CN117777309A - 一种包括xbbbq11类抗体的融合蛋白构建体、制备方法及其在疫苗中的应用 - Google Patents
一种包括xbbbq11类抗体的融合蛋白构建体、制备方法及其在疫苗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种包括XBBBQ11类抗体的融合蛋白构建体、制备方法及其在疫苗中的应用，所述融合蛋白构建体包括BQ11的RBD蛋白序列、XBB的RBD蛋白序列，以及抗体恒定区的蛋白序列，所述BQ11的RBD和XBB的RBD蛋白序列与不同的抗体恒定区蛋白序列连接，从而形成类似于抗体的融合蛋白构建体，可进一步用于制备疫苗，本发明的疫苗可刺激机体产生针对多种SARS‑CoV‑2亚型的中和抗体，具有广谱性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种包括XBBBQ11类抗体的融合蛋白构建体、制备方法及其在疫苗中的应用。
背景技术
冠状病毒是一类主要感染脊椎动物的有包膜的单股正链RNA病毒，因病毒包膜上有向四周伸出的突起，形如花冠而得名，广泛存在于人类、哺乳动物和鸟类宿主中。据悉，国际病毒分类委员会将冠状病毒分为四个属：α，β，γ和δ。β属冠状病毒又分A、B、C、D四个谱系，B谱系(又称Sarbecoviruses)包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
SARS-CoV-2席卷全球，可导致COVID-19，给人类工作生活造成了巨大的影响，随着SARS-CoV-2在不同地区的传播，出现不同的变异株，疫情态势仍持续紧张。截至目前，传播力超强的变异株有alpha(原始株)、beta、gamma、delta、lammda、omicron等变异株，未来很可能还有其它类型变异株出现。尽管研究表明接种疫苗可有效预防发病和降低感染后重症率和死亡率，但国内外均出现疫苗接种后突破性感染的案例，有研究表明这些变异株对疫苗均有不同程度的免疫逃逸能力。研发高效广谱的β冠状病毒B谱系的通用疫苗迫在眉睫。这样的疫苗不但能预防现在流行的SARS-CoV-2及其变异株的感染，也能预防未来再现的SARS-CoV感染或新发SARS相关冠状病毒的感染。
SARS-CoV-2至今为止，中和表位主要集中在RBD区，NTD及S2区的中和表位只有1-2个，所以，利用S蛋白作为疫苗免疫原有机会活化RBD区外的NTD中和抗体，但一般难以活化针对S2的中和抗体，因为S2的中和表位太弱。但是S蛋白作为免疫原时，由于NTD将遮挡RBD区，导致中和抗体应答主要集中在RBD顶端的3-4个表位，而损失掉了另外4-5个中和表位，所以，总体而言是得不偿失；此外，由于S蛋白带入了大量的结合抗体表位，这些结合抗体基本上没有保护作用，有可能增加免疫致病风险，所以与基于S1亚单位、全长S蛋白及灭活和减毒疫苗相比，基于RBD的疫苗能在免疫动物体内诱导更高水平的中和抗体和T细胞免疫反应，和更低水平的非中和抗体或有害免疫反应。将来自于不同亚属β属冠状病毒(例如XBB、BQ.1.1)的RBD进行串联或并联构成多特异性抗β属冠状病毒，拓宽免疫应答而增加攻击靶点，因而将更有效应对病毒的变异和逃逸，有可能成为预防COVID-19的通用疫苗。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种包括XBBBQ11类抗体的融合蛋白构建体、制备方法及其在疫苗中的应用的技术方案，具体的，
本发明第一方面，提供一种包括XBBBQ11类抗体的融合蛋白构建体，所述融合蛋白构建体包括BQ11的RBD蛋白序列、XBB的RBD蛋白序列，以及抗体恒定区蛋白序列。
优选的，所述恒定区包括轻链恒定区(LC)和重链恒定区(HC)。
优选的，所述BQ11的RBD蛋白序列和XBB的RBD蛋白序列与不同的恒定区连接，更优选的，所述BQ11的RBD蛋白序列与轻链恒定区蛋白序列连接形成BQ11-LC类抗体，所述XBB的RBD蛋白序列与重链恒定区蛋白连接形成XBB-HC类抗体，或者，所述BQ11的RBD蛋白序列与重链恒定区蛋白序列连接形成BQ11-HC类抗体，所述XBB的RBD蛋白序列与轻链恒定区蛋白序列连接形成XBB-LC类抗体。
优选的，所述连接包括直接连接和/或间接连接，更优选的，所述间接连接包括通过连接肽进行连接。
所述轻链恒定区与重链恒定区经二硫键直接连接。
优选的，所述融合蛋白构建体还包括信号肽。
更优选的，所述BQ11的RBD蛋白序列包括：
(A1)、SEQ ID No：1的第26-244位所示，
(A2)、将(A1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(A3)、与(A1)-(A2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更优选的，所述XBB的RBD蛋白序列包括：
(B1)、SEQ ID No：2的第26-244位所示，
(B2)、将(B1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(B3)、与(B1)-(B2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更优选的，所述抗体轻链恒定区的蛋白序列包括：
(C1)、SEQ ID No：1的第254-358位所示，
(C2)、将(C1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(C3)、与(C1)-(C2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更优选的，所述抗体重链恒定区的蛋白序列包括：
(D1)、SEQ ID No：2的第254-581位所示，
(D2)、将(D1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(D3)、与(D1)-(D2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
更优选的，所述连接肽的序列包括：
(E1)、SEQ ID No：1的第245-253位所示，或者SEQ ID No：2的第245-253位所示，
