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CN118063624A - 一种重组人生长激素融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种重组人生长激素融合蛋白及其应用 Download PDF

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CN118063624A CN202410060002.3A CN202410060002A CN118063624A CN 118063624 A CN118063624 A CN 118063624A CN 202410060002 A CN202410060002 A CN 202410060002A CN 118063624 A CN118063624 A CN 118063624A
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recombinant
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张文学
许辰华
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Abstract

本发明公开一种重组人生长激素融合蛋白及其应用。所述重组人生长激素融合蛋白由人生长激素、连接肽和人IgG4抗体Fc片段突变体组成。本发明同时公开了在哺乳动物细胞中高效表达所述重组人生长激素融合蛋白的载体、宿主细胞及筛选方法。本发明同时公开了所述重组人生长激素融合蛋白与人生长激素受体结合力测定的方法。与非融合人生长激素相比，本发明所述重组人生长激素融合蛋白与人生长激素受体的亲和力提高了5倍，生物活性(细胞增殖活性)提高了3倍以上。在医学应用上，本发明所述重组人生长激素融合蛋白可作为非融合人生长激素的升级产品。

Description

一种重组人生长激素融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种治疗性重组蛋白质药物，具体涉及一种重组人生长激素融合蛋白及其应用。
背景技术
人生长激素(human growth hormone，hGH)是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素。脑垂体在下丘脑生长激素释放因子的刺激下释放生长激素，通过血液运输到各个器官组织。hGH的受体遍及人的全身，因此生长激素能够影响几乎所有的组织类型和细胞。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化、调节蛋白质/糖类/脂肪的代谢等。hGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞膜上特异性受体结合后，改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。
临床上hGH主要用于治疗侏儒症，近年来的研究发现hGH还能治疗烧伤、创伤、骨折及骨质疏松等多种疾病。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老及心血管疾病治疗方面也有潜在的广泛用途。
hGH是由191个氨基酸组成的亲水性单链蛋白，其相对分子量约为22kD，等电点为4.9，分子内存在两对二硫键，分别位于Cys53与Cys165之间和Cys182与Cys189之间。生长激素的种属特异性很强。传统临床应用的生长激素是从人脑的垂体中提取，临床上难以获得规模产品。1985年美国FDA首次批准基因重组技术生产的重组hGH用于临床治疗和使用，其需求量和销售额在基因工程药物中排前列。其后人们开始用哺乳类细胞表达重组人生长激素，该制剂的氨基酸序列与人天然生长激素完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌，故无污染的危险，同时减少了抗原性。近年来，人们又不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、家兔、山羊、牛等表达人生长激素，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵后处理繁琐、难以工业化生产等问题。
二、人IgGFc融合蛋白
Fc融合蛋白是将人抗体IgG的Fc段作为融合伴侣,将功能性蛋白与Fc的氨基酸序列融合而成。Fc与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)结合避免被降解及融合蛋白较大不易被肾小球滤过,致使融合蛋白能显著延长血浆半衰期,在人体中的半衰期可到13天。所述功能蛋白可以是细胞因子、短肽、毒素、酶和蛋白性激素等。制备的Fc融合蛋白不仅能保留功能蛋白分子的生物学活性,还能实现FcγR等介导的生物学效应。Fc融合蛋白技术操作灵活、产物均一稳定、表达量高且易于纯化和质量控制。依那西普(etanercept)是美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一个肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factorreceptor,TNFR)药物、也是目前最成功的Fc融合蛋白,由人类TNFR-2(p75TNFR)的胞外部分与人IgG1的Fc段相连形成，在治疗类风湿性关节炎等方面效果显著。目前有数十种Fc融合蛋白在临床应用或试验中。
