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CN118176414A - 用于检测微生物的方法 - Google Patents

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CN118176414A
CN118176414A CN202280069411.9A CN202280069411A CN118176414A CN 118176414 A CN118176414 A CN 118176414A CN 202280069411 A CN202280069411 A CN 202280069411A CN 118176414 A CN118176414 A CN 118176414A
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angle
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CN202280069411.9A
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萨姆·杜坎
奥德丽·杜蒙特
艾迪斯·格雷克
亚历山大·穆勒
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Diamidex Co
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Diamidex Co
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Abstract

本发明涉及一种用于观察并在适当情况下检测和任选地计数支持物(例如膜或固体生长培养基)上的微生物对象的方法和相关装置。具体而言，所述方法包括：a)用相对于支持物的法线形成至少10°的角度(α)的至少两个入射准直光源照射所述支持物的区域，b)利用光接收元件获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及c)通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。

Description

用于检测微生物的方法
技术领域
本发明涉及微生物学领域，更具体而言涉及观察并在适合情况下检测和任选地计数支持物(例如膜或固体生长培养基)上的微生物对象的方法。
背景技术
需要监测环境(洗澡水或饮用水)或被设计用于人类和动物食用或使用的原材料和最终产品例如食品、饮料、医疗器械、药品或化妆品中的微生物。微生物的存在不仅会导致所述产品的变质或腐败，而且如果被人类或动物食用或给药到人类或动物，还会导致疾病。为了确保这些产品的安全性，需要进行微生物测试以检查在正常使用条件下的污染风险，从而防止中毒或感染爆发。特别是对于医疗器械、药品或化妆品行业来说，对无菌性的需要是非常重要的，并且在整个供应链中检测产品和原材料的微生物质量都是重要的，因为产品在每个生产阶段都可能出现缺陷。
当然，微生物也可能感染人或动物，并且在临床诊断中需要检测和/或定量造成感染的微生物。例如，尿路感染(UTI)的诊断可以通过定量尿液培养来进行。传统上，认为尿液中存在1,000个或更多个细菌/ml代表了显著的细菌尿，指示了UTI。
对于所有这些行业、临床应用和环境监测来说，污染阈值和使用的方法可能有所不同。然而，在尽可能早的阶段发现微生物的存在总是至关重要的。
自19世纪以来，在皮氏培养皿上培养，即路易·巴斯德的方法，一直是鉴定和计数微生物的最有效方法。到目前为止，在许多行业中这项技术仍然是检测和计数微生物的参考方法。所述方法简单：从样品中提取微生物，将它们放置在含有适合的培养基的专用皮氏培养皿上，并在菌落变得肉眼可见时对它们进行计数。尽管可靠，但这种方法时间长(根据目标微生物的不同，可以长达几天)。
为了缩短测定的时长，建议了使用指示剂例如产色底物、产荧光底物或荧光或放射性标记的抗体来检测较小尺寸的微菌落(例如国际专利申请WO 96/14431、WO 2013/050598、WO 2008/118400)。然而，对于大多数这些方法来说，生长和指示阶段必须分开才能获得最佳结果：生长阶段用于快速细胞生长，其中没有阻碍生长的有害指示剂，而指示阶段用于专门着色和鉴定，其有效地允许检测较小尺寸的微菌落。
多年来，已进行了许多其他尝试来减少测定所需的时间，特别是使用基于免疫学方法、核酸扩增方法或使用荧光抗体或产荧光底物进行标记的流式细胞术方法的不依赖于培养的方法。然而，这些方法仍然昂贵，工作流程不容易，需要高技能的专家和/或浓缩的样品，而且对大多数方法来说，很难区分活微生物和死微生物。
因此，对快速、灵敏、用户友好和成本效益高的用于检测和/或计数样品中的微生物的方法，仍存在着需求。
发明内容
本发明人在本文中提供了一种满足这种需求的方法。更具体而言，他们提供了一种新的方法，允许在微生物菌落生长的非常早期阶段，即当它们的直径太小而肉眼无法看到时，观察并在适当情况下检测微生物菌落。这种方法不需要使用任何有助于检测的额外试剂，例如标记剂。
第一方面，本发明涉及一种用于检测支持物上的微生物对象的方法，所述方法包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的至少两个入射准直光源照射所述支持物的区域，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
b)利用光接收元件获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
c)通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
优选地，所述待检测的微生物对象选自霉菌，以及细菌、古细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合，更优选地选自霉菌，以及细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合，甚至更优选地包括霉菌，以及细菌和/或酵母的菌落/微菌落。
优选地，所述待检测的微生物对象是可个体化或个体化的微生物对象。
优选地，所述待检测的微生物对象未用产生光子信号的化合物或部分标记。
优选地，步骤b)和c)被进行多次，以对所述支持物的几个区域成像，优选地对整个所述支持物成像。
所述方法还可以包括步骤d)：将所述区域的获取的图像合并，以形成合并图像。
所述支持物可以是膜滤器，优选为由混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙或其组合制成，更优选地由混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚酯砜(PES)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成，甚至更优选地由混合纤维素酯(MCE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜滤器。
可选地，所述支持物可以是固体生长培养基。
在某些实施方式中，所述支持物在容器中并用半透明盖子覆盖。
在某些实施方式中，所述方法在步骤b)之后和步骤c)之前还包括：
b’)重复步骤a)和b)一次或几次，每次使用不同的相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个入射准直光源，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的所述获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
优选地，在这个实施方式中，在步骤c)中，通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
在某些实施方式中，步骤a)和b)或步骤a)、b)和b’)被进行多次，以对所述支持物的几个区域成像，优选地对整个所述支持物成像。所述方法还可以在步骤b)或b’)之后包括：b”)将所述区域的获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。在步骤c)中，可以通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
优选地，分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。更优选地，分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7或8组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7或8次。
优选地，两组入射准直光源的区别在于它们的数量、它们的光类型、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。更优选地，两组入射准直光源的区别在于它们的数量、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。
优选地，所述光接收元件是包含像素传感器阵列、优选为CCD(电荷耦合器件)图像传感器或有源像素传感器例如CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器的相机。
优选地，在步骤a)(第一次或重复的步骤a)中，将所述支持物用一组至少3个、优选地3至24个、更优选地3至12个、甚至更优选地3至6个入射准直光源照射。具体而言，在步骤a)(第一次或重复的步骤a)中，可以将所述支持物用一组3个入射准直光源照射。
优选地，所述入射准直光源均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的圆上。具体而言，一组中的所述入射准直光源可以均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。
每个入射准直光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地相对于所述支持物的法线在25°至65°之间、更优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
优选地，一组包括至少三个入射准直光源，并且对于所述一组中的所有光源而言角度α的值均相同。
优选地，所述入射准直光源选自准直发光二极管(LED)和激光二极管及其组合。更优选地，所述入射准直光源是准直白色LED。
所述方法还可以包括从获取的图像或合并图像计数和/或鉴定所述支持物上的微生物对象。
所述方法还可以在步骤a)之前包括：提供待测试的样品，将所述样品与所述支持物接触并温育所述支持物，以允许微生物(如果存在的话)生长。
本发明的方法可用于检测样品中的微生物或测试样品的无菌性。
具体而言，所述样品可以从液体、固体或气体获得。优选地，所述样品选自生物样品，环境样品，医疗器械或其任何部分，供人或动物食用的食品或饮料，药品或化妆品，以及此类食品、饮料、药品或化妆品的成分。
第二方面，本发明涉及一种用于检测支持物、优选为膜滤器或固体生长培养基上的微生物对象的装置，所述装置包含：
至少两个入射准直光源，其用于照射所述支持物，所述至少两个入射准直光源相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
光接收元件，其用于获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，和
通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在的工具，和
任选的保持并任选地移动所述支持物的工具。
优选地，所述装置包含至少3个，优选地3至50个，更优选地3至24个，甚至更优选地3至12个入射准直光源。或者，所述装置可以包含至少13个入射准直光源，优选地15至50个、更优选地15至30个、甚至更优选地24个入射准直光源。
优选地，每个入射准直光源相对于所述支持物的法线形成在15°至75°之间、优选地25°至65°之间、更优选地30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
优选地，对于相对于所述光学获取轴对称的入射准直光源而言，角度α的值相同。
具体而言，所述装置可以包含：
(i)至少3个，优选地3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在45°至55°之间的入射准直光源，或
(ii)至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在30°至40°之间的入射准直光源，和至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在45°至55°之间的入射准直光源，或
(iii)至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在25°至35°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在40°至50°之间的入射准直光源，和至少6个、优选地7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在60°至70°之间的入射准直光源，或
(iv)至少3个、优选地3个角度(α)的值在28°至32°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在33°至37°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在38°至42°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在48°至52°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在53°至57°之间的入射准直光源，和至少3个、优选地3、4、5、6、7、8、9个角度(α)的值在60°至64°之间的入射准直光源。
优选地，所述装置包含至少三个入射准直光源，更优选地4至12个入射准直光源，所述入射光源均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的圆上，并且其中每个入射光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
