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CN117730152A - 具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的微生物及使用其的L-谷氨酸的生产方法 - Google Patents

具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的微生物及使用其的L-谷氨酸的生产方法 Download PDF

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CN117730152A
CN117730152A CN202280052622.1A CN202280052622A CN117730152A CN 117730152 A CN117730152 A CN 117730152A CN 202280052622 A CN202280052622 A CN 202280052622A CN 117730152 A CN117730152 A CN 117730152A
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CN
China
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microorganism
glutamic acid
polypeptide
activity
strain
Prior art date
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Application number
CN202280052622.1A
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English (en)
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权娜罗
李雅凛
宋规显
李珍南
奉贤珠
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CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
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Publication date
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Abstract

本申请涉及一种具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白活性的微生物及一种使用其的L‑谷氨酸的生产方法。具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白活性的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物具有显著增加的L‑谷氨酸生产率，且因此与常规微生物相比，使用此微生物能够以更高收率生产L‑谷氨酸。

Description

具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的微生物 及使用其的L-谷氨酸的生产方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求基于2021年7月26日提交的韩国专利申请第10-2021-0098072号的优先权的权益，并且相应韩国专利申请文件中公开的全部内容并入作为本说明书的一部分。
本申请涉及一种具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的微生物及一种使用其的L-谷氨酸的生产方法。
背景技术
为了生产L-氨基酸及其他有用物质，进行各种研究以研发高效率生产微生物及发酵工程技术。举例而言，主要使用目标物质特异性方法，诸如增加编码L-谷氨酸生物合成中所涉及的酶的基因的表达或移除生物合成所不必要的基因。
然而，根据对L-谷氨酸需求的增加，仍需要研究增加有效L-谷氨酸的生产率。
专利文献
(专利文献1)美国专利公开第2011-0027840号
发明内容
技术问题
本申请的一个目的为提供一种具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性及增强的L-谷氨酸生产率的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物。
本申请的另一目的为提供一种L-谷氨酸的生产方法，其包括在培养基中培养棒状杆菌属微生物。
技术方案
此将如下详细描述。另一方面，本申请中所公开的各描述及具体实施方式可应用于每个其他描述及具体实施方式中。换言之，本申请中所公开的各种要素的所有组合均属于本申请的范围内。另外，可发现本申请的范围不受下文所描述的详细描述限制。此外，贯穿本说明书引用数篇文章及专利文献，且指示对其的引用。所引用的文章及专利文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中以更清楚地描述本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
本申请的一个方面提供一种具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的棒状杆菌属微生物(或菌株、重组细胞)。
在本申请中，LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白可为具有LacI家族转录调节因子活性的蛋白质(例如LacI家族转录调节因子)，且例如可衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株或谷氨酸棒状杆菌ATCC14067菌株，但不限于此。在一种实施方式中，LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白可衍生自棒状杆菌ATCC13869菌株(序列可获自已知数据库NCBI的GenBank，且例如其可为GenBank登记号第WP_060564415.1号)。在一种实施方式中，衍生自谷氨酸棒状杆菌的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白可具有或包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成，或基本上由该氨基酸序列组成。具体地，蛋白质可由通过SEQ ID NO:3的氨基酸序列描述的多肽组成。