(E2)、将(E1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽；
(E3)、与(E1)-(E2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的多肽。
更优选的，所述信号肽的序列包括：
(F1)、SEQ ID No：1的第1-25位所示，或者SEQ ID No：2的第1-25位所示，
(F2)、将(F1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的多肽；
(F3)、与(F1)-(F2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的多肽。
本文中，同一性是指氨基酸序列同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
优选的，所述融合蛋白构建体还包括标签蛋白。
所述标签蛋白是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在一个具体的实施方式中，所述融合蛋白构建体包括BQ11-LC类抗体和XBB-HC类抗体，所述BQ11-LC类抗体和XBB-HC类抗体通过二硫键直接连接。
进一步优选的，所述BQ11-LC类抗体包括SEQ ID No：1的第26-244位和第254-358位或其对应于A2、A3、C2、C3的突变体。
进一步优选的，所述XBB-HC类抗体包括SEQ ID No：2的第26-244位和第254-581位或其对应于B2、B3、D2、D3的突变体。
本发明第二方面，提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述任一的融合蛋白构建体。
优选的，所述核苷酸分子包括DNA和/或RNA，例如重组DNA，或者mRNA。
更优选的，所述核苷酸分子包括：
(G1)、SEQ ID No：3的第76-732位，SEQ ID No：3的第760-1074位、SEQ ID No：4的第76-732位和SEQ ID No：4的第760-1743位，
(G2)、(G1)的互补、简并或者转录序列，
(G3)、与(G1)或(G2)限定的DNA分子或者mRNA具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白构建体中的相应蛋白的DNA分子或者mRNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述融合蛋白构建体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述融合蛋白构建体的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述融合蛋白构建体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述同一性是指与比较的核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQID No：3-4所示的核苷酸序列具有75％或更高，具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
更优选的，所述核苷酸分子包括编码BQ11-LC类抗体和XBB-HC类抗体的序列。
在一个具体的实施方式中，所述核苷酸分子包括SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，或者对应于(G2)-(G3)的变体。
本发明第三方面，提供一种载体，所述载体包括上述任一的核苷酸分子。
优选的，所述载体包括两个开放阅读框，分别编码BQ11-LC类抗体和XBB-HC类抗体，或者分别编码BQ11-HC类抗体和XBB-LC类抗体。
优选的，所述载体还包括调控因子，例如启动上述多肽或融合蛋白构建体编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述多肽或融合蛋白构建体编码基因序列转录的终止子。进一步，所述载体还可包括增强子序列。
本文所述载体是指能够把外源DNA、mRNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pUC57载体和/或pKS001载体。
本发明第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述任一的核苷酸分子或者载体。
本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞或大鲵(Andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为CHO-K1Q细胞。
优选的，所述宿主细胞也可以是微生物，本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillussp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为TOP10感受态细胞。
本发明第五方面，提供一种上述融合蛋白构建体的制备方法，所述制备方法包括将上述编码所述融合蛋白构建体的核苷酸分子或者载体导入到宿主细胞，培养所述宿主细胞。
优选的，所述制备方法包括筛选表达量高且稳定的单克隆细胞株。
更优选的，所述筛选方法包括本领域常规的筛选方法，例如添加筛选试剂，ELISA法比较克隆池生物活性等等。
更优选的，所述制备方法包括在非还原条件下，纯化所述融合蛋白构建体，获得通过LC与HC的二硫键连接的融合蛋白构建体。
本发明第六方面，提供一种上述任一的融合蛋白构建体、核苷酸分子、载体或者宿主细胞的应用，所述应用包括下述任一种：
(1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病的产品中的应用；
(2)在制备用于诱导SARS-CoV-2病毒抗原免疫反应的产品中的应用；
