CN118020643B - 一种野蕉胚的再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属农业生物技术领域，涉及一种野蕉胚的再生方法，包括外植体的消毒与取材、胚萌发诱导、不定芽分化和增殖、生根培养、炼苗移栽等步骤。本发明以抽蕾坐果后约80～100天左右的新鲜野蕉果实的种子胚为外植体进行组织培养，采用先诱导后分化的两步诱导萌发的方式不经过愈伤组织阶段便可高效分化不定芽，具有较好的萌发分化效果和较高的分化率，为后续的增殖培养、生根培养奠定基础，所需原材料少，遗传性状稳定，变异小，具有分化速度快，操作简单、成本低、生长快速等特点，是一种较为高效的野蕉无菌快繁方法，为野蕉的资源保护、生态恢复和发掘利用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属农业生物技术领域，涉及一种野蕉繁育方法，具体是一种以野蕉种子胚作为外植体进行组织培养的再生方法。
背景技术
野蕉(Musa balbisiana Colla)是芭蕉科芭蕉属，高大草本植物，产于中国云南西部、广西、广东，亚洲南部、东南部亦有分布。野蕉是许多香蕉品种两个主要祖先基因来源之一，其野生基因型(BB)对枯萎病及病虫害具有高度抗性，因此野蕉种质资源是现代生物技术育种的重要宝藏，其中包括抗性基因的分离克隆、基因转化和原生质体融合等技术的应用。野蕉为解决枯萎病及病虫害并生产出具有优良农艺性能的香蕉作物提供了重要基因和材料资源。因此，野蕉资源的系统考察、收集、鉴定、保护和利用的意义重大。
自然条件下，野蕉的常规繁殖方式为幼芽及地下茎繁殖，但其繁殖速度慢、周期长，易受多种因素限制。由于环境和人为多种因素，目前野蕉植株的数量正在锐减，该物种的野生资源极有可能变为濒危植物，采用人工干预手段繁育野蕉植株已成为保护野蕉资源的重要途径之一。有研究者利用组培技术通过将80％成熟度的野蕉种子胚经100mg/L的ZT处理24h后，培养70d得到不定芽，但其萌发率仅为34.33％，萌发率较低并且没有进行植株再生的相关实验。
发明内容
本发明的目的是提供一种野蕉胚的再生方法，以野蕉种子胚为外植体进行组织培养，诱导萌发直接分化不定芽，经过不定芽增殖、生根、移栽等过程，可在短时间内获得性状一致的组培苗，省去愈伤组织这一阶段，更加高效，为后续的增殖分化、提高分化率奠定基础。
本发明所采用的技术方案：
一种野蕉胚的再生方法，其步骤如下：
1.外植体的消毒与取材：取抽蕾坐果后80～100天的新鲜野蕉果实，消毒灭菌后于无菌条件下取出种子胚作为外植体。
2.胚萌发诱导：将获取的无菌外植体按照种子胚正常生长发育的方向垂直放至诱导培养基中进行前期不定芽萌发诱导培养，培养7～10d，培养条件：温度为25～27℃，在黑暗中进行培养；所述诱导培养基：改良MS培养基+6BA 15～20mg/L+IAA 175～200μg/L+VC10～15mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite 3g/L，pH值为5.8。
3.不定芽分化和增殖：将经过前期诱导的外植体转入分化与增殖培养基中进行培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～12h/d；培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的分化与增殖培养基继续增殖培养；所述分化与增殖培养基：改良MS培养基+6BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8。
4.生根培养：待不定芽生长至2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d，培养30d后形成良好根系，获得完整植株；所述生根培养基：改良White培养基+NAA 0.1～1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为5.8。
5.炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗7～10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫65～75％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
所述改良MS培养基是在MS培养基的基础上，调整微量元素的含量为原含量的2倍，并添加CH(水解酪蛋白)200mg/L，其它成分不变。
所述改良White培养基是在White培养基的基础上，调整无机盐的含量为原含量的0.6倍，并添加活性炭0.5g/L，其它成分不变。
优选地，所述野蕉种子胚的取出过程：先在流动自来水下清洗完整无破损的果皮，晾干后用75％酒精表面消毒5～8min，再用无菌水冲洗2～3次，备用；在无菌条件下，沿着果棱纵向切开果皮，完整分离种子，在种子顶端珠孔位置的侧下方纵向切开，得到无菌种子胚。
优选地，所述腐殖土是野蕉成林的林下腐殖土。