在一种实施方式中，LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白可为具有LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的多肽，其由LacI家族DNA结合性转录调节因子基因编码，但不限于此。在一种实施方式中，LacI家族DNA结合性转录调节因子基因可衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株，且具体地，其可包含SEQ ID NO:4的核酸序列(GenBank登记号序列ID：CP016335.1的核酸序列中的第1,421,016位至第1,422,125位的序列，例如BBD29_06680基因)。
在一种实施方式中，LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白可包含与SEQ ID NO:3所描述的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高的同源性或一致性或由该序列组成的氨基酸序列。另外，只要其为具有此同源性或一致性且显示出与LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白相对应的功效的氨基酸序列，具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加一些序列的氨基酸序列的变体亦可包含在LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白中。举例而言，其为具有序列添加或缺失、天然存在的突变、沉默突变或保守取代的情况，其不改变本申请的变体在氨基酸序列的N端、C端和/或内部的功能。
保守取代是指将一个氨基酸用具有类似结构和/或化学特性的另一氨基酸进行取代。此氨基酸取代一般可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的类似性而发生。通常，保守取代几乎不影响或不影响蛋白质或多肽的活性。
在本申请中，多核苷酸或多肽“具有、包含特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列、或由该序列组成、或基本上由该序列组成”可指该多核苷酸或多肽基本上包含该特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列，且可解释为包含“实质上等效的序列”，其中突变(缺失、取代、修改和/或添加)在维持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内应用于特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列中。在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“具有或包含特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列、或由该序列组成、或基本上由该序列组成”可指多核苷酸或多肽(i)基本上包含特定核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列，或(ii)由与特定核酸序列或氨基酸序列具有70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高的同源性或一致性的核酸序列(核苷酸序列)或氨基酸序列组成，或基本上包含此序列且维持原始功能和/或所需功能。在一种实施方式中，所需功能可指微生物的增加(增强)或提供L-谷氨酸生产率的功能。
在本申请中，“同源性”或“一致性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，且可以表示为百分比。术语、同源性及一致性通常可互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或一致性通过标准排列算法确定，且由所用程序建立的默认间隙罚分可一起使用。实质上，同源或一致序列一般可与序列的全部或一部分在中度或高度严格条件下杂交。显而易见的系，杂交也包括与含有一般密码子或考虑多核苷酸中的密码子简并性的密码子的多核苷酸进行杂交。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、类似性或一致性均可通过使用已知计算机算法，诸如使用如Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444的默认参数的“FASTA”程序来确定。另外，其可通过使用Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定，如EMBOSS包的Needleman程序中所进行(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或后续版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to HugeComputers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994，及[CARILLOETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。举例而言，可通过使用国家生物技术信息数据库中心的BLAST或ClustalW确定同源性、类似性或一致性。
多核苷酸或多肽的同源性、类似性或一致性可通过比较序列信息来确定，使用例如GAP计算机程序，诸如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443，已知于例如Smith及Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482。总之，GAP程序可定义为以类似方式排列的符号(亦即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中的较短序列中的符号的总数的值。GAP程序的默认参数可包括：(1)二元系统比较矩阵(含有值1用于一致性及值0用于非一致性)及Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz及Dayhoff编,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical ResearchFoundation,第353-358页(1979)所公开(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)；(2)各间隙的罚分为3.0及各间隙中的各符号为额外010罚分(或间隙开放罚分为10，及间隙延伸罚分为0.5)；及(3)末端间隙无罚分。
在本申请中，术语“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物或天然或人工基因修饰的微生物，且可为包含用于生产所需多肽、蛋白质或产物的基因修饰的微生物，作为由于诸如插入外来基因或削弱内源性基因的活性等原因而使特定机制减弱或增强的微生物。
在本申请中，术语多肽的“减弱”为包括全部降低活性或无活性的概念。减弱可与诸如失活、不足、下调、降低、减少、衰减等的术语一起使用。
