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CN118006597A - 一种改变细胞中dna的靶向部位的方法以及用于该方法的复合体 - Google Patents

一种改变细胞中dna的靶向部位的方法以及用于该方法的复合体 Download PDF

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CN118006597A
CN118006597A CN202410165335.2A CN202410165335A CN118006597A CN 118006597 A CN118006597 A CN 118006597A CN 202410165335 A CN202410165335 A CN 202410165335A CN 118006597 A CN118006597 A CN 118006597A
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dna
cell
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complex
cells
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西田敬二
近藤昭彦
荒添贵之
吉冈伸
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Kobe University NUC
Original Assignee
Kobe University NUC
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Abstract

本发明提供一种方法，其为改变细胞所具有的DNA的靶向部位的方法，其包括以下的工序：用诱导该细胞中内在的DNA修饰酶的因子刺激该细胞的工序，以及通过使可与选择出的DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体与该DNA接触，从而使得该靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入于该靶向部位的工序。

Description

一种改变细胞中DNA的靶向部位的方法以及用于该方法的复 合体
本申请是申请日为2018年3月20日、申请号为201880020115.3(国际申请号为PCT/JP2018/011198)、名称为“利用细胞内在性的DNA修饰酶将靶向化的DNA的核酸碱基特异地替换的、细胞的核酸序列的替换方法、以及用于该方法的分子复合体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种核酸序列的改变方法以及用于该方法的核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体，该核酸序列的改变方法可在不向细胞内导入外因性的DNA修饰酶以及编码其的核酸的状态下，改变细胞内的靶DNA的特定区域内的核酸碱基。
背景技术
近年来，作为在各种各样的生物物种中将目的基因·基因组区域进行改变的技术，基因组编辑受人注目。以往，关于基因组编辑的技法，提出了一种利用人工核酸酶的方法，该人工核酸酶通过将具有非序列依赖性的DNA切断能力的分子与具有序列识别能力的分子进行组合而得到(非专利文献1)。
例如，报道有以下的方法：使用锌指核酸酶(ZFN)，在宿主的植物细胞或昆虫细胞中在DNA的靶向基因座进行重组的方法，其中，所述锌指核酸酶(ZFN)通过将锌指(zincfinger)DNA结合结构域与非特异性的DNA切断结构域连结而得到(专利文献1)；
使用转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease、TALEN)，在特定的核苷酸序列内或相邻于其的部位，将靶基因切断·修饰的方法，其中，所述TALEN通过将植物病原菌黄单胞菌属(xanthomonas)所具有的DNA结合模块即转录激活因子样(TAL)效应物与DNA内切核酸酶(endonuclease)连结而得到(专利文献2)；
或者，利用CRISPR-Cas9系统的方法，其中，所述CRISPR-Cas9系统通过将真细菌(eubacteria)或古细菌所具有的在获得性免疫系统中发挥功能的DNA序列CRISPR(Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats、成簇的规律间隔短回文重复序列)和、与CRISPR一起具有重要作用的核酸酶Cas(CRISPR-associated)蛋白质家族进行组合而得到(专利文献3)等。另外，最近，作为CRISPR-Cas系统的新的内切核酸酶，报告有Cpf1(非专利文献2)。此外，也报告有一种使用将PPR蛋白质与核酸酶连结而得到的人工核酸酶，在该特定序列的近旁切断靶基因的方法，其中，所述PPR蛋白质构成为：通过由35个氨基酸构成并且识别1个核酸碱基的PPR基序的连续，从而识别特定的核苷酸序列(专利文献4)。
此外，最近，本发明人等报告了以下内容：使用对脱氨化反应进行催化的脱氨酶，通过将该脱氨酶与具有DNA序列识别能力的分子连结而得到的复合体导入于宿主细胞，从而在包括酵母或大肠杆菌在内的各种生物物种中，在不伴随着DNA双链切断(double-stranded DNA breaks、DSB)的状态下，成功地通过在包含特定的DNA序列的区域中的核酸碱基替换而改变基因组序列(专利文献5、非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第4968498号公报
专利文献2：日本特表2013-513389号公报
专利文献3：日本特表2010-519929号公报
专利文献4：日本特开2013-128413号公报
专利文献5：国际公开第2015/133554号
非专利文献
非专利文献1：Kelvin M Esvelt,Harris H Wang(2013)Genome-scaleengineering for systems and synthetic biology,Molecular Systems Biology 9：641
非专利文献2：Bernd Zetsche et al.(2015)Cpf1 Is a Single RNA-GuidedEndonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System,Cell 163：759-771
非专利文献3：Nishida Keiji et al.(2016)Targeted nucleotide editingusing hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems,Science 6：353(6305)
发明内容
发明所要解决的课题
但是，迄今为止提出的上述基因组编辑技术是以将外因性的DNA修饰酶导入于细胞为前提，但是存在因使用该外因性的DNA修饰酶导致的细胞毒性等副作用或、该DNA修饰酶向细胞内或靶DNA部位的传递(delivery)的问题。因此，本发明的目的在于提供新型的DNA编辑的技法特别是基因组编辑的技法、以及用于此技法的核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体，所述DNA编辑的技法可通过利用细胞内在性的DNA修饰酶从而提高安全性，另外可避免传递的制约。
用于解决课题的手段
本发明人等通过制作一种复合体并将该复合体导入于细胞内，在诱导该DNA修饰酶的因子的存在下培养了该细胞，该复合体使将目的DNA序列靶向化的核酸序列识别模块具有与细胞内在性的DNA修饰酶结合的功能。其结果，不使用外因性的DNA修饰酶的情况下，成功地将突变导入至目的基因的靶核苷酸序列以及其近旁。
本发明人等基于这些见解而进一步反复进行研究，结果完成本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种方法，其为改变细胞所具有的DNA的靶向部位的方法，其包括以下的工序：
用诱导该细胞中内在的DNA修饰酶的因子刺激该细胞的工序，以及
使可与选择出的DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体，与该DNA接触，从而使得该靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入于该靶向部位的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中，在不切断前述DNA的至少一条链的状态下进行前述靶向部位的改变。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述核酸序列识别模块选自由Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统、锌指基序(zinc finger motif)、TAL效应物以及PPR基序组成的组。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，前述核酸序列识别模块是Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述DNA修饰酶结合模块选自由针对DNA修饰酶的抗体、肽适体以及核酸适体组成的组。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述DNA修饰酶结合模块是选自由Vif、Bet蛋白质、TopoIIβ、IQGAP2以及ZNF335以及它们的片段(fragment)组成的组中的至少1种。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，前述DNA修饰酶结合模块的靶酶是脱氨酶。
[8]根据[7]所述的方法，其中，前述脱氨酶是属于APOBEC家族的蛋白质。
[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，由核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体，进一步结合了碱基切除修复的抑制因子(inhibitor)。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，诱导前述DNA修饰酶的因子是选自由干扰素(interferon)、琥珀酸脱氢酶阻碍剂以及低氧条件组成的组中的1个以上。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，通过将编码该复合体的核酸导入于前述细胞，培养该细胞而在细胞内表达该复合体，从而进行前述DNA与前述复合体的接触。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，用诱导DNA修饰酶的因子刺激细胞，是通过在该因子的存在下培养该细胞来进行的。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，前述细胞为脊椎动物细胞。
[14]根据[13]所述的方法，其中，前述脊椎动物细胞为哺乳类动物细胞。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的方法，其中，前述DNA为双链DNA。
[16]一种复合体，其为可与DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体，该核酸序列识别模块是Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统，使该靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入于该靶向部位。
[17]一种核酸，其编码[16]所述的复合体。
[18]一种DNA的靶向部位的改变剂，其含有[16]所述的复合体或者[17]所述的核酸。
[19]一种方法，其为改变细胞所具有的双链DNA的靶向部位的方法，其包括以下的工序：