本发明还涉及本发明的装置用于优选地根据本发明的方法检测并任选地计数和/或鉴定支持物上的微生物对象的用途。
本发明还涉及本发明的装置用于优选地使用本发明的方法检测样品中的微生物或测试样品的无菌性的用途。
附图说明
图1：本发明的装置的实施方式的示意图。
图2：本发明应用于细菌、酵母和霉菌检测的技术结果的图示说明。细菌微菌落的尺寸为直径约200-500μm(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、大肠埃希氏杆菌(E.coli)、皮氏罗尔斯通菌(R.pickettii))、500-700μm(嗜肺军团菌(L.pneumophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia))或1-2mm(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。酵母细胞的尺寸为直径约500μm(酵母白假丝酵母(C.albicans))，或霉菌适合≈5x5mm窗口尺寸(巴西曲霉(A.brasiliensis))。每张图像都指示了比例因子，其中白线表示约100μm。微生物在PDVF膜、黑色混合纤维素酯(MCE)膜、白色MCE膜或黑色聚醚砜(PES)膜上生长。
图3：本发明应用于细菌、酵母和霉菌检测的技术结果的图示说明。入射角α被设置为37°、50°或60°。每张图像都指示了比例因子，其中白线表示约100μm。微生物在PDVF膜、黑色MCE膜或白色MCE膜上生长。
图4：本发明应用于细菌、酵母和霉菌检测的技术结果的图示说明。将膜用白光、UV光、蓝光或红光照射。在可能的反射光中，只收集与照射颜色相同的反射光。微生物在PDVF膜或黑色PES膜上生长。每张图像都指示了比例因子，其中白线表示约100μm。
图5：本发明应用于细菌、酵母和霉菌检测的技术结果的图示说明。在参比条件“无盖子”下，膜未被覆盖并直接暴露于入射光。在其他条件下，在膜的顶上(在膜与光照射/光接收系统之间)添加盖子。所述盖子与膜之间的距离被设置为1至3mm。在这些条件下，入射光在达到样品之前必须穿过盖子，并且反射光在达到传感器之前必须穿过盖子。调查了三种类型的盖子材料：盖子1：来自Merck过滤装置(Merck Millipore，EZ-FIT过滤装置RefEFHVW10IS)的塑料，盖子2：UV级熔融二氧化硅(Chroma corp.，厚度：1mm)，盖子3＝钠钙玻璃(Selba corp.，厚度：1.8–2mm)。微生物在PDVF膜或白色MCE膜上生长。每张图像都指示了比例因子，其中白线表示约100μm。
图6：本发明应用于细菌、酵母和霉菌检测的技术结果的图示说明。微生物在PDVF、黑色MCE、白色MCE、黑色PES或尼龙膜上生长。每张图像都指示了比例因子，其中白线表示约100μm。
图7：本发明应用于巴西曲霉(A.brasiliensis)或大肠埃希氏杆菌(E.coli)检测的技术结果的图示说明。微生物直接在固体生长培养基表面上或配置在固体生长培养基表面上的PVDF或MCE膜上进行检测。
图8：本发明应用于白假丝酵母(C.albicans)检测的技术结果。微生物在有网格或无网格白色MCE膜上生长，在固体生长培养基上生长23、25或28小时后检测。对于所研究的每个时间而言，在标准条件0(3个led，入射角α设置为50°)、条件1(6个led，入射角α设置为37°)或条件2(12个led，其中6个入射角α设置为50°，其中6个具有α＝37°)下进行检测到的白假丝酵母(C.albicans)数量的计数，结果被表示成MICA检测相比于再次温育48h直至菌落变得肉眼可见后同一膜上的计数的百分率。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于在生长的非常早期阶段检测和任选地计数存在于支持物上的微生物对象、例如微生物或微生物菌落的方法和相应的装置。本发明人在本文中证明，这种方法提供了一种非常灵活的解决方案，用于在几种类型的支持物上和各种条件下、包括在封闭容器中检测大量种类的微生物，以防止通过环境的污染。这种方法还显示出允许早期检测这些微生物对象，而不需要(尽管允许)使用促进检测的任何额外试剂例如标记剂或染料的优点。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于检测支持物上的微生物对象的方法，所述方法包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的至少两个入射准直光源照射所述支持物的区域，
b)利用光接收元件获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
c)通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
本文所使用的术语“微生物对象”是指分离形式的微生物(例如霉菌)或一群微生物、即微生物的菌落或微菌落。优选地，所述微生物对象的维度(例如直径、长度或宽度)为至少10μm。更优选地，这种微生物对象的维度(例如直径、长度或宽度)为至少10μm，并且肉眼不可见或几乎不可见。通过本发明的方法检测的微生物对象可以包括以下或由以下组成：采取分离形式的微生物(特别是霉菌)、菌落或微菌落及其混合物，即(i)采取分离形式的微生物和(ii)菌落或微克隆的组合。
通过本发明的方法检测的微生物对象优选为可个体化或个体化的微生物对象。具体而言，这些对象优选地不包含在微生物菌苔中。可个体化微生物对象是其轮廓可以与其他微生物对象的轮廓目测区分开来的对象。可个体化微生物对象可以与其他对象分离，或者可以与其他对象部分重叠，例如两个重叠的菌落。个体化微生物对象是与其他对象分离开的对象，例如分离的菌落或微菌落或分离的霉菌。在优选实施方式中，通过本发明的方法检测的微生物对象是可个体化或个体化的(i)霉菌和/或(ii)细菌、古细菌和/或酵母的菌落/微菌落。具体而言，所述待检测的微生物对象选自霉菌，以及细菌、古细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合，优选地选自霉菌，以及细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合。特别地，所述待检测的微生物对象可以包括霉菌，以及细菌和/或酵母的菌落/微菌落。
在某些优选实施方式中，所述微生物对象包括微菌落或由微菌落组成。本文所使用的术语“微菌落”是指已生长数小时或数天(取决于微生物)且肉眼不可见或几乎不可见的菌落。通常，微菌落的直径小于500μm，优选地在10μm至500μm之间，更优选地在30μm至500μm之间，甚至更优选地在30μm至200μm之间。
本文所使用的术语“微生物”是指细菌、古细菌或微小真菌。优选地，该术语是指细菌、酵母(即单细胞微小真菌)或霉菌(即多细胞和丝状微小真菌)。所述待检测的微生物可以选自细菌、古细菌和微小真菌及其组合。优选地，所述待检测的微生物选自细菌和微小真菌及其组合。所述待检测的微生物可以是病原微生物或非病原微生物。优选地，所述微生物是病原微生物或非病原微生物，例如可以使产品(例如食品、饮料、医疗器械、药品或化妆品)或环境(例如游泳池、地下水)变质或腐败的微生物。
在某些实施方式中，所述待检测的微生物包括细菌。这些细菌可以以菌落或微菌落的形式、优选地以微菌落的形式检测。这些细菌可以是需氧、厌氧或兼性厌氧细菌，以及革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。具体而言，所述待检测的微生物可以包括属于气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila))、产碱杆菌属(Alcaligenes)(例如粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如醋酸不动杆菌(Acinetobacter aceti)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii))、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、Alicyclobacillus contaminans、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus hesperidum)、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))、梭菌属(Clostridium)(例如生孢梭菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、爱德华氏菌属(Edwardiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardiella tarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、Lactobacillus nagelii、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、微球菌属(Micrococcus)(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxellaosloensis))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、片球菌属(Pediococcus)(例如戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、链球菌(Streptococcus)(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus))、魏斯氏菌属(Weissella)(例如融合魏斯氏菌(Weissella confusa))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterolitica))的细菌及其组合。
在某些实施方式中，所述待检测的微生物包括酵母或霉菌。酵母可以以菌落或微菌落的形式、优选地以微菌落的形式检测。霉菌可以以分离的形式检测(独特生物体的检测)。具体而言，所述待检测的微生物可以包括属于曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis))、假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candidaalbicans))、地霉属(Geotrichum)(例如白地霉(Geotrichum candidum))、青霉属(Penicillium)(例如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))的酵母或霉菌及其组合。
所述待检测的微生物对象可以包含在待分析的样品中。该样品可以从液体(例如水、果汁、啤酒、葡萄酒、生物流体如尿液)、固体(例如食品、药品或化妆品、医疗器械或任何固体表面)或气体(例如空气)获得。取决于待测试的产品/环境的形式，可以直接允许所述样品在支持物上生长，或者可以在允许样品在支持物上生长之前将所述样品提交到初步步骤。
具体而言，所述样品可以是液体样品或液化样品。本文所使用的术语“液化样品”是指从固体样品获得的液体样品。在某些情况下，固体样品可以通过物理和/或化学处理溶解或悬浮在液体介质中。微生物也可以使用专业技术人员已知的任何方法从不同表面或装置提取，例如拭子法、摩擦法(例如使用湿巾)、印刷法(例如通过琼脂接触法)、漂洗或浸渍法或超声处理法，特别是去除生物膜(参见例如等，Int J Environ Res PublicHealth.2013Nov 14；10(11):6169-83，通过引用并入本文)。
液体样品可以含有悬浮的固体。然而，如果需要，可以使用适合的方法，优选地使用使微生物损失最小化的方法，例如通过低速离心或使用适合孔径的过滤，从液体介质中去除残留的悬浮固体。用于悬浮固体样品的液体介质可以是任何适合的溶剂，例如无菌水、缓冲溶液或液体培养基。
任选地，所述液体或液化样品可以在步骤a)之前使用任何适合的方法例如离心或过滤进行稀释(例如连续稀释)或浓缩。
用本发明的方法分析的样品可以是试图确定其是否被微生物污染的任何样品。
样品的实例包括但不限于生物样品(例如唾液、鼻咽、尿液、粪便、血液、血浆、脑脊液或黏液样品)、环境样品(例如住宅、商业或工业用水、废水、冷却水、锅炉水、地下水、娱乐用水、工艺用水、水处理装置的出水、土壤或其他环境材料)、医疗器械或其任何部分、供人类或动物食用的食品或饮料(例如乳制品、原材料、饮用水、果汁、啤酒、葡萄酒、产品组合物中使用的水)、药品或化妆品，以及此类食品、饮料、药品或化妆品的成分。
在使用本发明的方法观察之前，允许所述微生物对象在所述支持物上生长。具体而言，可以将所述样品与所述支持物接触，以便允许微生物(如果存在的话)生长。所述支持物可以是膜滤器或固体生长培养基。
本文所使用的术语“生长培养基”或“培养基”是指在本发明的上下文中用于微生物生长的营养培养基。所述生长培养基可以是从各个化学物质合成的限定培养基，因此确切的分子组成是已知的，也可以是包含一些复杂成分例如酵母提取物或酪蛋白水解物的非限定培养基，所述复杂成分由比例未知的许多化学物质的混合物组成。在本发明的方法中使用的生长培养基可以是非选择性生长培养基或选择性生长培养基。非选择性生长培养基是用于细菌生长、用于真菌生长或用于细菌和真菌两者生长的通用培养基。非选择性培养基通常含有支持广泛种类的微生物生长所需的营养物。选择性生长培养基是仅用于生长选定微生物的培养基。事实上，选择性培养基的组成确保了具有某些特性例如抗生素抗性或合成某种代谢物例如氨基酸的能力的细胞的增殖。因此，该培养基提供了与样品中可能存在的非目标微生物相比更加有利于目标微生物生长的环境。
本文所使用的表述“固体生长培养基”或“固体培养基”是指允许微生物在其表面上形成微菌落的生长培养基，例如具有凝胶样外观或采取凝胶形式的培养基，凝胶是一种胶体系统，其中互连粒子的多孔网络跨越液体介质的体积，并允许营养物通过介质扩散，从而变得可以为微生物所用。优选地，本文所使用的固体生长培养基通过向液体生长培养基添加足量的胶凝剂例如琼脂、琼脂糖、藻酸盐、卡拉胶、纤维素、明胶、果胶及其组合来制备。通常，固体生长培养基含有浓度为0.5％至3％、优选为1％至2.5％的胶凝剂，优选为琼脂。优选地，在本发明的方法中使用的固体生长培养基是琼脂生长培养基。所述固体生长培养基被倾倒在容器中。这种容器可以是适应于微生物培养的任何无菌容器，特别是常规皮氏培养皿。