减弱也可包含以下情况：由于编码多肽(或蛋白质，例如LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白)等的多核苷酸发生突变，多肽本身的活性与原始微生物具有的多肽活性相比降低或消失，由于编码多肽的多核苷酸基因的表达受到抑制或翻译成多肽的过程受到抑制而导致多肽的总体活性水平和/或浓度(表达量)低于细胞中的天然菌株的情况，完全不表达多核苷酸的情况，和/或即使表达多核苷酸也没有多肽活性的情况。当性状由于由天然或人工因素引起的基因突变而改变时，“内源性活性”是指转化前亲本菌株或野生型或非经修饰的微生物最初所具有的特异性多肽的活性。其可与“修饰前的活性”互换使用。与内源性活性相比，多肽的活性为“失活、不足、降低、下调、减少或衰减”，是指与转化的前亲本菌株或未经修饰的微生物最初具有的特定多肽的活性相比，多肽的活性降低。
该多肽(或蛋白质，例如LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白)的活性减弱可通过本领域中已知的任何方法进行，但不限于此，且可通过应用本领域中熟知的各种方法来实现(例如Nakashima N等人,Bacterial cellular engineering by genome editing andgene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773-2793，Sambrook等人,MolecularCloning 2012等)。
具体地，多肽(或蛋白质，例如LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白；下文中，描述为多肽)的减弱可为：
1)缺失编码多肽的基因的全部或一部分；
2)修饰表达调节区(或表达调节序列)，使得编码多肽的基因的表达降低；
3)修饰构成多肽的氨基酸序列，使得多肽的活性移除或减弱(例如氨基酸序列中一或多个氨基酸的缺失/取代/添加)；
4)修饰编码多肽的基因的序列，使得多肽的活性移除或减弱(例如，多肽基因的核酸核苷酸序列中的核酸核苷酸中一个或多个的缺失/取代/添加，使得编码经修饰以移除或减弱多肽的活性的多肽)；
5)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列；
6)引入互补结合于编码多肽的基因转录物的反义寡核苷酸(例如反义RNA)；
7)在编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列的前端添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列，以形成其中不可能附接核糖体的二级结构；
8)在编码多肽的基因序列的ORF(开放阅读框)的3'端添加反方向转录的启动子(反转录工程，RTE)；或
9)选自上文1)至8)中的两种或更多种的组合，但不特别限于此。
例如，
1)缺失编码多肽的基因的全部或一部分可为编码染色体中的内源性目标多肽的整个多核苷酸缺失，取代成其中核苷酸的一部分缺失的多核苷酸或取代为标记基因。
另外，2)修饰表达调节区(或表达调节序列)可为表达调节区(或表达调节序列)上通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合发生突变，或取代为具有较弱活性的序列。表达调节区包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列及调节转录和翻译终止的序列，但不限于此。
此外，3)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列可例如用编码另一起始密码子的核苷酸序列取代，该另一起始密码子与内源性起始密码子相比具有较低多肽表达率，但不限于此。
此外，4)及5)的修饰氨基酸序列或多核苷酸序列可为通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而在序列上发生突变以使多肽的活性变弱，或用经修饰而具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或经修饰而不具有活性的氨基酸序列或多核苷酸序列取代，但不限于此。举例而言，通过在多核苷酸序列中引入突变以形成终止密码子，可抑制或衰减基因的表达，但不限于此。“终止密码子”为充当指示不指代氨基酸的信号的密码子且蛋白质合成过程在mRNA上的密码子当中进行，且一般而言，3种UAA、UAG及UGA可用作终止密码子。
根据一个实例的微生物可被其中在SEQ ID NO:4的内源基因的ORF(开放阅读框)中的序列中引入突变以形成终止密码子的终止密码子置换(取代)，且例如对应于LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的第310位氨基酸(例如谷氨酰胺、Gln、Q)的密码子可被终止密码子置换(取代)。举例而言，在SEQ ID NO：4的核酸序列中，编码第310位氨基酸谷氨酰胺的多核苷酸是“CAG”，且其可为其中分别引入用“TAA”、“TAG”、“TGA”置换(取代)“CAG”的突变以用终止密码子取代该突变的多核苷酸。在一种实施方式中，引入突变以形成终止密码子的核酸序列可为SEQ ID NO:2的核酸序列(SEQ ID NO:4的野生型多核苷酸的第928位的C被T取代；C928T)。
6)引入互补结合于编码多肽的基因转录物的反义寡核苷酸(例如反义RNA)可参考例如文献[Weintraub,H.等人,Antisense-RNA as a molecular tool for geneticanalysis,Reviews-Trends in Genetics,第1(1)卷，1986]。
7)在编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列的前端添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列，以形成其中不可能附接核糖体的二级结构，使得mRNA翻译不可能或降低其翻译速率。
8)在编码多肽的基因序列的ORF(开放阅读框)的3'端添加反方向转录的启动子(反转录工程，RTE)可使与编码多肽的基因转录物互补的反义核苷酸减弱活性。
在本申请中，术语多肽活性的“增强”是指多肽活性与内源性活性相比增加。该增强可与诸如活化、上调、过表达、增加等术语互换使用。本文中，活化、强化、上调、过表达及增加可包括全部展现出其最初不具有的活性，或与内源性活性或修饰的前的活性相比展现出改善的活性。当性状通过天然或人工因素的基因突变而改变时，“内源性活性”是指转化前亲本菌株或非经修饰的微生物最初所具有的特异性多肽的活性。此术语可与“修饰前的活性”互换使用。与内源性活性相比，多肽的活性“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”是指其与转化之前亲本菌株或未经修饰的微生物最初具有的特异性多肽的活性和/或浓度(表达量)相比得到改善。