用诱导该细胞中内在的DNA修饰酶的因子刺激该细胞的工序，以及
通过使可与选择出的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块与该双链DNA进行接触，从而使得该靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入于该靶向部位的工序。
发明效果
根据本发明的DNA编辑，由于在DNA的修饰反应中不使用外来因子，因而降低副作用风险。另外，可将在DNA编辑中使用的构建体进行小型化，可提高传递效率。进一步，通过利用细胞中内在的DNA修饰酶，从而可利用瞬时作用而调节活性，可降低脱靶作用的风险。
附图说明
图1表示在实施例中使用的本发明的DNA的靶向化部位的改变方法的机理的示意图。图1中，IFN表示干扰素(是作为抗病毒因子诱导特定的防御基因表达的因子)，IFN诱导型的内在性脱氨酶表示利用IFN被表达诱导的抗病毒性的脱氨酶组(Apobec等)，dVif(Vif的突变体)表示与内在性脱氨酶进行结合的衔接蛋白(adapter protein)。
图2表示实施例中使用的DNA编辑用质粒的示意图。
图3表示实施例中使用的DNA编辑用质粒的示意图。
具体实施方式
本发明提供，通过利用细胞中内在的(本说明书中，亦称为“细胞内在性的”)DNA修饰酶，将该细胞内的DNA中的靶核苷酸序列以及其近旁的核苷酸替换为其它的核苷酸等等，改变该DNA的该靶向部位的方法(以下，亦称为“本发明的方法”)。此处“细胞中内在的”、“细胞内在性的”指该细胞生来具有。
本发明的方法的特征在于，其包括以下的工序：
用诱导细胞内在性的DNA修饰酶的因子(以下，亦称为“DNA修饰酶诱导因子”)刺激该细胞的工序，以及
通过使可与该DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体(以下，亦称为“本发明的复合体”)，在该细胞内与该DNA接触，从而将该靶向部位、即将靶核苷酸序列以及其近旁的核苷酸替换为其它的核苷酸等工序。
在本发明中，所谓DNA的“改变”指：DNA链上的某个核苷酸(例如dC)，被替换为其它的核苷酸(例如dT、dA、dG或dU)，或缺失，或者在DNA链上的某个核苷酸间插入核苷酸或者核苷酸序列。此处，被改变的DNA，只要是细胞所具有的(即，细胞内存在的)DNA则没有特别限制，可以是细胞内在性的DNA(例如，染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA；以下，亦将它们总括而称为“基因组DNA”)，或者也可以是外来的DNA(例如，源自被细胞感染了的病毒的DNA)。另外，前述DNA可以是单链DNA、双链DNA中的任一个，优选为双链DNA。作为双链DNA，优选举出基因组DNA。另外，所谓DNA的“靶向部位”指，核酸序列识别模块特异性地识别而结合的“靶核苷酸序列”的全部或者一部分、或者其与该靶核苷酸序列的近旁(5’上游以及3’下游中的任一方或两方)。另外，所谓“靶核苷酸序列”指DNA中的核酸序列识别模块所结合的序列。
在本发明中所谓“DNA修饰酶”指可修饰DNA的细胞内在性的酶，利用该修饰直接地或间接地产生DNA的改变。作为这样的DNA的修饰反应，举出：切断DNA的单链或双链的反应(以下，亦称为“DNA链切断反应”)、不直接伴随DNA链的切断的反应、即将核酸碱基的嘌呤或嘧啶环上的取代基替换为其它的基团或原子的反应(以下，亦称为“核酸碱基替换反应”)(例：碱基的脱氨基化反应)、将DNA的N-糖苷键水解的反应(以下，亦称为“脱碱基反应”)等。
在本发明中，所谓“DNA修饰酶诱导因子”指，可直接或者间接地提高细胞内在性的DNA修饰酶的表达的分子、及/或可将该DNA修饰酶进行活性化的因子(除了包括分子之外，还包括氧浓度、光、紫外线、温度、酸、碱等的物理化学性刺激等)。只要具有这样的功能，本发明的方法中使用的DNA修饰酶诱导因子就没有特别限制，例如举出蛋白质(包括肽，以下相同。)(例：转录因子、干扰素(IFN)、白细胞介素、丝裂原(Mitogen)等)、低分子化合物等。关于DNA修饰酶诱导因子，可使用市售品，也可使用利用公知的方法制作出的产品。
所谓干扰素(IFN)是指，在动物体内细胞对病原体(特别是病毒)或肿瘤细胞等异物的侵入做出反应而分泌的蛋白质，通过用IFN刺激细胞，从而诱导抗病毒蛋白质(例：属于APOBEC(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like、载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样)家族的蛋白质等)的表达。作为本发明中使用的干扰素没有特别限定，但是举出I型干扰素(例：IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ)、II型干扰素(例：IFN-γ)、III型干扰素(例：IFN-λ)等，特别优选I型干扰素，其中优选IFN-α以及IFN-β。干扰素可以是天然型也可以是基因重组型，也可以是结合了聚乙二醇(PEG)等高分子体而得到的PEG化干扰素。在使用干扰素的情况时，宿主细胞与作为干扰素的来源的生物优选为相同(例如，在使用人细胞的情况时，优选使用人干扰素)。另外，也可使用诱导IFN的产生的因子。作为相关的因子，举出病毒等的(疑似的)感染、疫苗、外来的DNA或RNA、双链RNA类似物(double stranded RNA analog)[poly(I：C)](例如，Trapp S1,et al.,(2009)J.Virol,83(2)：884-895)、干扰素基因的刺激因子(stimulator)、TANK结合激酶1(TANK-bindingkinase 1)等。
作为本发明中使用的白细胞介素，例如举出已知可诱导属于APOBEC家族的蛋白质(以下略记为“APOBEC”。)(特别是属于APOBEC3家族的蛋白质(以下略记为“APOBEC3”。))、即可提高该蛋白质的表达及/或活性的IL-2、IL-7、IL-15、IL-27等。
作为本发明中使用的丝裂原，例如举出已知可诱导APOBEC(特别是APOBEC3)的佛波酯(phorbol ester)(例：佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate、PMA)、植物血凝素(PHA)等)(例如，Stopak S.Kim,et al.,(2007)J.Biol Chem.,282(6)：3539-3546；Rose KM1,et al.,(2004)J.Biol Chem.,279(40)：41744-41749)等。
作为本发明中使用的低分子化合物，例如举出已知可诱导APOBEC(特别是APOBEC3)的在日本特开2011-231053号公报中记载的化合物、国际公开第2016-164889号公报中记载的琥珀酸脱氢酶的阻碍剂(例：Atpenin A5、丙二酸盐、二氮嗪(DZX)、苹果酸盐以及草酰乙酸盐、3-硝基丙酸、硝酰基(nitroxyl)、萎锈灵(carboxin)、TTFA等)等。
DNA修饰酶诱导因子不限定于它们，本领域技术人员可根据成为标靶的DNA修饰酶的种类适宜使用公知的蛋白质或化合物、物理化学性刺激等。DNA修饰酶诱导因子可仅使用1种，也可使用2种以上(例如，并用干扰素与琥珀酸脱氢酶的阻碍剂，并用干扰素与低氧条件等)。
用DNA修饰酶诱导因子刺激细胞的方法没有特别限制，例如举出在DNA修饰酶诱导因子的存在下培养细胞的方法。具体而言，可通过向用于培养细胞的培养基或缓冲液中添加DNA修饰酶诱导因子，或者在该因子为低氧等物理化学性刺激的情况时，可通过在存在该刺激的条件下培养细胞，从而进行。或者，也举出将编码DNA修饰酶诱导因子的核酸(优选为DNA)导入于细胞内，在该细胞内表达该因子的方法。
对开始用DNA修饰酶诱导因子刺激细胞的时机也没有特别限制，例如，通过将编码该复合体的核酸导入于该细胞来进行细胞内的靶DNA与本发明的复合体的接触的情况时，可以是该导入工序之前、之后、以及同时中的任一个。本发明的方法，可通过调整用DNA修饰酶诱导因子刺激细胞的期间，从而调整产生DNA的修饰反应的期间。因此，通过DNA的修饰反应产生，仅在固定靶向部位的改变所必需的期间用DNA修饰酶诱导因子刺激细胞，从而可一边避免宿主基因组中的脱靶作用的风险，一边可高效地实现靶序列的编辑。从刺激细胞期间的调整的容易性的观点考虑，优选在DNA修饰酶诱导因子的存在下培养该细胞的方法(例如，DNA修饰酶诱导因子为蛋白质、低分子化合物等时，将该因子添加于培养基或缓冲液中的方法)。添加于培养基或缓冲液中的期间，虽然因宿主细胞的种类或培养条件、成为标靶的DNA修饰酶的种类等而不同，但是在要改变的DNA为细胞内在性的DNA的情况时，通常必需经由至少数个世代的细胞分裂，因而认为2-3天左右是必需的。另一方面，在要改变的DNA是外来DNA的情况时，通常不需要经由细胞分裂，因而与细胞内在性的DNA的情况相比较，可缩短期间。本领域技术人员可基于所使用的培养条件等适宜确定适合的表达诱导期间。
添加于培养基的DNA修饰酶诱导因子的含量，只要进行靶DNA的改变就没有特别限制。在使用干扰素作为DNA修饰酶诱导因子的情况时，可优选成为10～100000IU(国际单位)、更优选成为100～20000IU、进一步优选成为500～5000IU地添加于培养基。另外，在使用ApteninA5作为DNA修饰酶诱导因子的情况时，可优选成为0.5μΜ～10μΜ、更优选成为1μΜ～3μΜ地添加于培养基。本领域技术人员可基于所使用的DNA修饰酶诱导因子、细胞的种类、培养条件等适宜确定优选的含量或效价(力価)等。
另一方面，作为DNA修饰酶诱导因子为物理化学性刺激的优选的一个例子，举出低氧条件。例如报告有属于APOBEC家族的蛋白质可在暴露于低氧条件的情况下进行活性化(例如，国际公开第2016-164889号公报)。作为将细胞暴露于低氧条件的方法，例如举出在低氧状态的气氛下培养细胞的方法等。此处所谓“低氧状态”指是低于大气中的氧浓度的氧浓度。作为相关的氧浓度，例如为15％以下，优选为10％以下，更优选为5％以下，进一步优选为1％以下，另外优选为0.1％以上。
或者，在将编码DNA修饰酶诱导因子的核酸(优选为DNA)导入于细胞内，于该细胞内表达该因子时，可与后述的编码核酸序列识别模块及/或DNA修饰酶结合模块的核酸同样地操作，导入于细胞内。在使用编码DNA修饰酶诱导因子的DNA时，通过将该DNA置于诱导性的调节区域的控制下，从而可通过在培养细胞的培养基或缓冲液中，添加及/或去除可将该调节区域进行活性化的物质，从而调整该细胞内的DNA修饰酶诱导因子的表达期间，由此可以调整产生DNA的修饰反应的期间。作为该“诱导性的调节区域”，可同样地使用关于编码本发明的复合体的核酸的表达调节而后述的调节区域。
在本发明中所谓“核酸序列识别模块”指具有将DNA链上的特定的核苷酸序列(即靶核苷酸序列)特异性地识别并结合的能力的分子或分子复合体。通过使核酸序列识别模块结合于靶核苷酸序列，从而介由连结于该模块的DNA修饰酶结合模块，可以使得细胞内在性的DNA修饰酶特异性地起作用于DNA的靶向部位。
在本发明中所谓“DNA修饰酶结合模块”指具有与DNA修饰酶结合的能力的分子或分子复合体。
本发明的复合体是，包含上述核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块连结而得到的复合体而成的、被赋予了特定的核苷酸序列识别能力以及与细胞内在性的DNA修饰酶相结合的结合能力的分子复合体。此处，“复合体”不仅仅包括由多个分子构成的复合体，而且也包括如融合蛋白质那样在单一的分子内具有核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体。