在其中所述支持物是固体生长培养基的实施方式中，所述方法还可以在步骤a)之前包括将容器中的样品与含有支持感兴趣的微生物生长的营养物的固体生长培养基接触。
在其中所述支持物是膜滤器的实施方式中，所述方法还可以在步骤a)之前包括在膜滤器上浓缩样品的微生物，然后将所述膜与生长培养基例如固体生长培养基或浸有液体生长培养基的垫、优选为固体生长培养基接触。在温育期间营养物质通过所述滤器，允许微生物在所述膜的上表面上生长。
液体、液化或气体样品可以使用适合于保留所述样品中包含的微生物的无菌膜滤器，通常为孔径小于目标微生物的微滤膜滤器进行过滤/浓缩。可以使用过滤漏斗和真空系统使所述样品通过所述膜。优选地，所述膜滤器具有不大于1.2μm的标称孔径，特别是0.22μm至1.2μm的孔径或0.22μm至0.8μm的孔径。在某些优选实施方式中，所述膜滤器具有不大于0.45μm的标称孔径，特别是0.22μm至0.45μm的孔径。所述滤器的直径可以取决于用于过滤所述样品的装置和包含所述生长培养基的容器的尺寸。例如，所述容器可以是直径为100mm、90mm或55mm的皮氏培养皿，并且所述膜可以具有47mm、50mm或更小的直径。
所述膜滤器可以由任何适合的材料制成，例如混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚酯砜(PES)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙或其组合。优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。更优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成。所述膜滤器可以是白色或彩色的，例如黑色，和/或可以是网格膜。
在优选实施方式中，调整样品稀释度和/或过滤的样品体积，以获得最大1000个、优选地最大300个微生物对象/cm2膜滤器或固体生长培养基表面。
在其中所述支持物是膜滤器的实施方式中，所述膜可以在照射和图像获取的步骤(步骤a)和b)，任选地重复)期间保持在所述生长培养基上，或者可以在步骤a)之前从所述生长培养基上移除并放置在样品架上。任选地，所述膜可以放置在容器(例如皮氏培养皿)中的样品架上。所述容器可以是开放容器，或者可以用半透明盖子封闭。
在其中所述支持物是固体生长培养基的实施方式中，所述支持物在容器例如皮氏培养皿中。在所述方法的步骤a)之前，可以通过移除在培养期间使用的盖子来打开所述容器，或者所述容器可以保持关闭，即使用半透明盖子。
在这些实施方式中，所述半透明盖子被放置成与所述微生物对象相对，在所述微生物对象和所述光接收元件之间，并且不与所述对象接触。优选地，所述半透明盖子被放置在距所述微生物对象1mm至10cm之间，更优选地1mm至5cm之间，甚至更优选地1mm至1cm之间的距离处。
在本发明的方法的步骤a)中，用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个入射准直光源照射所述支持物的区域。
入射光源是电力光源。它们可以用任何图案例如点、线、圆或正方形的图案来照射所述支持物。
本文所使用的术语“准直光源”是指产生平行光线的光源。因此，准直光在传播时发散极小。术语“准直光源”、“入射准直光源”、“入射光源”和“光源”在本文件中可互换使用。准直入射光源优选地选自准直发光二极管(LED)和激光二极管及其组合。更优选地，准直入射光源是准直LED。
在本发明中使用的光源可以发射单色、多色或甚至白光。具体而言，所述光源可以发射可见光(即具有400至700nm范围内的波长)、红外光(即具有大于700nm的波长)或紫外光(即具有小于400nm的波长)。优选地，所述光源发射波长在320至750nm范围内、更优选地在400nm至700nm范围内的光。
在一个实施方式中，所述一组中的每个光源发射独立地选自白光、UV光(优选地具有320至400nm范围内的波长)、绿光(优选地具有530至600nm范围内的波长)、蓝光(优选地具有430nm至530nm范围内的波长)和红光(优选地具有600nm至700nm范围内的波长)的光。
在一个优选实施方式中，所述一组中的每个光源发射独立地选自白光、UV光(优选地具有320至400nm范围内的波长)、蓝光(优选地具有430nm至530nm范围内的波长)和红光(优选地具有600nm至700nm范围内的波长)的光。
所述一组中的光源可以发射相同类型的光或不同类型的光。正如所示，所述一组中的每个光源可以提供白光。可选地，所述一组中的至少一个光源可以提供白光，并且所述一组中的至少一个其他光源可以提供UV光。优选地，所述一组中的每个光源发射相同类型的光，优选地发射白光。
在一个特定实施方式中，所述一组中的光源选自准直白色LED和发射UV光、蓝光或红光的准直LED及其组合。优选地，所述一组中的光源是准直白色LED。
在一个优选实施方式中，所述一组中的所有光源均选自准直白色LED和发射UV光、蓝光或红光的准直LED及其组合。优选地，所述一组中的所有光源均为准直白色LED。
在优选实施方式中，所述一组中的入射光在到达所述微生物对象或支持物之前不通过激发滤光器(即通常在荧光显微镜和光谱应用中用于从光源选择光的激发波长的滤光器)过滤。
如上所述，本发明的方法不需要使用促进检测的任何额外试剂，例如标记剂或染料。然而，在某些特定实施方式中，微生物对象可能已使用此类试剂(例如荧光染料)标记。优选地，所述微生物对象是未标记的，即未用标记剂(即产生光子信号的化合物或部分例如有色或荧光染料)标记。在优选实施方案中，本发明的方法不包括使用任何试剂(例如底物、探针、抗体、染料等)来标记微生物对象。
在步骤a)中，将所述支持物用一组至少两个光源，优选地用一组至少3个光源照射。具体而言，将所述支持物可以用一组3至50个光源，优选地用一组3至24个光源，更优选地用一组3至12个光源，甚至更优选地用一组3至6个光源照射。
在优选实施方式中，将所述支持物用一组3个光源照射。
优选地，所述一组中的光源被分布、优选地均匀分布(即彼此等距离)在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。在某些实施方式中，所述光源被分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的圆上。在某些其他实施方式中，所述光源被分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的几个圆(优选地具有不同直径)上，优选地在2、3、4、5或6个圆上。优选地，所述圆在与所述支持物的平面平行的平面中。
在一个实施方式中，将所述支持物用均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的圆上的一组3个光源照射。
在某些特定实施方式中，将所述支持物用偶数个光源照射，并且所述光源相对于所述光学获取轴对称。
对于所述一组中的每个光源而言，独立地选择角度α的值。因此，所述一组中的两个光源的角度α的值可以相同或不同。优选地，所述一组中的每个入射准直光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地相对于所述支持物的法线在25°至65°之间、更优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
在一个特定实施方式中，对于所述一组中的相对于所述光学获取轴对称的光源而言，角度α的值是相同的。
在一个优选实施方式中，对于所述一组中的所有光源而言，角度α的值是相同的。
在一个特别优选实施方式中，将所述支持物用一组至少三个光源照射，并且所有光源的角度α的值相同。具体而言，在这个实施方式中，角度α的值可以在相对于所述支持物的法线25°至65°之间。
由每个光源发射的光通量和由所有光源发射的光通量之和可以由专业技术人员容易地调节。优选地，由一组中的所有光源发射的光通量之和在0.80至15流明/mm2之间，并且由每个光源发射的光通量在0.10至5流明/mm2之间。
所述支持物被所述准直光源照射的区域可以是所述支持物的一部分或整个所述支持物。优选地，所述支持物被所述准直光源照射的区域是所述支持物的一部分。具体而言，所述区域可以是3至100mm2，优选为3至50mm2，更优选为25至50mm2。通常，所述支持物的整个区域在100mm2至10,000mm2之间，优选地在400mm2至8,000mm2之间，更优选地在450至2000mm2之间。
所述支持物与所述光接收元件和光源之间的距离可以由专业技术人员、由操作者容易地或自动地(例如使用计算机图像分析软件)调节。具体而言，该距离可以使用三角测量法确定。通常，所述支持物与所述光接收元件之间的距离为5mm至10cm，优选为5mm至5cm，更优选为5mm至3cm。
在本发明的方法的步骤b)中，利用光接收元件获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线。
所述光接收元件可以是包含像素传感器阵列，优选为CCD(电荷耦合器件)图像传感器或有源像素传感器例如CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器的相机。优选地，所述光接收元件是CMOS图像传感器。
本发明的优点之一是在生长的非常早期阶段检测微生物对象，而不需要放大。因此，优选地，所述光接收元件是非放大系统。然而，不排除使用此类系统，并且可以例如以0.5X至10X的放大率，优选地以2X至5X的放大率来获取图像。
在某些实施方式中，本发明的方法在步骤b)之后和步骤c)之前还包括：
b’)将步骤a)和b)重复一次或几次，每次使用不同的一组光源，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的所述获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
可以使用不同的1至20组至少两个入射准直光源将步骤a)和b)重复1至20次。具体而言，可以分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。优选地，分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7或8组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7或8次。更优选地，分别使用不同的1、2、3或4组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4次。
每组光源可以如上所定义。对于在重复步骤中使用的每组光源而言，也考虑了上文为步骤a)中使用的组所公开的所有实施方式。具体而言，每个组可以包括相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的至少2个、优选地至少3个光源，对于每个光源而言独立地选择角度(α)的值。优选地，对于同一组的每个光源而言，角度α的值是相同的。
每组可以包括3至24个、优选地3至12个、更优选地3至6个、甚至更优选地3个光源。对于每组而言，光源的数量可以相同或不同。具体而言，所有组可以包括不同数量的光源，所有组可以包括相同数量的光源，或者某些组可以包括相同数量的光源。
优选地，每组包括至少三个光源，并且对于一组中的所有光源而言角度α的值是相同的。优选地，相对于所述支持物的法线，角度α的值在25°至65°之间。
每组光源包括不同的光源组合，并且与其他组的区别在于至少一个光源，优选地所有光源都不同。
两组光源的区别可以在于它们的数量、它们的光类型、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。优选地，两组光源的区别在于它们的数量、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。更优选地，两组光源的区别至少在于它们的位置和/或每个光源的角度α的值。
优选地，所有组的光源都发射相同类型的光，优选为白光。更优选地，所有组的光源都是准直白色LED。
为每组光源获取所述区域的图像。然后将所述图像合并，以获得所述区域的合并图像。
应当注意的是，本发明的方法不排除用同一组光源将步骤a)和b)重复一次或几次的可能性。
具体而言，本发明的方法可以包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射所述支持物的区域，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
b)利用光接收元件获取由所述一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
b’)重复步骤a)和b)一次或几次，每次使用不同的相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的所述获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
在一个特定实施方式中，本发明的方法可以包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的第一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射所述支持物的区域，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
b)利用光接收元件获取由所述第一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
b’)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的第二组至少两个、优选地至少三个入射准直光源重复步骤a)和b)，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的所述获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
优选地，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同。更优选地，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，并在25°至65°之间。
优选地，所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同。更优选地，所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，并在25°至65°之间。
