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CN117947169B - 早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物组合、多重pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物组合、多重pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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CN117947169B CN202410149219.1A CN202410149219A CN117947169B CN 117947169 B CN117947169 B CN 117947169B CN 202410149219 A CN202410149219 A CN 202410149219A CN 117947169 B CN117947169 B CN 117947169B
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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物、多重PCR检测试剂盒及其应用。本发明的早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物，选自目标基因ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GAD2、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12任意至少一个基因中任意至少一段甲基化区域，通过检测对应的甲基化区域来对子宫内膜癌进行诊断，具有更高的灵敏度和特异性，对于提高子宫内膜癌高危人群的诊断率、实现早期干预治疗和降低病死率具有非常重要的意义。

Description

早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物组合、多重PCR检测 试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物、多重PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，又称子宫体癌，约占妇科恶性肿瘤的20-30%。近年来该肿瘤发病率逐渐上升且有明显的年轻化趋势，在部分发达地区其发病率已达妇科恶性肿瘤第一位。
由于子宫内膜癌具有不规则阴道流血和阴道排液的早期症状，约有70%的子宫内膜癌患者诊断时是局限于子宫体的早期病变。但由于该症状的不特异性，仍有较大一部分患者发现时即失去早期诊断的机会。早期诊断对子宫内膜癌具有重要意义。一方面早期诊断、早期治疗可显著提升患者的生存率及生活质量；另一方面，随着该肿瘤年轻化趋势，更多的子宫内膜癌患者仍有生育需求，早期发现将为保育治疗提供可能。
目前尚无推荐的可以对子宫内膜癌进行常规筛查的手段。依据当前子宫内膜癌的诊治指南，临床上主要采用阴道超声及血清肿瘤标志物CA125等进行辅助诊断，但是上述方法存在灵敏度和/或特异度不高的问题，不适用基于人群的子宫内膜癌的早期常规筛查。子宫内膜细胞采集器取材行液基细胞学检查可用于筛查症状人群及高危人群子宫内膜病变，但其易受操作者影响，灵敏度受限，且取样具有一定的创伤性。对于子宫内膜癌的早期筛查，仍需要开发更为准确、更为无创的标志物。
DNA甲基化是表观遗传学中的一种，即在胞嘧啶碱基的5号碳原子上添加一个甲基，这种修饰通常跟基因的沉默相关。DNA甲基化是基因表达的关键表观遗传调节因子，通常导致基因表达缺陷。肿瘤抑制基因的甲基化增加是许多肿瘤的早期事件。目前，甲基化标记检测是目前被普遍认可的肿瘤筛查标志物来源。此外，采用DNA甲基化检测作为肿瘤筛查手段，具有高敏感性和特异性的优势。但是目前缺乏针对子宫内膜癌甲基化基因检测的检测技术、方法和产品。因此，急需提供一种甲基化来源的、可区别子宫内膜癌与非癌群体的早期筛查标志物，且该标志物可用于尿液、血液等体液样本，拭子、刷片、灌洗液等脱落细胞采集样本，及肿瘤组织样本等，并能在各类无创采集样本中均可排除本底信号干扰而准确区别子宫内膜癌及其他疾病/健康个体的检测靶点。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物。
本发明发现了可用于子宫内膜癌或其癌前病变的诊断的新的甲基化基因：ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GAD2、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101和ZSCAN12，检测这些基因的甲基化以诊断子宫内膜癌或其癌前病变，具有更高的灵敏度和特异性。本发明为子宫内膜癌和其癌前病变的诊断提供了新的标志物和诊断策略。
本发明另一目的在于提供一种用于检测子宫内膜癌早期筛查诊断的多重PCR检测试剂盒。
本发明再一目的在于提供上述甲基化基因标志物在制备子宫内膜癌诊断试剂中的应用。
本发明再一目的在于提供上述多重PCR检测试剂盒在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物，选自目标基因ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GAD2、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12任意至少一个基因中以下任意至少一段甲基化区域：
ADARB2基因：chr10: 1779052-1779183、chr10: 1779756-1779910；
ADCYAP1基因：chr18: 907522-907672、chr18: 908206-908385；
ADHFE1基因：chr8: 67344466-67344599；
C17orf64基因：chr17: 58498643-58498859、chr17: 58498879-58499081；
CDO1基因：chr5: 115152259-115152414；