在本发明中，成为DNA修饰酶结合模块要结合的标靶的细胞内在性的DNA修饰酶(以下，亦称为“靶酶”)没有特别限制，例如举出核酸酶(例：内切核酸酶、外切核酸酶等)、重组酶(recombinase)、DNA旋转酶、DNA聚合酶、DNA拓扑异构酶、端粒酶、转座酶、脱氨酶、DNA糖基化酶(DNA glycosylase)等。从减轻细胞毒性的观点考虑，DNA的改变优选利用不切断双链DNA中的至少一条链的反应(例：DNA上的核酸碱基替换反应、脱碱基反应)来进行，而不是利用双链DNA链的切断反应来进行。作为对核酸碱基替换反应、脱碱基反应进行催化的DNA修饰酶，例如举出：对将氨基替换为羰基的脱氨化反应进行催化的、属于核酸/核苷酸脱氨酶超级家族的脱氨酶，对DNA的N-糖苷键的水解进行催化的DNA糖基化酶(例：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、氧代鸟嘌呤糖基化酶、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(例：酵母3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶(MAG1))等)等。作为优选的脱氨酶，举出：可分别将胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶替换为尿嘧啶或胸腺嘧啶的胞苷脱氨酶、可将腺嘌呤替换为次黄嘌呤的腺苷脱氨酶、可将鸟嘌呤替换为黄嘌呤的鸟苷脱氨酶等。作为胞苷脱氨酶，更优选举出APOBEC。人的方面，作为APOBEC，包括：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3(例：APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D(APOBEC3E)、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H)、APOBEC4、在脊椎动物的获得性免疫中将突变导入于免疫球蛋白(immunogloblin)基因的酶即活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase、AID)等。
本发明的方法中使用的DNA修饰酶结合模块，只要可与如上所述那样的细胞内在性的DNA修饰酶结合，则没有特别限制，例如举出针对成为标靶的DNA修饰酶的抗体、肽适体、核酸适体、其它的结合于DNA修饰酶的蛋白质等。DNA修饰酶结合模块可根据成为标靶的DNA修饰酶的种类而适宜选择。这些DNA修饰酶结合模块可利用与成为标靶的DNA修饰酶结合为公知的物质，或者，也可利用通过下述的方法制作出的分子。编码DNA修饰酶结合模块的DNA，可以以成为目的的DNA修饰酶结合模块的氨基酸序列、核酸序列的信息为基础，适宜制作。
本发明的方法中使用的抗体，可以为多克隆抗体以及单克隆抗体中的任一个，抗体中也包括抗体片段(例：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等)。抗体可利用公知的免疫学技法制作。肽适体是由氨基酸构成的适体，并且与抗体同样地是可结合于特定的靶分子的肽分子。关于肽适体，可基于噬菌体展示法或细胞表层展示法(例如，Whaley,S.R.,et al.,(2000),Nature,405,665-668)进行筛选和制作。核酸适体是由RNA、DNA、修饰核苷酸或它们的混合物构成的适体。关于适体，可按照公知的方法(例如，Ellington et al.,(1990),Nature，346，818-822；Tuerk et al.,(1990)Science，249，505-510)进行筛选和制作。
作为结合于DNA修饰酶的蛋白质，例如举出已知结合于APOBEC(特别是，APOBEC3)的人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIVmac)的Vif(Virion InfectivityFactor、病毒颗粒感染性因子)、泡沫病毒(foamy virus)的Bet(Bromodomain and extra-terminal、溴结构域和超末端)蛋白质、TopoIIβ(Topoisomerase 2-beta、拓扑异构酶2-β)、IQGAP2、ZNF335(别称：NIF1)、CD81、MLL、APOBEC3G的C末端(第196-384氨基酸残基)(例如，Schumacher,April Jean,Ph.D.,UNIVERSITY OF MINNESOTA,(2008)199,pages；3313466)、它们的片段(以下，只要没有特别的预先说明，则在蛋白质中也包括其片段)等，但是不限定于它们。这些蛋白质也可实施改变(有时会将被改变了的蛋白质称为蛋白质的“突变体”)。例如，关于Vif，由于已知与E3泛素连接酶(ubiquitin ligase)复合体结合，促进APOBEC3的蛋白质分解(例如，Stanley et al.(2008)Journal of virology,8656-8663；Guo et al.(2014)Nature,55,229-233)，因而使用Vif的情况时，优选实施使得对APOBEC3以外的蛋白质的结合性发生缺损的改变。作为这样的改变，例如举出使得Vif蛋白质(refseq号：AAF20197)的N末端的数个(例如，11个、10个、9个、8个、7个等)氨基酸发生缺失，且将第145亮氨酸残基取代为其它的氨基酸残基(例如，丙氨酸残基)等，但是不限定于这些改变。即使在使用除了Vif以外的蛋白质的情况时，也可基于蛋白质的功能、与靶分子的结合部位、立体结构等而适宜地实施改变。关于上述蛋白质的片段，只要具有与DNA修饰酶结合的结合区域就没有特别限制，例如举出通过将与DNA修饰酶的结合区域以外的区域(例如，具有蛋白质的催化活性的区域)去除而得到的片段等。作为相关的片段，具体举出由TopoIIβ(refseq号：NP_001059)的第452～591氨基酸残基构成的肽、由IQGAP2(refseq号：NP_006624)的第466～547氨基酸残基构成的肽、由ZNF335(refseq号：NP_071378)的第745～893氨基酸残基构成的肽等，但是它们只是例示，只要是本领域技术人员就可适宜地设计片段。另外，如由后述的实施例表示的那样，即使在组合了IQGAP2与ZNF335的情况时，也示出了靶向部位被改变的情况(表2)，因而也可将上述的结合于DNA修饰酶的蛋白质组合而使用。
在本发明中，所谓“碱基切除修复”是生物所具有的DNA修复机制中的1个，意味着通过利用酶将碱基发生了损伤的部分切下而再次接合，从而修复碱基的损伤的机制。关于具有损伤的碱基的切除，利用将DNA的N-糖苷键水解的酶即DNA糖基化酶而进行，利用AP内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等碱基切除修复(BER)路径的下游的酶而对利用该酶进行脱碱基反应的结果生成的没有碱基的部位(apurinic/apyrimidic(AP)site、无嘌呤/无嘧啶(AP)位点)进行处理。作为参与这些BER路径的基因或蛋白质，举出UNG(NM_003362)、SMUG1(NM_014311)、MBD4(NM_003925)、TDG(NM_003211)、OGG1(NM_002542)、MYH(NM_012222)、NTHL1(NM_002528)、MPG(NM_002434)、NEIL1(NM_024608)、NEIL2(NM_145043)、NEIL3(NM_018248)、APE1(NM_001641)、APE2(NM_014481)、LIG3(NM_013975)、XRCC1(NM_006297)、ADPRT(PARP1)(NM_0016718)、ADPRTL2(PARP2)(NM_005484)等(括弧内表示登记了各个基因(cDNA)的碱基序列信息的refseq号。)，但是不受限于它们。
在本发明中所谓“碱基切除修复的抑制因子”指，通过阻碍上述BER路径中的任一个阶段，或阻碍该BER路径中被动员的分子的表达自身，在结果上阻碍BER的物质。关于本发明中使用的碱基切除修复的抑制因子，只要是在结果上阻碍BER的抑制因子则没有特别限制，但是从效率的观点考虑，优选位于BER路径的上游的DNA糖基化酶的阻碍剂。作为本发明中使用的DNA糖基化酶的阻碍剂，举出胸腺嘧啶DNA糖基化酶的阻碍剂、尿嘧啶DNA糖基化酶的阻碍剂、氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的阻碍剂、烷基鸟嘌呤DNA糖基化酶的阻碍剂等，但是不受限于它们。例如，在DNA修饰酶结合模块的靶酶为胞苷脱氨酶的情况时，由于会阻碍由突变生成的DNA的U：G或G：U错配的修复，因而使用尿嘧啶DNA糖基化酶的阻碍剂是合适的。
作为这样的尿嘧啶DNA糖基化酶的阻碍剂，举出源自作为枯草杆菌(Bacillussubtilis)噬菌体(bacteriophage)的PBS1的尿嘧啶DNA糖基化酶阻碍剂(UGI)、或源自作为枯草杆菌噬菌体的PBS2的尿嘧啶DNA糖基化酶阻碍剂(UGI)(Wang,Z.,and Mosbaugh,D.W.(1988)J.Bacteriol.170,1082-1091)，但是不受限于这些，只要是上述DNA的错配的修复阻碍剂，就可用于本发明。特别是，关于源自PBS2的UGI，由于亦知难以引起DNA上的从C到T以外的突变或切断以及重组这样的效果，因而使用源自PBS2的UGI是合适的。
如上所述，在碱基切除修复(BER)机制中，利用DNA糖基化酶切除碱基时，AP内切核酸酶将切口(nick)加入于无碱基部位(AP部位)，进一步利用外切核酸酶将AP部位完全地切除。AP部位被切除时，DNA聚合酶以相反链的碱基为模板新制作碱基，最后DNA连接酶将切口填埋而完成修复。已知，失去了酶活性但是保持着与AP部位的结合能力的突变AP内切核酸酶会竞争性地阻碍BER。因此，这些突变AP内切核酸酶也可作为本发明的碱基切除修复的抑制因子使用。突变AP内切核酸酶的来源没有特别限制，例如可使用源自大肠杆菌、酵母、哺乳动物(例：人、小鼠、猪、牛、马、猴等)等的AP内切核酸酶。例如，人Ape1的氨基酸序列可参照UniprotKB No.P27695。作为失去了酶活性但是保持着与AP部位的结合能力的突变AP内切核酸酶的例子，举出作为活性位点或辅因子的Mg结合位点发生了突变的蛋白质。例如，人Ape1的情况时，举出E96Q、Y171A、Y171F、Y171H、D210N、D210A、N212A等。
利用本发明的复合体的核酸序列识别模块而被识别的DNA中的靶核苷酸序列，只要该模块可特异性地结合，就没有特别限制，可以是DNA中的任意的序列。关于靶核苷酸序列的长度，只要对核酸序列识别模块特异性地结合充分的即可，根据靶DNA的尺寸，例如为12个核苷酸以上，优选为15个核苷酸以上，更优选为18个核苷酸以上。长度的上限没有特别限制，优选为25个核苷酸以下，更优选为22个核苷酸以下。
作为本发明的复合体的核酸序列识别模块，例如，除了可使用Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统(以下，亦称为“CRISPR-突变Cas”)、锌指基序、TAL效应物以及PPR基序等之外，还可使用：包含限制性内切酶、转录因子、RNA聚合酶等可与DNA特异性地结合的蛋白质的DNA结合结构域、并且不具有DNA双链切断能力的片段等，但不限定于它们。优选举出CRISPR-突变Cas、锌指基序、TAL效应物、PPR基序等。
锌指基序是使3～6个Cys2His2型的不同的锌指单元(1指识别约3个碱基)进行连结而得到的锌指基序，可识别9～18个碱基的靶核苷酸序列。可利用Modular assembly法(Nat Biotechnol(2002)20：135-141)、OPEN法(Mol Cell(2008)31：294-301)、CoDA法(NatMethods(2011)8：67-69)、大肠杆菌one-hybrid法(Nat Biotechnol(2008)26：695-701)等公知的技法而制作锌指基序。关于锌指基序的制作的详细情况，可参照上述专利文献1。
TAL效应物具有以约34个氨基酸为单元的模块的重复结构，利用1个模块的第12以及13氨基酸残基(被称作RVD)而确定结合稳定性与碱基特异性。由于各模块的独立性高，因而可仅通过将模块进行接合，制作对靶核苷酸序列特异性的TAL效应物。关于TAL效应物，确立了利用了开放资源(open resource)的制作方法(REAL法(Curr Protoc Mol Biol(2012)Chapter 12：Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol(2012)30：460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res(2011)39：e82)等)，可比较简便地设计针对靶核苷酸序列的TAL效应物。TAL效应物的制作的详细情况可参照上述专利文献2。
