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CN117959287A - 一种鞣花酸自组装纳米复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种鞣花酸自组装纳米复合物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN117959287A
CN117959287A CN202410124759.4A CN202410124759A CN117959287A CN 117959287 A CN117959287 A CN 117959287A CN 202410124759 A CN202410124759 A CN 202410124759A CN 117959287 A CN117959287 A CN 117959287A
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CN
China
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ellagic acid
egcg
acid
gel
ellagic
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CN202410124759.4A
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黄浩洲
张定堃
林俊芝
李梦琪
韩丽
李格菲
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Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种鞣花酸自组装纳米复合物，它是由鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG制备而成，其中，没食子酸与EGCG的摩尔配比为：(2‑10)︰1；鞣花酸、没食子酸的摩尔配比为：1︰(17‑177)。本发明还提供了该纳米复合物的制备方法和用途。本发明纳米复合物三种原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG，均来源于天然余甘子汁，通过反溶剂诱导法成功制备了鞣花酸复合物。该复合物的制备方法简单、成本低廉，显著提高了鞣花酸的溶解性，并大大改善了其稳定性。加入透明质酸作为凝胶基质制备复合物凝胶后，鞣花酸复合物稳定性进一步提升，同时解决了复合物液体黏性低及附着能力差的问题，有便于后续用于皮肤伤口愈合产品的开发。

Description

一种鞣花酸自组装纳米复合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种鞣花酸自组装纳米复合物及其制备方法和用途，属于药物制剂。
背景技术
鞣花酸(Ellagic acid，简称EA)是一种有机物，化学式为C14H6O8，是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物。鞣花酸广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分，鞣花酸与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色。鞣花酸是一种多酚化合物，存在于多种水果和坚果中，如覆盆子、葡萄、草莓、石榴和核桃。研究表明它对某些癌细胞系具有抗增殖和凋亡作用。与其他多酚类植物化学物质一样，鞣花酸在体内外模型中也显示出抗氧化作用。在皮肤病学的应用中，鞣花酸对改善紫外线引起的皮肤老化迹象和治疗色素沉着非常有效，显示出良好的应用前景。鞣花酸不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界。鞣花酸与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色，Greiss—meger反应呈阳性，还易与金属阳离子如ca2、M结合。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体，熔点(吡啶)大于360℃，微溶于水、醇，溶于碱、吡啶和二甲基亚砜，不溶于醚。鞣花酸具有多种生物活性功能,例如抗氧化功能、抗癌、抗突变性能、对人体免疫缺陷病毒的抑制作用。除此之外,鞣花酸还是一种有效的凝血剂,对多种细菌、病毒都有很好地抑制作用,能保护创面免受细菌的侵入,防止感染,抑制溃疡。同时，经研究发现，鞣花酸还具有降压、镇静作用。
自组装是分子的无序实体由于非共价键力，即氢键、静电力、范德华力、π-π相互作用、疏水相互作用和配位相互作用等，自发排列成有序结构(如纳米管、纳米纤维、胶束和囊泡)的过程。中药自组装即中药成分，如氨基酸、糖、核苷碱基、甾体、三萜、香豆素等通过非共价键形成纳米聚集体(即纳米颗粒)。各类中药成分因结构不同，其自组装行为的产生机制也各异。例如，糖类的复杂结构中富含大量亲水基团，因而能通过疏水作用或者氢键作用与其他结构单元发生自组装行为，而三萜类成分的刚性骨架和多手性中心使其容易在不同介质中以多种形式折叠形成自组装纳米颗粒。
为了解决鞣花酸的水不溶性问题，目前尚无将自组装技术用于鞣花酸。
发明内容
本发明提供了一种鞣花酸自组装纳米复合物，本发明还提供了该复合物的制备方法和用途。