所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值与所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值可以相同或不同。在一个特定实施方式中，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值与所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，优选地在25°至55°之间，更优选地在30°至40°之间。在另一个特定实施方式中，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值与所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值不同，优选地所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值在30°至40°之间，并且所述第二组的每个入射准直光源的角度(α)的值在45°至55°之间，或正好相反。
在一个特定实施方式中，本发明的方法可以包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的第一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射所述支持物的区域，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
b)利用光接收元件获取由所述第一组至少两个、优选地至少三个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
b’)用N组至少两个、优选地至少三个入射准直光源中的每一组重复步骤a)和b)，每组的每个光源相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
N是整数并在2至20之间，优选地在2至12之间，更优选地在2至8之间，即选自2、3、4、5、6、7和8。
优选地，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同。更优选地，所述第一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，并在25°至65°之间。
对于N组中的每一组而言，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值可以相同或不同。优选地，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同。更优选地，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，并在25°至65°之间。
在一个特定实施方式中，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，优选地在25°至65°之间，并且对于所述N组中的每一组而言角度(α)的值不同。
在另一个特定实施方式中，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，优选地在25°至65°之间，并且两个或更多个组具有相同的角度(α)的值。
在另一个特定实施方式中，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，使用四组光源，两组的角度(α)的值在30°至40°之间，两组的角度(α)的值在45°至55°之间。优选地，每组包括至少三个光源，优选地3至6个光源，更优选地由三个光源组成。
在另一个特定实施方式中，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，使用至少8组光源，两组的角度(α)的值在25°至35°之间，两组的角度(α)的值在40°至50°之间，四组的角度(α)的值在60°至70°之间。优选地，每组包括至少三个光源，优选地3至6个光源，更优选地由三个光源组成。
在另一个特定实施方式中，同一组的每个入射准直光源的角度(α)的值相同，使用至少8组光源，一组的角度(α)的值在28°至32°之间，一组的角度(α)的值在33°至37°之间，一组的角度(α)的值在38°至42°之间，一组的角度(α)的值在48°至52°之间，一组的角度(α)的值在53°至57°之间，三组的角度(α)的值在60°至64°之间。优选地，每组包括至少三个光源，优选地由三个光源组成。优选地，每组包括至少三个光源，优选地3至6个光源，更优选地由三个光源组成。
在包括步骤a)、b)和b’)的实施方式中，在步骤c)中，可以通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
在某些优选实施方式中，步骤a)和b)(使用一组光源)或步骤a)、b)和b’)(使用多个光源组重复)被进行多次，以对所述支持物的几个区域成像，优选地对整个所述支持物成像。因此，所述方法还可以在步骤b)或b’)之后包括：b”)将所述区域的获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。然后，在步骤c)中，通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
步骤a)和b)或步骤a)至c)可以进行多次，以对所述支持物的几个不同区域成像。优选地，进行步骤a)和b)或步骤a)至c)以对整个所述支持物成像，即将所述步骤进行多次，足以通过合并获取的图像对整个所述支持物成像。
具体而言，可以将区域的照射和图像获取的步骤(步骤a)和b))以及任选的当使用一组或几组不同的光源重复步骤a)和b)时合并所述区域的获取的图像的步骤进行多次，以对所述支持物的几个不同区域成像，优选地通过合并不同区域的获取的图像对整个所述支持物成像。
轮次的数量取决于每轮成像的区域的尺寸和所述支持物的尺寸。通常，步骤a)和b)或步骤a)至c)可以进行10次至500次，优选地50次至400次。
具体而言，可以将区域的照射和图像获取的步骤(步骤a)和b))以及任选的当使用一组或几组不同的光源重复步骤a)和b)时合并所述区域的获取的图像的步骤进行10次至500次，优选地50次至400次。
所述方法还可以包括合并所述不同区域的获取的图像，以形成所述支持物的合并图像的步骤。对于每个照射区域而言，可以获取图像，然后对所述区域图像进行处理，以形成所述支持物的合并图像。或者，对于每个照射区域而言，可以获取并合并几个图像，然后对合并图像进行处理，以形成所述支持物的合并图像。然后，所述合并图像构成所述支持物的整体或其部分的表述。在优选实施方式中，步骤c)在所述支持物的整体或其部分的此类合并图像上进行。
图像的操作例如合并同一区域的获取的图像以形成区域的合并图像或合并不同区域的获取的或合并的图像以形成所述支持物的合并图像，可以通过专业技术人员常规使用的任何方法来进行。例如，图像的合并可以使用ImageJ软件来进行。
有利情况下，所述支持物被安装在移动的样品架上，使得可以扫描所述支持物的表面并重建所述支持物的部分或完整图像。入射区域(被照射和成像的区域)的宽度优选地等于或大于所述支持物的两个连续位置之间的平移步长。由于所述移动样品架，可以通过样品相对于光接收元件的线性和/或旋转运动来扫描所述支持物。
通过在所述获取的图像或合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物上微生物对象的存在或不存在。微生物对象在所述支持物的表面上增加某些不规则性，并且这可以凭借所述支持物和所述微生物对象上光反射、散射和/或漫射的差异而被检测到。从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光不同于由标记剂发射的光子信号，特别是不同于由荧光染料发射的荧光信号或由所述微生物对象发射的自体荧光信号。具体而言，从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光具有与入射光相同的波长范围。在一个特定实施方式中，所述入射准直光源发射白光，并且所述光接收元件检测从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的白光。对于其他类型的光(例如蓝光、红光、绿光、UV光)也是如此。
这种检测可以由操作者进行，或利用与所述光接收元件相连的计算机执行的图像处理软件来自动进行。此类计算机执行的图像处理软件可以是由专业技术人员容易地选择的任何适合的软件。
具体而言，微生物对象的检测可以通过检测由微生物对象给出的表面不规则性产生的反射点来进行。例如，该点检测可以如下进行：(i)使用对于像素传感器的像素阵列的每一行或每一列而言在光强度峰附近接收到高于阈值的信号水平的像素的数量，(ii)使用像素传感器的像素阵列的每一行或每一列的最高信号水平，或(iii)使用像素传感器阵列的信号水平。
在某些实施方式中，本发明的方法在步骤a)之前还包括提供待测试的样品，将所述样品与所述支持物接触并温育所述支持物，以允许微生物(如果存在的话)生长。所述样品、支持物和温育条件可以如上所定义。
这种检测可以伴随着对所述微生物对象进行计数，也可以伴随着根据给定标准例如它们的表面积或形态对它们进行分类/鉴定。
因此，本发明的方法还可以包括从获取的图像或合并图像计数和/或鉴定所述支持物上的微生物对象。
本文所使用的术语“鉴定”不一定需要确定给定微生物对象的属和种。该术语可以指微生物在分类组(任何级别)或特定组(例如嗜热嗜酸菌、乙酸菌、乳酸菌、酵母或霉菌)中的分类。这种鉴定可以通过从获取的图像或合并图像获得的信息(尺寸、形态、外观)和/或仅仅通过所述对象的检出(特别是如果培养步骤已在选择性生长培养基上和/或在选择性条件(例如嗜热条件)下进行)来实现。
在某些优选实施方式中，本发明的方法用于测试样品的无菌性或检测样品中的微生物。具体而言，如上所详述的，在步骤a)之前，可以将所述样品与所述支持物接触并温育，以允许微生物生长。微生物对象的存在或数量高于预定阈值的微生物对象的存在指示了所述样品不是无菌的。微生物对象的不存在或数量低于预定阈值的微生物对象的存在指示了所述样品是无菌的。该阈值可以根据待测试的产品和待应用的监管标准而变。
本发明的方法允许在一定温育时间后以高可靠性检测所述微生物对象，所述温育时间取决于待检测的微生物对象的本质，通常为4天或更短，优选为3、2、1天或更短。
另一方面，本发明涉及一种用于执行本发明的方法，特别是用于检测支持物、优选为膜滤器或固体生长培养基上的微生物对象的装置，所述装置包含：
至少两个入射准直光源，其用于照射所述支持物，所述至少两个入射准直光源相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)，
光接收元件，其用于获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，和
通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在的工具，和
任选的保持并任选地移动所述支持物的工具。
入射光源可以是如上所定义的任何准直光源。具体而言，入射光源是电力光源。它们可以用任何图案例如点、线、圆或正方形的图案照射所述支持物。
光源优选地选自准直发光二极管(LED)和激光二极管及其组合。更优选地，准直入射光源是准直LED。
在本发明中使用的光源可以发射单色、多色或甚至白光。具体而言，所述光源可以发射可见光(即具有400至700nm范围内的波长)、红外光(即具有大于700nm的波长)或紫外光(即具有小于400nm的波长)。优选地，所述光源发射波长在320至750nm范围内、更优选地在400nm至700nm范围内的光。
在一个实施方式中，每个光源发射独立地选自白光、UV光(优选地具有320至400nm范围内的波长)、绿光(优选地具有530至600nm范围内的波长)、蓝光(优选地具有430nm至530nm范围内的波长)和红光(优选地具有600nm至700nm范围内的波长)的光。
在一个优选实施方式中，每个光源发射独立地选自白光、UV光(优选地具有320至400nm范围内的波长)、蓝光(优选地具有430nm至530nm范围内的波长)和红光(优选地具有600nm至700nm范围内的波长)的光。
所述光源可以发射相同类型的光或不同类型的光。正如所示，每个光源可以提供白光。可选地，至少一个光源可以提供白光，并且至少一个其他光源可以提供UV光。优选地，每个光源发射相同类型的光，优选地发射白光。
在一个特定实施方式中，所述至少两个入射准直光源选自准直白色LED和发射UV光、蓝光或红光的准直LED及其组合。优选地，所述至少两个入射准直光源是准直白色LED。
在一个优选实施方式中，所有光源均选自准直白色LED和发射UV光、蓝光或红光的准直LED及其组合。优选地，所有光源均为准直白色LED。
所述装置可以包括至少3个入射准直光源，优选地3至50个、更优选地3至24个、甚至更优选地3至12个入射准直光源。在优选实施方式中，所述装置可以包括至少4个入射准直光源，优选地4至50个、更优选地4至24个、甚至更优选地4至12个入射准直光源。在另一个优选实施方式中，所述装置包括至少13个入射准直光源，优选地15至50个、更优选地15至30个、甚至更优选地24个入射准直光源。
优选地，所述光源被分布、优选地均匀分布(即彼此等距离)在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。在某些实施方式中，所述光源被分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的圆上。在某些其他实施方式中，所述光源被分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的几个圆(优选地具有不同直径)上，优选地在2、3、4、5或6个圆上。每个圆在与所述支持物的平面平行的平面中。优选地，每个圆包括至少三个光源的位置，优选地3至12个光源的位置，更优选地3至9个光源的位置。在优选实施方式中，位于同一个圆上的每个光源具有相同的角度α的值。
在某些特定实施方式中，所述装置包括偶数数量的光源，并且所述光源相对于所述光学获取轴对称。
对于每个光源而言，独立地选择角度α的值。因此，所述装置的两个光源的角度α的值可以相同或不同。优选地，每个入射准直光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地在25°至65°之间、更优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