PPR基序被构成为通过由35氨基酸构成并且识别1个核酸碱基的PPR基序的连续而识别特定的核苷酸序列，仅以各基序的第1、4以及ii(-2)的氨基酸而识别靶碱基。对基序构成没有依赖性，没有来自两侧的基序的干涉，因而与TAL效应物同样地，可仅通过将PPR基序进行接合，从而制作对靶核苷酸序列特异性的PPR蛋白质。PPR基序的制作的详细情况可参照上述专利文献4。
另外，使用限制性内切酶、转录因子、RNA聚合酶等的片段的情况时，由于这些蛋白质的DNA结合结构域是众所周知的，因而可容易地设计、构建包含该结构域且不具有DNA双链切断能力的片段。
上述任一个核酸序列识别模块，在上述DNA修饰酶结合模块为蛋白质时，也可以以与其的融合蛋白质的形式提供，或者，也可使SH3结构域、PDZ结构域、GK结构域、GB结构域等蛋白质结合结构域和它们的结合伴侣(binding partner)，分别与核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块融合，介由该结构域与其结合伴侣的相互作用，以蛋白质复合体的形式提供。或者，也可使内含肽(intein)分别与核酸序列识别模块和DNA修饰酶结合模块融合，利用各蛋白质合成后的连接(ligation)，将两者进行连结。
包含核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体(包括融合蛋白质。)而成的本发明的复合体与DNA的接触，优选通过将编码该复合体的核酸导入于具有目的DNA(例：基因组DNA)的细胞从而实施。
因此，核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块，优选以编码它们的融合蛋白质的核酸的形式制备，或者，优选以可利用结合结构域、内含肽等而翻译为蛋白质之后在宿主细胞内形成复合体那样的形态，以分别编码它们的核酸的形式制备。此处核酸可以是DNA也可以是RNA，但优选为DNA。在DNA的情况时，优选为双链DNA，以在宿主细胞内在功能性的启动子的控制下配置的表达载体的形态提供。
核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块结合而得到的本发明的复合体，可进行毒性低的DNA编辑，本发明的基因改变方法可适用于广泛的生物材料。因此，导入有编码核酸序列识别模块及/或DNA修饰酶结合模块的核酸的细胞，也可包括：从作为原核生物的大肠杆菌等细菌、作为下等真核生物的酵母等微生物的细胞到包括人等哺乳动物的脊椎动物、昆虫、植物等高等真核生物的细胞的、所有生物物种的细胞。
编码锌指基序、TAL效应物、PPR基序等核酸序列识别模块的DNA，可利用关于各模块在上面叙述的任一种方法而取得。关于编码限制性内切酶、转录因子、RNA聚合酶等的序列识别模块的DNA，例如可通过基于它们的cDNA序列信息，按照覆盖编码该蛋白质的所期望的部分(即，包含DNA结合结构域的部分)的区域的方式合成低聚DNA引物，使用由产生该蛋白质的细胞制备出的全RNA或者mRNA组分(日语：画分)作为模板，利用RT-PCR法进行扩增，从而克隆。
编码DNA修饰酶结合模块、DNA修饰酶诱导因子或碱基切除修复的抑制因子的DNA，也同样地可通过根据所使用的蛋白质等的cDNA序列信息而合成低聚DNA引物，使用由产生该蛋白质等的细胞制备出的全RNA或者mRNA组分作为模板，利用RT-PCR法而扩增，从而克隆。例如，使用HIV的Vif作为DNA修饰酶结合模块时，编码该蛋白质的DNA，可根据NCBI数据库中登记的cDNA序列(accession No.AF200477)，针对CDS的上游以及下游设计适当的引物，通过从感染HIV的细胞提取出的RNA，利用RT-PCR法进行克隆。
克隆化而得到的DNA，可以原样地、或者根据期望用限制性内切酶消化，或附加适当的连接子(linker)及/或核转运信号(目的DNA为线粒体或叶绿体DNA时，各细胞器转运信号)之后，与编码核酸序列识别模块的DNA连接，从而制备编码融合蛋白质的DNA。在以融合蛋白质的形式表达核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块时，例如可在融合蛋白质的两末端、或核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块之间附加核转运信号。核转运信号没有特别限制，例如举出源自SV40的核转运信号(例：序列号7、序列号9)。
或者，也可以通过分别使编码结合结构域或者其结合伴侣的DNA融合于编码核酸序列识别模块的DNA与编码DNA修饰酶结合模块的DNA，或者也可以通过使编码分离内含肽的DNA融合于各自的DNA，从而使得核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块在宿主细胞内被翻译出来之后，形成复合体。在这些情况时，也可根据期望在各自的DNA的适当的位置处连结连接子及/或核转运信号。
编码核酸序列识别模块的DNA以及编码DNA修饰酶结合模块的DNA(以及在通过将编码DNA修饰酶诱导因子的DNA导入于该细胞内进行表达从而进行该DNA修饰酶诱导因子对细胞的刺激的情况时，编码该因子的DNA；以下，在括弧中记载的情况下相同。)，也可以通过化学性地合成DNA链，或者也可通过将所合成出的部分重叠(overlap)的低聚DNA短链利用PCR法或Gibson Assembly法进行连接，从而构建编码其全长的DNA。利用化学合成或PCR法或者Gibson Assembly法的组合而构建全长DNA的操作的优点在于，可根据导入该DNA的宿主，在CDS全长范围设计使用密码子(使用コドン)。在异种DNA的表达之时，可通过将该DNA序列替换为在宿主生物中使用频率高的密码子，从而期待蛋白质表达量的增大。所使用的宿主中的密码子使用频率的数据，例如可使用Kazusa DNA Research Institute((公財)かずさDNA研究所)的主页中公开的遗传密码(遺伝暗号)使用频率数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)，或者也可参照记述了各宿主中的密码子使用频率的文献。只要参照所获取的数据与想要导入的DNA序列，将在该DNA序列中使用的密码子之中在宿主中使用频率低的密码子，替换为编码相同的氨基酸并且使用频率高的密码子即可。例如，在宿主细胞为人细胞的情况时，可使用在人的密码子使用方面最优化的编码核酸序列识别模块及/或DNA修饰酶结合模块的序列。也可同样地构建编码碱基切除修复的抑制因子的DNA。
包含编码核酸序列识别模块的DNA及/或编码DNA修饰酶结合模块的DNA(及/或编码DNA修饰酶诱导因子的DNA)的表达载体，例如可通过将该DNA连结于适当的表达载体中的启动子的下游从而制造。此外，关于前述表达载体，也可以使之包含编码碱基切除修复的抑制因子的DNA地制造。
作为表达载体，使用源自大肠杆菌的质粒(例：pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)；源自枯草杆菌的质粒(例：pUB110、pTP5、pC194)；源自酵母的质粒(例：pSH19、pSH15)；昆虫细胞表达质粒(例：pFast-Bac)；动物细胞表达质粒(例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；λ噬菌体等噬菌体；杆状病毒(baculovirus)等昆虫病毒载体(vector)(例：BmNPV、AcNPV)；逆转录病毒(retrovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、腺病毒(adenovirus)等动物病毒载体等。
作为启动子，只要是对应在基因的表达中使用的宿主而言恰当的启动子，就可以是任何的启动子。在伴随着DSB的以往方法中，由于毒性而存在宿主细胞的生存率显著降低的情况，因而理想的是事先增加细胞数量直至使用诱导启动子开始诱导为止，但是在诱导作为细胞内在性的DNA修饰酶的不伴随DSB的酶的情况时，即使表达本发明的复合体也可期待充分的细胞增殖，因而组成型启动子也可不受限制地使用。
例如，在宿主为动物细胞的情况时，使用SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒、cytomegalovirus)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒、Rous sarcoma virus)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒、Moloney murine leukemia virus)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶、purified herpesvirus thymidine kinase)启动子等。其中，优选CMV启动子、SRα启动子等。
宿主为大肠杆菌的情况时，优选trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等。
宿主为芽孢杆菌属菌的情况时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。
宿主为酵母的情况时，优选Gal1/10启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
宿主为昆虫细胞的情况时，优选多角体蛋白(polyhedrin)启动子、P10启动子等。
宿主为植物细胞的情况时，优选CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、NOS启动子等。
表达载体可根据期望含有：终止子(例：NOS终止子、豌豆rbcS3A终止子、热冲击(shock)蛋白质(HSP)17.3终止子等)、翻译增强子(translation enhancer)(例：源自水稻的乙醇脱氢酶5’非翻译区域(Os ADH-5’UTR)、源自CaMV、烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列等)、3’调节区域(例：源自水稻的肌动蛋白基因(Act1)3’UTR等)、聚A附加信号、耐药性基因(例：G418耐受性基因(nPtII)、耐潮霉素(hygromycin)性基因(hpt)等)的选择标记等。
编码核酸序列识别模块的RNA及/或编码DNA修饰酶结合模块的RNA(及/或编码DNA修饰酶诱导因子的RNA)，例如可通过以包含上述的编码核酸序列识别模块的DNA及/或编码DNA修饰酶结合模块的DNA(及/或编码DNA修饰酶诱导因子的DNA)的表达载体为模板，利用自身公知的体外转录系统(in vitro transcription system)而转录为mRNA，从而制备。编码碱基切除修复的抑制因子的RNA也可同样地制备。
通过将包含编码核酸序列识别模块及/或DNA修饰酶结合模块的DNA的表达载体导入于宿主细胞，培养该宿主细胞，从而可在细胞内表达核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体。
作为宿主，例如使用埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌、酵母、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。
作为埃希氏菌属菌，例如使用大肠杆菌(Escherichia coli)K12·DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，160(1968)]，大肠杆菌JM103[Nucleic Acids Research，9，309(1981)]，大肠杆菌JA221[Journal of Molecular Biology，120，517(1978)]，大肠杆菌HB101[Journal of Molecular Biology，41，459(1969)]，大肠杆菌C600[Genetics，39，440(1954)]等。