本发明以野蕉种子胚为外植体进行组织培养，采用先诱导后分化的两步诱导萌发的方式直接分化不定芽，省去愈伤组织这一阶段，具有较好的萌发分化效果和较高的分化率，为后续的增殖培养、生根培养奠定基础，所需原材料少，遗传性状稳定，变异小，具有分化速度快，操作简单、成本低、生长快速等特点，是一种较为高效的野蕉无菌快繁方法，为野蕉的资源保护、生态恢复和发掘利用奠定基础。
附图说明
图1是野蕉种子胚的培养流程图。A，抽蕾坐果后约80～100天的野蕉种子胚；B，诱导萌发13d后的野蕉种子胚；C，生长至2～3cm的不定芽；D，生根培养30d后的组培苗。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例所采用的各阶段培养基，均是以改良MS培养基或改良White培养基为基础培养基，在不同的阶段，相应地添加不同的成分，如激素、碳源等。
改良MS培养基是在MS培养基的基础上，调整微量元素的含量为原含量的2倍，并添加CH(水解酪蛋白)200mg/L，其它成分不变。
改良White培养基是在White培养基的基础上，调整无机盐的含量为原含量的0.6倍，并添加活性炭0.5g/L，其它成分不变。
一、野蕉种苗繁育
实施例一
1.外植体的消毒与取材：于2023年5月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取抽蕾坐果后约80～100天左右的新鲜野蕉果实，在流动自来水下清洗完整无破损的果皮，晾干后用75％酒精表面消毒5min，在酒精消毒过程中注意用纸巾配合擦拭，再用无菌水冲洗2次，备用。在无菌条件下，用尖嘴手术刀沿着果棱纵向切开果皮，完整分离种子备用。在解剖镜下用尖嘴手术刀在种子顶端珠孔位置的侧下方纵向切开，取发育成熟的无菌种子胚(如图1的A所示)作为外植体。
2.胚萌发诱导：将获取的无菌外植体按照种子胚正常生长发育的方向垂直放至诱导培养基(改良MS+6BA 18mg/L+IAA 180μg/L+VC 10mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite 3g/L，pH值为5.8)中进行前期不定芽萌发诱导培养，培养10d，培养条件：温度为27℃，在黑暗中进行培养。
3.不定芽分化和增殖：将经过前期诱导萌发的外植体转入分化与增殖培养基(改良MS+6BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化和增殖培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为1000lx，光照时间为12h/d。培养30d后获得大量的丛生芽(如图1的B所示)，更换新的分化与增殖培养基，切分丛生芽继续增殖培养。
4.生根培养：待不定芽生长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离(如图1的C所示)，接种到生根培养基(改良White+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为1600lx，光照时间为12h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株(如图1的D所示)。
5.炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗7d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土(野蕉成林的林下腐殖土)的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫75％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
实施例二
1.外植体的消毒与取材：于2023年6月上旬在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取抽蕾坐果后约80～100天左右的新鲜野蕉果实，在流动自来水下清洗完整无破损的果皮，晾干后用75％酒精表面消毒5min，在酒精消毒过程中注意用纸巾配合擦拭，再用无菌水冲洗3次，备用。在无菌条件下，用尖嘴手术刀沿着果棱纵向切开果皮，完整分离种子备用。在解剖镜下用尖嘴手术刀在种子顶端珠孔位置的侧下方纵向切开，取发育成熟的无菌种子胚作为外植体。
2.胚萌发诱导：将获取的无菌外植体按照种子胚正常生长发育的方向垂直放至诱导培养基(改良MS+6BA 15mg/L+IAA 200μg/L+VC 12mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite 3g/L，pH值为5.8)中进行前期不定芽萌发诱导培养，培养7d，培养条件：温度为26℃，在黑暗中进行培养。
3.不定芽分化和增殖：将经过前期诱导萌发的外植体转入分化与增殖培养基(改良MS+6BA 3mg/L+NAA 0.06mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化和增殖培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d。培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的分化与增殖培养基，切分丛生芽继续培养。