在一个特定实施方式中，对于相对于所述光学获取轴对称的光源而言，角度α的值是相同的。
在一个特定实施方式中，对于所有光源而言，角度α的值是相同的。
在另一个特定实施方式中，所述装置包含至少三个、优选地3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在45°至55°之间的光源。优选地，所述装置包含12个角度(α)的值在45°至55°之间的入射准直光源。所述光源可以分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。优选地，所述光源分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的一个圆上。
在另一个特定实施方式中，所述装置包含至少三个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在30°至40°之间的光源，和至少三个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在45°至55°之间的光源。优选地，所述装置包含6个角度(α)的值在30°至40°之间的光源和6个角度(α)的值在45°至55°之间的光源。所述光源可以分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。优选地，所述光源分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的两个圆上。具体而言，第一个圆可以包括角度(α)的值在30°至40°之间的光源的位置，并且第二个圆可以包括角度(α)的值在45°至55°之间的光源的位置。
在另一个特定实施方式中，所述装置包含至少三个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在25°至35°之间的光源，至少三个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在40°至50°之间的光源，和至少6个、优选地7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在60°至70°之间的光源。优选地，所述装置包含6个角度(α)的值在25°至35°之间的光源，6个角度(α)的值在40°至50°之间的光源，和12个角度(α)的值在60°至70°之间的光源。所述光源可以分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。优选地，所述光源分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的三个圆上。具体而言，第一个圆可以包括角度(α)的值在25°至35°之间的光源的位置，第二个圆可以包括角度(α)的值在40°至50°之间的光源的位置，并且第三个圆可以包括角度(α)的值在60°至70°之间的光源的位置。
在另一个特定实施方式中，所述装置包含至少三个、优选地3个角度(α)的值在28°至32°之间的光源，至少三个、优选地3个角度(α)的值在33°至37°之间的光源，至少三个、优选地3个角度(α)的值在38°至42°之间的光源，至少三个、优选地3个角度(α)的值在48°至52°之间的光源，至少三个、优选地3个角度(α)的值在53°至57°之间的光源，和至少三个、优选地3、4、5、6、7、8、9个角度(α)的值在60°至64°之间的光源。优选地，所述装置包含3个角度(α)的值在28°至32°之间的光源、3个角度(α)的值在33°至37°之间的光源、3个角度(α)的值在38°至42°之间的光源、3个角度(α)的值在48°至52°之间的光源、3个角度(α)的值在53°至57°之间的光源和9个角度(α)的值在60°至64°之间的光源。所述光源可以分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。优选地，所述光源分布、优选地均匀分布在以所述光学获取轴为中心的六个圆上。具体而言，第一个圆可以包括角度(α)的值在28°至32°之间的光源的位置，第二个圆可以包括角度(α)的值在33°至37°之间的光源的位置，第三个圆可以包括角度(α)的值在38°至42°之间的光源的位置，第四个圆可以包括角度(α)的值在48°至52°之间的光源的位置，第五个圆可以包括角度(α)的值在53°至57°之间的光源的位置，并且第六个圆可以包括角度(α)的值在60°至64°之间的光源的位置。
由每个光源发射的光通量和由所有光源发射的光通量之和可以由专业技术人员容易地调节。优选地，由所有光源发射的光通量之和在0.80至15流明/mm2之间，并且由每个光源发射的光通量在0.10至5流明/mm2之间。
在优选实施方式中，所述装置不包含任何激发滤光器，即用于从入射光源选择光的激发波长的滤光器。
所述光接收元件如上所定义。具体而言，所述光接收元件可以是包含像素传感器阵列、优选为CCD(电荷耦合器件)图像传感器或有源像素传感器例如CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器的相机。优选地，所述光接收元件是CMOS图像传感器。
所述光接收元件可以是放大系统或非放大系统。放大倍数可以在0.5X至10X之间，优选地在2x至5x之间。优选地，所述光接收元件是非放大系统。
所述光源和光接收元件被一起安装在支撑结构上，以便相对于彼此具有确定且固定的位置关系。
所述装置包含用于检测所述支持物上微生物对象的存在或不存在的工具。
所述装置优选地包含用于合并图像，特别是合并同一区域的获取的图像并合并几个区域的获取的或合并的图像的工具。因此，检测所述支持物上微生物对象的存在或不存在可以在所述支持物的区域的获取的图像上、所述支持物的区域的合并图像(合并同一区域的几个获取的图像)上或所述支持物的几个区域的合并图像上进行。
所述光接收元件可以与检测单元相连，所述检测单元将接收从所述光接收元件获得的图像信息并处理所述信息以检测任何微生物对象，即本身已知的计算机执行的图像处理软件。
因此，通过检测从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，可以辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，并因此检测所述支持物上微生物对象的存在或不存在。微生物对象在所述支持物的表面上增加某些不规则性，并且这可以凭借所述支持物和所述微生物对象上光反射、散射和/或漫射的差异而被检测到。事实上，由微生物对象给出的不规则性具有特定结构，提供了特定的反射图案。
从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光不同于由标记剂发射的光子信号，特别是不同于由荧光染料发射的荧光信号或由所述微生物对象发射的自体荧光信号。具体而言，从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光具有与入射光相同的波长范围。在一个特定实施方式中，所述入射准直光源发射白光，并且所述光接收元件检测从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的白光。对于其他类型的光(例如蓝光、红光、绿光、UV光)也是如此。
具体而言，微生物对象的检测可以通过检测由微生物对象给出的表面不规则性产生的反射点来进行。例如，该点检测可以如下进行：(i)使用对于像素传感器的像素阵列的每一行或每一列而言在光强度峰附近接收到高于阈值的信号水平的像素的数量，(ii)使用像素传感器的像素阵列的每一行或每一列的最高信号水平，或(iii)使用像素传感器阵列的信号水平。
任选地，所述装置还可以包含保持并任选地移动所述支持物的工具。优选地，所述装置包含如上所述的移动样品架，使得可以扫描所述支持物的表面。由于所述移动样品架，可以通过样品相对于光接收元件的线性和/或旋转运动来扫描所述支持物。
图1示出了本发明的装置的实施方式。这个示例性装置包含：
两个入射准直光源(3)，其用于照射支持物(2)，所述入射准直光源相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)，
光接收元件(4)，其用于获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，
通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光(未示出)来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在的工具，和
用于保持所述支持物的样品架(1)，
所述光源和所述光接收元件被一起安装在支撑结构(5)上，以便相对于彼此具有确定且固定的位置关系。
另一方面，本发明还涉及本发明的装置用于优选地根据本发明的方法检测并任选地计数和/或鉴定支持物上的微生物对象的用途。
具体而言，本发明涉及本发明的装置用于优选地根据本发明的方法测试样品的无菌性或检测样品中的微生物的用途。
在这一方面中，也设想了上文为本发明的方法和装置所描述的所有实施方式。
当在本文中使用时，由术语“在X与Y之间”定义的范围涵盖了该范围的极限值，即涵盖了值X和Y。
本说明书中引用的所有参考文献通过引用并入本申请。本发明的其他特征和优点将在下述实施例中变得更加清楚，提供所述实施例是出于说明而不是限制的目的。
实施例
实施例1
材料和方法：
微生物的制备
对于巴西曲霉(A.brasiliensis)而言，将来自Biomérieux的含有精确数量的微生物的(Multishot 550巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)SKU编号：56001)在NaCl 0,9％中稀释，以在每种实验条件下获得压紧在滤膜上的限定数量的微生物(密度≈100个对象/膜)。将所述膜配置在SDA琼脂平板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上，并允许微生物在32.5℃下生长17h或18h。或者，将所述膜配置在R2A琼脂平板(酪蛋白酸水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硫酸镁0.024g/L，蛋白胨0.5g/L，丙酮酸钠0.3g/L，可溶性淀粉0.5g/L，酵母提取物0.5g/L，琼脂15g/L，pH值7.2±0.2)上，并允许微生物在22.5℃下生长38h或44h。
将白假丝酵母(Candida albicans)(10231TM)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(10145TM)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(8739TM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(6633TM)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(25608TM)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii)(27511TM)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)(CIP 105349)从以前定量的冷冻保存的储用物在NaCl 0,9％中稀释，以获得每种实验条件的限定数量的微生物。将得到的悬液在膜上过滤，并允许微生物在固体生长培养基上，即在SDA、R2A、TSA(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)或GVPC(甘氨酸万古霉素多黏菌素环己酰胺，购自Oxoid，目录号：PO5074A)琼脂平板上，在温度T下生长t小时。
在所述实施例中使用的膜如下：PVDF膜(Durapore HVWG04700，MerckMillipore)、MCE黑色膜(HABG047，Merck Millipore)、MCE白色网格膜(HAWG047，MerckMillipore),MCE白色无网格膜(GE 10401670)、PES膜(metricel 66585，Pall laboratory)和尼龙膜(nylaflo66608，Pall laboratory)。
表1：用于在滤膜上生长微生物的条件
对于每个样品而言，通过从固体生长培养基中取出膜来停止生长，并将样品储存在4℃下直至成像。
样品制备
将所述膜与3滴无菌水(约50-250μl)一起配置在由黑色阳极氧化铝制成的样品架(1)上，以使膜重新水合并保持膜湿润。然后将盒子放置在适当位置进行成像，如图1中所示。
成像系统设置
通过如图1中所示的装置对膜进行成像，其中将膜(2)放置在样品架(1)上，并用相对于所述支持物的法线形成角度(α)的入射准直LED(3)照射。利用光学获取轴沿着所述膜的法线的CMOS图像传感器(4)对所述膜的入射区域成像。检测从所述膜和/或所述膜上的微生物对象反射/散射和/或漫射的光。
调整采集参数(光源强度在0.7至11流明/LED之间，相机曝光时间在100至300ms之间)以使信噪比最大化。将多波段发射滤光器(435±20nm、546±10nm和690±50nm带通)放置在CMOS图像传感器和样品之间。所述实施例中使用的CMOS传感器是Sony IMX178LLJ-C(IDS成像相机UI-3880CP-M-GL_R2或UI-3880CP-C-GL_R2)。
在标准配置中，将所述膜用发射白光的3个准直LED照射，所述LED彼此等距离，并以光学获取轴为中心。入射角α被设置为50°。
在下文描述的实施例中，这种配置的几个参数是可变的，即LED数量、角度α的值和入射光的波长。研究了其他参数，例如膜的类型和膜上半透明盖子的存在或不存在。
结果
LED数量的变化
将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的发射白光的准直LED照射。入射角α被设置为50°。LED的数量在3、6或12个之间变化，并测试了几种类型的膜(PVDF膜、白色和黑色MCE膜、PES膜)。随着LED数量的增加，单个LED的强度降低，以保持总强度不变(到达膜的总光保持在与使用3个LED的条件相同的数量级内)。对于这些条件中的每一者而言，手动调整采集参数(相机曝光时间和光强度)以产生相似的膜背景(无论条件如何，均为同一数量级的灰度级)。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图2中。这些结果显示，不论LED数量如何，在微生物上都发现了反射点。对于具有球形形状的微生物(例如白假丝酵母(C.albicans)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))而言，那些点是明确定义的。不完美的球形形状可能会导致点缺失。然而，多个光源的使用使信息倍增，因此允许高效地检测每种类型的微生物。