增强可通过引入外来多肽或增强内源性多肽的活性和/或浓度(表达量)来达成。多肽活性的增强可由相应多肽的活性的水平或表达量或自相应多肽排泄的产物的量的增加来证实。
本领域中熟知的各种方法可应用于增强多肽的活性，且其不受限制，只要其在修饰之前可强化目标多肽活性而非微生物。具体地，其可使用本领域技术人员熟知的基因工程改造和/或蛋白质工程改造，其为分子生物学的一般方法，但不限于此(例如Sitnicka等人,Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,第2卷.1-16，Sambrook等人,Molecular Cloning 2012等)。
具体地，增强本申请的多肽可为：
1)增加编码多肽的多核苷酸在细胞中的拷贝数；
2)用具有强活性的序列取代编码多肽的染色体上的基因表达调节区；
3)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列；
4)修饰多肽的氨基酸序列以使得多肽活性增强；
5)修饰编码多肽的多核苷酸序列，使得多肽活性增强(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码经修饰以强化多肽活性的多肽)；
6)引入显示多肽或编码此多肽的外来多核苷酸的活性的外来多肽；
7)对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化；
8)通过分析多肽的三级结构选择暴露位点进行变形或化学修饰；或
9)选自1)至8)中的2种或更多种的组合，但不特别限于此。
更具体而言，
1)增加编码多肽的多核苷酸在细胞中的拷贝数可通过将载体引入至宿主细胞来实现，该载体可复制且起作用，而不考虑宿主，其中编码对应多肽的多核苷酸可操作地连接。另外，编码对应多肽的多核苷酸可通过在宿主细胞中的染色体中引入1个拷贝或2个拷贝或更多个拷贝来实现。染色体中的引入可以通过将能够将多核苷酸插入染色体中的载体引入宿主细胞中来进行，但不限于此。
2)用具有强活性的序列取代编码多肽的染色体上的基因表达调节区(或表达调节序列)可例如通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在序列上发生突变，或用具有强得多的活性的序列取代，以进一步强化表达调节区的活性。表达调节区不特别限于此，但可包含启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列及调节转录及翻译终止的序列等。作为一种实施方式，其可用强启动子取代原始启动子，但不限于此。
已知强启动子的实例包括CJ1至CJ7启动子(美国专利US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(美国专利US 10584338 B2)、O2启动子(美国专利US10273491 B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但不限于此。
3)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列可例如用编码另一起始密码子的核苷酸序列取代，该另一起始密码子与内源性起始密码子相比具有高得多的多肽表达率，但不限于此。
4)及5)的修饰氨基酸序列或多核苷酸序列可为通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而在序列上发生突变以强化多肽的活性，或用经修饰以具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或经修饰以增加活性的氨基酸序列或多核苷酸序列取代，但不限于此。取代可特定地通过将多核苷酸通过同源重组而插入染色体中来进行，但不限于此。接着，待使用的载体可进一步包含用于确定染色体插入的选择标记。
6)引入显示多肽活性的外来多肽可为将编码显示与多肽相同/类似的活性的多肽的外来多核苷酸引入宿主细胞中。外源多核苷酸在其来源或序列上不受限制，只要其表现出与多肽相同/类似的活性即可。用于引入的方法可通过本领域技术人员适当地选择已知转化方法来进行，且多肽由所引入的多核苷酸表达来产生，且可增加其活性。
7)对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化可能是针对内源性多核苷酸的密码子优化以增加宿主细胞中的转录或翻译，或针对外来多核苷酸使其密码子优化以获得宿主细胞中的优化转录及翻译。
8)通过分析多肽的三级结构选择暴露位点进行变形或化学修饰可例如通过将待分析多肽的序列信息与数据库(其中储存碱基蛋白的序列信息)进行比较，确定根据序列的相似性程度而定的模板蛋白候选物，并基于此来确认结构，由此选择待变形或化学修饰的暴露位点来变形或修饰。
此类增强多肽活性可为基于修饰前野生型或微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度，相应多肽活性或浓度的表达量增加，或者相应多肽产生的产物的量增加，但不限于此。
本申请的微生物中的一部分或全部多核苷酸的修饰(例如，对编码前述蛋白质变体进行修饰)可通过以下方式诱导：(a)使用用于在微生物中插入染色体的载体进行同源重组或使用基因剪刀(经工程改造的核酸酶，例如CRISPR-Cas9)进行基因组校正和/或(b)处理诸如紫外线及放射性射线的光和/或化学物质，但不限于此。修饰一部分或全部基因的方法可包括通过DNA重组技术的方法。举例而言，通过将核苷酸序列或包含与目标基因具有同源性的核苷酸序列的载体注射至微生物中以引起同源重组，可实现一部分或全部基因的缺失。待注射的核苷酸序列或载体可包含显性选择标记，但不限于此。
在一种实施方式中，多肽(或蛋白质，例如LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白；下文中，描述为多肽)的衰减可由重组方法引起。重组方法可包括同源重组。当包含编码多肽的基因序列的一部分的载体转化至微生物中且在选择标记产物存在下培养时，同源重组方法可引起基因序列的一部分与微生物中的内源性基因的同源重组。
本申请的微生物可为LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白或编码其的多核苷酸失活或衰减的微生物；或由载体遗传修饰以使得LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白或多核苷酸失活或衰减的微生物(例如重组微生物)，但不限于此。
本申请的微生物(或菌株，重组细胞)可为具有L-谷氨酸生产率或增强的L-谷氨酸生产率(或收率)的微生物。
本申请的微生物可为天然具有L-谷氨酸生产率的微生物，或其中LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性减弱和/或使不具有L-谷氨酸生产率的亲本菌株得到L-谷氨酸生产率或改善生产率的微生物，但不限于此。