(3)在预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病中的应用；
(4)在用于诱导SARS-CoV-2病毒抗原免疫反应中的应用。
本文所述产品可为试剂、药物、或疫苗。
(1)和(2)中所述产品可为SARS-CoV-2病毒的疫苗或者抗体，所述抗体包括全长抗体或抗原结合片段(如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)等但不限于此)。
进一步地，所述SARS-CoV-2抗体可为特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor binding domain，RBD)的中和抗体。所述中和抗体可为针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体。
上述应用中，所述SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病可包括呼吸系统感染、消化系统感染、心血管系统感染、和/或神经系统感染等。
优选的，所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染。
优选的，所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻。
更优选，所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎。
更优选，所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤。
更优选，所述肺炎可包括新型冠状病毒感染导致的肺炎(COVID-19)。
优选的，用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病的产品包括疫苗。
优选的，所述新型冠状病毒包括原始株(alpha)，奥密克戎XBB，BA.1，BA.5，BA.2.75，CH.1.1，BQ1.1等突变株或分支。
本发明第七方面，提供一种疫苗，所述疫苗包括上述任一的融合蛋白构建体、核苷酸分子、载体或者宿主细胞。
优选的，所述疫苗还包括佐剂。
更优选的，所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。
本领域技术人员所熟知的是，为了增强抗原蛋白的免疫原性，除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外，还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构；或在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球中。
优选的，所述疫苗还包括疫苗递送系统。
所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
进一步的，所述疫苗还包括一种或者是多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明所述用于预防感染的疫苗可为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
本发明第八方面，还提供了一种产生免疫应答的方法，所述方法可包括给受试者施用上述任一的疫苗。
上述方法中，给受试者施用所述疫苗后，可在受试者中引发针对SARS-CoV-2病毒的免疫反应。述免疫反应可为细胞免疫反应，或体液免疫反应，或细胞免疫反应和体液免疫反应。
所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。
本文所述受试者可为人类或非人类动物。
进一步地，所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者(感染后恢复的受试者)。
本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。
概括来说，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的融合蛋白构建体将病毒的RBD区与抗体恒定区连接，增加其分子量，从而提高抗原的稳定性，同时，BQ11的RBD序列和XBB的RBD与不同的抗体恒定区连接，从而形成类似于抗体的二聚体融合蛋白构建体，轻链恒定区与重链恒定区的连接使得抗原具有多价的功能，增加诱导机体产生抗体的效果。
2、选择XBB与BQ11亚型的RBD区作为抗原并联合可以产生针对多个SARS-CoV-2亚型的中和抗体，包括原始菌株、奥密克戎多个分支，本发明的疫苗可以作为冠状病毒B谱系的广谱疫苗。
3、本发明的类抗体构建体由于包括抗体恒定区，进入机体后可发挥类似于Fc片段的功能，与抗原呈递细胞表面的Fc片段的受体，即FcReceptor结合，更容易被DC细胞吞噬，从而具备更高的抗原递呈效率，提高免疫反应水平。
4、本发明的类抗体构建体包括抗体恒定区，可以提高抗原分子的表达量：由于抗体分子的Fc部分结构在细胞内表达量非常高，能促进与它融合的基因在CHO中高效表达，可以提高抗原分子的产量，降低成本。
5、本发明的类抗体构建体易于纯化：抗原分子加上Fc结构后，在生产纯化过程中可以采用protein A亲和纯化工艺，简化纯化步骤，提高收率，从而减少生产损失，降低成本。
附图说明
图1：质粒结构示意图。
图2：融合蛋白构建体结构示意图。
图3：融合蛋白构建体的蛋白纯化结果。
图4：小鼠免疫后的中和抗体滴度，每一组从左至右对应于XBBBQ11-类抗体、XBB-类抗体和BQ.1.1-类抗体。
图5：疫苗对假病毒的中和实验结果，每一组从左至右对应于XBBBQ11-类抗体、XBB-类抗体和BQ.1.1-类抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下面列出了实施例中所用的材料、试剂等，其他如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.试剂耗材，如表1所示：
表1：试剂耗材
| 序号 | 名称 | 货号 | 供应商 |
