避免截短蛋白的积累，从而对机体产生保护作用。然而，NMD是一把双刃剑。它的效率下降会导致疾病的发生，过度作用也可能加重疾病的表型。NMD效率的改变可能影响遗传性疾病的病理机制。
对于无义突变导致的疾病，通过无义抑制药物增加全长蛋白质的相对含量,是潜在的治疗策略。氨基糖苷类抗生素，例如庆大霉素、G418等是最早报道的无义抑制药物。然而由于其具有较大的耳毒性和肾毒性，限制了此类药物的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，PTC124可以作为治疗血小板无力症的药物中的活性成分。
为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，所述PTC124作为治疗血小板无力症的药物的活性成分。
进一步的，所述PTC124的用药浓度为700～900mg/kg.d。
进一步的，所述PTC124的最佳用药浓度为800mg/kg.d。
进一步的，所述PTC124无细胞毒性，并通过增加突变巨核细胞系ITGA2B蛋白表达，增加细胞表面aIIbb3的含量发挥作用。
第二方面，本发明提供一种治疗血小板无力症的药物，包括PTC124及药物辅料，其中，所述PTC124作为治疗血小板无力症的药物的活性成分。
可选的，所述药用辅料包括pH调节剂、渗透压调节剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、矫嗅剂、润滑剂。
可选的，所述治疗血小板无力症的药物剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆、散剂、溶液、口服液、悬浮液或注射液的形式。
可选的，所述治疗血小板无力症的药物剂型为注射液。
可选的，所述注射液的给药方式采用注射给药、鼻腔给药、肺部给药、透皮给药或口服药。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明提供了PTC124在制备用于治疗或预防由无义突变引起的血小板无力症的药物中的用途，PTC124既可以作为单独的药效活性成分，又可以与其余无义抑制药物联用，PTC124在制备治疗血小板无力症药物中的应用无细胞毒性，经腹腔注射PTC124后，可增加血小板的ITGA2B蛋白表达，可以改善血小板聚集功能，从而改善出血表型。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过CRISPR/Cas9技术，构建人源巨核细胞Meg01细胞ITGA2B无义突变的细胞模型示意图；
图2为本发明实施例1中CCK8试剂盒测定不同浓度(浓度梯度为0、0.625、1.25、2.5、5、10uM)的PTC124对巨核细胞作用24h后的细胞毒性结果示意图；
图3为本发明实施例1中用流式细胞术检测细胞ITGA2B蛋白表达的测试示意图；
图4为本发明实施例1中用SZ22单抗行Western blot检测细胞中αIIbβ3含量的测试示意图；
图5为本发明实施例2中不同小鼠模型阳性克隆测序鉴定示意图；
图6为本发明实施例2中不同小鼠模型的血小板形态及数量对比示意图，其中，(i)为不同小鼠模型血小板形态与野生型小鼠的对比示意图、(ii)为不同小鼠模型血小板数量与野生型小鼠的对比示意图；
图7为本发明实施例2中在不同诱导下，突变型小鼠模型和野生型小鼠模型的血小板聚集功能检测示意图；
图8为本发明实施例3中PTC124作用于KT小鼠后的血小板聚集功能检测结果示意图；
图9为本发明实施例3中野生型小鼠和PTC124作用于KT小鼠后的血小板出血时间检测结果示意图；
图10为本发明实施例3中野生型小鼠和PTC124作用于KT小鼠后的血小板细胞αIIbβ3含量的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本申请中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域的通用方法，在本发明的实施例公开的数据的基础上结合本领域的公知技术，经过有限次试验均能得到本发明的实验结果。