微生物(或菌株，重组细胞)具有改善的L-谷氨酸生产率(或收率)或具有L-谷氨酸生产率可指，在微生物(或菌株，重组细胞)中，与未经修饰的微生物、重组之前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株相比L-谷氨酸生产率改善，或得到的L-谷氨酸生产率与不具有L-谷氨酸生产率的未经修饰的微生物、重组之前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株的不同。
根据一种实施方式的具有衰减的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白活性的微生物与同源未经修饰的微生物相比可具有改善(增加)的L-谷氨酸生产率。在本申请中，“未经修饰的”微生物不排除包含可能天然存在于微生物中的突变的菌株，但其可为野生型菌株或天然菌株本身，或指由于自然或人工因素引起的基因突变而改变性状之前的菌株。举例而言，未经修饰的微生物可指根据一种实施方式，LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性未衰减的菌株或在其衰减之前的菌株(或诱导LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性衰减的突变未引入或在引入之前的菌株)。“未修饰的微生物”可与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“未经突变的菌株”、“未经修饰的菌株”、“未经突变的微生物”、或“标准微生物”互换使用。LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性如前述衰减。在一种实施方式中，用于比较L-谷氨酸生产率是否增加的目标菌株、未经修饰的微生物可为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株、谷氨酸棒状杆菌ATCC14067菌株、谷氨酸棒状杆菌野生型中缺失odhA基因的菌株(例如ATCC13869△odhA菌株)或谷氨酸棒状杆菌BL2菌株，被称为生产L-谷氨酸的NTG突变型菌株(KFCC11074，韩国专利第10-0292299号)，但不限于此。
微生物(或菌株，重组细胞)可进一步包含突变以增加L-谷氨酸的生产量，且只要其增加L-谷氨酸的生产量，突变的位置和/或待突变的基因和/或蛋白质的类型可不受限制被包括。可无限制地使用重组细胞，只要其为可转化细胞即可。
作为一种实施方式，与突变之前或未修饰的微生物的亲本菌株相比，在具有改善(增加)生产率(或收率)的微生物(或菌株，重组细胞)中，L-谷氨酸生产率可增加约1％或更多、约2.5％或更多、约5％或更多、约6％或更多、约7％或更多、约8％或更多、约9％或更多、约10％或更多、约10.5％或更多、约11％或更多、约11.5％或更多、约12％或更多、约12.5％或更多、约13％或更多、约13.5％或更多、约14％或更多、约14.5％或更多、约15％或更多、约15.5％或更多、约16％或更多、约16.5％或更多、约17％或更多、约17.4％或更多、约17.5％或更多、约18％或更多、约18.5％或更多、约19％或更多、约19.5％或更多、约20％或更多、约20.5％或更多、约21％或更多、约21.1％或更多、约21.5％或更多、约21.5％或更多、约22％或更多、约22.5％或更多、约23％或更多、约23.5％或更多、约24％或更多、约24.5％或更多、约25％或更多、约25.5％或更多、约26％或更多、约26.5％或更多、约27％或更多、约27.5％或更多、约28％或更多、约28.5％或更多、约29％或更多、约29.5％或更多、约30％或更多、约31％或更多、约32％或更多、约33％或更多、约34％或更多或35％或更多(上限不受特别限制，且举例而言，其可为约200％或更少、约150％或更少、约100％或更少、约50％或更少、约45％或更少或约40％或更少或约35％更少)，且在一种实施方式中，其可增加约17.2％或更多、约21.4％或更多或约21.6％或更多。在另一具体实施方式中，与突变之前或未修饰的微生物的亲本菌株相比，在具有改善(增加)生产率(或产量)的微生物(或菌株，重组细胞)中，L-谷氨酸生产率(收率)可增加约1.1倍或更多、约1.12倍或更多、约1.13倍或更多、1.15倍或更多、1.16倍或更多、1.17倍或更多、1.18倍或更多、1.19倍或更多、约1.2倍或更多、约1.21倍或更多、约1.22倍或更多、1.25倍或更多或约1.3倍或更多(上限不受特别限制，且举例而言，其可为约10倍或更少、约5倍或更少、约3倍或更少或约2倍更少)，且在一种实施方式中，其可增加约1.172倍或更多、约1.214倍或更多或约1.216倍或更多。更具体地，与突变之前或未修饰的微生物的亲本菌株相比，在具有增加生产率(或收率)的重组菌株中，L-谷氨酸生产率可增加约17.2％、约21.4％或约21.6％(或约1.17倍、约1.21倍或约1.22倍)，但不限于此。术语“约”为包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，且包括等于或类似于术语约以下值的范围内的所有值，但不限于此。
在一种实施方式中，棒状杆菌属微生物可能是谷氨酸棒状杆菌、生乳棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、单一棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、龟口腔棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)和/或微黄棒状杆菌(Corynebacteriumflavescens)。
作为另一种实施方式，本申请的重组微生物可为如下微生物，其中L-谷氨酸的生物合成途径中蛋白质的一部分的活性进一步增强，或L-谷氨酸的降解途径中蛋白质的一部分的活性额外失活以强化L-谷氨酸生产率。
具体地，本申请的微生物可为如下微生物，其中OdhA蛋白进一步失活或odhA基因进一步缺失。更具体地，本申请的微生物可能是其中在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中OdhA蛋白质失活的谷氨酸棒状杆菌；或在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中odhA基因缺失的微生物。OdhA蛋白可包含NCBI序列ID WP_060564343.1的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:23的氨基酸序列)。OdhA蛋白质可为具有多官能酮戊二酸脱羧酶/酮戊二酸脱氢酶硫胺素焦磷酸结合亚单位/二氢脂酰赖氨酸-残基丁二酰转移酶亚单位的活性的蛋白，该蛋白衍生自谷氨酸棒状杆菌菌株。odhA基因可衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株，且具体地，其可包含SEQ IDNO:24的核酸序列(GenBank登记号序列ID：CP016335.1的核酸序列中的第1,276,170位至第1,279,787位的序列，例如BBD29_06050基因)。
