CN118048481A - 一种检测番茄斑萎病抗性的kasp标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测番茄斑萎病抗性的KASP标记引物及其应用，属于分子生物学技术领域，该KASP标记引物包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的KASP‑1‑F、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的KASP‑2‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的KASP‑R。本发明设计的KASP标记引物可实现SlDnaJ番茄斑萎病抗病基因的精准、快速、高通量检测，操作步骤简单、检测高效，为番茄斑萎病抗病番茄种质资源的筛选、种质鉴定提供了简单、快捷、经济、有效的分子工具，可应用于番茄商业化抗病育种及高品质遗传改良应用研究，为番茄斑萎病抗病育种应用提供一种新选择。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测番茄斑萎病抗性的KASP标记引物及其应用。
背景技术
番茄作为世界上栽培和消费最广泛、最重要的蔬菜作物，其产量和品质是影响番茄生产和加工的重要指标。近年来，番茄斑萎病严重影响了番茄产量和品质。目前克隆的Sw-5是番茄中抵抗番茄斑萎病的唯一规模化应用和具有广谱抗性的抗病基因。然而，经过多年广泛应用以及TSWV的进化变异，Sw-5的抗性在高浓度或特异番茄斑萎病毒分离物侵染情况下常被克服或打破，导致番茄品种抗性减弱或丢失。本研究获得的抗病品种对番茄斑萎病表现突出的抗性，且抗性稳定，利用该品种开发分子标记可作为番茄抗病育种中优良的标记性状，用于杂交子代的选育，可大大节约杂交育种过程中的人力和物力。
前期研究已经对番茄斑萎病抗病品种的抗性性状有了深入的调查研究，明确其番茄斑萎病抗性性状受显性单基因控制，并且完成了番茄斑萎病抗病性状基因的遗传定位，且初步完成番茄抗病基因SlDnaJ的克隆和分析研究。利用抗病和感病品种间抗病基因的差异性开发竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(Kompetitive allele specific PCR,KASP)分子标记，可高效检测出未知番茄材料是否表现番茄斑萎病抗性，对番茄商业化抗病育种及高品质遗传改良应用研究方面提供有效技术支持。
目前，未见相关文献报道用于鉴定关联番茄抗病基因SlDnaJ的KASP分子标记。为此，本发明基于突变位点开发了鉴定检测番茄斑萎病抗病番茄品种的KASP分子标记，本发明可高效的对携带番茄抗病基因SlDnaJ纯合品种、感病品种和杂交子代进行鉴定，为提高番茄斑萎病抗病育种应用提供一种新选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测番茄斑萎病抗性的KASP标记引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该KASP标记引物可实现SlDnaJ番茄斑萎病抗病基因的精准、快速、高通量检测，操作步骤简单、检测高效，为番茄斑萎病抗病育种应用提供一种新选择。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测番茄斑萎病抗性的KASP标记引物，所述KASP标记引物包含KASP-1-F、KASP-2-F和KASP-R；所述KASP-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述KASP-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述KASP-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种鉴定番茄斑萎病抗性的检测试剂或检测试剂盒，包含上述的KASP标记引物。
本发明还提供上述的KASP标记引物在制备检测番茄斑萎病抗性的产品中的应用。
进一步地，所述产品包含检测试剂或检测试剂盒。
本发明还提供一种筛选或鉴定番茄斑萎病抗病品种的方法，包括如下步骤：
以待测番茄的基因组DNA为模板，利用上述KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增反应，根据PCR扩增结果对待测番茄进行基因分型。
进一步地，若基因型为AA，待测番茄为番茄斑萎病抗病品种；若基因型为GG，待测番茄为番茄斑萎病感病品种。
本发明还提供上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒在筛选或鉴定番茄斑萎病抗病品种中的应用。
本发明还提供上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒在改良番茄斑萎病抗性中的应用。
本发明还提供上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒在番茄分子标记辅助育种中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明设计的KASP标记引物可实现SlDnaJ番茄斑萎病抗病基因的精准、快速、高通量检测，操作步骤简单、检测高效，为番茄斑萎病抗病番茄种质资源的筛选、种质鉴定提供了简单、快捷、经济、有效的分子工具，可应用于番茄商业化抗病育种及高品质遗传改良应用研究，为番茄斑萎病抗病育种应用提供一种新选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的KASP标记引物在待检测番茄材料中的Flu-Arms检测结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明研究发现番茄SL4.0ch10染色体的第61,445,003位碱基处存在一处SNP突变位点，多态性为G/A。基于突变位点开发了鉴定检测番茄斑萎病抗病番茄品种的KASP标记引物，适用于番茄斑萎病番茄抗病种质资源的筛选、种质鉴定及分子标记辅助育种研究。具体如下：
实施例1
本实施例提供用于检测番茄斑萎病抗病番茄品种的KASP标记引物，所述KASP标记引物包括KASP标记上游引物KASP-1-F、KASP-2-F和KASP-R下游引物，所述KASP-1-F和KASP-2-F的SNP的位点位于番茄SL4.0ch10染色体的第61,445,003位碱基，分子标记多态性为G/A；所述KASP-R位于番茄SL4.0ch10染色体的第61,445,024-61,445,051碱基。
KASP标记引物的序列如下：
KASP-1-F：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAAATAGCTACAATTATGGGTATG-3′(SEQ IDNO：1)；
KASP-2-F：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGAAATAGCTACAATTATGGGTATA-3′(SEQ IDNO：2)；
KASP-R：5′-TGGTAACAATACTTGCAGAACCGCCGGC-3′(SEQ ID NO：3)；
上述KASP标记引物中KASP-1-F包含了HEX荧光接头序列，KASP-2-F包含了FAM荧光接头序列(下划线)；3′末尾加粗的碱基G和A为分型位点。