| 1 | HEK293-ACE2 | DD1401 | Vazyme |
| 2 | SARS-CoV-2-FlucWT | DD1702 | Vazyme |
| 3 | 假病毒中和抗体标准品 | DD1602 | Vazyme |
| 4 | Bio-LiteLuciferaseAssaySystem | DD1201 | Vazyme |
| 5 | DMEM | C11995500BT | Gibco |
| 6 | OPM-293CD05Medium | 81075-001 | 上海奥浦迈 |
| 7 | FBS | FSP500 | ExCell |
| 8 | 双抗 | 450-201-CL | 维森特 |
| 9 | PBS | 311-010-CL | 维森特 |
2.设备信息，如表2：
表2：设备信息
实施例1融合蛋白构建体的制备
将XBBBQ11类抗体的氨基酸序列加上信号肽序列后委托南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，所合成的基因包括酶切位点、Kozak序列、信号肽、目的基因以及终止密码子，全长共3287bp。该重组基因合成时进行了密码子优化以利于在中国仓鼠卵巢细胞Cricetulus griseus(CHO细胞)中表达。
一、融合蛋白构建体(XBBBQ11类抗体，XBBBQ11-类抗体)表达载体构建：
1、XBBBQ11类抗体表达质粒构建材料，如表3所示：
表3：XBBBQ11类抗体表达质粒构建材料
| 名称 | 供应商 | 货号 |
| pKS001质粒 | QuaCell | A13201 |
| pUC57质粒 | 金斯瑞合成 | —— |
| NotI | NEB | R3189L |
| HindIII | NEB | R3104V |
| Q5Start高保真酶 | Biolabs | M0492S |
| 5×cutsmartbuffer | Biolabs | B6004S |
| Ligase | NEB | M2200L |
| 2×LigaseBuffer | Biolabs | B2200S |
| top10感受态细胞 | 全式金 | CD101-02 |
| LB培养基 | —— | 自行准备 |
| 2×PCRTaqMasterMix | Trans | AS111 |
XBBBQ11类抗体氨基酸序列:
BQ11-LC类抗体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示：
MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA
RVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSTVGGNYNYRYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGVNCYFPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSGSGGGSGGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID No：1)
其中，第1-25位为信号肽，第26-244位为BQ11的RBD，第245-253位为连接肽，第254-358位为抗体轻链恒定区(LC)。
XBB-HC类抗体的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示：
MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA
RVQPTESIVRFPNITNLCPFHEVFNATTFASVYAWNRKRISNCVADYSVIYNFAPFFAFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGNEVSQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKPSGNYNYLYRLFRKSKLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGSNCYSPLQSYGFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSGSGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID No：2)
其中，第1-25位为信号肽，第26-244位为XBB的RBD，第245-253位为连接肽，第254-581位为抗体重链恒定区(HC)。
核苷酸分子的序列:
编码BQ11-LC的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示：
ATGCTGAGAGGACCAGGACCAGGACTGCTGCTGGCTGTGCTGTGCCTGGGAACCGCTGTGAGGTGTACAGAGGCCCGGGTGCAGCCAACCGAGAGCATCGTGCGCTTCCCAAACATCACAAATCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTTAACGCCACCACATTTGCTTCTGTGTACGCCTGGAACAGGAAGCGGATCTCTAATTGTGTGGCTGATTATTCCGTGCTGTACAATTTCGCTCCCTTCTTTGCCTTTAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGTTTCACAAATGTGTATGCCGATTCCTTTGTGATCAGGGGCAACGAGGTGAGCCAGATCGCTCCAGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAATAAGCTGGATAGCACAGTGGGCGGCAACTACAATTATAGATACCGCCTGTTCAGAAAGAGCAAGCTGAAGCCTTTTGAGCGCGACATCTCTACCGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCATGCAATGGCGTGGCCGGCGTGAACTGTTATTTCCCTCTGCAGTCCTACGGCTTTAGGCCAACATATGGAGTGGGACACCAGCCATATAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCATGCTCCAGCTACCGTGTGCGGACCTAAGAAGTCCACAAACCTGGTGAAGAATAAGTCCGGAAGCGGAGGAGGATCTGGAGGACAGCCTAAGGCTGCTCCATCCGTGACCCTGTTCCCACCTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCTACCCTGGTGTGTCTGATCAGCGACTTTTACCCAGGAGCTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATTCTTCCCCTGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACAACCCCAAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTATGCCGCTAGCTCTTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGTCTCACCGGTCTTATTCCTGCCAGGTGACACATGAGGGCTCCACAGTGGAGAAGACCGTGGCCCCTACAGAGTGTAGC(SEQ ID No：3)。
其中，第76-732位编码BQ11的RBD蛋白序列，第760-1074位编码LC的蛋白序列。
编码XBB-HC的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示：
ATGCTGAGGGGACCAGGACCAGGACTGCTGCTGGCTGTGCTGTGCCTGGGAACCGCTGTGAGGTGTACAGAGGCCCGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGTGCGGTTCCCTAACATCACAAATCTGTGCCCATTCCACGAGGTGTTTAACGCCACCACATTTGCTTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGCGGATCAGCAATTGTGTGGCTGACTATTCTGTGATCTACAATTTCGCTCCATTCTTTGCCTTTAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGTTTCACAAATGTGTATGCCGATAGCTTTGTGATCAGGGGCAACGAGGTGTCTCAGATCGCTCCAGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACAGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAATAAGCTGGATTCCAAGCCTAGCGGCAACTACAATTATCTGTACAGACTGTTCCGCAAGTCCAAGCTGAAGCCCTTTGAGAGAGATATCAGCACCGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCTTGCAATGGCGTGGCCGGCTCTAACTGTTATTCCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCAGGCCTACATATGGCGTGGGCCACCAGCCATATCGGGTGGTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCATGCTCCAGCTACCGTGTGCGGACCCAAGAAGTCTACAAACCTGGTGAAGAATAAGTCCGGAAGCGGAGGAGGATCTGGAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTGTTTCCTCTGGCCCCATCCAGCAAGTCTACCTCCGGAGGAACAGCTGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCAGTGACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCATACATTTCCAGCCGTGCTGCAGTCTTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTAGCAATACAAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCAAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCCCCTTGTCCAGCTCCTGAGCTGCTGGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGCACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTATAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCAGCTCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGTTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCATTACACACAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGC(SEQ ID No：4)。
其中，第76-732位编码XBB的RBD蛋白序列，第760-1743位编码HC的蛋白序列。
2、构建方法，具体如下：