本发明提供了一种鞣花酸自组装纳米复合物，它是由鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG制备而成，其中，
没食子酸与EGCG的摩尔配比为：(2-10)︰1；
鞣花酸、没食子酸的摩尔配比为：1︰(17-177)。
其中，所述的没食子酸与EGCG的摩尔配比为：3︰1；鞣花酸、没食子酸的摩尔配比为：1︰133。
本发明还提供了一种制备所述的鞣花酸自组装纳米复合物的方法，它包括如下步骤：
a、称取各摩尔配比的原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG；
b、鞣花酸储备液的制备：将鞣花酸溶解在氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，得到浓度为2.16-64.45μg/mL的鞣花酸储备液备用；
c、没食子酸、EGCG水溶液的制备：分别称取没食子酸、EGCG，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的没食子酸水溶液、EGCG水溶液；
d、向没食子酸溶液中滴加鞣花酸储备液摇匀，形成二元复合物，再加入等体积的EGCG溶液，分别以超声、磁力搅拌、50-90℃恒温水浴或冷凝回流，制备成EA-GA-EGCG三元复合物。
其中，其中鞣花酸简称EA，没食子酸简称GA。
进一步优选地，
c步骤所述的没食子酸水溶液的浓度为1.5％；
d步骤所述的超声条件为：250W，33kHz，3min；磁力搅拌条件为：600r/min，70℃，30min；恒温水浴的条件为70℃；冷凝回流的时间为：30min。
其中，d步骤制备三元复合物的方法是恒温水浴。
本发明还提供了所述的鞣花酸自组装纳米复合物在制备抑菌、抗菌的药物中的用途。
本发明提供了一种鞣花酸复合物凝胶，它是将所述的鞣花酸自组装纳米复合物包裹在多糖基质中，制备成凝胶剂。
其中，所述的多糖基质为：透明质酸、季铵盐壳聚糖、lota卡拉胶中的一种或两种以上的混合；所述的基质的用量为鞣花酸复合物的0.5-2.5％；
优选地，所述的多糖基质为：透明质酸；基质用量为鞣花酸复合物的1.5％。
本发明还提供了一种制备所述的凝胶的方法，它包括如下步骤：
a、称取各摩尔配比的原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG；
b、鞣花酸储备液的制备：将鞣花酸溶解在氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，得到浓度为2.16-64.45μg/mL的鞣花酸储备液备用；
c、没食子酸、EGCG水溶液的制备：分别称取没食子酸、EGCG，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的没食子酸水溶液、EGCG水溶液；
d、向没食子酸溶液中滴加鞣花酸储备液摇匀，形成二元复合物；
e、在70℃恒温水浴条件下，先将凝胶基质与EGCG混合，再向其中加入等体积的d步骤制备的GA-EA二元复合物，混合后即得凝胶。
本发明还提供了所述的凝胶在制备治疗糖尿病创面的外用药物中的用途。
本发明纳米复合物三种原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG，均来源于天然余甘子汁，通过反溶剂诱导法成功制备了鞣花酸复合物。该复合物的制备方法简单、成本低廉，显著提高了鞣花酸的溶解性，并大大改善了其稳定性。加入透明质酸作为凝胶基质制备复合物凝胶后，鞣花酸复合物稳定性进一步提升，同时解决了复合物液体黏性低及附着能力差的问题，有便于后续用于皮肤伤口愈合产品的开发。
附图说明
图1鞣花酸与没食子酸的标准曲线图(注：A：鞣花酸标准曲线；B：没食子酸标准曲线)；
图2单体对EA的增溶能力考察(注：A：GA对EA的增溶；B：EGCG对EA的增溶)；
图3三元复合物制备时不同加入顺序对EA的增溶能力考察；
图4不同摩尔比对EA的增溶能力考察；
图5不同复合工艺对EA的增溶能力考察；
图6不同水浴温度对EA的增溶能力考察；
图7鞣花酸复合物的稳定性指数(TSI，上图)和粒径测(下)定结果
图8三元复合物的透射电镜图像
图9FTIR光谱图
图10XRD谱图
图11 1H-NMR
图12分子动力学模拟
图13各样品对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性(注：A：抑菌圈直径；B：抑菌圈)
图14多糖类凝胶材料筛选结果图
图15凝胶基质用量考察
图16凝胶制备方法
图17凝胶抑菌活性
图18鞣花酸复合物凝胶促糖尿病伤口愈合的体内评价(注：A-B：不同治疗组的伤口图像；C：不同治疗组的创面愈合率)
图19第7、14天鞣花酸复合物凝胶治疗糖尿病伤口的H&E染色切片图
图20第7、14天鞣花酸复合物凝胶治疗糖尿病伤口的Masson染色切片图
具体实施方式
实施例1鞣花酸自组装复合物的制备及条件筛选试验
1仪器与材料
1.1仪器
1.2材料
鞣花酸(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq21010403，质量分数≥98％)；没食子酸(上海麦克林生物科技有限公司，批号：C14384461，质量分数≥99％)；表没食子儿茶素没食子酸酯/EGCG(四川恒诚致远生物科技有限公司)；氮甲基吡咯烷酮(成都科隆化学品公司)；甲醇(美国Sigma公司，货号：WXBD7361V)；磷酸(美国Sigma公司，美国，货号：WXBD2060V)；氘代二甲亚砜(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.)；琼脂(广州硕谱生物科技有限公司)；脑心浸出液(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。
