CN118108809A - 一种跨膜荧光蛋白、水溶荧光蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种跨膜荧光蛋白、水溶荧光蛋白及其用途。所述跨膜荧光蛋白的氨基酸序列选自：SEQ ID No.:1，SEQ ID No.:2，SEQ ID No.:3，SEQ IDNo.:4，SEQ ID No.:5，以及所述水溶荧光蛋白的氨基酸序列选自：SEQ ID No.:6，SEQ ID No.:7，SEQ ID No.:8，SEQ ID No.:9。本发明的跨膜荧光蛋白、水溶荧光蛋白可以与HBC衍生物—HBC599和HBC620高亲和力、高特异性地结合，可以用作细胞内和细胞膜上的荧光成像。
Description
技术领域
本申请属于蛋白领域，具体涉及一种跨膜荧光蛋白、水溶荧光蛋白及其用途。
背景技术
跨膜蛋白对小分子的识别对于细胞膜两侧物质、能量和信息的交换至关重要。目前已经有许多尝试，试图从头设计跨膜蛋白，来理解细胞膜内小分子-蛋白相互作用的基本原理，从而实现对特定小分子的紧密和特异性识别；然而迄今为止，这方面的进展有限。目前还没有从头设计的跨膜荧光蛋白。
所有已知的自然存在的跨膜荧光蛋白亮度都非常弱。对于最广泛应用的一类天然跨膜荧光蛋白视紫红质，它们的荧光光谱局限于它们的荧光基团视黄醛，它们的蛋白拓扑结构局限于7次跨膜α螺旋。这些缺点限制了它们的应用。
因此，仍然需要一种新型的跨膜蛋白，其可以在细胞膜内与荧光基团特异地、高亲和力地结合，具有很高的亮度和量子产率。这样的蛋白可以变成非常好的工具，用于活细胞细胞膜上的传感、成像和跨膜转运。
发明内容
本发明的技术问题是提供一类跨膜荧光蛋白以及它对应的水溶荧光蛋白。它们与具有荧光基团的HBC衍生物——HBC599、HBC620(HBC：(4-((2-hydroxyethyl)(methyl)amino)-benzylidene)-cyanophenyl-acetonitrile，是一种用于与RNApepper结合的荧光基团，有多种衍生物，来产生各种波长的荧光。Chen X et al.,Visualizing RNAdynamicsin live cells with bright and stable fluorescent RNAs.Nat Biotechnol.2019Nov；37(11):1287-1293.)高亲和力、高特异性地结合，其亮度和量子产率高于EGFP，远远超过所有天然的荧光蛋白。这些跨膜蛋白可以被表达到活的大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞(如HEK293)的细胞膜上，用于细胞膜的传感、成像或跨膜转运。
一方面，本发明提供一种跨膜荧光蛋白，所述跨膜荧光蛋白包括SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:3、SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:5所示的氨基酸序列，或者所述跨膜荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.:1、SEQ IDNo.:2、SEQ ID No.:3、SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:5。
另一方面，本发明提供与上述跨膜荧光蛋白相对应的水溶荧光蛋白，所述水溶荧光蛋白包括SEQ ID No.:6、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:8或SEQ IDNo.:9所示的氨基酸序列，或者所述水溶荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo.:6、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:8或SEQ ID No.:9。
需要说明的是，本发明的荧光蛋白的特异性主要是指这些荧光蛋白均与HBC599、HBC620这两个衍生物特异性结合并激发荧光，而与其它衍生物比如HBC495、HBC508、HBC530结合和荧光激发非常弱或者不结合。
术语“与上述跨膜荧光蛋白相对应”是所述水溶荧光蛋白与跨膜荧光蛋白具有与相应HBC分子结合的一致的核心区域，换言之，本申请的这些蛋白与相应HBC分子结合的能力取决于蛋白核心区域的氨基酸序列，核心区域的序列是完全一致的或者几乎完全一致的。因此本申请的上述两类蛋白激活荧光所需的条件，结合HBC599/620之后的荧光光谱也都很相似，而核心区域(参见图7示出的突变位点)之外的序列，主要决定蛋白在细胞中表达到水溶环境(水溶蛋白)还是跨膜环境(跨膜蛋白)。
另一方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码上述跨膜荧光蛋白，或上述水溶荧光蛋白。
再一方面，本申请提供一种表达载体，其包含上述多核苷酸。