采用10％DMSO与90％SBE-β-CD生理盐水形成的混合溶液作为溶剂，将PTC124配制成不同浓度梯度的溶液，并将不含有PTC124的混合溶液作为对比例，进行实验测试。
实施例1、PTC124作用于巨核细胞的影响
1、实验方法：
1.1、构建ITGA2B c.2671C>T(p.Q891X)型人源巨核细胞Meg01细胞模型组合(突变型、野生型、PTC124-野生型、PTC124-突变型)
用CRISPR/Cas9技术构建ITGA2B c.2671C>T(p.Q891X)型人源巨核细胞Meg01细胞模型(突变型)，步骤如下：
针对特定的无义突变位点设计并合成gRNA。
用pX458-GFP质粒构建含有gRNA的CRISPR/Cas9质粒。
将CRISPR/Cas9质粒转染Meg01和DAMI细胞，流式分选GFP+单克隆细胞，挑取可见克隆提取基因，通过PCR测序筛选出具有靶向切割活性的CRISPR/Cas9质粒。
利用患者的DNA通过PCR的方法来构建模板质粒。
将筛选到的具有靶向切割活性的CRISPR/Cas9质粒以及模板质粒以合适的比例共转染至Meg01细胞中。
流式分选GFP+单克隆细胞，至96孔板培养传代，挑取可见克隆的50％提取基因，PCR扩增，测序验证是否构建成功，构建成功即可得到ITGA2Bc.2671C>T(p.Q891X)型人源巨核细胞Meg01细胞模型(以下称为突变型细胞模型)，如图1所示。
野生型细胞模型为直接获取即可得到，基因结构稳定，没有发生基因突变。在野生型细胞模型与突变型细胞模型中分别加入不同浓度的PTC124(浓度梯度为0，10，25，50，100，200ug/ml)，将细胞与PTC124孵育24h，分别得到PTC124-野生型细胞模型和PTC124-突变型细胞模型。
1.2、PTC124细胞毒性、ITGA2B蛋白表达、细胞中αIIbβ3含量检测
PTC124细胞毒性检测：
用CCK8试剂盒测定不同浓度的PTC124(浓度梯度为0，10，25，50，100，200ug/ml)对巨核细胞作用24小时后的细胞毒性。
ITGA2B蛋白表达检测：
向突变型细胞模型中分别加入不同浓度的PTC124(浓度梯度为0、50、100ug/ml)，并加入CD41(2μg/ml)抗体。
向野生型细胞模型中加入CD41(2μg/ml)抗体作为对比例，室温避光孵育20min，加入MTB洗涤一次，用流式细胞仪上机检测。
细胞中αIIbβ3含量检测：
向突变型细胞模型中分别加入不同浓度的PTC124(浓度梯度为0、100、200ug/ml)，将野生型细胞模型作为对比例，用SZ22单抗行Westernblot检测细胞中αIIbβ3含量。
2、实验结果
如图2所示，图2为不同浓度的PTC124对巨核细胞作用24小时后的细胞毒性的CCK8试剂盒测定结果示意图，从图中可以看出，加入不同浓度梯度的PTC124与不经PTC124处理的细胞存活率不存在统计学差异，说明PTC124无细胞毒性，PTC124对巨核细胞活力无影响。
如图3所示，图3为用流式细胞术检测细胞ITGA2B蛋白表达测试示意图，从图中可以明显看出，突变型细胞模型中加入PTC124之后，细胞的ITGA2B的蛋白表达相较于野生型细胞模型有所提升，且随着加入的PTC124浓度的不断增大，ITGA2B的蛋白表达也随之提升，这说明了在Meg01细胞中，PTC124能够有效提高ITGA2B的蛋白表达，即其翻译通读作用。
如图4所示，图4为用SZ22单抗行Westernblot检测细胞中αIIbβ3含量的测试示意图，由图可知，未加入PTC124的突变型细胞模型中的αIIbβ3含量比野生型细胞模型要少，当PTC124的浓度达到100ug/ml时，突变型细胞模型中的αIIbβ3含量与野生型细胞模型差不多，当PTC124的浓度达到200ug/ml时，突变型细胞模型中的αIIbβ3含量则要明显高于野生型细胞模型，因此，PTC124可以显著提升突变细胞中αIIbβ3含量，即增强了ITGA2B的蛋白表达(αIIbβ3是ITGA2B的蛋白名称，ITGA2B是基因名称)。
实施例2、构建转基因GT小鼠模型
1、实验方法：