GAD2基因：chr10: 26504914-26505063；chr10: 26506264-26506424；chr10:26506907-26507068；
GRM7基因：chr3: 6904068-6904274；
GYPC基因：chr2: 127413900-127414152；
KCNA1基因：chr12: 5018675-5018893；chr12: 5019386-5019578；
KCNQ5基因：chr6: 73331034-73331188；chr6: 73331252-73331411；
NETO1基因：chr18: 70535858-70535996；
RYR2基因：chr1: 237205894-237206034；
SORCS3基因：chr10: 106400776-106400914、chr10: 106401432-106401587；
STX16基因：chr20: 57225138-57225270；
TCTEX1D1基因：chr1: 67218010-67218198；
TMEM101基因：chr17: 42092213-42092341；
ZSCAN12基因：chr6: 28367209-28367379、chr6: 28367431-28367676。
本发明通过对子宫内膜癌相关基因种类，以及每个基因甲基化区域进行筛选，最终筛选出上述十七个标志物基因（或称为靶基因），及其对应的功能最优甲基化区域，能够通过各标志物基因甲基化结果确定判读界值，各甲基化区域结果可用于子宫内膜癌的早期检测，结果准确性非常高，能够给临床医生提供辅助诊断参考。
本发明提出了新的可以作为子宫内膜癌或其癌前病变诊断的标志物，即上述发生甲基化的基因。具体的，本发明以目标基因ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GAD2、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12中至少一个作为靶点，通过检测对应的甲基化区域来对子宫内膜癌进行诊断，具有更高的灵敏度和特异性，具有作为诊断或筛选子宫内膜癌的标志物的潜力和前景。因此，上述基因中的至少一个可以作为子宫内膜癌的生物标志物，对于提高子宫内膜癌高危人群的诊断率、实现早期干预治疗和降低病死率具有非常重要的意义。
进一步的，通过体外检测样本中任意至少一个目标基因对应的甲基化区域对子宫内膜癌进行诊断。所述的样本可包括尿液、血液等体液样本，拭子、刷片、灌洗液等脱落细胞采集样本，及肿瘤组织样本等。
更进一步的，当所述的样本为拭子、刷片、灌洗液等脱落细胞采集样本，以至少一个上述目标基因作为靶点，通过检测对应的甲基化区域对子宫内膜癌进行诊断，可实现灵敏度和特异性均高达100%。
更进一步的，当所述的样本为尿液时，以单一一个上述目标基因作为靶点，通过检测对应的甲基化区域进行诊断，仍可实现高达91%的灵敏度和高达95%的特异性。现有技术多利用子宫内膜组织和子宫颈抹片细胞的检测，本发明仅需一个分子标志（即一个基因）即可用于尿液样本的检测，并且能达到较高的灵敏性和特异性，为子宫内膜癌的检测提供了一种更简便、准确的方法。
进一步的，以上述两种或以上的基因甲基化组合的形式对子宫内膜癌或癌前病变进行诊断，能够显著提高灵敏度和特异性。
本发明还提供早期检测子宫内膜癌的检测引物，用于对应检测上述标志物基因甲基化区域的甲基化状态，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：
ADARB2基因：
chr10: 1779052-1779183对应检测引物为SEQ ID NO:1-2；
chr10: 1779756-1779910对应检测引物为SEQ ID NO:3-4；
ADCYAP1基因：
chr18: 907522-907672对应检测引物为SEQ ID NO:5-6；
chr18: 908206-908385对应检测引物为SEQ ID NO:7-8；
ADHFE1基因：
chr8: 67344466-67344599对应检测引物为SEQ ID NO:9-10；
C17orf64基因：
chr17: 58498643-58498859对应检测引物为SEQ ID NO:11-12；
chr17: 58498879-58499081对应检测引物为SEQ ID NO:13-14；
CDO1基因：
chr5: 115152259-115152414对应检测引物为SEQ ID NO:15-16；
GAD2基因：
chr10: 26504914-26505063对应检测引物为SEQ ID NO:17-18；
chr10: 26506264-26506424对应检测引物为SEQ ID NO:19-20；
chr10: 26506907-26507068对应检测引物为SEQ ID NO:21-22；
GRM7基因：
chr3: 6904068-6904274对应检测引物为SEQ ID NO:23-24；
GYPC基因：
chr2: 127413900-127414152对应检测引物为SEQ ID NO:25-26；
KCNA1基因：
chr12: 5018675-5018893对应检测引物为SEQ ID NO:27-28；
chr12: 5019386-5019578对应检测引物为SEQ ID NO:29-30；
KCNQ5基因：
chr6: 73331034-73331188对应检测引物为SEQ ID NO:31-32；
chr6: 73331252-73331411对应检测引物为SEQ ID NO:33-34；
NETO1基因：
chr18: 70535858-70535996对应检测引物为SEQ ID NO:35-36；
RYR2基因：
chr1: 237205894-237206034对应检测引物为SEQ ID NO:37-38；
SORCS3基因：
chr10: 106400776-106400914对应检测引物为SEQ ID NO:39-40；
chr10: 106401432-106401587对应检测引物为SEQ ID NO:41-42；
STX16基因：
chr20: 57225138-57225270对应检测引物为SEQ ID NO:43-44；
TCTEX1D1基因：
chr1: 67218010-67218198对应检测引物为SEQ ID NO:45-46；
TMEM101基因：
chr17: 42092213-42092341对应检测引物为SEQ ID NO:47-48；