角度α的值的变化
将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的发射白光的6个准直LED照射。入射角α被设置为37°、50°或60°，并测试了几种类型的膜(PVDF膜、白色和黑色MCE膜)。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图3中。这些结果显示，不论入射角如何，在微生物上都发现了反射点。小入射角(37°)提供位于微生物中心附近的反射点。事实上，平坦表面(推测存在于微菌落中心上)只会使来自小入射角的光略微偏向传感器：可以收集到反射光。相比之下，坚硬表面(推测存在于微生物边缘处)会使光远远偏离传感器：不能收集到反射光。
另一方面，高入射角(例如60°)产生位于微生物边缘附近的反射点。事实上，平坦表面(推测存在于微菌落中心上)会使光远远偏离传感器：不能收集到反射光。相比之下，坚硬表面(推测存在于微生物边缘处)只会使来自小入射角的光略微偏向传感器：可以收集到反射光。
这些结果表明，三个角度值(37°、50°和60°)允许高效地检测每种类型的微生物，并且在某些情况下可以通过根据待检测的微生物的结构调节入射角或通过使用不同入射角的组合来改进检测。
波长的变化
将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的3个准直LED照射。入射角α被设置为50°，并测试了两种类型的膜(PVDF膜和PES膜)。所述LED发射白光、UV光(365±10nm)、蓝光(495±20nm)或红光(645±30nm)。在“白光”条件下，传感器收集435±20nm、546±10nm和690±50nm带通内的光。在“UV光”条件下，传感器收集365±10nm带通内的光。在“蓝光”条件下，传感器收集482±35nm带通内的光。在“红光”条件下，传感器收集640±75nm带通内的光。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图4中。这些结果显示，不论光/波长如何，均可以高效地检测每种类型的微生物。
半透明盖子的存在
将用半透明盖子覆盖的膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的发射白光的12个准直LED照射。入射角α被设置为50°，并测试了两种类型的膜(PVDF膜和白色MCE膜)。研究了三种类型的盖子材料：来自Merck过滤装置的塑料、UV级熔融二氧化硅(Chroma corp.，厚度：1mm)、钠钙玻璃(Selba corp.，厚度：1.8–2mm)。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图5中。这些结果显示，即使将所述膜用半透明盖子覆盖，并且无论所述盖子的材料如何，均可以高效地检测每种类型的微生物。
膜类型
对于不同种类的膜，调查了本发明的方法：PDVF、黑色MCE、白色MCE、黑色PES或尼龙膜。对于每种条件而言，将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的发射白光的6个准直LED照射。入射角α被设置为37°。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图6中。这些结果显示，在所有测试的膜上均可以高效地检测每种类型的微生物。
在固体生长培养基上的检测
从甘油储用物稀释大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(8739TM)。将得到的悬液在TSA琼脂板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)上铺展，或者在膜(PVDF或白色MCE)上过滤。将所述膜配置在TSA板上。在任一情况下，允许细菌在37℃下生长8h。
将巴西曲霉(A.brasiliensis)(Multishot 550巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)SKU编号：56001，来自Biomérieux，含有精确数量的微生物)在NaCl 0,9％中稀释，并在R2A板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上铺展，或以≈100个对象/膜的密度压实在PVDF滤膜上并配置在R2A板上。在任一情况下，允许微生物在22.5℃下生长44h。
然后直接在固体生长培养基表面上或在配置在固体生长培养基(90mm直径的皮氏培养皿)表面上的膜上检测巴西曲霉(A.brasiliensis)或大肠埃希氏杆菌(E.coli)微生物。在任一情况下，将样品配置在由黑色塑料制成的样品架(1)上。
在每种条件下获取的图像的实例呈现在图7中。这些结果显示，可以直接在固体生长培养基上或膜上进行微生物的检测，即使所述膜被维持在所述生长培养基上。
使用不同的设置条件以使检测微生物所需的温育时间最小化
对于在白假丝酵母(C.albicans)检测上的不同时间，调查了本发明的方法。将微生物在接触SDA固体生长培养基的白色MCE膜(有网格或无网格)上生长，并在不同时间(23h、25h或28h)停止生长。对于所研究的每个时间而言，将样品在不同条件下成像：标准条件0(3个led，入射角α被设置为37°)、条件1(6个led，入射角α被设置为37°)、条件2(12个LED：其中6个被设置为α＝37°、其余6个被设置为α＝50°)。对于每种条件而言，将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的发射白光的准直LED照射。
对于每种条件而言，对成像后在膜上检测到的微生物的数量进行定量(操作者计数，N)，并允许膜再次生长48小时，直至菌落变得肉眼可见(CFU计数)。检测百分率被计算为N/CFU计数的比率。
在每种条件下获得的这些百分率呈现在图8中。这些结果显示，某些设置条件允许更早地检测微生物。
实施例2
材料和方法
与来自制药行业和化妆品的原材料或最终产品的污染有关的微生物的检测
将巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)9763TM、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)DSM 70492、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)18502TM、白假丝酵母(Candida albicans)10231TM和宛氏青霉(Penicillium variotii)18502TM压实在PVDF、黑色或白色MCE滤膜上(取决于菌株)。将膜配置在SDA琼脂平板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上。然后将板在22.5℃下温育24h至50h(取决于菌株和膜的类型)。
将鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)19606TM、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)6633TM、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)19146TM、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)25608TM、白假丝酵母(Candida albicans)10231TM、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)19404TM、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)6919TM、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)35028TM、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCCTM29212TM、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)8739TM、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)13883TM、藤黄微球菌(Kocuria rhizophila)9341TM、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)43645TM、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)29906TM、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)9027TM、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)27511TM、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)14756TM、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)25931TM、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)6538TM、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)49619TM、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)17802TM、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterolitica)9610TM压实在PVDF、黑色或白色MCE滤膜(取决于菌株)上。将膜配置在TSA琼脂平板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)上。然后将板在32.5℃下温育6h至72h(取决于菌株和膜的类型)。
与非复杂性和复杂性UTI有关的细菌的检测
将覆盖89％的非复杂性和复杂性UTI的大肠埃希氏杆菌(E.coli)8739TM、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)13883TM、奇异变形杆菌(P.mirabilis)29906TM、粪肠球菌(E.faecalis)19433TM和金黄色葡萄球菌(S.aureus)6538TM压实在PVDF和黑色MCE滤膜上。将膜配置在哥伦比亚血琼脂平板(蛋白胨23g/l，淀粉1g/l，氯化钠5g/l，绵羊血50ml/l，琼脂14g/l，pH值7.3±0.2)上(对于所有菌株而言)和MacConkey琼脂平板(蛋白胨20g/L，乳糖10g/L，胆盐1.5g/L，结晶紫0.001g/L，中性红0.05g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.1+/-0.2)上(对于大肠菌群(大肠埃希氏杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))而言)。将哥伦比亚琼脂平板在37℃下温育7h30至10h45(取决于菌株)。将Mac Conkey琼脂平板在32.5℃下温育10h至11h(取决于菌株和膜的类型)。
与自来水和制药用水(纯化水和WFI水)的污染有关的微生物的检测
在本实施例中使用的革兰氏阴性细菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)19606TM、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)35654TM、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)19146TM、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)25608TM、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)8090TM、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)15947TM、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)35028TM、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CIP82.115、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)13883TM、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)CIP 106787、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)ATCC成团泛菌(Pantoea agglomerans)27155TM、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)29906TM、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)10145TM、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)27511TM、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)13311TM、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)13880TM、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)25931TM、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)29837TM、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)13637TM、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)17802TM、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)9610TM。革兰氏阳性细菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)6633TM、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)19433TM、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)6538TM。测试的酵母和霉菌是巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM和白假丝酵母(Candidaalbicans)10231TM。这个选择名单覆盖了至少84％的自来水系统微生物污染物、77％的纯化水系统污染物和制药用WFI系统的最常见污染物。将菌株压实在PVDF和黑色或白色MCE滤膜(取决于菌株)上。将膜配置在Reasoner's 2A琼脂(R2A)板(酵母提取物0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，最终pH 7.2±0.2)上。将R2A板在32.5℃下温育24h至48h(取决于菌株)。