人IgG抗体分子共有4个亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各亚型在抗原结合、免疫复合物的形成、补体激活、触发效应细胞、半衰期和胎盘转运等方面均具有特异性。其中IgG4具有独特的生物学特性。IgG4是一种具有两个铰链区半胱氨酸的四聚物分子(H2L2)，结构上与IgG1相似，但它可以进行重链交换(Fab-arm exchange)而形成单价或双价抗体。功能上IgG4对于大多数FcγR受体具有较弱的亲和力，如FcγRII和FcγRIII；而且它还缺乏激活补体的能力，比如IgG4对于C1q的亲和力比其他亚型偏低。在体内,由于Fab臂交换使得IgG4典型特征是单价有效，阻止抗体形成免疫复合体。这些性质使得IgG4呈现相对“非炎症性的”特征，更适合用于Fc融合蛋白。
新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)是由一条重链和一条轻链非共价结合组成的异二聚体。重链的结构类似MHCⅠ类分子，具有一个胞浆尾段、一个跨膜区以及α1、α2、α3三个胞外功能段。三个胞外功能段与轻链(β2微球蛋白)共同构成FcRn。血管内皮是FcRn介导IgG再循环的主要部位，包含IgG在内的细胞外液被细胞非特异性胞饮后，与含有FcRn的酸性内体融合，暴露于酸性环境中的IgG与FcRn结合形成复合物，随后出芽形成不含其他蛋白质的微泡并返回细胞膜，接触弱碱性的血浆时，IgG从FcRn上释放进入血液循环，因此IgG比其他类型的抗体具有更长的半衰期。
研究发现，在成年人的一些吸收性上皮组织细胞(如肺脏、肾脏和小肠上皮细胞)上仍然表达、分布着FcRn，这些FcRn受体可以和人IgG抗体的Fc片段结合，结合后的抗体一方面可以抵抗酶的降解、延长其体内半衰期；另一方面，这些上皮细胞上的FcRn结合IgG抗体后，能够通过受体依赖的细胞转运(transcytosis)机制将结合的IgG抗体分子从细胞的一侧转运到细胞的另一侧。这种受体依赖的细胞转运机制的发现提示含有Fc片段的蛋白质分子经吸入/喷雾(经肺脏)或口服(经小肠上皮)后，可以经过上皮细胞转运到体内，并进入血流。
三、人生长激素突变体及融合蛋白
在“野生型人生长激素突变体(CN103509102A)”专利申请中，发明者突变了野生型生长激素氨基酸序列的第16位、第116位、第119位和第127位氨基酸，此突变体的生物学活性约为野生型的8倍。但这四点突变的组合体改变了生长激素的天然构型，临床上长期使用有可能引发人体的免疫反应。
在“高糖基化人生长激素融合蛋白及其制备方法与用途(CN106256835A)”专利申请中，发明者设计了一种由人生长激素、柔性肽接头、至少一个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端刚性肽和人免疫球蛋白Fc片段依次构成。其中Fc片段包括IgG1Fc突变体(Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser)、IgG2Fc突变体(Pro331Ser或Pro331Ser/Thr250Gln/Met428Leu)或IgG4Fc突变体(Ser228Pro、Leu235Ala)。
在“一种长效重组人生长激素融合蛋白及其工程细胞(CN110256575B)”专利中，发明者公布了由N端至C端依次为人生长激素、连接肽、IgGFc片段的融合蛋白。
在“高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用(CN112239760A)”专利申请中，发明者公布了一种按大肠杆菌密码子偏性优化的人生长激素和信号肽表达基因，并在大肠杆菌中进行了重组表达与纯化。
在“重组人生长激素Fc融合蛋白和用途及其工程细胞株(CN112661858A)”专利申请中，发明者公布了由人生长激素、连接肽和Fc片段组成的融合蛋白。其Fc片段为变体：1)至少含有以下两个突变的IgG1Fc：Leu234Ala，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro以及删除C末端Lys；2)至少含有以下两个突变的IgG2Fc：Asn297Ala，Val308Pro，Pro331Ser以及删除末端Lys；3)至少含有以下两个突变的IgG4Fc：至少含有Ser228Pro，Glu233Pro，Leu234Ala或者Leu234Val，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro和Arg409Lys以及删除C末端Lys的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。
虽然有如上的一些hGH融合蛋白及突变体，考虑到hGH在临床使用中具有低龄化(儿童)、长期性(数年)等特点，仍有必要进一步开发高生物活性、长半衰期、低副作用的hGH产品，以满足低剂量、低使用频次、高安全性的临床要求。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种重组人生长激素融合蛋白。
本发明的第一个目的是提供一种重组人激素融合蛋白，所述的融合蛋白生长依次含有人生长激素、连接肽和人IgG4 Fc突变体，所述的人IgG4 Fc突变体含有S228P、E233P、L234A、M252Y、S254T和T256E突变位点，并去除末端赖氨酸(K447)。
进一步的，所述连接肽的氨基酸序列为1～3组GGGGS。
进一步的，所述的重组人生长激素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