作为芽孢杆菌属菌，例如使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MI114[Gene、24，255(1983)]，枯草芽孢杆菌207-21[Journal of Biochemistry，95，87(1984)]等。
作为酵母，例如使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-，NA87-11A，DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913，NCYC2036，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
作为昆虫细胞，例如，在病毒为AcNPV时，使用源自夜盗蛾的幼虫的株化细胞(Spodoptera frugiperda cell；Sf细胞)、源自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的中肠的MG1细胞、源自粉纹夜蛾的卵的High FiveTM细胞、源自甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞、源自Estigmena acrea的细胞等。在病毒为BmNPV的情况下，关于昆虫细胞，使用源自蚕的株化细胞(Bombyx mori N细胞；BmN细胞)等。作为该Sf细胞，例如，使用Sf9细胞(ATCCCRL1711)、Sf21细胞[以上，In Vivo,13,213-217(1977)]等。
作为昆虫，例如使用蚕的幼虫、果蝇、蟋蟀(cricket)等[Nature、315、592(1985)]。
作为动物细胞，例如使用：猴COS-7细胞、猴Vero细胞、中国仓鼠(Chinesehamster)卵巢(CHO)细胞、dhfr基因缺损CHO细胞、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤(mouse myeloma)细胞、大鼠GH3细胞、源自人类胎儿肾脏的细胞(例：HEK293细胞)、源自人肝癌的细胞(例：HepG2)、人FL细胞等的细胞株、人以及其它的哺乳动物的iPS细胞和/或ES细胞等多功能干细胞、由各种组织制备出的初代培养细胞。此外，也可使用斑马鱼胚、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevis)等。
作为植物细胞，使用由各种植物(例如，水稻、小麦、玉米等谷物，西红柿、黄瓜、茄子等经济作物，香石竹(carnation)、洋桔梗等园艺植物，烟草、拟南芥等实验植物等)制备出的悬浮培养细胞、愈伤组织(callus)、原生质体(protoplast)、叶切片、根切片等。
上述任一个宿主细胞可以是半数体(一倍体)，也可以是倍数体(例：二倍体、三倍体、四倍体等)。在以往的突变导入技法中，原则上，仅将突变导入于同源染色体(homologous chromosome)中的一条，变为异源的(hetero)基因型，因而若不是显性突变则不表达所期望的性状，并且在同源化(ホモ化)方面耗费工夫与时间，不良情况多。与此相对，根据本发明，在利用使用以CRISPR-突变Cas为代表的核酸序列识别模块的本发明的方法而进行靶DNA的改变时，存在可将突变导入于基因组内的同源染色体上的所有等位基因中的可能性，因而即使是隐性突变也可在当代就表达所期望的性状，可克服以往方法的问题。
表达载体的导入，可以根据宿主的种类，按照公知的方法(例如，溶菌酶(lysozyme)法、感受态法(competent method)、PEG法、CaCl2共沉淀法、电穿孔法(electroporation method)、微注射法、粒子枪法(particle gun method)、脂质体转染法(lipofection method)、农杆菌法等)而实施。
大肠杆菌例如可按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)、Gene、17、107(1982)等中记载的方法进行转化。
芽孢杆菌属菌例如可按照Molecular&General Genetics，168，111(1979)等中记载的方法导入载体。
酵母例如可按照Methods in Enzymology，194，182-187(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)等中记载的方法导入载体。
昆虫细胞以及昆虫例如可按照Bio/Technology，6，47-55(1988)等中记载的方法导入载体。
动物细胞例如可按照细胞工程学附册8新细胞工程学实验方案(protocol)，263-267(1995)(秀润社发行)，Virology，52，456(1973)中记载的方法导入载体。
关于导入了载体的细胞的培养，可根据宿主的种类，按照公知的方法实施。
例如，培养大肠杆菌或芽孢杆菌属菌时，作为培养中使用的培养基，优选液体培养基。另外，培养基优选含有对于转化体的生长繁殖必需的碳源、氮源、无机物等。此处，作为碳源，例如举出葡萄糖、糊精(dextrin)、可溶性淀粉、蔗糖等；作为氮源，例如举出铵盐类、硝酸盐类、玉米浆(corn steep liquor)、蛋白胨(peptone)、酪蛋白、肉浸膏、大豆粕、马铃薯提取液等无机物质或有机物质；作为无机物，例如举出氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。另外，也可向培养基中添加酵母抽提物、维生素类、生长促进因子等。培养基的pH优选为约5～约8。
作为培养大肠杆菌的情况时的培养基，例如优选为含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸的M9培养基[Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold SpringHarbor Laboratory,New York 1972]。根据需要，为了使启动子高效地动作，例如也可将3β-吲哚基丙烯酸那样的化学试剂添加于培养基。大肠杆菌的培养通常在约15℃～约43℃进行。也可根据需要进行通气、搅拌。
芽孢杆菌属菌的培养，通常在约30～约40℃进行。也可根据需要进行通气、搅拌。
作为培养酵母的情况时的培养基，例如举出伯克霍尔德(Burkholder)最小培养基[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505(1980)]、含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81、5330(1984)]等。培养基的pH优选为约5～约8。通常在约20℃～约35℃进行培养。也可根据需要进行通气、搅拌。
作为培养昆虫细胞或昆虫的情况时的培养基，例如使用通过向Grace’s InsectMedium[Nature、195，788(1962)]中适当加入灭活化(inactivation)了的10％牛血清等添加物而得到的培养基等。培养基的pH优选为约6.2～约6.4。通常在约27℃下进行培养。也可根据需要进行通气、搅拌。
作为培养动物细胞的情况时的培养基，例如使用含有约5～约20％的胎牛血清的最小必需培养基(MEM)[Science、122，501(1952)]、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium、DMEM)[Virology，8，396(1959)]、RPMI 1640培养基[TheJournal of the American Medical Association，199，519(1967)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]等。培养基的pH优选为约6～约8。通常在约30℃～约40℃下进行培养。也可根据需要进行通气、搅拌。
作为培养植物细胞的培养基，使用MS培养基、LS培养基、B5培养基等。培养基的pH优选为约5～约8。培养通常在约20℃～约30℃下进行。也可根据需要进行通气、搅拌。
如上所述地操作，可在细胞内表达核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体、即本发明的复合体。
编码核酸序列识别模块及/或DNA修饰酶结合模块的RNA向宿主细胞的导入，可通过微注射法、脂质体转染法等而进行。RNA导入可以进行1次，或者可以设置适当的间隔而反复地进行多次(例如2～5次)。
认为：从导入于细胞内的表达载体，表达核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块的复合体时，该核酸序列识别模块特异性地识别目的DNA(例：基因组DNA)内的靶核苷酸序列而结合。而后，连结于该核酸序列识别模块的DNA修饰酶结合模块，与接受DNA修饰酶诱导因子的刺激而诱导出的细胞内在性的DNA修饰酶结合，在该DNA修饰酶的作用下，在靶向部位(靶核苷酸序列的全部或者一部分或它们的近旁)产生DNA链或碱基的修饰。
在靶DNA为双链的情况时，在靶向部位的正义链(sense strand)或者反义链(antisense strand)发生DNA的修饰。在DNA的修饰是DNA链的切断的情况时，在利用碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、单链切断修复、非同源末端连接(NHEJ)、同源重组(HR)等修复机制进行修复之时，导入各种突变。在DNA的修饰不直接伴随DNA链的切断的情况时，在双链DNA内生成错配、没有碱基的部位(AP部位)(apurinic/apyrimidic(AP)site)，在将其修复的过程中导入突变。例如，在使用了可结合于APOBEC等胞苷脱氨酶的DNA修饰酶结合模块的情况时，靶向部位的正义链或者反义链上的胞嘧啶被替换为尿嘧啶，生成U：G或者G：U错配。通过在不正确地修复此错配的状态下，以相反链的碱基与替换了的链的碱基形成对的方式进行修复(在上述的例子中，T-A或者A-T)，在修复之时进一步取代为其它的核苷酸(例如，U→A、G)，或者生成1个至数十个碱基的缺失或者插入，从而导入各种突变。另外，例如，在使用了可结合于DNA糖基化酶的DNA修饰酶结合模块时，在靶向部位的正义链或者反义链产生脱碱基反应，在双链DNA中的一条链产生无碱基部位(AP部位)。于是，细胞内的碱基切除修复(BER)系进行动作，首先AP内切核酸酶识别AP部位而将DNA片链的磷酸键切断，外切核酸酶将脱碱基了的核苷酸切除。接着，DNA聚合酶以相反链DNA为模板新插入核苷酸，在最后DNA连接酶将接口修复。通过在该BER中的任一个阶段发生修复错误，从而导入各种突变。
关于锌指基序，由于特异性地结合于靶核苷酸序列的锌指的制作效率不高，另外，结合特异性高的锌指的拣选(選別)是繁杂的，因而不容易制作许多实际上发挥功能的锌指基序。关于TAL效应物和PPR基序，与锌指基序相比靶向核酸序列识别的自由度高，但是由于需要每次根据靶核苷酸序列设计、构建巨大的蛋白质，因而在效率方面留下问题。
与此相对，CRISPR-Cas系统由于利用与靶核苷酸序列互补的向导RNA而识别目的DNA的序列，因而仅通过合成可与靶核苷酸序列特异性地形成杂合体(hybrid)的低聚DNA，即可将任意的序列标靶化。
因此，在本发明的更优选的实施方式中，作为核酸序列识别模块，使用Cas效应物蛋白质的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统即CRISPR-突变Cas。
使用了CRISPR-突变Cas的本发明的核酸序列识别模块以复合体的形式提供，该复合体是：包含与靶核苷酸序列互补的序列的CRISPR-RNA(crRNA)与、根据需要的对突变Cas效应物蛋白质的募集(recruit)必需的trans-activating RNA(tracrRNA)(在需要tracrRNA时，可以以与crRNA的嵌合RNA的形式提供)与、突变Cas效应物蛋白质的复合体。将与突变Cas效应物蛋白质进行组合而构成核酸序列识别模块的、单独的crRNA或者由crRNA与tracrRNA的嵌合RNA构成的RNA分子，统称为“向导RNA”。在使用核酸适体作为DNA修饰酶结合模块的情况时，核酸适体优选与向导RNA结合。向导RNA与核酸适体结合而得到的核酸，可利用公知的方法(例如，Mali et al.,(2013),Nat Biotechnol,31(9),833-838)而制作。