再一方面，本申请提供一种细胞，其包含上述表达载体，或者表达上述跨膜荧光蛋白，或上述水溶荧光蛋白。
在具体实施方式中，所述细胞包括但不限于大肠杆菌细胞、人HEK293细胞。
又一方面，本申请提供上述跨膜荧光蛋白，或其表达载体在细胞膜上的成像和传感中的应用。
又一方面，本申请提供上述水溶荧光蛋白，或其表达载体在细胞成像和传感中的应用。
又一方面，本发明提供一种细胞膜成像方法，所述方法包括使用上述跨膜荧光蛋白。
又一方面，本发明提供一种细胞成像方法，所述方法包括使用水溶荧光蛋白。
技术效果
本申请涉及一种利用深度神经网络从头设计的跨膜荧光蛋白，以及与其对应的水溶荧光蛋白。本申请的跨膜荧光蛋白以及水溶荧光蛋白与具有荧光基团的HBC衍生物(HBC599和HBC620)高亲和力、高特异性地结合，其亮度和量子产率高于EGFP，远远超过所有天然的荧光蛋白。
本发明中的跨膜荧光蛋白和水溶荧光蛋白，在大肠杆菌中表达纯化之后，可以测到与HBC599、HBC620分子能特异性结合。与相应HBC(例如HBC599)结合时，跨膜荧光蛋白使HBC亮度最高提高超过1675倍，亲和力达到17nM，荧光量子产率0.87，荧光发射峰最短为555nm，最长为590nm；水溶荧光蛋白使HBC亮度最高提高超过1150倍，亲和力达到51nM，荧光量子产率达到0.88，荧光发射峰最短为545nm，最长为590nm。
本申请的这些跨膜荧光蛋白可以表达到活的大肠杆菌(coli)和哺乳动物细胞(如HEK293)的细胞膜上，用于细胞膜的传感、成像或跨膜转运。
附图说明
图1：本申请的水溶荧光蛋白(a)和跨膜荧光蛋白(b)的氨基酸序列和HBC衍生物的分子结构(c)。图中示出的所有wFAP都是基于wFAP0改造的突变体，所有tmFAP都是基于tmFAP0.1改造的突变体。图中，黑点代表突变体对应位置序列相对于wFAP0或者tmFAP0.1没有变。红色、蓝色、绿色是为了提示改造突变体时序列有变化的位置。红色或者蓝色标出的位置，突变体的序列与wFAP0或者tmFAP0.1不同。绿色标出的位置，tmFAP2.1与tmFAP0.1序列不同。黄色标出的位置，是从水溶荧光蛋白改造为跨膜荧光蛋白时序列变化的位置。
图2：本申请的各跨膜荧光蛋白和水溶荧光蛋白的荧光性质以及与天然荧光蛋白的比较。
图3：本申请的水溶荧光蛋白的荧光性质检测。(a)水溶荧光蛋白激发HBC599荧光的示意图，(b)水溶荧光蛋白的特异性，(c)荧光光谱，(d)各个突变体的解离常数测定曲线，(e)蛋白与HBC衍生物结合后发光照片展示，(f)wFAP1.1与不同HBC衍生物解离常数测定曲线。
图4：本申请的跨膜荧光蛋白的荧光性质检测。(a)水溶荧光蛋白改造为跨膜荧光蛋白示意图，(b)跨膜荧光蛋白的特异性，(c)荧光光谱，(d)各个突变体的解离常数测定曲线，(e)蛋白与HBC衍生物结合后发光照片展示，(f)tmFAP1.2与不同HBC衍生物解离常数测定曲线。
图5：本申请的水溶荧光蛋白wFAP1.1与HBC结合状态(b)、未结合(a)两种状态的晶体结构。蛋白核心区域与HBC相互作用的结构和与设计模型的对比(c,d)。
图6：本申请的跨膜荧光蛋白和水溶荧光蛋白在活细胞(大肠杆菌(a)、人HEK293细胞(b))内表达之后的荧光照片。在图a中：大肠杆菌中不表达本申请蛋白时无荧光(第1行)，表达水溶荧光蛋白时整个细胞有荧光(第2行)，表达跨膜荧光蛋白时细胞膜上有荧光(第3、4行，其中第4行是第3行的局部放大)。在图b中，人HEK293细胞中表达水溶荧光蛋白时整个细胞有荧光(第1行)，添加线粒体定位信号时线粒体位置有荧光(第2行)，表达跨膜荧光蛋白时细胞膜上有荧光(第3、4行，其中第四行是第3行的局部放大)。
图7：在wFAP1.1(上图)和tmFAP1.1(下图)的结合口袋中引入突变对于荧光激活信号的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细描述本申请的技术方案，以使本领域的技术人员更好地理解本发明。然而这些实施例的提供不用于限制本申请的范围。
实施例1：水溶荧光蛋白的制备和纯化
水溶荧光蛋白(wFAPs)构建使用pET-29b载体(蛋白C端有6*His标签)。表达时将质粒转入大肠杆菌细胞(Lemo21(DE3)Competent E.coli,NEB)，在LB培养基中37℃，220RPM培养，在OD达到0.6后加入0.2mM IPTG继续培养16小时。wFAPs通过Ni2+-NTA亲和层析，随后通过尺寸排阻层析柱进行纯化。具体操作如下：表达水溶荧光蛋白的大肠杆菌细胞在含有5mM咪唑、20mM Tris-HCl pH 8.0和500mM NaCl的裂解缓冲液中重悬并均质化。经过24000g离心后，上清液与Ni2+-NTA beads孵育。孵育后，用洗涤缓冲液(20mM咪唑，20mM Tris-HCl pH8.0和500mM NaCl)清洗珠子3次，然后用洗脱缓冲液(100mM咪唑，20mM Tris-HCl pH 8.0和500mM NaCl)洗脱。洗脱的蛋白随后在TBS(pH 7.4)中使用凝胶过滤层析柱(Superdex200Increase 10/300GL，GE Healthcare)纯化。根据A280读数收集目标蛋白wFAP0、wFAP1.1、wFAP1.2、wFAP1.3(氨基酸序列分别为SEQ ID No.:6-9)的部分。