ZSCAN12基因：
chr6: 28367209-28367379对应检测引物为SEQ ID NO:49-50；
chr6: 28367431-28367676对应检测引物为SEQ ID NO:51-52。
本发明还提供一种用于检测子宫内膜癌早期筛查诊断的多重PCR检测试剂盒，其包括用于检测目标基因甲基化的试剂；
所述目标基因选自如下基因中的至少一种：ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GAD2、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12。
所述的试剂包括以上所述的检测引物中的至少一种。
进一步的，所述多重PCR检测试剂盒的工作过程可为：
（1）提取待测样本中的DNA，并进行转化，得到修饰后DNA；
（2）采用多重PCR检测试剂盒对修饰后DNA进行检测，检测程序包括两轮PCR反应；第一轮多重PCR的引物包括靶向区域扩增引物片段，正向测序引物和反向测序引物的测序连接引物片段两个部分；第二轮多重PCR的引物包括包含一段与第一轮PCR引物中测序引物连接片段的互补片段及另一段包含测序接头的引物片段。
上述工作过程中，所述的转化指实现DNA甲基转化；所用的试剂为常规甲基转化的试剂即可，如可包括但不限于重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或肼盐处理，酶学转化等。
进一步的，对经两轮PCR反应得到的扩增产物进行二代测序。
进一步的，靶向区域扩增引物片段的长度为26-38bp。
进一步的，第一轮多重PCR得到的正向检测引物包括正向测序引物+ NNNNNNNN +正向扩增引物，其长度可为63-75bp；反向检测引物包括反向测序引物+ NNNNNNNN +反向扩增引物，其长度可为69-72bp；也可根据测试仪进行调整。
二代测序可直接使用Illumina测序仪进行（PE150，PE250，SE150，SE250等测序模式均可）。
本发明还提供上述甲基化基因标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
本发明还提供上述多重PCR检测试剂盒在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
所述诊断产品包括试剂盒、制剂和芯片中的任意一种。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明通过对子宫内膜癌相关基因种类，以及每个基因甲基化区域进行筛选，最终筛选出上述十七个标志物基因（或称为靶基因），及其对应的功能最优甲基化区域，能够显著提高对早期子宫内膜癌检测的灵敏度以及特异性。本发明的甲基化基因标志物可用于尿液、血液等体液样本，拭子、刷片、灌洗液等脱落细胞采集样本，及肿瘤组织样本等，并能在各类样本中均可排除本底信号干扰而准确区别子宫内膜癌及其他疾病/健康个体的检测靶点。对于无创采集的尿液样本，即使其中DNA模板浓度低，本发明的甲基化基因标志物亦可实现优异的检测灵敏度以及特异性，减少不必要的创伤取样，具有取样无创、更高的灵敏度特异性等优点，不仅优化了医疗资源的分配，提高了受试者的接受度，改善了筛查体验，而且能够确保结果的准确性，以帮助实现子宫内膜癌的早发现、早诊断、早治疗的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为多重PCR扩增甲基化测序用于多个甲基化区域测序的试剂盒检测流程图。
图2为多重PCR扩增甲基化测序的文库构建流程图。
图3为DNA片段化对多重靶向扩增子甲基化测序效果的影响图。
图4为样本起始DNA上样量对多重靶向扩增子甲基化测序效果的影响图。
图5为多重靶向扩增子甲基化测序与DNA甲基化芯片技术的重测一致性结果。
图6为基因甲基化标志物在子宫内膜癌的癌组织、癌旁组织及非癌正常组织中的甲基化率水平图。
图7为基因甲基化标志物在子宫内膜癌术前及术后配对样本中的甲基化率改变图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
实施例1：子宫内膜癌的甲基化基因标志物的筛选
本发明利用TCGA公共数据库获取子宫内膜癌的524例癌组织及34例癌旁组织的450K甲基化芯片数据，筛选在子宫内膜癌组织中显著高甲基化的位点；再采用CHAMP.DMP方法进行差异位点筛选，以FDR校正后P值<0.05且癌组织平均甲基化率-癌旁组织平均甲基化率>0.35为筛选标准，共筛选出8730个差异位点。
由于尿液、宫颈刷片、阴道拭子及血液等采样方式除了采集到肿瘤来源的细胞或DNA外，不可避免地会有白细胞或泌尿道上皮细胞等成分的掺入。这些非目标的外源DNA的掺入可能作为背景信号干扰目标标志物的检出。因此，在筛选标志物时应细致处理背景信号的干扰。考虑到上述情况，本发明进一步纳入了TCGA及GEO数据库中来源于女性的78例泌尿道癌旁组织及338例白细胞450k甲基化芯片数据，分别与425例子宫内膜癌癌组织数据进行CHAMP.DMP差异检验。同时满足以下条件的位点纳入筛选范围：（1）两次差异检验FDR校正后P值<0.05且；（2）癌组织平均甲基化率-泌尿道癌旁组织平均甲基化率>0且；（3）癌组织平均甲基化率-白细胞癌旁组织平均甲基化率>0且；（4）泌尿道癌旁的平均甲基化率<0.1且；（5）白细胞的平均甲基化率<0.1。满足上述要求的位点与子宫内膜癌/癌旁差异筛选的差异位点取交集，共有1464个位点纳入下一步筛选过程。
为进一步评估上述1464个候选位点在实际样本中的甲基化水平情况，本发明对在中山大学肿瘤防治中心和佛山市第一人民医院采集的12例子宫内膜癌患者及15例对照的脱落细胞样本进行Illumina Epic 850k芯片检测。该芯片是450K芯片的升级版，保留了大部分450K芯片位点的同时新加入了近40万个甲基化位点。最终确定选择来自C17orf64、CDO1、KCNQ5、STX16、ZSCAN12、KCNA1、ADARB2、SORCS3、GAD2、RYR2、GRM7、ADCYAP1、NETO1、GYPC、TMEM101、ADHFE1及TCTEX1D1在内的17个基因。上述基因对子宫内膜癌诊断效果最佳的甲基化位点及其效果信息见表1。