Fc融合蛋白的一个生物学特点由Fc片段体现，与单克隆抗体中Fc段功能类似，融合蛋白的Fc段可以起到延长功能蛋白在血浆内的半衰期、提高分子的稳定性、特异性结合体内的Fc受体、并发挥相应的生物学功能等作用。除此之外，Fc段可以特异性结合proteinA，简化了Fc融合蛋白的纯化步骤，在相关生物制品的研发制备具有重要意义。
人体内的免疫球蛋白依赖于Fc段与FcRn的结合，在FcRn的保护下，半衰期可以长达19-2天。与此类似，Fc融合蛋白也能依赖此原理延长在体内的半衰期：Fc段与FcRn的结合呈pH依赖性，在pH7.4的生理条件下，FcRn与Fc不结合；在细胞内涵体pH 6.0～6.5的酸性条件下，两者结合，从而避免了融合蛋白在细胞内被溶酶体等快速降解。除此之外，Fc段能够增大分子体积，降低肾清除率，也从一定程度上延长了半衰期。Fc融合蛋白可以通过Fc铰链区的二硫键链接形成稳定的二聚体。通过对二硫键进行进一步的基因工程改造，还可以使Fc融合蛋白形成更加稳定的六聚体复合物。另外，Fc区域可以独立折叠，保证了分子的稳定性。
本发明所设计并成功制备的重组人生长激素融合蛋白为人生长激素通过连接肽与人抗体IgG4的突变体依次连接而成，即所述融合蛋白氨基酸链依次为人生长激素、连接肽和人IgG4Fc突变体，所述的人IgG4 Fc突变体含有S228P、E233P、L234A、M252Y、S254T和T256E突变位点，并去除了末端赖氨酸(K447)。此融合蛋白在制备过程中自发形成同源二聚体，使其分子具有更高的稳定性；在进入人体后，一方面此同源二聚体融合蛋白与FcRn受体结合，实现胞内-胞外的再循环，另一方面，由于其大分子量减少了肾小球滤除，使其在人体内具有更长的血浆半衰期。
在某一个特殊的实施例中，发明者进行了重组人生长激素融合蛋白编码基因的设计与合成。按高生物活性、长半衰期、低副作用的目标，本发明设计的重组人生长激素融合蛋白由人生长激素通过连接肽与人抗体IgG4的突变体依次连接而成，即所述融合蛋白氨基酸链依次为人生长激素、连接肽和人IgG4 Fc突变体，所述的人IgG4 Fc突变体含有S228P、E233P、L234A、M252Y、S254T和T256E突变位点，并去除了末端赖氨酸(K447)。此融合蛋白在制备过程中自发形成同源二聚体，使其分子具有更高的稳定性；在进入人体后，一方面此同源二聚体融合蛋白与FcRn受体结合，实现胞内-胞外的再循环，另一方面，由于其大分子量减少了肾小球滤除，使其在人体内具有更长的血浆半衰期。
进一步地，所述重组人生长激素融合蛋白的人抗体IgG Fc片段选择自IgG4亚类。人IgG抗体分为4种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。不同亚类具有不同的免疫功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的同种型特异性结合是基于对不同免疫细胞上Fc受体的选择性以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在各种同种型中，Fcγ受体对IgG1和IgG3的相对亲和力较高，然而和IgG4的亲和力较低。
本发明的第二个目的是提供编码前述重组人生长激素融合蛋白的DNA序列。
在某一个特殊的实施例中，将编码人生长激素、连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)和人抗体IgG4 Fc突变体片段的核苷酸序列连接后，获得编码hGH和Fc融合蛋白的核苷酸序列，然后按人类(Homo sapiens)氨基酸密码子偏性进行密码子调整，获得优化的hGH和Fc融合蛋白编码序列。全基因合成了编码所设计hGH和Fc融合蛋白的cDNA序列(ZJ518)。
进一步的，所述DNA序列如SEQ ID No.2所示：
ATGGCTACAGGCTCCCGGACCTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCCTGAGTAGGTTGTTCGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCTACACCCAGCAACAGAGAGGAGACACAACAGAAATCCAACCTGGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCTTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCAAACCCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCCGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACTTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTCGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGTCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTATTCCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCTTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA
本发明的第三个目的是提供一种重组表达质粒载体，所述重组表达质粒载体包含如前述的DNA序列。
进一步的，所述重组表达质粒载体的基础载体为pUC57质粒，将所述DNA序列插入pL101质粒的HindIII/EcoRⅠ酶切位点间；
优选的，将所述DNA序列的5’端连接Kozak序列后，插入pL101质粒的HindIII/EcoRⅠ酶切位点间。