4.生根培养：待不定芽生长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基(改良White+NAA 0.8mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为24℃，光照强度为2000lx，光照时间为11h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。
5.炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土(野蕉成林的林下腐殖土)的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫65％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
实施例三
1.外植体的消毒与取材：于2023年6月下旬在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取抽蕾坐果后约80～100天左右的新鲜野蕉果实，在流动自来水下清洗完整无破损的果皮，晾干后用75％酒精表面消毒5min，在酒精消毒过程中注意用纸巾配合擦拭，再用无菌水冲洗3次，备用。在无菌条件下，用尖嘴手术刀沿着果棱纵向切开果皮，完整分离种子备用。在解剖镜下用尖嘴手术刀在种子顶端珠孔位置的侧下方纵向切开，取发育成熟的无菌种子胚作为外植体。
2.胚萌发诱导：将获取的无菌外植体按照种子胚正常生长发育的方向垂直放至诱导培养基(改良MS+6BA 20mg/L+IAA 190μg/L+VC 15mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite 3g/L，pH值为5.8)中进行前期不定芽萌发诱导培养，培养8d，培养条件：温度为25℃，在黑暗中进行培养。
3.不定芽分化和增殖：将经过前期诱导萌发的外植体转入分化与增殖培养基(改良MS+6BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化和增殖培养，培养条件：温度为24℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d。培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的分化与增殖培养基，切分丛生芽继续培养。
4.生根培养：待不定芽生长到2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基(改良White+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。
5.炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗8d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土(野蕉成林的林下腐殖土)的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
对比试验：
对照例一：以MS培养基作为基本培养基，添加KH2PO4200 mg/L、Morel维生素。以抽蕾坐果后约80～100天的成熟野蕉种子胚作为外植体进行分化、增殖、生根培养。
对照例二：以MS培养基作为基本培养基，添加2,4-D 2mg/L、KH2PO4200 mg/L、Morel维生素。以抽蕾坐果后约80～100天的成熟野蕉种子胚作为外植体进行分化、增殖培养。
对照例三：以MS培养基作为基本培养基，添加Picloram 2.0mg/L、KH2PO4200 mg/L、Morel维生素。以抽蕾坐果后约80～100天的成熟野蕉种子胚作为外植体进行分化、增殖培养。
二、组织培养效果鉴定
1.野蕉种子胚萌发不定芽分化效果鉴定
为鉴定野蕉种子胚萌发不定芽分化效果，对上述实施例、对照例中野蕉种子胚的分化情况、不定芽数进行观测与统计，计算诱导率。结果见表1。
表1种子胚不定芽分化效果
上述野蕉种子胚萌发不定芽诱导分化效果表明，与未经诱导直接以野蕉抽蕾坐果80～100d的成熟种子胚直接分化不定芽的分化方式、分化出不定芽的外植体数相比，本发明采用先诱导后分化的两步诱导萌发的方式，以改良MS培养基进行先诱导后分化，在不经过愈伤组织的情况下，能有效地降低分化时间，缩短育苗周期，提高不定芽的分化数量，诱导率达87％以上，具有非常好的诱导分化效果。
2.不定芽增殖效果鉴定
为鉴定不定芽的增殖效果，对上述实施例、对照例的不定芽的增殖情况进行观察和统计。30d后统计增殖数，计算增值系数，结果见表2。
表2不定芽的增殖效果