与食品工业(原材料和最终产品)中的腐败或污染有关的微生物的检测
概要
将鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)19606TM、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)6633TM、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)19146TM、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)35028TM、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCCTM29212TM、藤黄微球菌(Kocuria rhizophila)9341TM、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)25931TM、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)49619TM、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)17802TM、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)9610TM压实在PVDF滤膜上。将膜配置在PCA琼脂平板(胰蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，葡萄糖1g/L，琼脂15g/L，pH值7.0±0.2)上。将板在35℃下温育18h至27h(取决于菌株)。
软饮料
在本实施例中使用的霉菌是巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM和宛氏青霉(Penicillium variotii)18502TM。使用的乙酸细菌是醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)15973TM、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)14835TM、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)DSM 15972和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)19357TM)，使用的乳酸细菌菌株是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)8014TM、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)10881TM和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)393TM。将菌株压实在PVDF、黑色或白色MCE滤膜(取决于菌株)上。将膜配置在OSA(酪蛋白蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾3g/L，D(+)-葡萄糖4g/L，柑橘提取物5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂17g/L，pH值5.5±0.2)、PDA(马铃薯浸出物4g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L，pH值5.6±0.2)或YM琼脂平板(葡萄糖10g/L，麦芽提取物3g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂15g/L，pH值6,2±0,2)上(对于巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和宛氏青霉(Penicillium variotii)而言)，YM琼脂平板上(对于乙酸细菌而言)，以及MRS琼脂平板(柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，D(+)-葡萄糖20g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，肉提取物5g/L，乙酸钠5g/L，通用蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂12g/L，pH值5.7)上(对于乳酸细菌而言)。将OSA板在30℃下温育40h。将PDA板在25℃下温育40h。将YMA板在25℃或30℃下温育15h至72h(取决于菌株和膜的类型)。将MRS琼脂平板在30℃下温育24h至26h。
果汁
将脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)细菌的菌株，包括酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)49025TM、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)27009TM、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)DSM 14558、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)49028TM,Alicyclobacillus hesperidum DSM 12766、Alicyclobacillus herbarius DSM 13609和Alicyclobacillus contaminans DSM 17975，压实在PVDF或黑色MCE滤膜(取决于菌株)上。将膜配置在BAT琼脂平板(酵母提取物2g/l，D(+)葡萄糖5g/l，氯化钙0.25066g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸锌0.00018g/l，硫酸铜0.00016g/l，硫酸锰0.00015g/l，钼酸钠二水合物0,00030g/l，琼脂18g/l，pH值3.8-4.2)上。将BAT琼脂平板在45℃下温育24h。
葡萄酒
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(环境菌株)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)(环境菌株)、Lactobacillus nagelii(环境菌株)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)33316TM压实在PVDF滤膜上。将膜配置在番茄汁琼脂平板(番茄汁20g/L，蛋白胨10g/L，胨化牛奶10g/L，琼脂12g/L，pH值6.1±0.2)上。将番茄汁琼脂平板在25℃和30℃下温育18h至72h(取决于菌株和培养条件)。
样品制备
将膜与3滴无菌水(约50-150μl)一起配置在由黑色阳极氧化铝制成的样品架(1)上，以使膜重新水合并保持膜湿润。然后将盒子放置在适当位置进行成像，如图1中所示。
成像系统设置
通过如图1中所示的装置对膜进行成像，其中将膜(2)放置在样品架(1)上，并用彼此等距离并以光学获取轴为中心且相对于所述支持物的法线形成50°的角度(α)的发射白光的3个准直LED(3)照射。利用光学获取轴沿着所述膜的法线的CMOS图像传感器(4)对所述膜的入射区域成像。检测从所述膜和/或所述膜上的微生物对象反射/散射和/或漫射的光。
调整采集参数(对于压实在PVDF和黑色MCE膜上的微生物而言光源强度为3至7流明/LED并且相机曝光时间为100ms，对于压实在MCE白色膜上的微生物而言光源强度为1至5流明/LED并且相机曝光时间为40至50ms)，以使信噪比最大化。将多波段发射滤光器(435±20nm、546±10nm和690±50nm带通)放置在CMOS图像传感器和样品之间。
结果
表2：使用本发明的方法检测各种微生物
(X)意味着检测到感兴趣的微生物。
(/)意味着该条件未测试。
实施例3
材料和方法：
微生物的制备
对于巴西曲霉(A.brasiliensis)而言，将来自Biomérieux的含有精确数量的微生物的(Multishot 550巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)SKU编号：56001)在NaCl 0,9％中稀释，以在每种实验条件下获得压紧在滤膜上的限定数量的微生物(密度≈100个对象/膜)。将所述膜配置在SDA琼脂平板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上，并允许微生物在22.5℃下生长38h。
将巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)(16404TM)、白假丝酵母(Candida albicans)(10231TM)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(8739TM)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(9027TM)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)(NBRC 15911，BAA-2500TM)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)(27511TM)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)(19146TM)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(25416TM)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(6538TM)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(12228TM)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(17386TM)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(6633TM)从以前定量的冷冻保存的储用物在NaCl 0,9％中稀释，以获得每种实验条件的限定数量的微生物(密度≈100个对象/膜)。将得到的悬液在MCE白色网格膜(HAWG047，MerckMillipore)上过滤，并允许微生物在固体生长培养基上，即在SDA、R2A或TSA琼脂平板上，在温度T下生长t小时。用于在滤膜上生长微生物的条件示出在表3中。对于每个样品而言，通过将膜从固体生长培养基中取出来停止生长，并将样品储存在4℃下直至成像。
样品制备
将所述膜与3滴无菌水(约50-250μl)一起配置在由黑色阳极氧化铝制成的样品架(1)上，以使膜重新水合并保持膜湿润。然后将盒子放置在适当位置进行成像，如图1中所示。
成像系统设置
通过如图1中所示的装置对膜进行成像，其中将膜(2)放置在样品架(1)上，并用几个发射白光的入射准直LED(3)照射，每个LED相对于所述支持物的法线形成角度(α)。利用光学获取轴沿着所述膜的法线的CMOS图像传感器(4)对所述膜的入射区域成像。检测从所述膜和/或所述膜上的微生物对象反射/散射和/或漫射的光。
用于检测巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)的装置包含均匀分布在以所述光学获取轴为中心的圆上的角度(α)的值为37°的6个光源。
用于检测白假丝酵母(Candida albicans)和细菌的装置包含均匀分布在以所述光学获取轴为中心的圆上的角度(α)的值为37°的6个光源，和均匀分布在以所述光学获取轴为中心的另一个圆上的角度(α)的值为50°的6个光源。
调整采集参数(光源强度在0.7至11流明/LED之间，相机曝光时间在100至300ms之间)以使信噪比最大化。将多波段发射滤光器(435±20nm、546±10nm和690±50nm带通)放置在CMOS图像传感器和样品之间。所述实施例中使用的CMOS传感器是Sony IMX178LLJ-C(IDS成像相机UI-3880CP-M-GL_R2或UI-3880CP-C-GL_R2)。
通过与对照条件、即在足够时间以在琼脂板(含有或不含膜)上得到肉眼可见的菌落后获得的菌落数量进行比较，来评估检测的百分率。
结果
巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)的检测