本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如前述的重组表达质粒载体。
进一步的，所述宿主细胞为CHO的衍生细胞株。
本发明的第五个目的是提供前述的重组人生长激素融合蛋白或前述的DNA序列或前述的重组表达质粒载体或前述的宿主细胞在制备治疗和/或预防人生长激素低下以及由人生长激素低下导致的疾病的药物中的应用。
在某个特殊的实施例中，所述药物能够作为生长激素替代剂或生长激素强化补充剂。
本发明技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：
与非融合人生长激素相比，本发明所述重组人生长激素融合蛋白与人生长激素受体的亲和力提高了5倍，生物活性(细胞增殖活性)提高了3倍以上，提示其具有长半衰期、低副作用的特点，能够满足医学上对人生长激素低剂量、低使用频次、高安全性的技术要求。
附图说明
图1为pL101质粒图谱。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1重组人生长激素融合蛋白编码基因的设计与合成
按高生物活性、长半衰期、低副作用的目标，本发明设计的重组人生长激素融合蛋白由人生长激素通过连接肽与人抗体IgG4的突变体依次连接而成，即所述融合蛋白氨基酸链依次为人生长激素、连接肽和人IgG4Fc突变体，所述的人IgG4Fc突变体含有S228P、E233P、L234A、M252Y、S254T和T256E突变位点，并去除了末端赖氨酸(K447)。此融合蛋白在制备过程中自发形成同源二聚体，使其分子具有更高的稳定性；在进入人体后，一方面此同源二聚体融合蛋白与FcR受体结合，实现胞内-胞外的再循环，另一方面，由于其大分子量减少了肾小球滤除，使其在人体内具有更长的血浆半衰期。
进一步地，所述连接肽氨基酸序列为1-3组GGGGS，其中G为甘氨酸(Glycine)，S为丝氨酸(Serine)，即连接肽可以是GGGGS、GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，优化地，连接肽选取GGGGSGGGGSGGGGS。
进一步地，所述重组人生长激素融合蛋白的人抗体IgGFc片段选择自IgG4亚类。人IgG抗体分为4种亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。不同亚类具有不同的免疫功能，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，以及补体依赖细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的同种型特异性结合是基于对不同免疫细胞上Fc受体的选择性以及结合C1q和活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在各种同种型中，Fcγ受体对IgG1和IgG3的相对亲和力较高，然而和IgG4的亲和力较低。
将编码人生长激素、连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)和人抗体IgG4Fc突变体片段的核苷酸序列连接后，获得编码hGH和Fc融合蛋白的核苷酸序列，然后按人类(Homosapiens)氨基酸密码子偏性进行密码子调整，获得优化的hGH和Fc融合蛋白编码序列(如SEQ ID NO.2所示)。
为后续表达载体构建的需要和提高其在哺乳动物细胞的表达水平，在所优化的hGH和Fc融合蛋白编码序列的5’端加入HindIII限制性内切酶酶切位点(AAGCTT)和Kozak序列(Kozak consensus sequence)(GCCACCATGG)，3’端加入EcoRⅠ限制性内切酶酶切位点(GAATTC)。
采用全基因合成技术合成此含酶切位点、Kozak序列的完整hGH和Fc融合蛋白cDNA编码序列(命名为ZJ518，SEQ ID NO.3所示)，并克隆至pUC57质粒上，经DNA测序验证后，获得重组克隆质粒pUC57/ZJ518。
SEQ ID NO.3所示ZJ518序列为：
AAGCTTGCCACCATGGATGGCTACAGGCTCCCGGACCTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCT
GCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCCTGAGTAGGTT
GTTCGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCA
GGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCA
GACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCTACACCCAGCAACAGAGAGGAGACACAAC
AGAAATCCAACCTGGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCTTGGCTGGAGC
CCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGC
AACGTCTATGACCTCCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCAAACCCTGATGGGGAGGCT
GGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACA
CAAACTCACACAACGATGACGCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGG
AAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGG
CAGCTGTGGCTTCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCG
AGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCAT
CCGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGG
TCACTTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTAC
GTCGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACA
GCACATACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAG
GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTTCCTCCATCGAGAAAACCATCTC
CAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGTCAGGAA
GAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGA
CATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACACCT
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTATTCCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCTTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGAGAATTC
实施例2ZJ518重组表达载体的构建
将pUC57/ZJ518克隆载体用HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收约1500bp左右的目的基因片段。同时用HindⅢ/EcoRⅠ双酶切pL101表达质粒，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收9kb左右载体片段。将胶回收产物用T4DNA连接酶2～8℃连接过夜，然后转化TG1感受态，挑选6个克隆进行质粒小量抽提质粒，酶切鉴定后将此重组表达质粒命名为pL101/ZJ518。
所用pL101表达质粒由本实验室构建，利用谷氨酰胺合成酶(GlutamineSynthetase,GS)作为筛选标记，能够在哺乳细胞内高水平表达目的基因。pL101质粒的DNA序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其图谱如图1所示。
实施例3ZJ518表达细胞株的建立与纯化
用PureLink HiPure Plasmid DNA Purification Kits试剂盒大量制备实施例2构建的pL101/ZJ518质粒，取40μg质粒用PVU1限制性内切酶进行线性化。将此线性化质粒电转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1细胞株，转染后分别将细胞悬液加入20块96孔细胞培养板，次日加入终浓度为20μM蛋氨酸二甲基代砜(MethionineSulfoximine，MSX)的选择培养基选择性培养2周，之后进行斑点杂交(Dot-blot)分析，将高表达hGH的细胞逐级转至6孔细胞培养板扩增培养，随后转至50ml摇瓶，在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。定量ELISA检测并选择表达量高的细胞株，扩大培养后从培养上清中亲和层析纯化目的蛋白，检测NR-CE、R-CE、iCIEF、SEC和MASS分子量。此纯化的hGH和Fc融合蛋白命名为ZJ518，序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例4ZJ518与人生长激素受体的亲和力检测
本发明采用两种方法检测ZJ518与人生长激素受体达到亲和力。
(一)表面等离子体共振技术(Surfaceplasmonresonance，SPR)。
采用CM5芯片偶联人生长激素受体作为分析物，检测其与实施例3制备的ZJ518及对照品结合的亲和力，对照品为商品化的重组人生长激素。CM5芯片表面偶联hGHR，之后检测分析物ZJ518及对照品与芯片表面hGHR的动力学亲和力。分析物浓度设置范围为0.3125-20μg/ml，7个浓度，2倍比稀释，采用多循环动力学方法进行检测，样品间做再生处理。ZJ518实际分析浓度为0.625-20μg/ml，对照品实际分析浓度为0.3125-5μg/ml(对应摩尔浓度范围：ZJ518为6.44-206.18nmol/L，对照品为14.20-227.27nmol/L)。
亲和力检测实验结果表明，ZJ518和对照品与hGHR结合的亲和常数KD分别为10-11M和10-10M数量级，具体亲和力结果见下表。结合数据及图谱分析，ZJ518与hGHR的亲和力高于对照品，尤其是ZJ518的解离速率明显低于对照品，符合ZJ518的双价设计(表一)。
表一、SPR分析ZJ518/对照品与hGHR亲和力结果
样品 Ka(1/s) Kd(M/s) KD(M)
ZJ518 6.704E+05 1.191E-05 1.776E-11
对照品 2.753E+05 9.455E-05 3.435E-10