2鞣花酸自组装复合物的制备与优化
2.1含量测定
2.1.1色谱条件
色谱柱Welchrom C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相0.2％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～6min，5％B；6～15min，5％～7％B；15～20min，7％～15％B；20～25min，15％～21％B；25～31min，21％～22％B；31～41min，22％B；41～47min，22％～28％B；47～51min，28％～32％B；51～57min，32％～38％B；57-70min，38％～45％B；70～80min，45％～65％B)；检测波长270nm；体积流量1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL。
2.1.2对照品溶液的制备
取鞣花酸对照品适量，精密称定后置于250mL棕色容量瓶中，使用甲醇定容至刻度线后超声30min，冷却至室温后即得对照品储备液；取没食子酸对照品适量，精密称定后置于5mL容量瓶中，使用50％甲醇定容至刻度线后超声30min，冷却至室温后即得对照品储备液。
2.1.3供试品溶液的制备
将各样品静置冷却后使用50％甲醇稀释适当倍数，使用0.22mm微孔滤膜滤过，参照第一章3.2.4项下的液相方法进行测定。
2.1.4标准曲线及线性范围
分别精密吸取2.1.2项下制备的对照品储备液，加入甲醇稀释成6个不同浓度的对照品溶液，分别过0.22μm微孔滤膜后按照3.4.1项下色谱方法进样测定。以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴进行线性回归。
2.2自组装复合物对鞣花酸的增溶能力考察
2.2.1EA储备液的制备
将鞣花酸溶解在氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，得到1.5％的鞣花酸储备液备用。
2.2.2EA-GA复合增溶能力考察
分别称取GA适量，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的GA水溶液；随后将EA储备液滴加入不同浓度的GA水溶液中，摇晃混匀后使用0.45μm微孔滤膜滤过。
2.2.3EA-EGCG复合增溶能力考察
分别称取EGCG适量，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的EGCG水溶液；随后将鞣花酸储备液滴加入不同浓度的EGCG水溶液中，摇晃混匀后使用0.45μm微孔滤膜滤过。
2.2.4EA-GA-EGCG复合增溶能力考察
在70℃水浴条件下分别配置浓度为3％的GA溶液和EGCG溶液备用，考察不同加入顺序对鞣花酸复合物的影响。顺序1：等体积混合GA和EGCG溶液摇匀，再滴加EA储备液；顺序2：向GA溶液中滴加EA储备液摇匀，再加入等体积的EGCG溶液；顺序3：向EGCG溶液中滴加EA储备液摇匀，再加入等体积的GA溶液；各样品摇晃混匀后使用0.45μm微孔滤膜滤过。
2.3EA-GA-EGCG复合物制备优化
2.3.1增溶物质加入比例
70℃水浴条件下，将EA储备液滴加至3％的GA溶液中摇匀；随后等体积加入不同浓度的EGCG溶液，使GA与EGCG的摩尔比分别为2:1，3:1，4:1，5:1和10:1；各样品摇晃混匀后使用0.45μm微孔滤膜滤过。
2.3.2复合物制备工艺筛选
将EA滴加至3％的GA溶液中摇匀，然后等体积加入不同浓度的EGCG溶液，使GA与EGCG的摩尔比为3:1；随后分别通过超声(250W，33kHz，3min)、磁力搅拌(600r/min，70℃，30min)、恒温水浴(70℃)、和冷凝回流(30min)制备EA-GA-EGCG复合物。
2.3.3水浴温度考察
分别在50、60、70、80和90℃恒温水浴条件下配置浓度为3％的GA溶液和EGCG溶液备用；向GA溶液中滴加EA储备液摇匀，再加入等体积的EGCG溶液，使GA与EGCG的摩尔比为3:1；各样品摇匀后使用0.45μm微孔滤膜滤过。
3鞣花酸自组装体系的表征与抑菌活性研究
3.1稳定性考察
将鞣花酸复合物水溶液倒入多重光样品瓶的四分之三处，除去液体表面的气泡，放入Turbiscan Lab稳定性分析仪进行测量。设置扫描时间间隔为30min，共扫描24h；扫描高度为50mm；平衡时间为20min；测试温度25℃；连续相光投射强度(T0)为99.9％(水)；分散相折射率(np)为1.36；连续相折射率(nf)为1.33。数据使用Turbiscan Easy Sof软件(版本2.2.0.82，法国Formulaction公司)进行处理。
3.2透射电镜
用滴管吸取最优条件下制备的EA-GA-EGCG复合物滴在铜网上，静置10min待其干燥后置于透射电镜下观察并拍照。
3.3红外光谱分析
取溴化钾于玛瑙研钵中，在红外烤灯下研磨成细粉后转移至压片模具中，将模具置于压片机中压实，得半透明薄片，即溴化钾空白片。分别取EA、GA、EGCG单体和冷冻干燥制备的EA-GA复合物、EA-GA-EGCG复合物和EA-GA-EGCG物理混合物粉末适量，与溴化钾在玛瑙研钵中研磨，压片制成样品片，将样品片置于傅里叶变换红外光谱仪中，在400-4000cm-1的范围内扫描得到样品片的一维红外光谱。