17个基因的最佳位点的曲线下面积在0.867-0.983之间。其中，C17orf64、CDO1、KCNQ5、STX16、ZSCAN12、KCNA1及ADARB2在内的7个基因的AUC大于0.98；SORCS3、GAD2、RYR2、GRM7、ADCYAP1、NETO1及GYPC在内的7个基因的AUC在0.90-0.95之间。不同基因在检测灵敏度及特异度上展现出不同的优势，其中CDO1、KCNA1及TCTEX1D1基因的灵敏度可达100%，C17orf64、KCNQ5、STX16及ZSCAN12基因的特异度可达100%。这17个基因甲基化标志物除GRM7及GAD2外灵敏度均高于80%；除TCTEX1D1外，特异度均高于80%。综合来看，C17orf64、KCNQ5、STX16及ZSCAN12基因在特异度为100%时，灵敏度可达91.7%；KCNA1基因在灵敏度为100%时，特异度可达93.3%，上述基因在子宫内膜癌与对照间表现出优秀的鉴别能力。
此外，鉴别能力较强的位点围绕最优位点成簇出现，在最佳位点上下游500bp内，上述基因具有1-8个位点的AUC大于0.8，其中14个基因至少有3个及以上的位点AUC高于0.8。AUC>0.8的位点个数小于3个的基因也极有可能是因为Epic 850k芯片设计时这些基因的探针覆盖密度较小、检测位点过少而导致。多位点成簇出现进一步表明上述基因甲基化作为子宫内膜癌诊断标志物的确定性，并有利于甲基化位点检测方法的开发。结果表明，本发明的17个基因在子宫内膜癌和对照人群上中具有优秀的鉴别能力。
表1
备注：A*为最佳位点上下游500bp内AUC>0.8的位点个数。
实施例2：构建多重PCR扩增甲基化测序技术检测标志物甲基化信号
针对实施例1中筛选的17个基因，建立了DNA扩增子靶向甲基化测序的方法，对重亚硫酸盐转化后的DNA进行靶向PCR扩增，并通过二代测序进行检测，得到样本中候选标志物的甲基化水平，流程图如图1所示。具体步骤如下：
2.1 目标区域多重PCR引物的设计
目标区域的确定：位于CpG岛上的位点往往连续出现，为确定最佳的序列扩增范围，本发明首先对前述候选17个差异甲基化位点以基因为单位进行最佳扩增区域选择。以该基因中受试者工作特征曲线的曲线下面积（AUC）最佳位点作为中心，提取所在基因上所有850k芯片包含甲基化位点在脱落细胞及子宫内膜癌组织数据中甲基化率情况，并拉取150-350bp甲基化位点最密集且在脱落细胞及组织中差异最为显著的区域进行下一步引物设计。
目标区域PCR引物的设计：使用MethPrimer等DNA甲基化特异性PCR引物设计软件进行各序列的引物设计。对设计后的引物进行两两配对，对配对引物进行兼容性比较，以尽量避免多对引物之间的引物二聚体及发卡结构等问题，提高引物的成功率。经反复调试，17个目标基因共设计26对引物进行多重PCR检测。引物序列、扩增区域的染色体物理位置及目标基因的信息见表2。其中，“F”表示正向扩增引物，“R”表示反向扩增引物。
表2
2.2 两轮PCR扩增构建目的片段的扩增子文库并上机测序
尿液样本前处理及DNA提取使用ZYMO Quick-DNA™ Urine Kit，DNA重亚硫酸盐转化使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit。对于重亚硫酸盐转化后的DNA样本，本发明建立了针对17个目标基因的26个片段的多重PCR引物系统，可累积检测280个甲基化位点。该方法分为两轮PCR：第一轮多重PCR的引物分为26-38 bp的靶向区域扩增引物片段及29bp（正向引物）和26bp（反向引物）的测序连接引物片段两部分；得到的第一轮多重正向PCR引物的长度在63-75bp，反向PCR引物的长度在69-72bp。第二轮多重PCR的引物包含一段与第一轮PCR引物中测序引物连接片段的互补片段及另一段包含测序接头的引物片段。经过两轮PCR的扩增产物可直接使用Illumina测序仪进行二代测序（PE150，PE250，SE150，SE250等测序模式均可）。两轮PCR引物的设计原理如图2。
具体步骤如下：
（1）第一轮PCR扩增
第一轮PCR为多重PCR扩增体系，其扩增引物分为两部分：{测序引物片段+8个自由碱基+扩增引物片段}。本试剂盒共覆盖本申请所述17个基因在内的28个甲基化区域的检测，各扩增区域的扩增引物片段序列见表2。各基因甲基化检测区域的基本信息、检测序列的参考基因组位置、检测序列长度及检测区域的参考基因组序列见表3。
表3
第一轮多重PCR引物的引物序列设计思路见表4，引物总体构成为“测序引物 +NNNNNNNN + 扩增引物”。正向测序引物序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’；中间加入八个可变碱基“NNNNNNNN”作为区分测序所得序列样本信息的barcode序列；再连接各基因甲基化正向扩增引物，详见表2中的F引物。反向测序引物序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTC-3’；中间加入八个可变碱基“NNNNNNNN”作为区分测序所得序列样本信息的barcode；再连接各基因甲基化反向扩增引物，详见表2中的R引物。本发明将各扩增区域的第一轮多重PCR引物按照等比例进行混合作为PCR引物，以重亚硫酸盐转化后的DNA作为模板DNA，使用KAPA HiFi Mix为DNA聚合酶进行扩增。扩增循环数根据DNA模板的质量及浓度而定，控制在15-35个循环以内。其中，PCR反应体系组成为（每孔用量）：2 µL5x KAPA HiFi buffer；0.3 µL 10 mM dNTPs；0.5 µL DMSO；0.2 µL KAPA HiFiPolymerase；1 µL正向测序引物 (5 µM)；1 µL反应测序引物 (5 µM)；3 µL无酶水；2 µL转化后DNA。PCR反应条件：先95℃-5min；然后98℃-20s，50-60℃-30s，72℃-1min，15-35个循环；最后4℃维持。
表4
（2）第二轮PCR扩增及纯化