然而，OdhA蛋白失活或odhA基因缺失为一种实例，且其不限于此，且本申请的微生物可为各种已知的L-谷氨酸生物合成途径的蛋白活性增强或降解途径的蛋白活性失活或减弱的微生物。
本申请的另一方面提供一种L-氨基酸的生产方法，其包括在培养基中培养本申请的微生物。
本申请的L-氨基酸的生产方法可包括在培养基中培养本申请的微生物。本申请的微生物如前述。
此外，本申请的L-氨基酸可为L-谷氨酸。
在本申请中，“培养”是指使本申请的谷氨酸棒状杆菌菌株在经适当调整的环境条件下生长。本申请的培养过程可根据适当培养基及本领域中已知的培养条件进行。此类培养方法可通过本领域技术人员根据待选择的菌株容易地调整而使用。具体地，培养可为分批的、连续的和/或分批补料的，但不限于此。
在本申请中，“培养基”是指其中培养本申请的谷氨酸棒状杆菌菌株所需的养分混合作为主要组分且供应养分及生长因子等的物质，包括存活及生长所必需的水。具体地，可不受特定限制地使用用于培养本申请的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养基及其他培养条件，只要其为用于培养常见微生物的培养基即可，但本申请的谷氨酸棒状杆菌菌株可在含有碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等适合的普通培养基中，在好氧条件下，在调整温度、pH值等时进行培养。
具体地，棒状杆菌属菌株的培养基可在文献[“《普通细菌学方法手册(Manual ofMethods for General Bacteriology)》”由美国细菌学协会编写(美国华盛顿特区，1981年)]中发现。
在本申请中，碳源可包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、蔗糖(sucrose)、麦芽糖等；糖醇，诸如甘露糖醇、山梨糖醇等；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；及氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。另外，可使用天然有机养分，诸如淀粉水解产物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣以及玉米浸渍液，且具体地，可使用碳水化合物，诸如葡萄糖及灭菌预处理的糖蜜(亦即转化成还原糖的糖蜜)等，且可不受限制地使用其他适当量的碳源。此等碳源可单独或以两种或更多种的组合形式使用，但不限于此。
作为氮源，可使用无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；及有机氮源，诸如氨基酸，包括谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等、蛋白胨、NZ-胺、肉萃取物、酵母萃取物、麦芽萃取物、玉米浸渍液、酪蛋白水合物、鱼或其分解产物、经脱脂的大豆饼或其分解产物等。这些氮源可单独或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。
磷源可包含磷酸一氢钾、磷酸二氢钾或与其对应的含钠盐等。可使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等作为无机化合物，且可包括其他氨基酸、维生素和/或适当前体等。这些组分或前体可以分批或连续方式添加至培养基中。然而，其不限于此。
另外，在本申请的棒状杆菌属菌株的培养期间，可以适当方式将化合物(诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等)添加至培养基中以调整培养基的pH。此外，在培养期间，诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂可用于抑制气泡产生。另外，为了维持培养基的好氧条件，将氧气或含氧气体注入培养基中，或为了维持厌氧及非好氧条件，可注入气体、氮气、氢气或二氧化碳气体，但不限于此。
在本申请的培养中，培养温度可维持在20至45℃，具体为25至40℃，且培养可进行约10至160小时，但不限于此。
通过本申请的培养生产的L-氨基酸(例如，L-谷氨酸)可以分泌至培养基中或残留在细胞中。
本申请的L-氨基酸的生产方法可进一步包含例如在培养之前制备本申请的微生物(菌株)，制备用于培养微生物的培养基或其组合(以任何次序)。
本申请的L-氨基酸的生产方法可进一步包括根据培养从培养基(其中进行培养的培养基)或微生物(棒状杆菌属菌株)回收L-氨基酸。回收可进一步包括在培养之后。
回收可通过使用本领域中已知的适当方法，根据本申请的微生物的培养方法(例如分批、连续或分批补料培养方法等)收集目标L-氨基酸。举例而言，可使用离心、过滤、用结晶的蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、萃取、超声波破坏、超滤、透析、各种类型的层析(诸如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等)、HPLC或这些方法的组合，且目标L-氨基酸可通过使用本领域中已知的适当方法从培养基或微生物回收。
另外，本申请的L-氨基酸的生产方法可另外包括纯化。纯化可通过使用本领域中已知的适合方法进行。在一种实施方式中，当本申请的L-氨基酸的生产方法包括回收及纯化两者时，回收及纯化可以任何顺序连续或非连续地执行，或可同时执行或整合成一个步骤，但不限于此。
本申请的另一个方面提供一种用于生产L-氨基酸(例如，L-谷氨酸)的组合物，其包含本申请的微生物；培养其的培养基；或其两种或更多种的组合。
本申请的组合物可进一步包含用于生产氨基酸的组合物中常用的任何适当赋形剂，且此赋形剂可为例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或张力剂等，但不限于此。
在本申请的组合物中，微生物(菌株)、培养基及L-氨基酸等如上文其他方面中所描述。
本申请的另一个方面提供一种本申请的微生物；培养其的培养基；或其两种或更多种的组合用于生产L-氨基酸(例如L-谷氨酸)的用途。
本申请的另一个方面提供一种本申请的微生物；培养其的培养基；或其两种或更多种的组合在制备用于生产L-氨基酸(例如，L-谷氨酸)的组合物中的用途。
有益效果
本申请的具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子活性的棒状杆菌属微生物具有显著增加的L-谷氨酸的生产率，且因此与常规微生物相比，使用此微生物有可能以更高收率生产L-谷氨酸。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本申请。然而，以下实施例仅为说明本申请的较佳实施方式，且因此并不意欲限制本申请的范围。另一方面，本说明书中未描述的技术事项可充分理解且容易地由本领域或本申请的类似技术领域的技术人员实施。
实施例1：生产用于在微生物中表达LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白变体的载体