(二)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ZJ518与hGHR的亲和力
96孔酶标板捕获浓度为0.039-10nmol/L的ZJ518及对照品，之后分别与0.5μg/ml、0.2μg/ml的hGHR结合后再加入二抗羊抗鼠(HRP)，通过显色反应的情况来分析抗体与hGHR的亲和力。
结果表明，对照品与hGHR结合的亲和力常数KD为10-9M数量级，ZJ518与hGHR结合的亲和力常数KD为10-10数量级，结合数据及图谱分析，ZJ518与hGHR的亲和力高于对照品，和SPR结果一致(表二)。
表二、ELISA分析ZJ518与hGHR亲和力结果
样品 HGHR浓度 KD(M)
ZJ518 0.5μg/ml 2.47E-10
对照品 0.5μg/ml 4.13E-09
ZJ518 0.2μg/ml 2.67E-10
对照品 0.2μg/ml 4.15E-09
实施例5ZJ518的细胞增殖实验
hGH是生长因子家族成员，主要由脑垂体前叶中的生长激素细胞合成。生长激素受体(GHR)是一种膜结合受体，属于I类细胞因子受体超家族。GH通过与跨膜GHR结合来发挥其生物学作用。生长激素与其受体结合后可诱导细胞分化和成熟，启动细胞内的合成代谢并促进细胞增殖。INS-1为大鼠胰岛瘤细胞，在无血清环境中，GH可诱导INS-1细胞增殖，通过细胞增殖发光显色试剂进行检测，发光强度与GH浓度成正比，用四参数曲线来判定生物活性。
(1)细胞铺板。取对数生产期的大鼠胰岛细胞INS-1细胞，用0.02％EDTA/0.05％Trypsin消化后重悬，1000rpm离心5分钟。弃上清，沉淀用无血清RPMI1640重悬，洗涤两遍后用RPMI1640重悬计数，调整细胞密度为2x104/ml。细胞按50μl/孔加入到96孔细胞培养板中，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
(2)ZJ518和参比品样品起始浓度均为2570nmol/L，用无血清RPMI1640连续4倍稀释至0.01nmol/L。将各稀释度的样品分别加入到上述INS-1细胞孔，每孔50μl。37℃、5％二氧化碳培养箱中培养48小时。
(3)Cell Titer-Luminescent Cell Viability Assay(Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测试剂盒，按试剂盒操作说明书，每孔加入100μl的2倍显色液，混匀后室温避光显色15分钟，用生物发光检测仪进行读数。
(4)数据分析。将发光仪测到的原始数据导入softMax分析软件拟合标准曲线：横坐标为参比品或样品浓度，纵坐标为发光读数，曲线呈“S”型，采用四参数方程回归模型。回归方程为：Y＝(A-D)/(1+(X/C)B)+D。生物活性计算公式：相对生物活性＝参比品EC50(nmol/L)÷y样品EC50(nmol/L)x100％。
(5)结果
本研究所用参比品为丹麦诺和诺德公司的重组人生长激素注射液，批号为202106AGC1，浓度为3.33mg/ml。结果显示，ZJ518生物活性明显高于参比品，其活性是参比品的357％(表三)。
表三、ZJ518与参比品的细胞增殖实验结果比较
样品 EC50(nmol/L) 相对生物活性(％)
ZJ518 9.098 357
参比品 32.494 100
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组人生长激素融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白依次含有人生长激素、连接肽和人IgG4 Fc突变体，所述的人IgG4 Fc突变体含有S228P、E233P、L234A、M252Y、S254T和T256E突变位点，并去除末端赖氨酸(K447)。
2.根据权利要求1所述的重组人生长激素融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为1～3组GGGGS。
3.根据权利要求1所述的重组人生长激素融合蛋白，其特征在于，所述的重组人生长激素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.编码权利要求1所述重组人生长激素融合蛋白的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQ ID No.2所示。
6.一种重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体包含如权利要求3或4所述的DNA序列。
7.根据权利要求6所述的重组表达质粒载体，其特征在于，所述重组表达质粒载体的基础载体为pL101质粒，将所述DNA序列插入pL101质粒的HindIII/EcoRⅠ酶切位点间；优选的，将所述DNA序列的5’端连接Kozak序列后，插入pL101质粒的HindIII/EcoRⅠ酶切位点间。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求5所述的重组表达质粒载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为CHO的衍生细胞株。
10.权利要求1至3任意一项所述的重组人生长激素融合蛋白或权利要求4或5所述的DNA序列或权利要求6或7所述的重组表达质粒载体或权利要求8或9所述的宿主细胞在制备治疗和/或预防人生长激素低下以及由人生长激素低下导致的疾病的药物中的应用。
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