将第一轮PCR扩增产物使用AMPure XP磁珠进行纯化，纯化所得核酸作为第二轮PCR的模板DNA，进行二轮扩增，使用KAPA HiFi Mix为DNA聚合酶进行扩增，扩增退火温度及延伸时间根据产物具体情况而定，循环数控制在10-20个循环以内。二轮扩增的正向引物序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG，反向引物序列为 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC，其中“NNNNNNNN”为测序仪index序列。应注意的是，第一轮PCR测序引物及第二轮测序引物可根据测序仪的不同品牌、不同规格大的具体要求而制定更改，本发明中提供的测序引物仅提供其中一种测序引物的示例；使用其它合乎相应测序仪规定的测序引物并不会影响本试剂盒的检测结果。其中，PCR反应体系组成（每孔用量）：2 µL 5x KAPA HiFi buffer；0.3 µL 10 mM dNTPs；0.5 µL DMSO；0.2 µLKAPA HiFi Polymerase；1 µL正向测序引物 (5 µM)；1 µL反应测序引物 (5 µM)；3 µL无酶水；2 µL第一轮PCR稀释产物DNA。PCR反应条件：先95℃-5min；然后98℃-20s，50-60℃-30s，72℃-1min，10-20个循环；最后4℃维持。
（3）扩增产物混样及质量评价
将第二轮PCR扩增产物使用AMPure XP磁珠进行纯化，纯化所得DNA使用qubitdsDNA high sensitivity assay kit及qPCR方法进行核酸定量，等摩尔质量混合不同样本的扩增产物后，在相应测序仪进行二代测序。
（4）测序数据的生物信息学分析
测序数据下机后使用fastqc软件进行数据质量查看，使用软件Trimmomatic去除测序接头和低质量碱基和序列，得到质控后的合格序列。随后，采用basmap甲基化测序数据比对软件将合格序列和扩增区域的目标序列进行比对分析。然后，计算每一个样本的每一个目标序列上CG碱基的甲基化水平，甲基化水平大的计算公式为：C位点的甲基化水平 =支持甲基化的序列数/（支持甲基化的序列数+支持非甲基化的序列数)；根据以上公式即可获得每个样本在检测区域内所有甲基化位点的甲基化率水平。对于某个位点所在的序列的测序深度小于50X的，将该样本的该位点的甲基化率定义为缺失值NA，不再纳入计算。
（5）靶向扩增子甲基化测序效果评价
①DNA片段化程度对多重PCR扩增的影响
由于脱落细胞等样本来源的DNA常存在核酸降解片段化的风险，因此本发明测试了5个片段化程度不一的样本，观察DNA片段化对试剂盒检测结果的影响。结果显示，对于片段化严重的样本，本发明的靶向甲基化测序技术所检测的合格位点的百分比在99%以上，说明本发明的检测方法基本不受DNA片段化影响，在片段化严重的情况下仍可得到可靠的检测数据，见图3和表5。
表5
②上样量对多重PCR扩增测序的影响
脱落细胞等无创采集的样本由于个体采样异质性大，常常还存在样本获取核酸量不足的情况，因此本发明测试了不同样本起始DNA上样量的情况下的检测效果。结果显示，即使DNA投入量在小于200ng的情况下，靶向甲基化测序技术所检测的合格位点的平均百分比仍可达98%，与更高的样本起始DNA上样量分组的合格位点百分比之间并不存在统计学差异（图4）。这说明本发明的检测方法在待测样本仅获取少量核酸的情况下仍可获得充足的数据。
③多重靶向扩增子甲基化测序与DNA甲基化芯片技术的重测一致性
不同检测方法对甲基化位点的检测结果会存在一定偏差。为评价本申请构建的多重靶向扩增子甲基化测序对样本中真实甲基化水平的反映效果，对3例已检测多重靶向扩增子甲基化测序的样本同时采用Illumina Epic 850K甲基化芯片进行检测。Epic 850K甲基化芯片为目前广泛使用、备受认可的DNA甲基化检测方法之一。通过比较两种方法均检测的甲基化位点的甲基化率，计算这3例重测样本的两种检测方法甲基化率的相关性。结果显示，3例样本两种检测方法的重测一致性好，相关系数R2分别为0.878,0.941及0.851，具有很高的正相关关联（图5）。这说明本发明的检测方法可反映样本中的真实甲基化信号。
综上所述，本发明的多重靶向扩增子甲基化测序检测方法可兼容DNA片段化严重、DNA投入量低等样本常见问题，可反映样本中的真实甲基化率水平，具有开发为检测试剂盒的可行性，尤其是检测脱落细胞及体液来源样本等个体异质性较大样本时具有优势。
实施例3：甲基化标志物在尿液样本中对子宫内膜癌的诊断效果
尿液样本相比于血液样本及组织样本而言，完全无创；相比于子宫颈刷片及阴道拭子等样本，受到个体取样手法的影响更小，且无需医务人员的协助，群众对此种采样方式接受度高，可实现居家采样。本实施例中的检测样本为在中山大学肿瘤防治中心及广州医科大学附属肿瘤医院采集的107例子宫内膜癌患者及111例对照参与者的尿液。
样本采用本申请实施例2构建的检测方法提取DNA、进行DNA重亚硫酸盐修饰，构建靶向甲基化扩增文库的构建，并通过Illumina平台测序。测序数据经上述生物信息的分析流程，得到17个基因扩增区域内的甲基化位点的甲基化水平。经过数据质量控制流程，来自17个基因的280个位点信息纳入分析。由于数据根据各基因的测序深度进行质量控制过滤，测序深度不足50条序列的位点定义为缺失，经此过滤后各位点最终纳入分析的病例数为97-106例不等，对照数为105-111例不等。
本发明所包含基因使用靶向扩增甲基化测序方式在独立样本中对子宫内膜癌诊断效果最佳的甲基化位点及其效果信息见表6。17个基因中检出的甲基化位点在3-35个不等。测定对应基因时，使用表2中该基因覆盖的所有引物对进行检测。通过对同一基因内甲基化位点进行Logistic模型建模，曲线下面积在0.788-0.886之间。其中，GAD2、ADCYAP1及C17orf64在内的3个基因甲基化标志物的AUC大于0.85；除CDO1以外的16个标志物的AUC大于0.8。与实施例1中的结果相似，CDO1表现出优秀的灵敏度，为91.3%；GAD2及GRM7的灵敏度高于80%；KCNA1及ADCYAP1的特异度高于90%。上述17个基因甲基化检测区域中预测效果最佳的甲基化位点的曲线下面积在0.730-0.814。
表6
备注：A为病例组纳入建模样本量；B为对照组组纳入建模样本量；AUC1为该基因全部位点建模曲线下面积；C为扩增区域鉴定的甲基化位点个数；AUC2为预测效果最佳甲基化位点的曲线下面积。