在本发明实施例中，为了证实其中对应于LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:3的氨基酸序列)第310位的谷氨酰胺(Gln，Q)的密码子被取代为终止密码子(*)的变体(Q310*；SEQ ID NO:1，309序列)对L-谷氨酸生产的影响，按以下方法生产用于生产表达载体的菌株的载体。
以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的gDNA(基因组DNA)为模板，通过分别使用描述为SEQ ID NO:5及6的序列的引物对及描述为SEQ ID NO:7及8的序列的引物对分别进行PCR。使用上文获得的两个片段的混合物作为模板，再次使用SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:8的序列的引物对进行重叠PCR以获得片段。使用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，且通过在95℃下变性5分钟，且接着在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒且在72℃下聚合1分钟30秒，重复30次，且接着在72℃下聚合5分钟进行PCR。
使用Gibson组装(DG Gibson等人,NATURE METHODS,第6卷，第5期，2009年5月,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)方法克隆经扩增的基因片段及使用SmaI限制酶切割的用于染色体转化的载体pDCM2(韩国专利公开第10-2020-0136813号)，且接着通过按计算的摩尔数混合Gibson组装试剂及各基因片段，且随后将其在50℃下保存1小时来进行克隆。将菌株涂抹在包含卡那霉素(kanamycin)(25mg/l)的LB固体培养基中。在选择其中插入目的基因的菌落之后，通过使用通常已知的质粒(载体)萃取方法获得载体。该载体命名为pDCM2-BBD29_06680(Q310*)。本发明实施例中所用的引物序列描述于下表1中。
表1
名称 序列(5'->3') SEQ ID NO
1F ATTCGAGCTCGGTACCCGAAAACCCAGAGCTGCTTG SEQ ID NO:5
2R CATTGATCAGCTTCTaCAGAATCTCAAACGC SEQ ID NO:6
3F GCGTTTGAGATTCTGtAGAAGCTGATCAATG SEQ ID NO:7
4R CGACTCTAGAGGATCCCCCCTGTGCCTGCCTGCG SEQ ID NO:8
实施例2：生产衍生自野生型谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸生产菌株以及引入LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白变体
实施例2-1：生产具有L-谷氨酸生产率的衍生自野生型谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸棒状杆菌菌株
为了生产具有L-谷氨酸生产率的衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的菌株，基于先前技术(Appl Environ Microbiol.2007年2月；73(4):1308-19.电子出版2006年12月8日)，生产了其中缺失odhA基因(GenBank登记号第WP_060564343.1号，SEQ ID NO:24)的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869△odhA菌株。
具体地，对于odhA缺失，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869染色体DNA作为模板，通过分别使用SEQ ID NO:17及18的引物对及SEQ ID NO:19及20的引物对分别进行PCR，得到odhA基因的上游区及下游区。使用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，且PCR扩增条件为在95℃下变性5分钟，接着在95℃下变性30秒，在58℃下退火30秒，且在72℃下聚合60秒，重复30次，接着在72℃下聚合5分钟。
通过使用Gibson组装方法克隆所扩增的odhA上游及下游区及用SmaI限制酶切割的用于染色体转化的载体pDCM2，从而获得重组载体，且将其命名为pDCM2-△odhA。通过按计算的摩尔数混合Gibson组装试剂及各基因片段，且随后将其在50℃下保存1小时来进行克隆。
将所生产的pDCM2-△odhA载体通过电穿孔转化至谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中，然后进行二次杂交，由此得到染色体上缺失odhA基因的菌株。经由使用SEQ ID NO:21及22的PCR及基因组测序确认odhA基因的缺失，且将生产的菌株命名为ATCC13869△odhA。用于本实施例中的引物的序列描述于下表2中。
表2
名称 序列(5'->3') SEQ ID NO
13F TGAATTCGAGCTCGGTACCCTTGAACGGAATTGGGTGG SEQ ID NO:17
14R CCCAGGTGGCATCGGTACCTTCACCCAGCGCCACGCAG SEQ ID NO:18
15R CGCTGGGTGAAGGTACCGATGCCACCTGGGTTGGTCAAG SEQ ID NO:19
16R GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGACAAGGAATGGAGAGA SEQ ID NO:20
17F CTTACCGTTGTTGCCCTT SEQ ID NO:21
18R CTCCTTCACCCACATCATT SEQ ID NO:22
实施例2-2：生产引入LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白变体的菌株
将上述实施例1中生产的载体pDCM2-BBD29_06680(Q310*)通过电穿孔转化至上述实施例2-1中生产的ATCC13869△odhA中，然后进行二次杂交，由此得到在染色体上引入BBD29_06680(Q310*)突变的菌株。引入BBD29_06680(Q310*)突变的菌株通过使用SEQ IDNO:9及10的PCR及基因组测序得到确认，且将生产的菌株命名为CA02-1626。CA02-1626菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌CA02-1626，且在2021年1月18日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏编号为KCCM12930P。
用于本实施例中的引物的序列描述于下表3中。
表3
名称 序列(5'->3') SEQ ID NO
5F GCTGCTCGTGAAGCTGG SEQ ID NO:9