1.1、构建ITGA2B c.2659C>T(p.Q887X)的C57BL/6小鼠模型
小鼠ITGA2B基因(NM_010575.2；Ensembl:ENSMUSG00000034664)位于小鼠11号染色体。该基因共有30个外显子，起始密码子ATG位于1号外显子，终止密码子TGA位于30号外显子，c.2659C位于26号外显子，26号外显子是基因编辑的靶点。
设计gRNA和模板寡核苷酸：
1)gRNA靶向序列:5’-ATGCCTGTCTGCGCTCACGCTGG-3’
2)模板序列:5’-GGTGGACTGGAAACTATCCACGCCCAGCCCTTCT
TCCATTCCCCGTCCATCACCAACGTGAGCGCAGATAGGCATTCCTGCA G GGGCCCAAGCCAGGGCAGCAGGACCCAGTTCTGGTGGTGAGAAGGCTC-3’
构建gRNA载体链接：
gRNA:https://en.vectorbuilder.com/vector/VB190829-1209qve.html
模板的突变位点c.2659C>T(CAG to TAG)通过同源定向修复引入26号外显子。
Cas9 mRNA,体外转录产生的gRNA和模板寡核苷酸同时注射到用于突变型小鼠生产的受精卵中，得到ITGA2B c.2659C>T(p.Q887X)的C57BL/6小鼠模型，即KI小鼠(KI表示突变型)，也叫转基因小鼠模型。
经PCR鉴定及测序鉴定阳性的小鼠，保种传代，其中两条等位基因突变的小鼠为纯合KI小鼠，一条等位基因突变的为杂合KI小鼠。
其中，PCR鉴定测序引物:
Mouse ITGA2B(Q887X)-F:CCCTCGGATCTGCTCTACATCCTG
Mouse ITGA2B(Q887X)-R:AGCGACACACACAGAGAACCTACGTG 2
野生型小鼠模型可以直接获取得到，其基因结构稳定，没有发生基因突变。不同小鼠模型的阳性克隆测序鉴定结果如图5所示。
1.2、不同小鼠模型血小板形态及数量检测
在不同时间监测各个小鼠模型的生命体征、不良反应及生存情况，观察小鼠的临床表现，并对其血小板的形态及数量进行检测。
1.3不同小鼠模型的血小板聚集功能检测
分别在0.1U/ml凝血酶、10μMADP以及2μg/ml胶原诱导下，对野生型小鼠模型和突变型小鼠模型的血小板聚集功能进行检测。
2、实验结果
通过在不同时间监测各个小鼠模型的生命体征、不良反应及生存情况，发现ITGA2B基因的突变不会影响小鼠正常的生理状态，无不良反应。
如图6所示，图6(i)为三种小鼠模型的血小板形态示意图，图6(ii)为三种小鼠模型的血小板数量示意图，其中可以看出，突变型小鼠模型和野生型小鼠模型的血小板形态及数量均无明显不同。
如图7所示，图7为突变型小鼠模型和野生型小鼠模型的血小板聚集功能检测示意图，可知，在不同诱导剂下，突变型小鼠模型的血小板聚集功能都要明显比野生型小鼠模型差，表型鉴定结果显示突变型小鼠模型符合血小板无力症(GT)表型。
实施例3、PTC124作用于KI小鼠
1、实验材料：
C57BL/6小鼠，体重20-25g，购于南京大学模式动物中心。PTC124(纯度99.82％)购于MCM。
2、实验方法及结果：
2.1PTC124的最佳用药浓度和起效时间测定
分别以浓度梯度为0、200、400、800、1600mg/kg.d的PTC124和水喂食小鼠2周，给药不影响小鼠的正常生理功能，检测小鼠鼠尾的出血时间，结果如表1所示：
表1：不同浓度梯度的PTC124对小鼠出血时间的影响
由表1可知，当PTC124浓度为800mg/kg.d时，KI小鼠鼠尾出血时间显著降低，因此确定PTC124的最佳用药浓度为800mg/kg.d。
以800mg/kg.d PTC124处理小鼠，分别在用药前及用药30min、2h、8h、24h、1w、2w后检测小鼠鼠尾出血时间，结果如表2所示：
表2：不同用药时间前后小鼠鼠尾出血时间对比
由表2可知，当PTC124处理小鼠1w时，KI小鼠鼠尾出血时间显著降低，因此确定KI小鼠中PTC124的起效时间分别为1周。
2.2PTC124作用于KI小鼠后的血小板聚集功能检测