根据上述设计的引物，依据KASP-1-F和KASP-2-F引物的3′末尾基因型，选择携带番茄抗病基因SlDnaJ的纯合番茄斑萎病抗病番茄品种：R6、R7、H149(记载在文献“石岩,默宁,祁世明,梁燕.2020.番茄斑萎病毒病抗性种质筛选及人工接种鉴定方法优化.中国蔬菜,(06):39-43.”和“Qi,S,Shen,Y,Wang,X,Zhang,S,Li,Y,Islam,M M,Wang,J,Zhao,P,Zhan,X,Zhang,F,Liang,Y.2022.A new NLR gene for resistance to Tomato spottedwilt virus in tomato(Solanum lycopersicum).Theoretical andApplied Genetics,135(5):1493-1509.”中)；纯合番茄斑萎病感病番茄品种：M82、Moneymaker、Ailsa Craig；以M82和R6构建的F1群体和F2(F2-抗病纯合群体、F2-感病纯合群体、F2-抗病杂合群体)群体用于标记鉴定(构建群体方法参照文献“Qi,S,Shen,Y,Wang,X,Zhang,S,Li,Y,Islam,M M,Wang,J,Zhao,P,Zhan,X,Zhang,F,Liang,Y.2022.A new NLR gene for resistance toTomato spotted wilt virus in tomato(Solanum lycopersicum).TheoreticalandApplied Genetics,135(5):1493-1509.”)。
用于检测番茄斑萎病抗病番茄品种的KASP分子标记的方法，具体如下：
S1，提取待测番茄样品的基因组DNA为模板，包括纯合番茄斑萎病感病番茄品种：M82、Moneymaker、Ailsa Craig；纯合番茄斑萎病抗病番茄品种：R6、R7、H149；以M82和R6构建的F1群体和F2(F2-抗病纯合群体、F2-感病纯合群体、F2-抗病杂合群体)群体；阴性对照无菌双蒸水(ddH2O)。
S2，用KASP标记上游引物KASP-1-F、KASP-2-F和下游引物KASP-R对S1中提取的待测番茄样品的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增反应；
扩增反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为：5μL FLu-Arms 2x PCR Mix(FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V4试剂盒，广州固德生物技术有限公司)、2μL DNA模板、0.1μL上游引物KASP-1-F(10μM)、0.1μL上游引物KASP-2-F(10μM)、0.3μL下游引物KASP-R(10μM)、2.5μL无菌ddH2O，离心混匀。
扩增程序：95℃预变性10min；降落PCR 95℃变性15s，61→55℃，-0.6℃/循环，60s，10个循环；扩增，95℃变性15s，55℃延伸60s，28个循环。常规PCR扩增结束后仪器设定30℃30s进行荧光信号读板检测。
S3，检测结果判断。
本实施例中具体的试验试剂、设备和试验方法为：
1、KASP检测试剂盒：
FLU-ARMS for KASP 2x PCR Mix V4试剂盒由广州固德生物技术有限公司提供，无菌ddH2O为双蒸水121℃高压灭菌25min。
2、KASP检测设备：用BIO-RAD CFX 96实时荧光定量PCR仪进行检测。
结果如图1所示，纯合番茄斑萎病感病番茄材料M82、Moneymaker和Ailsa Craig各3株、F2-感病纯合群体367株均位于左上部检测位，荧光信号范围FAM(1914.33-2011.94)、HEX(2374.04-2613.37)；纯合番茄斑萎病抗病番茄材料R6、R7和H149各3株、F2-抗病纯合群体387株均位于右下部检测位，荧光信号范围FAM(2157.77-2483.01)、HEX(2175.40-2290.56)；杂合番茄斑萎病抗病番茄材料F1群体3株和F2-抗病杂合群体769株均位于中上部检测位，荧光信号范围FAM(2001.01-2245.46)、HEX(2316.07-2606.00)，检出率为97.34％。
结果显示，纯合番茄斑萎病感病番茄品种M82、Moneymaker、Ailsa Craig与F2-感病纯合群体荧光信号一致，均为绿色荧光型号标记(HEX)，基因型为GG。纯合番茄斑萎病抗病番茄品种R6、R7、H149与F2-抗病纯合群体荧光信号一致，均为黄色荧光型号标记(FAM)，基因型为AA。而F1群体和F2-抗病杂合群体检测结果为蓝色信号标记(HEX-FAM)，则基因型为AG。实验结果证实，本实施例提供的KASP标记引物能够准确鉴定番茄斑萎病抗病番茄品种，为番茄抗斑萎病种质资源筛选提供了简单、快捷、经济、有效的分子工具。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测番茄斑萎病抗性的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物包含KASP-1-F、KASP-2-F和KASP-R；所述KASP-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述KASP-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述KASP-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种鉴定番茄斑萎病抗性的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的KASP标记引物。
3.如权利要求1所述的KASP标记引物在制备检测番茄斑萎病抗性的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包含检测试剂或检测试剂盒。
5.一种筛选或鉴定番茄斑萎病抗病品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测番茄的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增反应，根据PCR扩增结果对待测番茄进行基因分型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，若基因型为AA，待测番茄为番茄斑萎病抗病品种；若基因型为GG，待测番茄为番茄斑萎病感病品种。
7.如权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒在筛选或鉴定番茄斑萎病抗病品种中的应用。
8.如权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒在改良番茄斑萎病抗性中的应用。
9.如权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒在番茄分子标记辅助育种中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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