上述不定芽增殖效果表明，本发明以改良MS培养基进行增值培养，增殖系数达到6.0以上，增殖效果明显。对照例一中所得不定芽，虽然具有一定的增值效果，但其芽形较差，还出现畸形，不利于后续的培养，对照例二、对照例三都难以分化正常不定芽，更不能实现增殖。
3.不定芽生根效果鉴定
为鉴定不定芽的生根效果，对上述实施例、对照例一增殖获得的不定芽生根情况进行观察和统计。15d后统计生根数，计算生根率，结果见表3。
表3不定芽生根效果
| 项目 | 不定芽数 | 生根数 | 生根率 | 根系形态 |
| 实施例一 | 200 | 200 | 100％ | 粗壮、完整 |
| 实施例二 | 200 | 200 | 100％ | 粗壮、完整 |
| 实施例三 | 200 | 200 | 100％ | 粗壮、完整 |
| 对照例一 | 35 | 13 | 37.1％ | 纤弱、不完整 |
| 对照例二 | 0 | —— | —— | |
| 对照例三 | 0 | —— | —— |
上述不定芽生根效果表明，本发明以改良White培养基对不定芽进行生根诱导，在短时间内(30d左右)诱导出完整根系，生根率达100％，生根快，根系粗壮、发达，有利于提高生根苗移栽成活率以及植株生长，对照一因其芽形较差，能够有效诱导出的根系比较纤弱，且不完整，不有利于生根苗移栽成活以及植株生长。
4.生根苗苗圃移栽效果鉴定
为鉴定生根苗的移栽成活效果，对上述实施例、对照例的生根苗苗圃移栽生长情况进行观察，移栽40天后统计成活数，计算成活率，结果见表4。
表4生根苗苗圃移栽效果
| 项目 | 生根苗数 | 成活数 | 成活率 |
| 实施例一 | 200 | 187 | 93.5％ |
| 实施例二 | 200 | 192 | 96.0％ |
| 实施例三 | 200 | 190 | 95.0％ |
| 对照例一 | 13 | 5 | 38.5％ |
| 对照例二 | 0 | —— | —— |
| 对照例三 | 0 | —— | —— |
上述移栽效果表明，本发明以诱导出良好根系的生根苗进行苗圃移栽，以椰糠和腐殖土的混合物为栽培基质，具有较高的生根苗移栽成活率，达到93％以上，可为野蕉的资源保护、生态恢复和发掘利用奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种野蕉胚的再生方法，其特征在于，其步骤如下：
1)外植体的消毒与取材：取抽蕾坐果后80～100天的新鲜野蕉果实，消毒灭菌后于无菌条件下取出种子胚作为外植体；
2)胚萌发诱导：将获取的无菌外植体按照种子胚正常生长发育的方向垂直放至诱导培养基中进行前期不定芽萌发诱导培养，培养7～10d，培养条件：温度为25～27℃，在黑暗中进行培养；所述诱导培养基：改良MS培养基+6-BA 15～20mg/L+IAA 175～200μg/L+VC 10～15mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite 3g/L，pH值为5.8；
3)不定芽分化和增殖：将经过前期诱导的外植体转入分化与增殖培养基中进行培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～12h/d；培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的分化与增殖培养基继续增殖培养；所述分化与增殖培养基：改良MS培养基+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L，pH值为5.8；
4)生根培养：待不定芽生长至2～3cm时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d，培养30d后形成良好根系，获得完整植株；所述生根培养基：改良White培养基+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为5.8；
5)炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗7～10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫65～75％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物；
所述改良MS培养基是在MS培养基的基础上，调整微量元素的含量为原含量的2倍，并添加CH200 mg/L，其它成分不变；
所述改良White培养基是在White培养基的基础上，调整无机盐的含量为原含量的0.6倍，并添加活性炭0.5g/L，其它成分不变。
2.根据权利要求1所述的再生方法，其特征在于：所述野蕉种子胚的取出过程：先在流动自来水下清洗完整无破损的果皮，晾干后用75％酒精表面消毒5～8min，再用无菌水冲洗2～3次，备用；在无菌条件下，沿着果棱纵向切开果皮，完整分离种子，在种子顶端珠孔位置的侧下方纵向切开，得到无菌种子胚。
3.根据权利要求1所述的再生方法，其特征在于：所述腐殖土是野蕉成林的林下腐殖土。
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