模板合成：编码XBB类抗体与BQ11类抗体的核苷酸序列经CHO细胞密码子优化，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，插入至pUC57质粒中，获得PUC57-XBB-HC和PUC57-BQ11-LC，将优化后的XBB-HC及BQ11-LC核酸序列从PUC57载体上酶切下来依次连接在PKS001同一个载体上，表达XBBBQ11类抗体，质粒结构示意图如图1所示。
2.1目的基因和载体质粒的双酶切
PUC57-XBB-HC使用限制性核酸内切酶双酶切，体系如表4所示：
表4：XBB-HC限制性核酸内切酶双酶切体系
| 反应物 | 用量 |
| DNA | 2-6μg |
| ECORI | 1.5 |
| HindIII | 1.5 |
| 10×cutsmartbuffer | 5 |
| Nuclease-FreeWater | 补齐到50μl |
PUC57-BQ11-LC使用限制性核酸内切酶双酶切，体系如表5所示：
表5：BQ11-LC限制性核酸内切酶双酶切体系
| 反应物 | 用量 |
| DNA | 2-6μg |
| XbaI | 1.5 |
| NotI | 1.5 |
| 10×cutsmartbuffer | 5 |
| Nuclease-FreeWater | 补齐到50μl |
混匀后，37℃酶切1.5hr，进行核酸电泳鉴定，显示条带正确后进行胶回收，测定DNA浓度，进行下一步试验。
2.2与pKS001载体连接与转化
(1)按照连接体系，将目的片段与pKS001载体连接，连接体系如表6(20μl体系)：
表6：目的片段与pKS001载体连接体系
| pKS001Vector(双酶切) | 1μl |
| DNA模板(双酶切) | 8μl |
| Ligase | 1μl |
| 2×LigaseBuffer | 10μl |
混合反应液置于室温(25℃)反应5～10min。
(2)连接产物的转化
将连接产物加入到50～100μl冰浴上融化的TOP10感受态细胞中，在冰上静置30min，使得感受态细胞与连接产物充分混匀。将上述产物置于42℃中热激90s，然后迅速将其转移到冰上冰浴2min。在上述产物中加入400μl灭菌的LB培养基(不含抗生素)，将其混合均匀后后置于37℃，220rpm摇床中培养1hr。将全部菌液吹匀后菌液均匀涂布于两个氨苄抗性的LB琼脂培养基。将平板倒置于37℃温箱，过夜培养。
(3)重组质粒的鉴定
随机挑取平板上的单个克隆，分别接种到500μl含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃摇床培养2hr，吸取0.5μl菌液，进行菌落PCR验证。
菌落PCR验证体系(10μl体系)如表7：
表7：PCR验证体系
| PCR体系组分 | 加入量 |
| 2×PCRTaqMasterMix | 5μl |
| 上游引物 | 0.5μl |
| 下游引物 | 0.5μl |
| 菌液 | 1μl |
| Nuclease-FreeWater | 3μl |
PCR反应参数如表8：
表8：PCR:反应参数
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
选择扩增出目的条带的阳性克隆送去测序。
(5)将测序无误的质粒菌株在含有氨苄抗性的LB培养基中大量扩增，使用去内毒素质粒提取试剂盒大量提取表达质粒。
二、细胞表达：
本实验目的是筛选出表达量高且稳定的单克隆细胞株。采用电转方式将目的DNA传递到CHO-K1Q细胞中，细胞按比例接种在96孔板中，通过添加筛选试剂，培养压力，最终含有目的基因的细胞会生成克隆池，通过ELISA法比较克隆池生物活性，挑选生物活性高的继续扩大培养；最后挑选活性较高的克隆池，使用有限稀释法，最终挑选出高表达的单克隆株。
实验方法
高表达克隆株的筛选
1、转染
材料如表9所示：
表9：转染材料
| 材料 | 供应商 | 货号 |
| CHO-K1Q细胞 | QuaCell | A13101 |
| CHOCD04培养基 | QuaCell | A11004 |
| Glutamin | gibco | 25030-081 |
| DPBS | gibco | 14190-136 |
| 电转仪 | 壹达生物 | —— |
| EBELBuffer | 壹达生物 | H10305 |
| 电转杯 | 壹达生物 | ETTA2mm |
电转前30min将Buffer、细胞培养液、D-PBS提前取出回复至室温。
1.1细胞传代：转染前一天，细胞计数，离心1200rpm，4min，以每瓶1.5x106个细胞浓度传代。
1.2收集细胞，计数：取细胞混悬均匀后置于EP管，台盼蓝染色进行计数。
1.3离心：取所需培养液细胞置于一新的离心管内，1000rpm，离心4min；
1.5D-PBS清洗：弃去上清培养液，获得所需细胞，加入1mL D-PBS重悬细胞，1000rpm，离心4min；
1.5DNA、细胞、buffer混合：弃去D-PBS，加入所需量buffer和质粒，轻轻吹打混匀；
1.6电转：将混有质粒的细胞悬液按照200μl+DNA体积/杯，加入到H1电转杯中，将电转杯插入基座内，选择正确的电转条件电转。
实验参数如表10：
表10：电转实验参数
1.7培养：向提前准备好的T75方瓶中加入20ml CD04培养基(含4mM Glutamin)，电转后将液体转移到方瓶中，轻轻混匀放37℃，5％CO 2温箱中培养。
2、单克隆高表达株的筛选。
材料如表11所示：
表11：单克隆高表达株筛选材料
| QuaMonoPlusCHOCloningMediumA | QuaCell | A11602A |
| QuaMonoPlusCHOCloningMediumB | QuaCell | A11602B |
| QuaMonoPlusCHOCloningMediumC | QuaCell | A11602C |
| CHOCD04培养基 | QuaCell | A11004 |
| 96孔板 | NEST | 701001 |
| 24孔板 | NEST | 702001 |
| 6孔板 | NEST | 703001 |