3.4X射线衍射分析
为了验证EA复合物中EA的物理状态，采用X射线衍射分析仪对EA、GA、EGCG和冷冻干燥制备的EA-GA复合物、EA-GA-EGCG复合物和EA-GA-EGCG物理混合物粉末进行分析。使用Cu-Kα，设定扫描范围为10°-50°，扫描速度2°/min，管电压30Kv，管电流30mA。
3.5氢核磁共振
将EA、GA、EGCG和冻干得到的EA-GA复合物与EA-GA-EGCG复合物分别溶于氘代二甲亚砜中，然后移至核磁管中，在25°条件下于核磁共振仪中测定。
3.6分子动力学模拟
运用Gaussian 09w程序进行理论计算。采用密度泛函M06-2X-D3理论方法，在6-31G(d,p)/SMD(Water)基组水平上对复合物进行相互作用能计算，所有结构优化与能量计算均采用Gaussian 09w软件。
3.7抑菌活性研究
3.7.1细菌的培养
将冻存有金黄色葡萄球菌(S.aureus)的甘油冻存管置于超净工作台内自然解冻，从中吸取10μL于HB液体培养基中，将装有菌液的液体培养基置于37℃摇床中以180rpm的转速培养24h；使用无菌水稀释菌液，使菌液浓度为1×106CFU/mL。
3.7.2纸片扩散法
将直径为6mm的圆形滤纸片灭菌，分别浸入EA-GA-EGCG复合物溶液、EA-GA-EGCG物理混合物、NMP溶解的EA溶液(0.2mg/mL)以及NMP中；将200μL金黄色葡萄球菌(1×106CFU/mL)涂布在琼脂培养基表面；将浸泡20分钟后的滤纸片置于琼脂平板上，在37℃下培养24小时，使用数字卡尺记录抑菌圈的直径。
4结果与讨论
4.1含量测定标准曲线及线性范围
如图1A所示，鞣花酸含量测定标准曲线回归方程为Y＝3.779X，R2＝1，在14.4～36μg/mL范围内线性关系良好；如图1B所示，没食子酸含量测定标曲线回归方程为Y＝3.7728X+0.1708，R2＝0.9997，在0.298～2.984mg/mL范围内线性关系良好。
4.2鞣花酸自组装复合物的制备与优化
4.2.1GA和EGCG对鞣花酸的增溶能力考察
据推测，没食子酸可能是参与自组装复合物的形成并增溶鞣花酸的关键所在，而EGCG能够引发并促进没食子酸的自组装。为探究没食子酸和EGCG对鞣花酸的增溶能力，采用反溶剂诱导法制备了GA-EA和EGCG-EA二元自组装复合物，探究了不同浓度GA和EGCG对EA的增溶能力，结果如图2所示。图2A中结果表明，GA浓度为0.2％、0.4％、0.8％、1％、1.5％、2％时，EA的浓度分别为2.16、6.39、12.15、24.69、73.28、64.45μg/mL。结果证明GA单体即可与EA组装复合并增溶EA，且增溶能力随着GA浓度提高而增强，当GA浓度为1.5％时对鞣花酸增溶能力最强。但当GA浓度不断升高时，GA因降温而析出的现象愈发严重，这也是GA浓度高于1.5％时对EA增溶能力反而下降的原因。因此，抑制GA析出才能够维持EA与GA之间的相互作用。不同浓度EGCG对EA的增溶能力如图2B所示。结果表明，EGCG浓度为0.2％、0.4％、0.8％、1％、1.5％、2％时，EA的浓度分别为1.57、2.14、2.52、4.94、12.39、10.18μg/mL。可以发现，EGCG单体直接用于EA的增溶能力很弱，表明EGCG单体与EA间难直接实现稳定的组装。
4.2.2EA-GA-EGCG自组装复合物对鞣花酸的增溶考察
上述结果表明，GA与EA能够形成自组装复合物，但稳定性有限，且EGCG无法直接与EA直接进行组装。因此，在制备三元自组装复合物时，研究考察并对比了三种成分不同的复合次序对复合物形成的影响。不同加入顺序制备EA-GA-EGCG复合物时，鞣花酸的增溶浓度如图3所示。结果表明，当先混合GA和EGCG溶液再滴加EA时，EA的浓度为82.28μg/mL；当先向EGCG溶液中滴加EA，再等体积混合GA溶液时，EA浓度为48.27μg/mL；当先向GA溶液中滴加EA，再等体积混合EGCG溶液时，EA浓度为122.32μg/mL。与上述4.2.1结果共同表明，鞣花酸自组装体系中，GA与EA间实现了第一步组装，随后加入的EGCG与GA-EA复合物间实现了第二步组装。因此，最优的复合次序为先使GA与EA形成二元复合物，再加入EGCG行程三元复合物。
4.2.3增溶物质加入比例
使用不同GA与EGCG摩尔比制备三元复合物时，EA的增溶浓度如图4所示。结果表明，GA与EGCG的摩尔比为2:1，3:1，4:1，5:1和10:1制备复合物时，EA的浓度分别为39.36、202.94、122.23、47.05和37.82μg/mL。可以发现，当GA与EGCG摩尔比为3:1时，能最大程度地增溶EA。
4.2.4复合物制备工艺筛选
采用不用的复合物制备工艺制备EA-GA-EGCG复合物时，EA的增溶浓度如图5所示。结果表明，在超声、磁力搅拌、恒温水浴和冷凝回流条件下制备EA-GA-EGCG复合物时，EA的浓度分别为55.95、38.92、202.94和43.93μg/mL，恒温水浴为最优工艺。
4.2.5复合物制备水浴温度考察
在不同的水浴温度下制备EA-GA-EGCG复合物时，EA的增溶浓度如图6所示。结果表明，在50、60、70、80和90℃条件下制备EA-GA-EGCG复合物时，EA的浓度分别为78.68、89.76、202.94、167.62和50.08μg/mL。