测试了两种实验设置。
在第一种设置中，将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心的6个准直LED同时照射。入射角α被设置为37°。然后将在这种条件下获取的图像用于微生物的检测。已显示这种设置允许检测69％的巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)微生物。
在第二种设置中，将膜用第一组彼此等距离并以光学获取轴为中心的3个准直LED和不同于所述第一组的第二组彼此等距离并以光学获取轴为中心的3个准直LED顺序照射。入射角α被设置为37°。然后将使用所述第一组和第二组3个LED获取的图像合并，并用于微生物的检测。已显示这种设置允许检测100％的巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)微生物。
白假丝酵母(Candida albicans)的检测
测试了两种实验设置。
在第一种设置中，将膜用彼此等距离并以光学获取轴为中心且角度α为37°的6个准直LED和彼此等距离并以光学获取轴为中心且角度α为50°的6个准直LED同时照射。然后将在这种条件下获取的图像用于微生物的检测。已显示这种设置允许检测64％的白假丝酵母(Candida albicans)微生物。
在第二种设置中，将膜用四组LED顺序照射：第一组是角度α为37°的3个准直LED，第二组是角度α为37°的另外3个准直LED，第三组是角度α为50°的3个准直LED，第四组是角度α为50°的另外3个准直LED。然后将使用这四个组中的每一组获取的图像合并，并用于微生物的检测。已显示这种设置允许检测100％的白假丝酵母(Candida albicans)微生物。
细菌的检测
将上文为白假丝酵母(Candida albicans)的检测所详述的第二种设置用于检测不同的细菌。结果呈现在下面的表3中。
表3：使用本发明的方法检测各种细菌

Claims (51)

1.一种用于检测支持物上的微生物对象的方法，所述方法包括：
a)用相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个入射准直光源照射所述支持物的区域，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
b)利用光接收元件获取由所述一组至少两个入射准直光源照射的所述支持物的所述区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，以及
c)通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中待检测的微生物对象选自霉菌，以及细菌、古细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中待检测的微生物对象选自霉菌，以及细菌和酵母的菌落/微菌落，及其组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中待检测的微生物对象包括霉菌，以及细菌和/或酵母的菌落/微菌落。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中待检测的微生物对象是可个体化或个体化的微生物对象。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中待检测的微生物对象未用产生光子信号的化合物或部分标记。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述支持物是膜滤器。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚酯砜(PES)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙或其组合制成。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述支持物是固体生长培养基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述支持物在任选地用半透明盖子覆盖的容器中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤b)和c)被进行多次，以对所述支持物的几个区域成像，优选地对整个所述支持物成像。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法还包括步骤d)：将所述区域的获取的图像合并，以形成合并图像。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤b)之后和步骤c)之前还包括：
b’)重复步骤a)和b)一次或几次，每次使用不同的相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)的一组至少两个入射准直光源，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，从而获得所述区域的多个获取的图像，并将所述区域的所述获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤c)中，通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤a)和b)或步骤a)、b)和b’)被进行多次，以对所述支持物的几个区域成像，优选地对整个所述支持物成像。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法在步骤b)或b’)之后还包括：
b”)将所述区域的获取的图像合并，以形成所述区域的合并图像。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤c)中，通过在所述区域的所述合并图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光，来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中分别使用不同的1、2、3、4、5、6、7或8组至少两个入射准直光源，将步骤a)和b)重复1、2、3、4、5、6、7或8次。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中两组入射准直光源的区别在于它们的数量、它们的光类型、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。
23.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中两组入射准直光源的区别在于它们的数量、它们的位置和/或每个光源的角度α的值。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中一组包括至少三个入射准直光源。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中一组包括3至24个入射准直光源。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中一组包括3至12个入射准直光源。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中一组包括3至6个入射准直光源。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中一组包括3个入射准直光源。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中一组中的所述入射准直光源均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的一个或几个圆上。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中每个入射准直光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地相对于所述支持物的法线在25°至65°之间、更优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中一组包括至少三个入射准直光源，并且对于所述一组中的所有光源而言角度α的值均相同。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述入射准直光源选自准直发光二极管(LED)和激光二极管及其组合。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述入射准直光源是准直白色LED。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述光接收元件是包含像素传感器阵列、优选为CCD(电荷耦合器件)图像传感器或有源像素传感器例如CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器的相机。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，所述方法还包括从获取的图像或合并图像计数和/或鉴定所述支持物上的微生物对象。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤a)之前还包括：
提供待测试的样品，
将所述样品与所述支持物接触并温育所述支持物，以在存在微生物的情况下允许所述微生物生长。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其用于检测样品中的微生物或测试样品的无菌性。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述样品从液体、固体或气体获得。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述样品选自生物样品，环境样品，医疗器械或其任何部分，供人或动物食用的食品或饮料，药品或化妆品，以及此类食品、饮料、药品或化妆品的成分。
40.一种用于检测支持物、优选为膜滤器或固体生长培养基上的微生物对象的装置，所述装置包含：
至少两个入射准直光源，其用于照射所述支持物，所述至少两个入射准直光源相对于所述支持物的法线形成至少10°的角度(α)，对于每个入射准直光源而言独立地选择角度(α)的值，
光接收元件，其用于获取由所述至少两个入射准直光源照射的所述支持物的区域的图像，所述光接收元件的光学获取轴沿着所述支持物的法线，和
通过在所述获取的图像上辨别从所述支持物和所述支持物上的微生物对象反射、散射和/或漫射的光来检测所述支持物的所述区域上微生物对象的存在或不存在的工具，和
任选的保持并任选地移动所述支持物的工具。
41.根据权利要求40所述的装置，其中所述装置包含至少3个，优选地3至50个，更优选地3至24个，甚至更优选地3至12个入射准直光源。
42.根据权利要求40所述的装置，其中所述装置包含至少13个入射准直光源，优选地15至50个、更优选地15至30个、甚至更优选地24个入射准直光源。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的装置，其中每个入射准直光源相对于所述支持物的法线形成在15°至75°之间、优选地25°至65°之间、更优选地30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的装置，其中对于相对于所述光学获取轴对称的入射准直光源而言，角度α的值相同。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的装置，其中所述装置包含至少3个，优选地3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在45°至55°之间的入射准直光源。
46.根据权利要求40至44中任一项所述的装置，其中所述装置包含至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在30°至40°之间的入射准直光源，和至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在45°至55°之间的入射准直光源。
47.根据权利要求40至44中任一项所述的装置，其中所述装置包含至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在25°至35°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3、4、5或6个角度(α)的值在40°至50°之间的入射准直光源，和至少6个、优选地7、8、9、10、11或12个角度(α)的值在60°至70°之间的入射准直光源。
48.根据权利要求40至44中任一项所述的装置，其中所述装置包含至少3个、优选地3个角度(α)的值在28°至32°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在33°至37°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在38°至42°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在48°至52°之间的入射准直光源，至少3个、优选地3个角度(α)的值在53°至57°之间的入射准直光源，和至少3个、优选地3、4、5、6、7、8、9个角度(α)的值在60°至64°之间的入射准直光源。
49.根据权利要求40所述的装置，其中所述装置包含至少三个入射准直光源，更优选地4至12个入射准直光源，所述入射光源均匀地分布在以所述光学获取轴为中心的圆上，并且其中每个入射光源形成相对于所述支持物的法线在15°至75°之间、优选地相对于所述支持物的法线在30°至60°之间独立地选择的角度(α)。
50.根据权利要求40至49中任一项所述的装置用于优选地根据权利要求1至39中任一项所述的方法检测并任选地计数和/或鉴定支持物上的微生物对象的用途。
51.根据权利要求40至49中任一项所述的装置用于优选地使用根据权利要求1至39中任一项所述的方法检测样品中的微生物或测试样品的无菌性的用途。
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