| T25方瓶 | NEST | 707003 |
| 125摇瓶 | NEST | 781011 |
2.1配置培养基：配置Medium A与MediumB混合液，按照100:1比例配(1mlB加100mlA)
2.2细胞铺板：细胞计数，离心1200rpm，4min，以每孔0.5个细胞浓度计算铺板数量，200μl/孔AB混合液，铺96孔板，用胶带将96孔板对角封上，37℃，5％CO 2温箱中培养7天。
2.3细胞补液：培养天后，补加Medium C，100μl/孔，37℃，5％CO2温箱中培养7天。
ELISA法检测生物活性，挑取活性高的扩大培养。
最终挑选出单克隆株比单克隆池蛋白表达ELISA结果显示高出50倍。得到的蛋白纯度较高，先使用ECA填料纯化，得率约60mg/L。
3、间接ELISA法检测XBBBQ11类抗体蛋白活性。
检测体系如表12：
表12：间接ELISA PBS法检测XBBBQ11类抗体蛋白活性检测体系
3.1.试剂配制
3.1.1ELISA包被液(1X)配制：取ELISA包被液(10X)用无菌蒸馏水稀释至1X。
3.1.2.PBS配制：取出PBS powder，每袋用2L无菌蒸馏水溶解。
3.1.3.洗液：PBST(含0.05％Tween-20的PBS)量取1L过滤后的PBS到蓝盖瓶中，加入500μLTween-20，充分混匀，存于2～8℃备用。根据实际情况，按此方法配制所需体积的PBST。
3.1.4.封闭液和样品稀释液(含5％脱脂奶粉的PBS。称取PBS体积的5％的脱脂奶粉(奶粉质量/g＝PBS体积/mLx5％)，将从2～8℃取出的PBS平衡至室温，量取所需体积的PBS溶液至已加入奶粉的离心管中，然后充分溶解，备用。
3.1.5.稀释羊抗鼠二抗：将规格为1mL的二抗平衡至室温，然后进行分装，放置在-20℃±5℃保存。每次使用之前取出，按1:4000进行稀释，此处稀释液为PBS。
3.2包被：取细胞上清10倍稀释，10μl加90μl包被液，包被酶标版，100μl/孔，设置阳性对照和阴性对照，4℃放置过夜。
3.3封闭：将包被板从2～8℃取出后，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；然后在已包被孔中加入预先配制的封闭液，300μl/孔，盖封板膜，37℃，60-90min。
3.4洗板：将封闭后的包被板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干。
3.5一抗稀释：在离心管内用PBS将一抗稀释至合适浓度。将已稀释好的一抗加入至样品孔中，100μl/孔；盖上封板膜，37℃孵育60min。
3.6加二抗：弃去样品，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；加入稀释后的二抗，100μl/孔，盖封板膜，37℃孵育60min。
3.7显色：将96孔板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干，加单组分TMB显色液1(提前从取出，平衡至室温)，100μl/孔，25℃避光显色，15min。
3.8终止：显色后立即加入终止液终止反应，50μl/孔，轻晃混匀。
3.9检测：将酶标板放入酶标仪，在450nm和650nm波长下测吸光度值。
3.10判定：大于阴性OD值的2.1倍判为阳性。
4抗原纯化
材料如表13所示，
表13：抗原纯化材料
| 材料 | 供应商 | 货号 |
| UniMab50 | 纳威 | 17010-050100 |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | solarbio | A1010 |
| 蛋白电泳Marker | solarbio | PR1910 |
4.1离心：将细胞悬液离心，8000转，20分钟，取上清。
4.2具体步骤：
1.洗柱：PBS洗柱40ml以上，洗脱前需赶气泡，若柱中有气泡，需重新装填
2.上样：收流穿液，盯着别上完进入气泡。
3.平衡：PBS平衡40-50ml。
4.洗脱：0.1M甘氨酸PH3(出峰收流出液，浓HCl(3M)调节PH值)，收集的洗脱液需用2M Tris-Base调PH到7。
5.洗柱子：使用1M NaoH，洗30ml左右。
6.PBS洗柱直至PH为7。
保存：20％乙醇20ml-30ml，放-4℃保存。
4.9SDS-PAGE进行验证，XBB-HC目的条带大小为64KD，BQ11-LC目的条带大小为35KD,得率120mg/L。
融合蛋白构建体结构示意图如图2所示，轻链与重链之间通过二硫键连接，重链与重链之间也通过二硫键连接，形成类似于抗体的结构。
纯化结果如图3所示，在还原条件下，获得两个目的条带，XBB-HC目的条带和BQ11-LC目的条带(参见图3中“洗脱还原”对应的列)，在洗脱非还原条件下LC和HC通过二硫键结合，形成类抗体结构的单一目的条带(参见图3中“洗脱非还”对应列的上面第一个条带)。
实施例2小鼠免疫后的抗体滴度
具体方法为：选择6-8周龄Balb/c小鼠随机分组，每组5只小鼠，肌肉注射上述疫苗组合物，并设置疫苗组、对照组(PBS)，0、3周免疫，第3、5周采血。采用ELISA法检测第5周血清中的抗原始株RBD-his(原始株)，Omicron1 RBD-his(BA.1)，Omicron5 RBD-his(BA.5)，XBB RBD-his(XBB)，BQ11 RBD-his(BQ11)蛋白(以上蛋白均购自义翘)的抗体滴度(即totalIgG)，以EC50值表示(EC50是指小鼠血清能引起50％最大效应的稀释度)，结果如图4和表14所示：
表14：各实验组小鼠免疫后的抗体滴度
结果显示，本发明的XBBBQ11类抗体疫苗能刺激机体产生广谱的抗体，既包括SARS-CoV-2的各个亚型(原始株、以及目前流行的Omicron株的各种分支)，均可产生较高滴度的抗体，相对于对照组，具有显著性的差异，同时XBBBQ11联合还具有协同作用，例如相对于单独的XBB-类抗体，产生针对XBB的抗体显著提高，相对于单独的BQ11-类抗体，产生针对BQ11的抗体也显著提高，甚至比XBB-类抗体与BQ11-类抗体产生的抗体之和也有显著性的提高，这种协同作用也体现在针对其他病毒亚型产生的抗体上。