在本发明的17个基因甲基化标记物中，GAD2、ADCYAP1及C17orf64等的综合性能最佳，GAD2等在灵敏度上具有优势，KCNA1及ADCYAP1等在特异度上具有优势，因此进一步评价组合标志物对107例子宫内膜癌和111例对照的诊断效能。当进行多基因标志物联合检测时，使用表2中联合基因覆盖的所有引物对进行检测。表7展示了两基因、三基因及四基因标志物联合时的判别效果。具体来看，在两个基因甲基化标志物组合时，GAD2及GYPC两标志物联合的AUC最高，可达0.928，灵敏度为82.2%，特异度为86.8%，较单个基因甲基化标志物的效果具有明显提升。其余各基因两两联用时的可达0.9，展示出优异的联合诊断性能。在三个基因甲基化标志物组合时，C17orf64、GAD2及GYPC三标志物联合的AUC最高，可达0.948，灵敏度为85.4%，特异度为91.2%，模型灵敏度较两标志物模型有明显提升，准确性有所提升。其中，GAD2、GYPC与C17orf64、ADCYAP1、TMEM101及ZSCAN12等基因联用的AUC可到0.94以上ADARB2、CDO1、GRM7、KCNA1、NETO1、SORCS3、STX16、TCTEX1D1基因与C17orf64、GAD2或GYPC联用时AUC也可达0.93。在四个甲基化基因标志物组合时的诊断性能可进一步提高，其中ADCYAP1、GAD2、GYPC及TMEM101的标志物组合的AUC可达0.959，灵敏度为93.9%，特异度为86.1%。在较优的四标志物组合模型中，GAD2、GYPC及TMEM101基因出现频次最高，是组合模型中的关键基因，GAD2、GYPC、ADCYAP1、TMEM101、C17orf64、ADHFE1、ZSCAN12、TCTEX1D1、STX16、RYR2、KCNQ5、SORCS3、RYR2及KCNA1等基因的相互组合AUC接近0.95，表现出基因间的互补性。
表7
纳入五个甲基化基因标志物时，所有组合的AUC均高于0.857，最优的组合为GAD2、GYPC、ADCYAP1、TMEM101及STX16，AUC为0.960；GAD2、GYPC、ADCYAP1、C17orf64及ZSCAN12基因组合的AUC也为0.960；共有130个组合的AUC高于0.95，且130个组合中17个基因标志物均被多次纳入模型中，充分体现各基因在高精准模型中的重要性。
六基因组合标志物时，所有组合的AUC均高于0.872，最优组合为ADCYAP1、C17orf64、GAD2、GYPC、TCTEX1D1及ZSCAN12，AUC为0.962；其中效果前100的所有组合的AUC均高于0.956，17个基因标志物均被多次纳入模型中，充分体现各基因在高精准模型中的重要性。
七基因组合标志物时，所有组合的AUC均高于0.884，最优组合为ADCYAP1、C17orf64、GAD2、GYPC、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12，AUC为0.963；组合ADARB2、ADCYAP1、GAD2、GYPC、STX16、TCTEX1D1及TMEM101亦可达到相同诊断效果；七基因组合中，效果前100的所有组合的AUC均高于0.960，17个基因标志物均被多次纳入模型中，充分体现各基因在高精准模型中的重要性。
八基因组合标志物时，所有组合的AUC均高于0.888，最优组合为ADCYAP1、C17orf64、GAD2、GYPC、RYR2、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12，AUC为0.964；八基因组合中，效果前100的所有组合的AUC均高于0.961，17个基因标志物均被多次纳入模型中，充分体现各基因在高精准模型中的重要性。
综上所述，本发明甲基化基因标记物或其组合能很好的区分子宫内膜癌及对照个体，可用于制备用于子宫内膜癌诊断的试剂盒。且以上述两种或以上的基因甲基化组合的形式对子宫内膜癌或癌前病变进行诊断，能够显著提高灵敏度和特异性。
值得注意的是，在病例组100例具有明确病理分期的子宫内膜癌中，I期（极早期）患者占73%之多，II期患者占19%，III和IV期（中晚期）患者仅占8%，体现了上述标志物对早期子宫内膜癌的极佳表现能力，可用于内膜癌的早期诊断。
实施例4：甲基化标志物在宫颈刷片样本中对子宫内膜癌的诊断效果
为评价实施例1中包含的17个标志物在宫颈刷片取材样本中对子宫内膜癌的诊断价值，该实施例检测样本为在中山大学肿瘤防治中心及佛山市第一人民医院采集的17例子宫内膜癌患者及14例对照参与者的宫颈刷片。宫颈刷片为相对无创的采样方案，可进行自我采样，具有作为无创诊断采样样本的优势。样本采用本申请实施例2构建的检测方法提取DNA、进行DNA重亚硫酸盐修饰，构建靶向甲基化扩增文库的构建，并通过Illumina平台测序。测序数据经上述生物信息的分析流程，得到17个基因扩增区域内的甲基化位点的甲基化水平。经过数据质量控制流程，来自17个基因的280个位点信息纳入分析。由于数据根据各基因的测序深度进行质量控制过滤，测序深度不足50条序列的位点定义为缺失，经此过滤后各位点最终纳入分析的病例数为14-17例不等，对照数为13-14例不等。
本申请所包含基因在宫颈刷片样本中对子宫内膜癌诊断效果见表8。17个基因中检出的甲基化位点在3-35个之间。测定对应基因时，使用表2中该基因覆盖的所有引物对进行检测。通过对同一基因内甲基化位点进行Logistic模型建模，取最佳截断值评价各基因对病例组及对照组个体的判别准确性。其中的11个基因甲基化标志物对子宫内膜癌和对照个体的实现完全准确的判别，这些基因包括ADARB2，ADCYAP1，C17orf64，GAD2，GYPC，KCNA1，KCNQ5，SORCS3，STX16，TMEM101及ZSCAN12。此外，GRM7、TCTEX1D1、CDO1及NETO1对对照组的判别完全正确，RYR2对病例组的判别完成正确，但这两个基因甲基化标志物的特异度可达100%，在对照的识别上具有很好的有事。以上结果表明，在采用宫颈刷片样本作为检测样本时，本申请中的17个基因甲基化标志物对子宫内膜癌具有优秀的诊断能力。
表8
备注：A项为病例组纳入建模样本量；B项为对照组组纳入建模样本量；C项为病例组正确判别，样本/总样本；D项为对照组正确判别，样本/总样本；E项为扩增区域鉴定的甲基化位点个数；AUC1为该基因全部位点建模曲线下面积；AUC2为预测效果最佳甲基化位点的曲线下面积。
实施例5：甲基化标志物在阴道拭子样本中对子宫内膜癌的诊断效果