实施例2：跨膜荧光蛋白的制备和纯化
跨膜荧光蛋白(tmFAPs)构建使用pET-29b载体(蛋白N端有MBP(麦芽糖结合蛋白)标签，C端有6*His标签)。表达时将质粒转入大肠杆菌细胞(Lemo21(DE3)CompetentE.coli,NEB)，在LB培养基中37℃，220RPM培养，在OD达到0.6后加入0.2mM IPTG继续培养16小时。对于跨膜荧光蛋白纯化，从至少1L表达跨膜荧光蛋白的大肠杆菌培养液中收集细胞，重悬，并在30ml裂解缓冲液中均质化(25mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl)。细胞使用高压均质器裂解。通过15000g离心10分钟去除细胞碎片。收集上清液，进行25000g超速离心1小时。膜部分用1.5％n-Octyl-β-D-Glucopyranoside(OG，Anatracec)在4℃下至少2小时溶解，随后进行15000g离心45分钟。上清液加载到Ni2+-NTA beads上，用20ml洗涤缓冲液(裂解缓冲液加20mM咪唑和1.1％ OG)清洗，并用10ml洗脱缓冲液(洗涤缓冲液加额外的300mM咪唑)洗脱。洗脱的蛋白浓缩至1ml，进一步通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)纯化。凝胶过滤的缓冲液包含25mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl和1.1％OG。根据A280读数和SDS-PAGE结果收集目标蛋白tmFAP0.1、tmFAP1.1、tmFAP1.2、tmFAP1.3、tmFAP2.1(氨基酸序列分别为SEQ ID No.:1-5)的部分。
实施例3：测定蛋白的荧光性质、结合HBC的亲和力和特异性
解离常数(Kd)、荧光光谱和消光系数是使用Varioskan LUX微孔板检测仪(Thermo)测量的。所有荧光读数都在黑色96孔微孔板(Corning)中测量。蛋白质浓度通过使用NanoPhotometer N60(Implen)测量A280来估算。为了确定Kd，将一系列浓度的纯化蛋白(wFAP0、wFAP1.1、wFAP1.2、wFAP1.3、tmFAP0.1、tmFAP1.1、tmFAP1.2、tmFAP1.3)与50nM HBC(HBC599、HBC620)混合。每种条件的最终总体积为100μL，含2％ DMSO。然后测量最佳激发波长下的荧光读数。使用Origin Pro拟合全局解离常数。使用Kd滴定实验中观察到的数据计算蛋白的荧光激活倍数。将背景荧光读数与稳态荧光读数或观察到的最高读数(对于稳态未测量的弱结合体)进行比较。使用2μM HBCs和过量纯化蛋白测量FAPs的荧光光谱。每种蛋白-HBC组合使用200μL样品。使用每种HBC-蛋白组合的最佳激发/发射波长扫描荧光读数。对于tmFAP-HBC特异性实验，1μM蛋白与每种组合中的1μM HBC混合，并测量每种条件下最佳波长的荧光读数。
实施例4：消光系数和吸收测量
所有吸收读数都在透明的96孔微孔板中测量，使用Varioskan LUX微孔板检测仪(Thermo)。为了测量消光系数，将一系列浓度的HBC衍生物与过量蛋白(使用的HBC衍生物和蛋白组合如图2中所列出)混合。根据Kd值估算，至少95％的HBC与蛋白结合。混合物在室温下孵育至少3小时，然后加入透明96孔微孔板进行吸收测量。使用每种HBC-蛋白组合的吸收峰处的吸收值。这些值经过600nm处吸收的背景减除处理，此处HBC的吸收最小，并通过测量900nm和975nm处水的吸收进行路径长度校正。使用Beer-Lambert-Bouguer定律计算消光系数，通过至少4种浓度的数据点进行线性拟合。
实施例5：荧光量子产率测量
通过在爱丁堡FLS1000光谱仪上使用积分球来测量绝对量子产率。将0.5μM的HBC衍生物与至少2μM的蛋白(使用的HBC衍生物和蛋白组合是图2中列出的组合)(1％ DMSO)混合，在黑暗条件下在4℃下过夜孵育。所有样品在室温下使用495nm的激发波长进行测量。
实施例3-5的结果示于图2-4中，从图2中，可以看出与EGFP(数据来自：Sarkisyan,K.S.et al.Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophoreand long fluorescence lifetime.Biophys J 109,380-389,doi:10.1016/j.bpj.2015.06.018(2015).)对比，本申请的跨膜荧光蛋白和水溶荧光蛋白的亮度和荧光量子产率都接近或者超过EGFP。本发明中的跨膜荧光蛋白和水溶荧光蛋白，在大肠杆菌中表达纯化之后，可以与HBC599、HBC620分子特异性结合。跨膜荧光蛋白突变体与HBC599结合时，亮度是未加蛋白时的1675倍以上，亲和力达到17nM，荧光量子产率0.87，荧光发射峰最短为555nm，最长为590nm；水溶荧光蛋白突变体与HBC599结合时，亮度是未加蛋白时的1150倍以上，亲和力达到51nM，荧光量子产率达到0.88，荧光发射峰最短为545nm，最长为590nm。