使用双通道血小板聚集仪(美国Chrono-Log公司产品)，通过透光度的变化测试血小板的聚集。血小板聚集仪的温度设置为37℃，搅拌转速设置为1200rpm。取洗涤的小鼠血小板悬液250ul(2×108/ml)加入聚集管中，加1mM CaCl2，加入刺激剂，检测血细胞聚集。在PTC124作用小鼠1周后，分别在0.1U/ml凝血酶、10μMADP以及2μg/ml胶原诱导下，对KI小鼠进行血小板聚集功能进行检测。
结果如图8所示，图8结果与图7相对比可知，在PTC124作用于KI小鼠后，其血小板聚集功能得到改善。
2.3PTC124作用于GT小鼠后的出血时间检测
使用5％水合氯醛溶液对小鼠进行麻醉，在距小鼠尾巴末端3mm处剪断尾巴，将剪断后的尾巴浸入盛有生理盐水的15ml离心管中，待尾巴伤口处出现红色血流时开始计时，红色血流消失时停止计时，此时间间隔记为出血时间。出血时间上限设为20min。
在PTC124作用小鼠1周后，对PTC124作用于KI小鼠后的出血时间、野生型小鼠的出血时间进行检测。
结果如图9所示，PTC124作用于KI小鼠后，小鼠的出血时间较未作用PTC124时要有所缩短。
2.4PTC124作用于KI小鼠后的血小板中αIIbβ3含量检测
采用眼眶采血法采集小鼠外周血，分离出血小板，加入细胞裂解液裂解血小板，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后，将蛋白样品转印到PVDF膜上，使用兔抗鼠αIIbβ3抗体(Ab1)作为一抗，IRDye800标记的羊抗兔IgG作为二抗，检测血小板中αIIbβ3蛋白表达是否增强。
在PTC124作用小鼠1周后，用Westernblot检测细胞中αIIbβ3含量。
结果如图10所示，PTC124作用于KI小鼠后，小鼠的血小板细胞的αIIbβ3含量较未作用PTC124时有所提升，即ITGA2B蛋白表达增强。
这些结果均证明了PTC124可以通过增强血小板的ITGA2B蛋白表达，改善血小板聚集功能，从而使出血减轻，最终起到治疗血小板无力症的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，其特征在于，所述PTC124作为治疗血小板无力症的药物的活性成分。
2.根据权利要求1所述的PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，其特征在于，所述PTC124的用药浓度为700~900mg/kg.d。
3.根据权利要求2所述的PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，其特征在于，所述PTC124的最佳用药浓度为800mg/kg.d。
4.根据权利要求1所述的PTC124在制备治疗血小板无力症的药物中的应用，其特征在于，所述PTC124无细胞毒性，并通过增加突变巨核细胞系ITGA2B蛋白表达，增加细胞表面aIIbb3的含量发挥作用。
5.一种治疗血小板无力症的药物，其特征在于，包括PTC124及药物辅料，其中，所述PTC124作为治疗血小板无力症的药物的活性成分。
6.根据权利要求5所述的治疗血小板无力症的药物，其特征在于，所述药用辅料包括pH调节剂、渗透压调节剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、矫味剂、矫嗅剂、润滑剂。
7.根据权利要求5所述的治疗血小板无力症的药物，其特征在于，所述治疗血小板无力症的药物剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆、散剂、溶液、口服液、悬浮液或注射液的形式。
8.根据权利要求7所述的治疗血小板无力症的药物，其特征在于，所述治疗血小板无力症的药物剂型为注射液。
9.根据权利要求8所述的治疗血小板无力症的药物，其特征在于，所述注射液的给药方式采用注射给药、鼻腔给药、肺部给药、透皮给药或口服药。
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