实施例3假病毒实验
送南京诺唯赞假病毒中和实验，检测实施例2中的疫苗诱导的血清对WT，XBB，BA.1，BA.5，BA.2.75，CH.1.1，BQ.1.1病毒株的中和实验，结果以IC50值(IC50是抑制细胞50％感染的血清稀释度)表示，如图5和表15所示：
表15疫苗诱导的血清对假病毒的中和实验
结果显示，本发明的疫苗诱导产生的抗体可以中和包括原始株、目前流行的Omicron株各个分支，从而具有广谱的抗病毒作用，相对于对照组，具有显著性的差异，同时XBBBQ11联合还具有协同作用，例如相对于单独的XBB类抗体和单独的BQ11类抗体，中和效果显著提高，这种协同作用也体现在针对其他病毒亚型上。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种包括XBBBQ11类抗体的融合蛋白构建体，其特征在于，所述融合蛋白构建体包括BQ11的RBD蛋白序列、XBB的RBD蛋白序列，以及抗体恒定区蛋白序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白构建体，其特征在于，所述恒定区序列包括轻链恒定区(LC)和重链恒定区(HC)，优选的，所述BQ11的RBD蛋白序列和XBB的RBD蛋白序列与不同的恒定区连接，更优选的，所述BQ11的RBD蛋白序列与轻链恒定区蛋白序列连接形成BQ11-LC类抗体，所述XBB的RBD蛋白序列与重链恒定区蛋白连接形成XBB-HC类抗体，或者，所述BQ11的RBD蛋白序列与重链恒定区蛋白序列连接形成BQ11-HC类抗体，所述XBB的RBD蛋白序列与轻链恒定区蛋白序列连接形成XBB-LC类抗体。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白构建体，其特征在于，
所述BQ11的RBD蛋白序列包括：
(A1)、SEQ ID No：1的第26-244位所示，
(A2)、将(A1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(A3)、与(A1)-(A2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白；
优选的，所述XBB的RBD蛋白序列包括：
(B1)、SEQ ID No：2的第26-244位所示，
(B2)、将(B1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(B3)、与(B1)-(B2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白；
优选的，所述抗体轻链恒定区的蛋白序列包括：
(C1)、SEQ ID No：1的第254-358位所示，
(C2)、将(C1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(C3)、与(C1)-(C2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白，
优选的，所述抗体重链恒定区的蛋白序列包括：
(D1)、SEQ ID No：2的第254-581位所示，
(D2)、将(D1)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；
(D3)、与(D1)-(D2)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。
4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码权利要求1-3任一所述的融合蛋白构建体。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子包括DNA和/或RNA，优选的，所述核苷酸分子包括：
(G1)、SEQ ID No：3的第76-732位，SEQ ID No：3的第760-1074位、SEQ ID No：4的第76-732位和SEQ ID No：4的第760-1743位，
(G2)、(G1)的互补、简并或者转录序列，
(G3)、与(G1)或(G2)限定的DNA分子或者mRNA具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白构建体中的相应蛋白的DNA分子或者mRNA。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4-5任一所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4-5任一所述的核苷酸分子或权利要求6所述的载体。
8.一种权利要求1-3任一所述融合蛋白构建体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求4-5任一所述的核苷酸分子或者权利要求6所述的载体导入到宿主细胞，培养所述宿主细胞，优选的，所述制备方法包括在非还原条件下，纯化所述融合蛋白构建体，获得通过LC与HC的二硫键连接的融合蛋白构建体。
9.一种权利要求1-3任一所述的融合蛋白构建体、权利要求4-5任一所述的核苷酸分子、权利要求6所述的载体或者权利要求7所述的宿主细胞的应用，所述应用包括下述任一种：
(1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病的产品中的应用；
(2)在制备用于诱导SARS-CoV-2病毒抗原免疫反应的产品中的应用；
(3)在预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病中的应用；
(4)在用于诱导SARS-CoV-2病毒抗原免疫反应中的应用。
10.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1-3任一所述的融合蛋白构建体、权利要求4-5任一所述的核苷酸分子、权利要求6所述的载体或者权利要求7所述的宿主细胞，优选的，所述疫苗还包括佐剂。
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