实施例6：结晶结构
结晶
为了进行蛋白结晶，纯化的wFAP1.1被浓缩至12mg/ml。晶体通过18℃下的悬滴蒸发扩散法获得。为了制备悬滴，将0.8μL浓缩的蛋白溶液与0.8μL的含有20％ PEG1000、100mM磷酸二钠/柠檬酸pH 4.2和200mM硫酸锂的结晶溶液混合。对于wFAP1.1/HBC599复合物的结晶，将wFAP1.1与2％体积/体积的50mM HBC599混合。晶体在与单蛋白X射线衍射仪相同条件下获得。
数据采集和结构确定
在X射线衍射实验之前，晶体在含有额外20％体积/体积甘油的结晶溶液中浸泡以进行保护。wFAP1.1 apo的衍射数据在西湖大学生物医学平台的单晶X射线衍射仪上收集。wFAP1.1/HBC599复合物的衍射数据在上海光源BL02U1束线上收集。数据使用HKL2000软件进行处理和缩放。
wFAP1.1 apo和wFAP1.1/HBC599结构均通过PHASER中的分子置换方法确定，使用设计模型作为搜索模型。结构模型在PHENIX中进行了精化，并在COOT中进行了调整。模型质量由MolProbity进行了检查。所有结构图均使用PyMOL(https://www.pymol.org)制作。
图5示出水溶荧光蛋白wFAP1.1与HBC结合状态、未结合两种状态的晶体结构。从图中可以看出荧光基团HBC599与蛋白紧密结合在蛋白核心部分。
实施例7：人细胞培养、转染和荧光成像
用于人细胞成像时，所有蛋白构建使用pcDNA载体(蛋白N端有Ig Kappa标签和neurexin信号肽，C端有mtagBFP2，用于显示蛋白在细胞中的定位)。HEK293T细胞在杜氏改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco,ThermoFisher)中培养，添加10％胎牛血清(Cellmax)和50U/ml的青霉素和链霉素。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000转染试剂(ThermoFisher)将构建的质粒载体转染至细胞中。转染后一天，细胞用PBS缓冲液洗涤一次，然后用含有1％ HBC599的PBS缓冲液替换。随后，细胞孵育10分钟，并使用尼康C2共聚焦显微镜进行成像。
实施例8：在大肠杆菌中的活细胞成像
从实施例1和2的培养液中离心收集表达tmFAP或者wFAP的大肠杆菌细胞，用M9培养基洗涤两次，并在成像前至少与200nM的HBC599(1％DMSO)一起孵育至少20分钟。使用Zeiss 980显微镜的Airyscan模式进行荧光成像，使用63倍油镜头。分别使用405nm和488nm激光来激发mtagBFP2和HBC599信号。
图6中示出实施例7(图6b)和8(图6a)的成像结果，从图中可以看出荧光信号定位在细胞膜上，且有很高的信噪比，而没有蛋白表达的细胞(负对照)在同样条件下没有荧光信号。这些结果显示本申请的蛋白可以用作细胞内和细胞膜上的荧光成像。
实施例9：检测wFAP1.1和tmFAP1.1突变对荧光激活的影响
对于单点突变，通过PCR将突变引入到相应的位点。突变体随后通过电穿孔法转化到大肠杆菌BW28873细胞中，并在37℃下在SOB培养基(Sigma)中培养。wFAP1.1和tmFAP1.1都被0.0004％阿拉伯糖诱导3.5小时。细胞随后用TBS缓冲液洗涤三次，然后在室温下与HBC599(1％ DMSO)一起孵育超过10分钟。使用流式细胞仪(Melody,BD)根据HBC599和mtagBFP2的荧光信号对细胞进行排序。所有样品都与200nM的HBC599一起孵育相同的时间。每个突变体记录3000个事件用于分析。
结果如图7所示。从图7可以看出在wFAP1.1，tmFAP1.1的HBC结合口袋中引入的突变，所有的突变体相比未突变的蛋白荧光都有明显降低。该结果可以说明本申请的蛋白通过核心区域的氨基酸与HBC分子产生高度特异的、高亲和力的结合，而不是非特异的弱结合。
Claims (10)
1.一种跨膜荧光蛋白，所述跨膜荧光蛋白包括SEQ ID No.:1、SEQ IDNo.:2、SEQ IDNo.:3、SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:5所示的氨基酸序列，或者所述跨膜荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2、SEQ IDNo.:3、SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:5。