为评价实施例1中包含的17个标志物在宫颈刷片取材样本中对子宫内膜癌的诊断价值，本实施例检测样本为在中山大学肿瘤防治中心及佛山市第一人民医院采集的17例子宫内膜癌患者及14例对照参与者的阴道拭子。相比于宫颈刷片，阴道拭子采样深入深度较浅，医务人员协助需求较小，是较为无创且简单易操作的采样方式之一。样本采用本申请实施例2构建的检测方法提取DNA、进行DNA重亚硫酸盐修饰，构建靶向甲基化扩增文库的构建，并通过Illumina平台测序。测序数据经上述生物信息的分析流程，得到17个基因扩增区域内的甲基化位点的甲基化水平。经过数据质量控制流程，来自17个基因的280个位点信息纳入分析。由于数据根据各基因的测序深度进行质量控制过滤，测序深度不足50条序列的位点定义为缺失，经此过滤后各位点最终纳入分析的病例数为15-17例不等，对照数为11-14例不等。
本申请所包含基因在阴道拭子样本中对子宫内膜癌诊断效果见表9。17个基因中检出的甲基化位点在3-35个之间。测定对应基因时，使用表2中该基因覆盖的所有引物对进行检测。通过对同一基因内甲基化位点进行Logistic模型建模，曲线下面积在0.874-1之间。其中的13个基因甲基化标志物对子宫内膜癌和对照个体的实现完全准确的判别，曲线下面积为1，灵敏度及特异度均为100%。这些基因甲基化标志物包括ADARB2，ADCYAP1，C17orf64，GAD2，GYPC，KCNA1，KCNQ5，RYR2，SORCS3，STX16，TCTEX1D1，TMEM101及ZSCAN12。此外，GRM7及CDO1基因的AUC大于0.95，表现出优异的诊断效能。NETO1及ADHFE1的AUC分别为0.929及0.874，这两个基因甲基化标志物的特异度可达100%，在对照的识别上具有很好的能力。以上结果表明，在采用阴道拭子样本作为检测样本时，本申请中的17个基因甲基化标志物对子宫内膜癌具有优秀的诊断能力。
表9
备注：A项为病例组纳入建模样本量；B项为对照组组纳入建模样本量；C项为病例组正确判别，样本/总样本；D项为对照组正确判别，样本/总样本；E项为扩增区域鉴定的甲基化位点个数；AUC1为该基因全部位点建模曲线下面积；AUC2为预测效果最佳甲基化位点的曲线下面积。
实施例6：甲基化标志物在子宫内膜癌癌组织及癌旁样本中的检测效果
为评价实施例1中包含的17个标志物在子宫内膜癌组织中的信号，本实施例检测样本为在中山大学肿瘤防治中心及佛山市第一人民医院采集的88例来源于子宫内膜癌患者的子宫内膜癌癌组织、34例来源于子宫内膜癌患者的癌旁组织及20例来源于良性肌瘤患者的子宫内膜正常组织。子宫内膜癌癌组织中的甲基化信号可反映原发病灶处的真实情况，为本申请中的标志物信号提供可靠验证。样本采用本申请实施例2构建的检测方法提取DNA、进行DNA重亚硫酸盐修饰，构建靶向甲基化扩增文库的构建，并通过Illumina平台测序。测序数据经上述生物信息的分析流程，得到17个基因扩增区域内的甲基化位点的甲基化水平。经过数据质量控制流程，来自17个基因的280个位点信息纳入分析。
本发明综合比较了本申请中的17个基因甲基化标志物在癌与癌旁组织、以及癌与正常组织间的甲基化率差异，并使用符号秩和检验进行组间差异分析。结果显示，在17个基因覆盖的280个甲基化位点中，全部位点的癌组织甲基化率均显著高于正常组织（P值范围：6.4×10-11- 6.8×10-3，P值中位数：5.4×10-9）；其中的246个位点的癌组织甲基化率显著高于癌旁，占比84%。图6展示了17个基因中的代表性甲基化位点在正常、癌旁及癌组织中的甲基化率分布情况。如图所示，各甲基化位点在癌组织中的甲基化率明显高于正常组织及癌旁组织，在GAD2、GRM7、SORCS3、TMEM101、KCNA1、GYPC、CDO1及C17orf64等基因中尤为明显，其癌与癌旁差异的P值小于1×10-9。
实施例7：甲基化标志物在手术前后的变化趋势比较
如若本申请中的标志物可准确反映子宫内膜癌病灶的存在，那么当手术切除病灶后甲基化信号理论上将会明显下降甚至消失。为进一步在此层面上增加标志物的真实性证据，本实施例在中山大学肿瘤防治中心及佛山市第一人民医院采集了36例患者术前及术后3-5天的尿液样本进行本申请中的标志物动态监测。由于子宫内膜癌手术多采取子宫双附件全切，对术后患者采集宫颈刷片及阴道拭子将不合时宜，因此采用更为无创的尿液样本作为监测的样本类型。因肿瘤切除术后病灶释放的肿瘤相关甲基化信号将会终止，术后患者的甲基化信号理论上应降低。
综合比较了本申请中的17个基因甲基化标志物在同一患者的术前及术后配对样本中的甲基化率水平，并使用符号秩和配对检验进行组间差异分析。结果发现，在17个基因甲基化标志物检测所覆盖的280个甲基化位点中，有235个位点的癌组织甲基化率显著高于癌旁，占比80%。图7展示了17个基因中的代表性甲基化位点在术前及术后样本的甲基化率分布情况。如图所示，相比于术前样本，各甲基化位点在术后样本中的甲基化率均明显下降，除STX16外，其余15个基因的代表性位点均达到显著水平，P值在1.7×10-3~1.7×10-5之间。综合来看，ADHFE1、TMEM101、KCNA1、ADCYAP1及GYPC等甲基化位点的术前/术后差异尤为明显，P值小于1×10-4水平。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种早期检测子宫内膜癌的甲基化基因标志物，其特征在于为目标基因GAD2中以下甲基化区域，或ADARB2、ADCYAP1、ADHFE1、C17orf64、CDO1、GRM7、GYPC、KCNA1、KCNQ5、NETO1、RYR2、SORCS3、STX16、TCTEX1D1、TMEM101及ZSCAN12任意至少一个基因中以下甲基化区域和GAD2的以下甲基化区域的组合；
ADARB2基因：chr10: 1779052-1779183和chr10: 1779756-1779910；
ADCYAP1基因：chr18: 907522-907672和chr18: 908206-908385；
ADHFE1基因：chr8: 67344466-67344599；
C17orf64基因：chr17: 58498643-58498859和chr17: 58498879-58499081；
CDO1基因：chr5: 115152259-115152414；
GAD2基因：chr10: 26504914-26505063、chr10: 26506264-26506424和chr10:26506907-26507068；
GRM7基因：chr3: 6904068-6904274；
GYPC基因：chr2: 127413900-127414152；