本发明中使用的Cas效应物蛋白质，只要是可通过与向导RNA形成复合体从而将目的基因中的靶核苷酸序列与相邻于其的前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif、PAM)进行识别并且结合的属于第2类(class 2)CRISPR系统的效应物蛋白质，就没有特别限制，优选为Cas9或Cpf1。关于Cas9，例如举出源自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpCas9；PAM序列(5’→3’方向；下同)NGG(N为A、G、T或C。下同))、源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9(StCas9；PAM序列NNAGAAW)、源自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的Cas9(MmCas9；PAM序列NNNNGATT)等，但是不限于它们。优选为基于PAM的制约少的SpCas9(实质上是2个碱基，理论上基因组上的大致任何部位都可靶向化)。另外，作为Cpf1，例如举出源自新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)的Cpf1(FnCpf1；PAM序列TTN)、源自氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)的Cpf1(AsCpf1；PAM序列TTTN)、源自毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)的Cpf1(LbCpf1；PAM序列TTTN)等，但是不限于它们。作为本发明中使用的突变Cas效应物蛋白质(以下，有时会略记为“突变Cas”)，将Cas效应物蛋白质的双链DNA中的两条链的切断能力失活了的突变Cas效应物蛋白质、以及仅仅将一条链的切断能力失活了的具有切口酶(nickase)活性的突变Cas效应物蛋白质均可以使用。例如，在SpCas9的情况时，可使用：第10的Asp残基替换为Ala残基的、与向导RNA形成互补链的链的相反链的切断能力欠缺的(因此，具有针对与向导RNA形成互补链的链的切口酶活性的)D10A突变体，或者，第840的His残基替换为Ala残基的、与向导RNA形成互补链的链的切断能力欠缺的(因此，具有针对与向导RNA形成互补链的链的相反链的切口酶活性的)H840A突变体，以及其双重突变体(dCas9)。另外，在FnCpf1的情况时，可使用第917Asp残基替换为Ala残基(D917A)、或者第1006Glu残基替换为Ala残基(E1006A)的、两条链的切断能力欠缺的突变体。只要使得双链DNA的至少一条链的切断能力欠缺，也可同样地使用其它的突变Cas。
利用与上述锌指等的连结样式相同的技法，以与突变Cas的复合体的形式提供DNA修饰酶结合模块。或者，也可利用由作为RNA适体的MS2F6、PP7等与它们的结合蛋白质而得到的RNA scaffold，使DNA修饰酶结合模块与突变Cas进行结合。向导RNA中的靶序列(targeting sequence)与靶核苷酸序列形成互补链，突变Cas被募集于向导RNA中的其它的区域(即，crRNA中的除了靶序列以外的序列，或者接续于crRNA的tracrRNA)而识别PAM，但是无法将DNA中的一条链或两条链切断，连结于突变Cas的DNA修饰酶结合模块与DNA修饰酶进行结合，在该DNA修饰酶的作用下，在靶向部位(可在包含靶核苷酸序列的全部或者一部分的数百碱基的范围内适当调节)产生修饰，将DNA链切断，或者在靶DNA为双链DNA的情况时，在DNA内产生错配或AP部位。通过这些DNA链的切断、错配或AP部位未被正确地修复的状态下，修复成相反链的碱基与替换了的链的碱基形成对，或者在修复之时进一步替换为其它的核苷酸，或者生成1至数十碱基的缺失或者插入，从而导入各种突变。
在使用CRISPR-突变Cas作为核酸序列识别模块的情况时，也与使用锌指等作为核酸序列识别模块时同样地，核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块优选以编码它们的核酸(优选为DNA)的形态导入于具有目的DNA的细胞中。
编码Cas效应物蛋白质(例：Cas9、Cpf1)的DNA，可利用与关于编码DNA修饰酶结合模块的DNA而在上面叙述了的内容同样的方法，从产生该蛋白质的细胞克隆。另外，关于突变Cas，可通过向编码克隆化而得到的Cas的DNA，使用自身公知的部位特异性突变诱发法，以将对于DNA切断活性重要的部位的氨基酸残基(例如，在SpCas9的情况时，举出第10的Asp残基、第840的His残基，在FnCpf1的情况时，举出第917Asp残基、第1006Glu残基、第1255Asp残基等，但是不限定于它们)替换为其它的氨基酸的方式导入突变，从而取得。另外，也可用化学合成或PCR法或者Gibson Assembly法的组合构建全长DNA，从而根据导入该DNA的宿主而在CDS全长设计使用密码子。例如，作为导入了这样的突变的、适于人细胞中表达的具有密码子使用的SpCas9 DNA，举出具有序列号4所表示的核苷酸序列的DNA。
所获得的编码突变Cas的DNA及/或编码DNA修饰酶结合模块的DNA，可根据宿主细胞，插入于与上述同样的表达载体的启动子的下游。在表达载体中，如上所述，可根据期望含有终止子、翻译增强子、3’调节区域、聚A附加信号、耐药性基因等选择标记等。
另一方面，编码向导RNA的DNA，可通过设计包含与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列(本说明书中，亦称为“靶序列(targeting sequence)”)的、crRNA序列(例如，募集FnCpf1作为Cas效应物蛋白质的情况时，可使用在靶序列的5’侧包含序列号10；AAUUUCUACUGUUGUAGAU的crRNA，下划线部的序列彼此形成碱基对并且取茎-环(stem-loop)结构)的编码序列、或者、将crRNA编码序列与根据需要的已知的tracrRNA编码序列(例如，作为在募集Cas9作为Cas效应物蛋白质的情况时的tracrRNA编码序列，是gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc；序列号11)进行连结而得到的低聚DNA序列，并且使用DNA/RNA合成仪，从而化学合成。在靶DNA为双链的情况时，crRNA序列包含与靶核苷酸序列“靶链(targeted strand)”互补的核苷酸序列。
此处所谓“靶链”指与靶核苷酸序列的crRNA形成杂合体的一条链，将其相反链、即因靶链与crRNA形成杂合体而成为单链状的链称为“非靶链(non-targeted strand)”。另外，由于推定DNA的修饰反应通常在成为单链状的非靶链上产生的情况多，因而由单条链表现靶核苷酸序列的情况时(例如，标记PAM序列的情况时、或表示靶核苷酸序列与PAM的位置关系的情况时等)，设定用非靶链的序列代表。
靶序列的长度，只要可特异性地结合于靶核苷酸序列，就没有特别限制，例如为15～30个核苷酸，优选为18～25个核苷酸。靶核苷酸序列的选择，受限制于与该序列的3’侧(Cas9的情况时)或者5’侧(Cpf1的情况时)相邻的PAM的存在，但是根据酵母等的知识，在通过将CRISPR-突变Cas9与胞苷脱氨酶进行组合的系统中，不论靶核苷酸序列的长度如何，存在从其5’端起在3’方向上处于7个核苷酸以内的位置的C容易被取代这样的规则性，因而存在通过适当选择靶核苷酸序列的长度从而使得可导入突变的碱基的部位进行位移(shift)的可能性。由此，可至少部分性地解除基于PAM(在SpCas9中是NGG)的制约，可期待突变导入的自由度进一步变高。
关于靶序列的设计，例如在使用Cas9作为Cas效应物蛋白质的情况时，可通过使用公开的向导RNA设计网站(CRISPR Design Tool、CRISPRdirect等)，从目的基因的CDS序列之中挑选(list up)在3’侧邻接PAM(例如，SpCas9的情况时，NGG)的20mer序列，在将从其5’端起在3’方向上7个核苷酸以内的C替换为T的情况时，选择在目的基因所编码的蛋白质中产生氨基酸变化那样的序列，从而进行。此外，在使靶序列的长度在例如18～25个核苷酸的范围进行变化的情况时，同样地，选择存在从其5’端起在3’方向上在7个核苷酸以内因向T的碱基替换而产生氨基酸变化的C的序列。从这些候选之中，可使用宿主的基因组中的脱靶位点数量少的候选序列作为靶序列。在所使用的向导RNA设计软件没有检索宿主的基因组的脱靶位点的功能的情况时，例如关于候选序列的3’侧的8～12个核苷酸(靶核苷酸序列的识别能力高的seed序列)，可通过对宿主的基因组施加Blast检索，从而检索脱靶位点。
关于编码向导RNA(例如，crRNA或crRNA-tracrRNA嵌合体)的DNA，可通过设计将与靶核苷酸序列的靶链互补的序列与、已知的tracrRNA序列(募集Cas9的情况时)或crRNA的同向重复序列(募集Cpf1的情况时)进行连结而得到的低聚RNA序列，并且使用DNA/RNA合成仪，从而化学合成。编码向导RNA的DNA也可插入于与上述同样的表达载体，但是作为启动子，优选使用pol III系的启动子(例：SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U3、U6、H1启动子等)以及终止子(例：聚T序列(T6序列；tttttt等))。
编码突变Cas的DNA、编码DNA修饰酶结合模块的DNA、编码向导RNA的DNA，可根据宿主，利用与上述同样的方法导入于宿主细胞。
本发明人等报告了：在使用了脱氨酶与核酸序列识别模块的复合体的基因组编辑(以下，有时会称为“Target AID”。)(专利文献5)方面，将切断不同的链的2种具有切口酶活性的突变Cas的效果进行了比较，结果是，在一方中，突变部位集中于靶核苷酸序列的中央附近，与此相对，在另一方中，从靶核苷酸序列中在数百碱基的区域随机地导入了多种多样的突变，在本发明中也可期待同样的效果。因此，通过选择切口酶切断的链，从而可在特定的核苷酸或核苷酸区域精确地导入突变，或者在比较宽广的范围随机地导入多种多样的突变，也可根据目的而适宜地使用。例如，只要将前者的技术应用于基因疾病iPS细胞，则通过在由患者自身的细胞制作出的iPS细胞中修复病原基因的突变，然后分化为目的体细胞，从而可制作更加降低了排斥风险的细胞移植疗法剂。
另外，本发明人等在Target AID中，通过针对接近的多个靶核苷酸序列制作序列识别模块，同时使用，从而相比于以单独的核苷酸序列为标靶的情况，通过使用出芽酵母而确认了突变导入效率大幅提高，在本发明中也可期待同样的效果。从在两个靶核苷酸序列的一部分发生重复那样的情况下，到两者分离了600bp左右的场合时，该效果也同样地实现突变诱导。另外，在靶DNA为双链DNA的情况时，在靶核苷酸序列是相同方向(即，靶链处于相同链上)的情况与靶核苷酸序列是相对方向(即，双链DNA的两条链成为靶链)的情况中的任一个情况中都可以发生。
另外，也可将位置完全不同的多个DNA区域设为标靶而改变。因此，在本发明的优选的一个实施方式中，可使用与不同的靶核苷酸序列(例如，在靶DNA为细胞内在性的DNA的情况时，也可以是1个目的基因内，也可以处于不同的2个以上的目的基因内。)分别特异性地结合的2种以上的核酸序列识别模块。在此情况时，这些核酸序列识别模块中的各1个与DNA修饰酶结合模块形成复合体。此处DNA修饰酶结合模块可使用共通的DNA修饰酶结合模块。例如，在使用CRISPR-Cas系统作为核酸序列识别模块的情况时，Cas效应物蛋白质与DNA修饰酶结合模块的复合体(包括融合蛋白质)可使用共通的复合体；作为向导RNA，可制作并使用：包含与不同的靶核苷酸序列分别形成互补链的2个以上的crRNA中的各个crRNA的、2种以上的向导RNA。另一方面，在使用锌指基序、或TAL效应物等作为核酸序列识别模块的情况时，例如可使DNA修饰酶结合模块融合于与不同的靶向核苷酸特异性地结合的各核酸序列识别模块上。