4.3鞣花酸复合物的表征
4.3.1稳定性、粒径结果
由鞣花酸复合物的多重光结果显示，TSI指数在4h后趋于平稳，且TSI指数在3左右，低于鞣花酸单体在水溶液中的TSI指数，说明鞣花酸复合物能够有效增溶和稳定鞣花酸。粒径结果显示，鞣花酸复合物在溶解前期有一定波动，可能和复合物的溶解过程有关。而鞣花酸复合物粒径在后期(4h)后趋于稳定，粒径在150nm左右。以上结果均显示复合物能够有效稳定鞣花酸分子，且复合物的粒径在150nm左右(图7)。
4.3.2透射电镜
透射电镜可观察溶液中自组装复合物的微观结构，其结果有助于推断成分间的相互作用。如图8所示，鞣花酸复合物呈现出较规律的层状堆叠长棒状结构，其长度约300～500nm，也有部分呈直径约100nm的类球状。据文献Self-Assembly of Naturally SmallMolecules into Supramolecular FibrillarNetworks for Wound Healing报道，GA可通过π-π堆叠和氢键相互作用形成层状堆叠的长棍状结构，结合鞣花酸复合物制备时物质的加入顺序，可推测图中棍状主体即为GA堆叠形成，而EA被嵌入了其层状结构之中。EGCG为最后加入，可能存在于棍状主体外层，其通过氢键与GA结合，有效地稳定了GA的堆叠结构。
4.4复合物自组装机制研究
4.4.1红外光谱
当分子间或分子内存在非共价相互作用时，红外光谱中对应振动吸收峰的位移或强度会产生规律性变化。图9中展示了各样品的红外光谱图。在EA的FTIR光谱中，3477cm-1处是-OH的伸缩振动峰，1720cm-1处的强吸收峰是酯键上羰基的伸缩振动峰，在1449-1620cm-1范围内的吸收峰是芳环骨架的特征吸收峰。在GA的FTIR光谱中，3495cm-1处是-OH的伸缩振动峰，1666cm-1处是羰基的伸缩振动峰。在EGCG的FTIR光谱中，3480cm-1处是-OH的伸缩振动峰，1690cm-1处是羰基的伸缩振动峰。在三者的物理混合物的FTIR光谱中，分别在3558cm-1、3495cm-1、3356cm-1和3382cm-1观察到了EGCG、GA和EA的特征吸收峰，表明物理混合物是各单体的简单混合，并不存在相互作用。在EA-GA复合物对应的光谱中，-OH的吸收峰向低波数大幅移动至3391cm-1，且峰型较宽，表明EA与GA的羟基间形成了分子间氢键；此外，在1695cm-1出现了一个属于羰基的强吸收峰，推测GA中的-COOH形成了分子间氢键，从而使-COOH上的羰基间发生了缔合，形成了GA二聚体。在EA-GA-EGCG复合物对应的光谱中，-OH的伸缩振动峰进一步大幅向低波数移动，在3202cm-1处出现一个极宽且钝的振动吸收峰，表明三者间羟基间形成了大量氢键；1694cm-1处仍出现了羰基的振动吸收峰，与EA-GA复合物中1695cm-1相较无明显位移，因此表明EGCG加入后，GA仍保留二聚体结构，以氢键的增多为主要改变。
4.4.2X射线衍射分析
一般来说，疏水性生物活性物质从无定形颗粒中释放出来比从晶态颗粒中释放出来更有效。因此，我们使用XRD谱图来评估复合物中EA的物理状态。所有样品的XRD图谱如图10所示。粉末状EA由于是晶体，在2θ值为12.2-28.2°范围内有多个明显的衍射峰(12.2，13.5，13.9，17.4，20.9，23.8，25.1，26.2和28.2)。同样，GA和EGCG单体也属于结晶体，具有较多的衍射峰。不难发现，EA-GA复合物和EA-GA-EGCG复合物的衍射峰明显减少且减弱，这表明各单体之间的作用力使各自的结晶倾向受到抑制，这不仅是EA溶解度大幅增加的原因，也一定程度解释了GA和EGCG溶解度的小幅提升。然而，在复合物的谱图中，仍然存在几个明显的衍射峰，这是由于复合物中始终存在未发生相互作用而游离的结晶态单体存在。
4.4.3H1核磁共振氢谱
为了进一步探究鞣花酸复合物的形成机理，研究对比了自组装复合物形成过程中1H核磁共振氢谱的变化，图11为各样品的1H-NMR谱图。在GA的1H-NMR谱图中，由低场至高场，位于12.22ppm为羧基氢的吸收峰、9.18ppm为间位酚羟基氢的吸收峰、8.82ppm为对位酚羟基的吸收峰、6.91ppm为苯环上氢的吸收峰。GA中羧基氢位移值处于10-13ppm范围内，这证明羧基是以二聚体形式存在且形成了双分子氢键，可以推测GA的层状堆叠结构中两分子的GA为一个单位形成堆叠。形成EA-GA二元复合物后，GA的羧基氢峰型愈发尖锐，表明相较于GA单体，GA中部分羧基可能与EA结构中的羟基形成了氢键，从而使GA羧基间氢键减弱。当形成EA-GA-EGCG三元复合物后，该峰的峰型转变为宽峰，GA羧基氢交换速度变慢，推测EGCG的加入使EA与GA间氢键作用力减弱，且进一步使GA分子间的自组装力增强。在EA的1H-NMR谱图中，10.69ppm为四个酚羟基氢的吸收峰，7.46为苯环上氢的吸收峰。当EA形成EA-GA二元复合物后，位于10.69ppm处的单峰裂解为对称的双峰，这表明EA的酚羟基与GA形成了分子间氢键，使EA临近酚羟基上的氢间发生耦合，导致峰裂分。当EA-GA进一步形成EA-GA-EGCG三元复合物后，此双峰同步向低场位移，表明EA与EGCG分子间可能也形成了氢键，氢键增多。
4.4.4分子动力学模拟