KCNA1基因：chr12: 5018675-5018893和chr12: 5019386-5019578；
KCNQ5基因：chr6: 73331034-73331188和chr6: 73331252-73331411；
NETO1基因：chr18: 70535858-70535996；
RYR2基因：chr1: 237205894-237206034；
SORCS3基因：chr10: 106400776-106400914和chr10: 106401432-106401587；
STX16基因：chr20: 57225138-57225270；
TCTEX1D1基因：chr1: 67218010-67218198；
TMEM101基因：chr17: 42092213-42092341；
ZSCAN12基因：chr6: 28367209-28367379和chr6: 28367431-28367676；
所述的基因以人类基因组版本hg19为参考基因组。
2.早期检测子宫内膜癌的检测引物，其特征在于：用于对应检测权利要求1中所述标志物基因甲基化区域的甲基化状态，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：
ADARB2基因：
chr10: 1779052-1779183对应检测引物为SEQ ID NO:1-2；
chr10: 1779756-1779910对应检测引物为SEQ ID NO:3-4；
ADCYAP1基因：
chr18: 907522-907672对应检测引物为SEQ ID NO:5-6；
chr18: 908206-908385对应检测引物为SEQ ID NO:7-8；
ADHFE1基因：
chr8: 67344466-67344599对应检测引物为SEQ ID NO:9-10；
C17orf64基因：
chr17: 58498643-58498859对应检测引物为SEQ ID NO:11-12；
chr17: 58498879-58499081对应检测引物为SEQ ID NO:13-14；
CDO1基因：
chr5: 115152259-115152414对应检测引物为SEQ ID NO:15-16；
GAD2基因：
chr10: 26504914-26505063对应检测引物为SEQ ID NO:17-18；
chr10: 26506264-26506424对应检测引物为SEQ ID NO:19-20；
chr10: 26506907-26507068对应检测引物为SEQ ID NO:21-22；
GRM7基因：
chr3: 6904068-6904274对应检测引物为SEQ ID NO:23-24；
GYPC基因：
chr2: 127413900-127414152对应检测引物为SEQ ID NO:25-26；
KCNA1基因：
chr12: 5018675-5018893对应检测引物为SEQ ID NO:27-28；
chr12: 5019386-5019578对应检测引物为SEQ ID NO:29-30；
KCNQ5基因：
chr6: 73331034-73331188对应检测引物为SEQ ID NO:31-32；
chr6: 73331252-73331411对应检测引物为SEQ ID NO:33-34；
NETO1基因：
chr18: 70535858-70535996对应检测引物为SEQ ID NO:35-36；
RYR2基因：
chr1: 237205894-237206034对应检测引物为SEQ ID NO:37-38；
SORCS3基因：
chr10: 106400776-106400914对应检测引物为SEQ ID NO:39-40；
chr10: 106401432-106401587对应检测引物为SEQ ID NO:41-42；
STX16基因：
chr20: 57225138-57225270对应检测引物为SEQ ID NO:43-44；
TCTEX1D1基因：
chr1: 67218010-67218198对应检测引物为SEQ ID NO:45-46；
TMEM101基因：
chr17: 42092213-42092341对应检测引物为SEQ ID NO:47-48；
ZSCAN12基因：
chr6: 28367209-28367379对应检测引物为SEQ ID NO:49-50；
chr6: 28367431-28367676对应检测引物为SEQ ID NO:51-52。
3.检测标志物基因甲基化区域的试剂在制备检测试剂盒或设备中的应用，其特征在于所述的检测试剂盒或设备用于检测、筛查或诊断子宫内膜癌；所述的标志物基因甲基化区域为权利要求1所述的标志物基因甲基化区域。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的试剂包括特异性针对所述标志物基因甲基化区域检测的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一，其中，所述引物包括权利要求2所述的检测引物。
5.根据权利要求3或4的应用，其特征在于：所述检测试剂盒或设备的检测样本包括体液样本、脱落细胞采集样本和肿瘤组织样本中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述体液样本包括尿液和血液中的至少一种；所述脱落细胞采集样本包括拭子、刷片和灌洗液中至少一种。
7.一种用于子宫内膜癌早期筛查诊断的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括用于检测权利要求1所述的标志物基因甲基化区域的试剂；
所述的试剂包括特异性针对所述标志物基因甲基化区域检测的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一，其中，所述引物包括权利要求2所述的检测引物。
8.权利要求1所述的甲基化基因标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
9.权利要求7所述的多重PCR检测试剂盒在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述诊断产品包括试剂盒、制剂和芯片中的任意一种。
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