为了在宿主细胞内表达本发明的复合体，如上所述，将包含编码核酸序列识别模块的DNA与编码DNA修饰酶结合模块的DNA的表达载体(两DNA可以处于各别的载体上，也可以处于单一的载体上)，或将编码各模块的RNA导入于宿主细胞，但是为了高效地导入突变，优选以一定期间以上、在一定水平以上维持本发明的复合体的表达。从相关的观点考虑，导入可在宿主细胞内自主复制的表达载体(例如质粒等)是可靠的，但是由于该质粒等是外来DNA，因而优选在顺利地实现突变导入之后迅速地去除。因此，虽然根据宿主细胞的种类等而变动，但例如优选在从表达载体导入起经过6小时～2天后，使用本技术领域中公知的各种质粒去除法，从宿主细胞将导入了的质粒去除。
另一方面，作为用于去除编入于宿主基因组DNA的外来DNA的手段，举出使用Cre-loxP系的方法或使用转座子(transposon)的方法等。
或者，只要可获得对突变导入充分的本发明的复合体的表达，那么另外也优选：通过使用在宿主细胞内不具有自主复制能力的表达载体(例如，欠缺在宿主细胞中发挥功能的复制起点及/或编码对复制必需的蛋白质的基因的载体等)和/或RNA，利用瞬时表达，由此将突变导入于目的DNA。
或者，通过在所期望的时期，仅仅以对于引发DNA的修饰反应并且固定靶向部位的改变所必需的期间，使本发明的复合体在宿主细胞内瞬时地表达，从而可一边避免脱靶作用的风险，一边高效地实现宿主DNA的编辑。对于引发DNA的修饰反应并且固定靶向部位的改变所必需的期间，可与用上述的DNA修饰酶诱导因子刺激细胞的期间同样地适当确定。本发明的复合体的表达诱导期间，也可在不使得宿主细胞产生不优选的副作用的范围，超过上述的期间而延长。
作为在所期望时期以所期望的期间瞬时地表达本发明的复合体的手段，举出如下的方法，即制作以可控制该复合体的表达期间的形态包含编码该复合体的DNA[即编码核酸序列识别模块的DNA(在CRISPR-Cas系统方面，指编码向导RNA的DNA与编码突变Cas的DNA)、以及编码DNA修饰酶结合模块的DNA(在CRISPR-Cas系统方面，编码DNA修饰酶结合模块的DNA，依据该模块为蛋白质或RNA，可以与分别编码突变Cas的DNA或编码向导RNA的DNA进行连结)]的构建体(表达载体)，导入于宿主细胞内的方法。作为“可控制表达期间的形态”，具体举出：将编码本发明的复合体的DNA置于诱导性的调节区域的控制下的形态。“诱导性的调节区域”没有特别限制，例如，在细菌(例：大肠杆菌)或酵母等微生物细胞中，举出温度感受性(ts)突变阻遏子(repressor)与受其控制的操纵基因(operator)的操纵子。作为ts突变阻遏子，例如举出源自λ噬菌体的cI阻遏子的ts突变体，但是不限定于此。在λ噬菌体cI阻遏子(ts)的情况时，在30℃以下(例：28℃)结合于操纵基因而抑制着下游的基因表达，但是在37℃以上(例：42℃)的高温时从操纵基因解离，因而诱导基因表达。因此，通常在30℃以下培养导入了编码本发明的复合体的DNA的宿主细胞，通过在恰当时期将温度提高到37℃以上培养一定期间而表达本发明的复合体，利用该复合体所募集了的细胞内在性的DNA修饰酶而进行DNA的修饰反应，将突变导入于靶向基因，之后迅速地返回到30℃以下，从而可将抑制靶基因的表达的期间设为最短。因此，即使在将对于宿主细胞而言必需的基因设为标靶的情况时，也可一边压制副作用一边高效地编辑。
在利用温度感受性突变时，例如，通过将对于载体的自主复制必需的蛋白质的温度感受性突变体搭载于包含编码本发明的复合体的DNA的载体，从而在该复合体的表达后，无法迅速地进行自主复制，随着细胞分裂，该载体自然地脱落。作为这样的温度感受性突变蛋白质，举出对于pSC101 ori的复制必需的Rep101 ori的温度感受性突变体，但是不限定于此。Rep101 ori(ts)为30℃以下(例：28℃)时，作用于pSC101 ori从而可使得质粒进行自主复制，但是变为37℃以上(例：42℃)时则失去功能，质粒变得无法自主复制。因此，通过与上述λ噬菌体的cI阻遏子(ts)并用，从而可同时进行本发明的复合体的瞬时表达与质粒去除。
另一方面，在将动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等高等真核细胞设为宿主细胞的情况时，通过将编码本发明的复合体的DNA，在诱导启动子(例：金属硫蛋白(metallothionein)启动子(用重金属离子诱导)、热休克蛋白质启动子(用热休克诱导)、Tet-ON/Tet-OFF系启动子(用四环素(tetracycline)或其衍生物的添加或去除而诱导)、甾体响应性启动子(用甾体激素或其衍生物诱导)等)的控制下导入于宿主细胞内，在恰当时期向培养基中添加诱导物质(或从培养基去除)而诱导该复合体的表达，培养一定期间，利用该复合体所募集的细胞内在性的DNA修饰酶而进行DNA的修饰反应，将突变导入于靶向基因，然后将前述诱导物质从培养基去除(或添加于培养基)，从而可实现本发明的复合体的瞬时表达。
此外，在大肠杆菌等的原核细胞中，也可利用诱导启动子。作为这样的诱导启动子，例如举出lac启动子(用IPTG诱导)、cspA启动子(用冷休克诱导)、araBAD启动子(用阿拉伯糖诱导)等，但是不限定于它们。
或者，也可利用上述的诱导启动子作为在将动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等高等真核细胞设为宿主细胞的情况时的载体切除机构。即，通过在载体中搭载编码在宿主细胞中发挥功能的对复制起点与其复制必需的蛋白质的核酸(例如，如果是动物细胞，则是SV40ori与大T抗原(large T antigen)、oriP与EBNA-1等)，利用上述诱导启动子而控制编码该蛋白质的核酸的表达，由此虽然在诱导物质存在下可使得载体进行自主复制，但去除诱导物质时变得无法自主复制，随着细胞分裂，载体自然地脱落(在Tet-OFF系载体中，相反地通过添加四环素(tetracycline)、强力霉素(doxycycline)而变得无法自主复制)。
根据本发明人等的研究，可存在如下的情况：若使用DNA修饰酶诱导因子而使细胞内在性的DNA修饰酶的表达、或活性充分上升，则即使不使用DNA修饰酶结合模块，也可以仅使用核酸序列识别模块改变靶DNA。虽然不期望受约束于任何的理论，但是作为具有可能性的机理，认为：在通过使核酸序列识别模块进行结合而生成的靶向部位的双螺旋结构的变形处(歪み)，能够接触以充分的量存在的该DNA修饰酶的频率是增加的，并且作用于靶向部位从而改变目的DNA。
因此，在本发明的另一实施方式中提供一种方法，其包括以下的工序：
用诱导细胞内在性的DNA修饰酶的因子而刺激该细胞的工序，以及
通过使得可与选择出的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块与该双链DNA进行接触，从而使得该靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入于该靶向部位的工序。
以下，通过实施例来说明本发明。但本发明不限定于这些实施例。
实施例
1.载体构建
1-1.Cas9、nCas9、nCas9-dVif、dVif-nCas9或nCas9-PmCDA1表达载体
实施例中使用的DNA编辑用质粒载体的概要图示于图1。通过以pNeo载体为基础，向源自人类胎儿肾脏的细胞(HEK293T细胞)进行转染(transfection)，从而构建了进行基因导入的质粒载体。作为质粒载体，使用了将次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase、HPRT)基因的外显子(exon)6设为标靶的1907c(Cas9)、1907n(nCas9-PmCDA1)、1907n-cugi(nCas9-PmCDA1-UGI)、1921(nCas9)、1923(nCas9-dVif)、1924(dVif-nCas9)以及作为对照的pNeo。1907c(Cas9)、1907n(nCas9-PmCDA1)、1907n-cugi(nCas9-PmCDA1-UGI)以及1921(nCas9)，通过以在非专利文献3中使用的载体为基础，将向导RNA的靶序列，从HPRT基因的外显子6的开始点变更为第24～第43序列(aatgcagactttgctttcct：序列号12)(site 3)从而构建。作为编码nCas9(D10A)的DNA，使用了包含由序列号4表示的碱基序列的DNA。关于1923(nCas9-dVif)、1924(dVif-nCas9)，如以下所述地制作。首先，针对1921(nCas9)进行限制性内切酶位点的追加与不需要的序列的切除，从而构建了载体1922(序列号13)。关于HIV的dVif片段，参照了数据库上的作为Vif序列的GenBank：AF200477.1。关于前述序列的ORF的28-576碱基，通过将第433-435碱基(CTA)改变为GCT，从而合成导入了L145A突变的人工基因(将碱基序列示于序列号1，将氨基酸序列示于序列号2。另外，将通过在5’侧附加AvrII的识别部位并且在3’侧附加NheI的识别部位而得到的碱基序列示于序列号3。)，利用限制性内切酶切断与连接而插入于1922，由此制作出1923(nCas9-dVif)以及1924(dVif-nCas9)。在图2中示出所制作出的载体1923(nCas9-dVif)以及1924(dVif-nCas9)的示意图。
通过将前述载体导入于HEK293T细胞，在细胞内表达，从而形成了crRNA-tracrRNA与、Cas9、nCas9、nCas9-dVif、dVif-nCas9或nCas9-PmCDA1的复合体。
1-2.UGI-nCas9-dVif、dVif-nCas9-UGI、TopBv2(TopoIIβ isoform 2)-nCas9、 nCas9-IQGAP2466-547-ZNF335745-893或nCas9-PmCDA1-UGI表达载体
以1-1.的步骤为参考，制作将HPRT基因的特定区域设为标靶(靶序列(site 1)：tcgagatgtgatgaaggaga；序列号27)的、载体1923-2(UGI-nCas9-dVif：序列号28)、载体1924-2(dVif-nCas9-UGI：序列号29)、载体1931(TopBv2452-591-nCas9：序列号30)以及载体1932(nCas9-IQGAP2466-547-ZNF335745-893：序列号31)，另外为比较实验用制作出载体1907(nCas9-PmCDA1-UGI：序列号32)。编码TopBv2、IQGAP2以及ZNF335的片段的碱基序列，分别参照数据库上的序列即refseq号：NM_001068、NM_006633以及NM_022095而进行设计。在图3中示出，所制作出的载体1923-2、1924-2、1931以及1932的示意图。分别将编码UGI的碱基序列以及UGI的氨基酸序列示于序列号19以及20，分别将编码TopBv2452-591的碱基序列以及TopBv2452-591的氨基酸序列示于序列号21和22，分别将编码IQGAP2466-547的碱基序列以及IQGAP2466-547的氨基酸序列示于序列号23以及24，分别将编码ZNF335745-893的碱基序列以及ZNF335745-893的氨基酸序列示于序列号25以及26。
2.细胞株·培养·转化·表达诱导
2-1.1-1的载体的导入系
按照以下的步骤来进行使用了上述1-1的载体的实验。使用了源自人类胎儿肾脏的细胞(HEK293T细胞)。对于细胞，使用添加了100μg/mL青霉素-链霉素(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)以及10％胎牛血清(FBS)(Biosera,Nuaille,France)的DME-glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific,USA)，在37℃、5％CO2条件下进行了培养。在细胞的回收方面使用了5％胰蛋白酶。