结合上述表征与光谱分析结果，研究通过高斯计算模拟预测了分子间的自组装结合位点与相互作用方式，并计算了分子组装过程中的吉布斯自由能变(△G)，以便更清晰地说明鞣花酸三元复合物的形成机理并解释鞣花酸的增溶现象。如图12所示，GA分子间可通过羧基形成的氢键构成一个二聚体平面结构，再以二聚体为单位通过π-π堆积作用构成堆叠的层状结构，这与上述推测相符。EA分子中有四元环，是典型的平面结构，当向GA中加入EA时，EA可嵌入GA形成的平面层状结构间隙，并通过氢键和π-π相互作用与GA结合。该过程的吉布斯自由能变为-13.7kcal/mol，表明GA与EA的组装为自发发生且反应趋势较大。EGCG为非平面结构，且含有多个活泼氢。当向EA-GA二元复合物中加入EGCG后，EGCG可与相邻夹层的GA分别形成氢键从而将EA分子“包封”在它们所形成的立体空间内。该过程的吉布斯自由能变为-4.9kcal/mol，也是自发发生，但反应趋势不如GA-EA强烈。推测除EGCG外，其他能够与相邻GA夹层同时形成氢键的一种或多种化学成分都可替代EGCG用于制备鞣花酸三元复合物。
4.5鞣花酸复合物体外抑菌活性
为探究鞣花酸复合物是否具有更强的体外抑菌活性，研究对比了鞣花酸单体、EA-GA-EGCG混合物和EA-GA-EGCG复合物的抑菌活性，并选择了十分常见的皮肤感染菌金黄色葡萄球菌进行实验。结果如图13所示，NMP溶解的鞣花酸单体几乎无抑菌活性，其抑菌圈直径为6.3±0.24mm，且所用到的溶剂NMP并无抑菌活性；物理混合物的抑菌圈直径为12.5±0.71mm；鞣花酸复合物具有最强的抑菌活性，其抑菌圈直径为16±0.63mm。物理混合物能够抑制金黄色葡萄球菌的生长，这主要与溶液中溶解的GA和EGCG的抑菌能力有关。当EA与GA、EGCG形成自组装复合物后，表现出较溶解的EA单体及物理混合物都更强的抑菌能力，这表明它们可能在增溶EA后能够持续递送EA与细菌结合，且各成分能够发挥一定的协同抗菌作用，从而更高效地使细菌失活。
实施例2本发明复合物及凝胶的制备
复合物制备工艺：使用氮甲基吡咯烷酮溶解鞣花酸，得到15mg/mL的鞣花酸储备液；称量150mg没食子酸并加入5mL水，在70℃水浴条件下使其溶解，随后趁热向其中滴加134μL鞣花酸储备液，此为溶液A；称量135mgEGCG并加入5mL水，在70℃水浴条件下使其溶解，此为溶液B；趁热混合A和B溶液即得复合物溶液。
复合物凝胶制备工艺：使用氮甲基吡咯烷酮溶解鞣花酸，得到15mg/mL的鞣花酸储备液；称量150mg没食子酸并加入5mL水，在70℃水浴条件下使其溶解，随后趁热向其中滴加134μL鞣花酸储备液，此为溶液A；称量135mg EGCG并加入5mL水，在70℃水浴条件下使其溶解，随后向其中加入150mg透明质酸，于磁力搅拌器上充分溶解混匀，得凝胶C；将溶液A与凝胶C混合即得复合物凝胶。
实施例3鞣花酸复合物凝胶敷料的制备
1仪器与试剂
1.1仪器
1.2试剂
透明质酸(上海源叶生物科技有限公司，批号：J31IS206158)；鞣花酸(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq21010403，质量分数≥98％)；没食子酸(上海麦克林生物科技有限公司，批号：C14384461，质量分数≥99％)；表没食子儿茶素没食子酸酯/EGCG(四川恒诚致远生物科技有限公司)；氮甲基吡咯烷酮(成都科隆化学品公司)；甲醇(美国Sigma公司，货号：WXBD7361V)；磷酸(美国Sigma公司，美国，货号：WXBD2060V)；琼脂(广州硕谱生物科技有限公司)；脑心浸出液(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。
2鞣花酸复合物水凝胶敷料的制备
2.1凝胶基质种类筛选
在70℃恒温水浴条件下，向制备好的鞣花酸复合物中分别加入1.5％的多糖基凝胶材料(透明质酸、季铵盐壳聚糖、lota卡拉胶)搅拌混匀。各样品使用50％甲醇稀释后使用0.45μm微孔滤膜滤过后测定其中EA的浓度以评估不同凝胶材料对复合物的稳定作用。
2.2凝胶基质用量考察
在70℃恒温水浴条件下，向制备好的三元复合物中分别加入0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％的凝胶材料搅拌混匀。各样品使用50％甲醇稀释后使用0.45μm微孔滤膜滤过后测定其中EA的浓度以评估不同凝胶基质用量对复合物的稳定作用。
2.3凝胶制备方法考察
分别采用以下三种方法制备鞣花酸复合物凝胶：①直接向制备好的鞣花酸复合物中加入凝胶材料，搅拌混匀即得；②在70℃恒温水浴条件下，先将凝胶材料与EGCG混合，再向其中加入等体积的GA-EA二元复合物，搅拌混匀即得；③在70℃恒温水浴条件下，先将凝胶材料、EGCG、GA混合，再向其中滴加EA，搅拌混匀即得。
3鞣花酸复合物水凝胶的表征
3.1凝胶中鞣花酸的体外释放行为研究
将2mL水凝胶浸入含有10mL PBS的试管中，并将管置于37℃摇床中。在特定时间取出液体，将等体积的PBS加入到释放系统中。48小时内测量EA的释放。液体在289nm处的吸光度和EA溶解度的标准曲线用于测定水凝胶中EA的释放。使用零级、一阶、Higuchi和Ritger-Peppas模型分析EA在水凝胶中的释放机制。
3.2粒径及PDI
凝胶用蒸馏水稀释10倍，测定其粒径和PDI，每个样品重复3次。
3.3硬度、脆度、粘附性与弹性
首先，在室温下将水凝胶制备成圆柱形样品(直径为14mm、高度为3mm)。然后，使用质构仪(rapid TA+，ShanghaiTengbo instrument)进行全质构分析(texture profileanalysis，TPA)。实验采用X探头，测前速率Xmm/s，测试速率Xmm/s，测后速率Xmm/s，压缩程度X％，停留时间5s，触发力Xg。每个样品重复实验3次。