2.一种与权利要求1所述的跨膜荧光蛋白相对应的水溶荧光蛋白，所述水溶荧光蛋白包括SEQ ID No.:6、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:8或SEQ IDNo.:9所示的氨基酸序列，或者所述水溶荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo.:6、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:8或SEQ IDNo.:9。
3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的跨膜荧光蛋白或如权利要求2所述的水溶荧光蛋白。
4.一种表达载体，其包含如权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种细胞，其包含如权利要求4所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的细胞，其包括大肠杆菌细胞或人HEK293细胞。
7.如权利要求1所述的跨膜荧光蛋白在细胞膜上的成像和传感中的应用。
8.如权利要求2所述的水溶荧光蛋白在细胞成像和传感中的应用。
9.一种细胞膜成像方法，所述方法包括使用如权利要求1所述的跨膜荧光蛋白。
10.一种细胞成像方法，所述方法包括使用如权利要求2所述的水溶荧光蛋白。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2811734A1 (en) * | 2010-09-21 | 2012-03-29 | Altor Bioscience Corporation | Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same |
| CN102590528A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-18 | 厦门大学 | 一种蛋白相互作用的检测方法 |
| CN112512544A (zh) * | 2018-07-19 | 2021-03-16 | 华盛顿大学 | 蛋白质开关的全新设计 |
| CN114686449A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 复旦大学 | 一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法 |
| CN117106097A (zh) * | 2022-05-23 | 2023-11-24 | 华东理工大学 | 一种rna-蛋白质复合物及其应用 |
| CN117126817A (zh) * | 2016-04-21 | 2023-11-28 | 里昂高等师范学院 | 用于选择性地调节细胞的不同亚型的活性的方法 |
-
2024
- 2024-03-15 CN CN202410300103.3A patent/CN118108809A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2811734A1 (en) * | 2010-09-21 | 2012-03-29 | Altor Bioscience Corporation | Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same |
| CN102590528A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-07-18 | 厦门大学 | 一种蛋白相互作用的检测方法 |
| CN117126817A (zh) * | 2016-04-21 | 2023-11-28 | 里昂高等师范学院 | 用于选择性地调节细胞的不同亚型的活性的方法 |
| CN112512544A (zh) * | 2018-07-19 | 2021-03-16 | 华盛顿大学 | 蛋白质开关的全新设计 |
| CN114686449A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 复旦大学 | 一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法 |
| CN117106097A (zh) * | 2022-05-23 | 2023-11-24 | 华东理工大学 | 一种rna-蛋白质复合物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 钱红梅: "新型融合荧光蛋白IEGFP作为荧光指示分子的应用初探", 硕士电子期刊，基础科学专辑, no. 2022, 15 April 2022 (2022-04-15) * |
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