利用37℃的水浴溶解在低温冰箱(Deep Freezer)中保存了的HEK293T细胞，以成为5x106cells地在75T-flask中进行了接种。在培养1-3天后将细胞回收，以成为0.5x105cells/well地在24孔板(well plate)的各孔(well)进行了接种。在培养1-3天后，对60-80％融合性的(confluent)状态的各孔的细胞，使用3μl的脂质体(Lipofectamine)2000(Life Technologies,Carlsbad,USA)将约1μg上述的各质粒DNA进行了转染。在转染5小时后，交换为包含G418(0.125mg/mL)(InvivoGen,USA)与干扰素α(IFNα)(2000IU)(Takara Bio)或干扰素γ(2000IU)(PeproTech,Inc.)的培养基。作为对照，使用了仅包含G418的培养基。
2-2.1-2的载体的导入系
在使用了上述1-2的载体的实验中，按照以下的步骤来进行。将细胞(HEK293或者HepG2)以成为1x105cells/well地在24孔板的各孔中进行接种，进行了一夜培养。接着，利用FugeneHD(Promega)而转染(DNA 1μg/well,FugeneHD 1.5μl/well)，在16小时后将培养基进行了交换。此时，在HEK293的情况时，从OPTI-MEM，交换为DMEM+10％FBS+P/S(青霉素-链霉素)+嘌呤霉素(puromycin)(1μg/ml)+/-IFNα(10000U/ml)，在HepG2的情况时，从OPTI-MEM，交换为DMEM+10％FBS+P/S+1％NEAA(非必需氨基酸)+嘌呤霉素(1μg/ml)+/-IFNa(10000U/ml)。在6天间，继续进行基于嘌呤霉素的选择(selection)。此时，每48小时将培养基进行了交换。
3.序列解析
3-1.1-1的载体的导入系
通过上述2-1而回收的细胞，按照下面的步骤提取基因组DNA，进行了序列解析。为了序列解析，在培养3天后回收各细胞，提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA设为模板，使用以HPRT基因的外显子6为标靶的正向引物(5’-ATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’：序列号14)以及反向引物(5’-AATTCCAGGAGGTCCAGATCTTCAGGGCCC-3’：序列号15)，将靶区域进行了扩增。将扩增的DNA片段设为模板，使用正向引物(5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTCCAGAATATCTCCATGTAGATTTTGGT-3’：序列号16)以及反向引物(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAGGCAAGGAAGTGACTGTAATTATGAGC-3’：序列号17)，获得了附加了NGS解析用的接头(adapter)的约300bp的扩增片段。在各样品中附加索引序列(indexsequence)，然后使用MiSeq Reagent Kit v3以及MiSeq sequencing system(Illumina)而进行了基于双端(pair end)的深度测序(deep sequencing)。在解析中，使用了CLCGenomics Workbench 7.0(Filgen)。将结果示于表1。表中，indel表示插入缺失，数字表示核苷酸的取代比例(％)。在干扰素的存在下培养表达了nCas9与dVif的复合体的细胞的情况时，发生插入缺失及/或碱基取代，碱基取代的大部分是从胞嘧啶取代为胸腺嘧啶。另外，插入缺失以及碱基取代的比例，与使用了外因性的脱氨酶的以往方法(Target-AID)为相同程度。此外，在表中的核酸碱基的第19个T与第20个C，较多地发现碱基的取代，但是由于在pNeo也高频率地发现取代，因而认为这些突变是序列的误差(error)。
[表1]
3-2.1-2的载体的导入系
通过上述2.2而回收的细胞，按照下面的步骤提取基因组DNA，进行了序列解析。HEK293细胞在第6天的时间点回收，HepG2细胞在48小时的恢复培养后回收，使用NucleoSpin Tissue XS(Takara Bio)，提取了基因组DNA。进行1st PCR(DNA聚合酶：KOD FXNEO(东洋纺)、引物对(primer set)：正向引物(5’-TTTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAGTGG-3’：序列号33)；反向引物(5’-ACAATAGCTCTTCAGTCTGATAAAATCTAC-3’：序列号34))，利用电泳确认条带(band)，使用Exo/Sap(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))进行纯化，获得了1100bp的扩增片段。接着，将纯化后的PCR产物设为模板，进行2nd PCR(DNA聚合酶：KODFX NEO、引物对：正向引物(5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGGACTGAACGTCTTGCTC-3’：序列号35)；反向引物(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTCATAGGAATGGATCTATCAC-3’：序列号36))，利用电泳确认条带，使用Exo/Sap进行纯化，获得了220bp的扩增片段。进一步，将纯化后的PCR产物设为模板，进行3rd PCR(Q5 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)、引物对：序列号14以及15)，使用AMPure XP(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))进行纯化，获得了附加了NGS解析用的接头的约150bp的扩增片段。对于使用AMPure XP进行了纯化之后的样品，利用Multina(岛津)确认了条带。对于样品，以由Multina获得的条带(浓度)为参考而跑电泳(pool)，利用Qubit(Thermo Fisher Scientific)测定样品的浓度，将样品以成为10nM的方式进行稀释，用Qubit确认了是10nM。将10nM的样品稀释为1nM，将1nM的样品进行了变性处理。之后，以成为1.5pM地进行了稀释。将4nM PhiX(Illumina)进行变性处理，其后以成为1.5pM地进行了稀释。将500μl的样品(1.5pM)与100μl的PhiX(1.5pM)进行混合，应用于卡盒(cartridge)。起动Miniseq(Illumina)，进行了测序。将结果示于表2。表中，indel表示插入缺失(其中，在表2中没有检测到indel)，数字表示核苷酸的取代比例(％)。在干扰素的存在下培养了表达了UGI、nCas9以及dVif的复合体的HEK293细胞的情况时，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的碱基取代。同样地，在干扰素的存在下培养了表达了nCas9与、TopBv2或IQGAP2以及ZNF335的复合体的细胞的情况时，产生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的碱基取代。另外，在干扰素的存在下培养表达了UGI、nCas9以及dVif的复合体的HepG2细胞的情况时，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的碱基取代。在使用了HepG2细胞的情况时，碱基取代的比例与使用了外因性的脱氨酶的以往方法(Target-AID)为相同程度。
[表2]
Hek293细胞 HPRT位点1
1923-2：UGI-nCas9-Vif
1924-2：Vif-nCas9-UGI
1931：TopBv2-nCas9
1932：nCas9-ZF
HepG2细胞 HPRT位点1
1924-2：Vif-nCas9-UGI
1907：nCas9-CDA-ugi(参考数据)
本申请以在日本申请的日本特愿2017-056727(申请日：2017年3月22日)为基础，其内容全部包含于本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明，由于在DNA的改变反应中不使用外来的酶，因而是安全的，而且利用在DNA编辑中使用的构建体的小型化，从而可实现传递效率提高了的DNA编辑，极其有用。

Claims (15)

1.一种改变细胞中DNA的靶向部位的用于非治疗目的的方法，其包括以下工序：
用诱导细胞中内在的DNA修饰酶的因子刺激细胞，以及
使与选择出的DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块互相结合而得到的复合体与DNA进行接触，从而使得靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入所述靶向部位；其中，所述核酸序列识别模块是Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统，所述Cas是第2类CRISPR-Cas；所述细胞不包括在体人类细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA修饰酶结合模块选自Vif、Bet蛋白质、TopoIIβ、IQGAP2和ZNF335以及它们的片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在不切断所述DNA的至少一条链的情况下进行所述靶向部位的改变。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞中内在的DNA修饰酶为脱氨酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块结合而得到的复合体还包含与其结合的碱基切除修复的抑制因子。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，诱导DNA修饰酶的所述因子是干扰素。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过将编码所述复合体的核酸导入所述细胞，培养所述细胞而在细胞中表达所述复合体，从而进行所述DNA与所述复合体的接触。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用诱导DNA修饰酶的因子刺激细胞通过在所述因子的存在下培养所述细胞进行。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞是脊椎动物细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述脊椎动物细胞是哺乳类动物细胞。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA是双链DNA。
12.一种复合体，其为与DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合的核酸序列识别模块与DNA修饰酶结合模块互相结合而得到的复合体，其中，所述核酸序列识别模块是Cas的至少1种DNA切断能力失活了的CRISPR-Cas系统，所述Cas是第2类CRISPR-Cas；所述复合体使得靶向部位的1个以上的核苷酸缺失或替换为其它的1个以上的核苷酸，或者将1个以上的核苷酸插入所述靶向部位；其中，所述DNA修饰酶结合模块具有与细胞中内在的DNA修饰酶结合的能力。
13.根据权利要求12所述的复合体，其中，所述DNA修饰酶结合模块选自Vif、Bet蛋白质、TopoIIβ、IQGAP2和ZNF335以及它们的片段。
14.一种核酸，其编码权利要求12或13所述的复合体。
15.一种DNA的靶向部位的改变剂，其包含权利要求12所述的复合体或权利要求14所述的核酸。
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