硬度gf 脆度gf 粘附性gf＊s 弹性
阿拉丁＞1.8 285.3 285.3 -1724.877 0.817
307.5 257.9 -1800.472 0.826
300.1 300.1 -1764.319 0.822
均值 297.6 281.1 -1763.222667 0.821667
标准差 11.3 21.41121 37.80942298 0.004509
3.4凝胶流变性能
采用流变仪评价复合物凝胶的流变性能。线性粘弹性在X-X％应变和XHz的固定角频率下进行。剪切粘度在0.1至1000s-1的剪切速率下进行。
4结果与讨论
4.1凝胶的制备方法考察
4.1.1凝胶基质筛选
研究对比了三种多糖类凝胶材料对复合物的稳定作用，结果如图14所示。在固定基质材料用量的情况下，透明质酸制备的凝胶对复合物的稳定作用最优，因此选择透明质酸作为凝胶基质进行后续凝胶的制备。
4.1.2凝胶基质用量考察
在筛选出透明质酸为凝胶基质的基础上，分别以透明质酸含量0.5％、1％、1.5％、2％和2.5％制备鞣花酸复合物凝胶，所制备的凝胶的载药量见图15。当透明质酸含量为1.5％时，所制备的凝胶对鞣花酸复合物的稳定作用最强，能够包载最大量的鞣花酸，因此最终选择凝胶的基质用量为1.5％。
4.1.3凝胶制备方法考察
研究对比了三种鞣花酸复合物凝胶的制备方法，结果如图16所示，结果表明，在70℃恒温水浴条件下，先将凝胶材料与EGCG混合，再向其中加入等体积的GA-EA二元复合物，所制备得到的凝胶最为澄清，能够包载约200μg/mL的鞣花酸，以此作为凝胶的制备方法。
以下通过药效试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明凝胶用于糖尿病伤口的药效学研究
1仪器与材料
1.1仪器
1.2材料
鞣花酸(四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq21010403，质量分数≥98％)；没食子酸(上海麦克林生物科技有限公司，批号：C14384461，质量分数≥99％)；EGCG(四川恒诚致远生物科技有限公司)；透明质酸(海源叶生物科技有限公司，批号：J31IS206158)；琼脂(广州硕谱生物科技有限公司)；脑心浸出液(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)；氮甲基吡咯烷酮(成都科隆化学品公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；。
1.3动物
SPF级雄性SD大鼠16只，体重150g-180g，购于斯贝福生物技术有限公司(生产许可证号：SCXK(京)2019-0010)。所有大鼠饲养在一个标准的动物饲养室，温度：20～25℃，湿度40％～70％，12h昼夜交替照明。本研究由成都中医药大学伦理委员会审核批准。
2凝胶抑菌活性评价
2.1细菌的培养
同实施例13.7.1项下。
2.2杯蝶法
在每个涂有200μL金黄色葡萄球菌(1×106CFU/mL)菌液的培养基表面分散放置三个已灭菌的牛津杯，并轻轻按压使其与培养基接触且无空隙。随后分别向牛津杯中加入鞣花酸凝胶、混合物凝胶和复合物凝胶。将培养基放置在37℃下培养24小时后使用数字卡尺记录抑菌圈的直径。
3凝胶的创面修复效果
3.1模型建立及给药
造模前，将所有大鼠于饲养环境下适应性喂养3天，随后采用高脂饲料喂养三周。喂养三周后，禁食处理12h后称重。按照剂量35mg/kg向大鼠腹腔注射1％的STZ(用柠檬酸钠缓冲液避光配置)以破坏大鼠的胰岛β细胞。继续高脂饲料喂养三天后，尾静脉采血测量大鼠血糖，血糖值大于16.8mmol/L即视为高血糖大鼠。对照组大鼠正常饲养。将所有大鼠使用20％乌来糖麻醉，去除背部的毛发后用75％的酒精消毒，再使用皮肤打孔器在每只大鼠的背部打2个8mm的圆孔。将4只健康大鼠与16只高血糖大鼠分为对照组(健康大鼠，不给药)、模型组(高血糖大鼠，不给药)、EA凝胶组(高血糖大鼠，鞣花酸凝胶)、Phm凝胶组(高血糖大鼠，物理混合物凝胶)与Com凝胶组(高血糖大鼠，鞣花酸复合物凝胶)，每组四只。所有治疗每天进行一次，持续14天。
3.2宏观分析与组织病理学分析
创伤后第0、2、6、10和14天记录伤口面积，创面愈合率(％)＝(C0-C1)/C0×100％(C0是初始面积，C1是测量面积)。此外，为了进一步观察皮肤再生和胶原沉积情况，在第7天和第14天分别处死相应大鼠，取创面及附近皮肤样品，将其浸泡在10％福尔马林中，按照标准程序对皮肤组织进行苏木精-伊红(H&E)染色和Masson染色。
4结果与讨论
4.1凝胶抑菌活性，见图17。
4.2糖尿病大鼠创面愈合效果
各组糖尿病大鼠创面愈合情况如图18A-B所示，结果可以发现，EAgel组和Mix gel组与模型组相似，在6天内愈合缓慢，且愈合前期伤口周围红肿，推测为伤口感染，结果表明未溶解的EA及其与GA和EGCG的物理混合物并不能改善糖尿病大鼠伤口愈合困难的问题。而对照组和Comgel组前期愈合程度明显优于其他三组，且伤口边缘清晰平整，说明分子态存在的EA能够明显改善糖尿病大鼠伤口前期因炎症等因素导致的愈合困难。在D7-D14期间，各组愈合情况均较快，总体契合糖尿病大鼠伤口前期愈合难而后期趋于正常的愈合特征。在最终的D14当天，可以看到Com gel组伤口面积最小，而模型组伤口最大，且伤口周围皮肤伴有损伤。愈合效果最差。如图18C所示为各组大鼠的伤口愈合率，结果表明，PE gel组和Mixgel组无明显差异，愈合率略高于模型组但低于对照组，推测主要是制剂中的透明质酸基质发挥了一定的促愈合作用。而Com gel中分子态存在的鞣花酸能够显著改善糖尿病伤口前期的愈合困难并加速伤口收缩闭合，使得愈合率显著高于对照组。
4.3创面H&E染色分析
完整的皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分构成。如图19所示，在糖尿病大鼠伤口愈合七天后，Model组、PE gel组和Mixgel组表皮结构完整度低，且均有程度不一的隆起，伤口部位有明显的炎症与肿胀，其中EAgel组和Mixgel组差异不明显，三组皮下均有大量未成熟肉芽组织，但相较模型组程度略轻。对照组与Com gel组表皮最为完整，尤其是Com gel组表皮连续且平整，恢复情况最佳；此二组皮下未成熟肉芽组织两侧已见结构完整的皮肤附属器，包括皮脂腺与毛囊，表明皮下恢复状况良好。伤口愈合14天后，各组表皮均较完整，组织排列整齐，皮肤附属器趋于完整。其中，Com gel组表皮最为光滑平整，伤口恢复最佳。可注射自愈粘合剂壳聚糖水凝胶，具有抗氧化、抗菌和止血活性，可快速止血和皮肤伤口愈合。
4.4创面Masson染色分析
如图20所示，在糖尿病大鼠伤口愈合七天后，对照组与Com gel组的胶原沉积量明显高于模型组、EAgel组和Mixgel组；其中，Com gel组的胶原纤维密度显著强于对照组，表现出最强的皮肤再生能力。愈合14天后，各组均显示出相对密集的胶原沉积和紧密的排列，其中，Com gel组和Control组真皮区域的胶原生成量比其他组高，且胶原沉积更明显，表明鞣花酸复合物能更有效地促进创面部位的胶原生成。

Claims (10)

1.一种鞣花酸自组装纳米复合物，其特征在于：它是由鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG制备而成，其中，
没食子酸与EGCG的摩尔配比为：(2-10)︰1；
鞣花酸、没食子酸的摩尔配比为：1︰(17-177)。
2.根据权利要求1所述的鞣花酸自组装纳米复合物，其特征在于：所述的没食子酸与EGCG的摩尔配比为：3︰1；鞣花酸、没食子酸的摩尔配比为：1︰133。
3.一种制备权利要求1或2任意一项所述的鞣花酸自组装纳米复合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤:
a、称取各摩尔配比的原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG；
b、鞣花酸储备液的制备：将鞣花酸溶解在氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，得到浓度为2.16-64.45μg/mL的鞣花酸储备液备用；
c、没食子酸、EGCG水溶液的制备：分别称取没食子酸、EGCG，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的没食子酸水溶液、EGCG水溶液；
d、向没食子酸溶液中滴加鞣花酸储备液摇匀，形成二元复合物，再加入等体积的EGCG溶液，分别以超声、磁力搅拌、50-90℃恒温水浴或冷凝回流，制备成EA-GA-EGCG三元复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
c步骤所述的没食子酸水溶液的浓度为1.5％；
d步骤所述的超声条件为：250W，33kHz，3min；磁力搅拌条件为：600r/min，70℃，30min；恒温水浴的条件为70℃；冷凝回流的时间为：30min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：d步骤制备三元复合物的方法是恒温水浴。
6.权利要求1或2所述的鞣花酸自组装纳米复合物在制备抑菌、抗菌的药物中的用途。
7.一种鞣花酸复合物凝胶，其特征在于：它是将权利要求1或2所述的鞣花酸自组装纳米复合物包裹在多糖基质中，制备成凝胶剂。
8.根据权利要求7所述的凝胶，其特征在于：所述的多糖基质为：透明质酸、季铵盐壳聚糖、lota卡拉胶中的一种或两种以上的混合；所述的基质的用量为鞣花酸复合物的0.5-2.5％；
优选地，所述的多糖基质为：透明质酸；基质用量为鞣花酸复合物的1.5％。
9.一种制备权利要求7或8所述的凝胶的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、称取各摩尔配比的原料鞣花酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG；
b、鞣花酸储备液的制备：将鞣花酸溶解在氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，得到浓度为2.16-64.45μg/mL的鞣花酸储备液备用；
c、没食子酸、EGCG水溶液的制备：分别称取没食子酸、EGCG，在70℃水浴条件下分别配制0.2％，0.4％，0.8％，1％，1.5％和2％的没食子酸水溶液、EGCG水溶液；
d、向没食子酸溶液中滴加鞣花酸储备液摇匀，形成二元复合物；
e、在70℃恒温水浴条件下，先将凝胶基质与EGCG混合，再向其中加入等体积的d步骤制备的GA-EA二元复合物，混合后即得凝胶。
10.权利要求7或8所述的凝胶在制备治疗糖尿病创面的外用药物中的用途。
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