6R GAACCCACCTGAGCATTC SEQ ID NO:10
实施例2-3：比较表达LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白变体的菌株的L-谷氨酸生产率
使用2-2中生产的菌株ATCC13869△odhA菌株作为对照组，证实L-谷氨酸生产率。对照组及CA02-1626菌株通过如下方法培养。
各菌株接种于含有种子培养基25mL的250mL角挡板烧瓶(corner-baffled flask)中，且在以200rpm振荡下，在30℃下培养20小时。此后，将1mL的种子培养液接种于含有生产培养基25mL的250mL角挡板烧瓶中，且在以200rpm振荡下，在30℃下培养40小时。完成培养之后，使用高效液相层析(HPLC)测量L-谷氨酸的收率，且测量结果展示于下表4中。
<种子培养基>
葡萄糖1％、牛肉萃取物0.5％、聚蛋白胨1％、氯化钠0.25％、酵母萃取物0.5％、脲0.2％，pH 7.2
<生产培养基>
粗糖6％、碳酸钙5％、硫酸铵2.25％、单磷酸钾0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸铁10mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、生物素50μg/L
表4
菌株名称 L-谷氨酸浓度(g/L) L-谷氨酸浓度增加率(％)
ATCC13869△odhA 1.90 -
CA02-1626 2.31 21.6
如上表4中所显示，证实与对照组ATCC13869△odhA菌株相比，在其中引入BBD29_06680(Q310*)突变的CA02-1626菌株中，L-谷氨酸的浓度增加约21.6％。
实施例3：生产LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白缺失的菌株及测量L-谷氨酸生产率
实施例3-1：生产LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白基因缺失的载体
在该实施例中，证实了当与LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的第310位氨基酸谷氨酰胺(Gln，Q)相对应的密码子被终止密码子取代时，L-谷氨酸的生产率得到了提高。因此，在本实施例中，确认LacI家族DNA结合性转录调节因子(BBD29_06680)基因缺失对L-谷氨酸的生产量的影响。
具体地，对于BBD29_06680缺失，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的gDNA(基因组DNA)作为模板，通过使用SEQ ID NO:11及12的引物对及描述为SEQ ID NO:13及14的序列的引物对进行PCR，得到BBD29_06680基因的上游区及下游区。使用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，且PCR扩增条件为在95℃下变性5分钟，接着在95℃下变性30秒，在58℃下退火30秒且在72℃下聚合60秒，重复30次，且接着在72℃下聚合5分钟。通过使用用SmaI限制酶切割的用于染色体转化的载体pDCM2及Gibson组装方法克隆所扩增的DNA片段，从而获得重组载体，且将其命名为pDCM2-△BBD29_06680。通过按计算的摩尔数混合Gibson组装试剂及各基因片段，且随后将其在50℃下保存1小时来进行克隆。
用于本实施例中的引物的序列描述于下表5中。
表5
名称 序列(5'->3') SEQ ID NO
7F attcgagctcggtacccCCAGTTCGGTCACAAGAC SEQ ID NO:11
8R GCTTTTTGGGCTGCTTCGCTTCTTCGGGCTGG SEQ ID NO:12
9F CCAGCCCGAAGAAGCGAAGCAGCCCAAAAAGC SEQ ID NO:13
10R GACTCTAGAGGATCCCCGGACAACGCCTTGGCG SEQ ID NO:14
实施例3-2：生产LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白缺失的菌株
将上述实施例3-1中生产的载体pDCM2-△BBD29_06680通过电穿孔转化至上述实施例2-1中生产的ATCC13869△odhA中，然后进行二次杂交，由此得到染色体上缺失BBD29_06680基因的菌株，且通过使用SEQ ID NO:15及16的引物对进行PCR及基因组测序来确认。所选择的菌株命名为CA02-1627。用于本实施例中的引物的序列描述于下表6中。
表6
名称 序列(5'->3') SEQ ID NO
11F GCAAGGCGATGGAACGTC SEQ ID NO:15
12R CTCATCCAAGTGGTGCG SEQ ID NO:16
实施例3-3：测量LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白缺失的菌株的L-谷氨酸生产率
为了确认L-谷氨酸生产率，使用上述实施例2-1生产的ATCC13869△odhA菌株为对照组，按照实施例2-3的发酵滴度评价方法进行评价，且在完成培养后，用高效液相层析(HPLC)测量L-谷氨酸的产率，且经测量的结果如下表7所示。
表7
菌株名称 L-谷氨酸浓度(g/L) L-谷氨酸浓度增加率(％)
ATCC13869△odhA 1.92 -
CA02-1627 2.33 21.4
如上表7中所展示，证实与对照组ATCC13869△odhA菌株相比，在其中缺失BBD29_06680基因的CA02-1627中，L-谷氨酸的浓度增加约21.4％。
实施例4：生产NTG突变体衍生的引入LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白变体的菌株及测量L-谷氨酸生产率
为了证实BBD29_06680(Q310*)变体是否在衍生自NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)突变棒状杆菌属的L-谷氨酸生产率增加的菌株中也显示出相同效应，将该变体引入至被称为生产L-谷氨酸的NTG突变菌株的谷氨酸棒状杆菌BL2菌株(KFCC11074，韩国专利第10-0292299号)中。
将实施例1中生产的pDCM2-BBD29_06680(Q310*)载体通过电穿孔转化至KFCC11074菌株中，然后进行二次杂交，由此选择在染色体上引入BBD29_06680(Q310*)变体的菌株。这通过使用SEQ ID NO:9及10的PCR及基因组测序进行确认，且所生产的菌株命名为CA02-1630。
对于所生产的CA02-1630及谷氨酸棒状杆菌KFCC11074菌株，通过下文所指定的方法进行发酵滴定实验。
各菌株接种于含有种子培养基25mL的250mL角挡板烧瓶中，且在以200rpm振荡下，在30℃下培养20小时。此后，将1mL的种子培养液接种于含有生产培养基25mL的250mL角挡板烧瓶中，且在以200rpm振荡下，在30℃下培养40小时。完成培养之后，通过使用HPLC方法测量L-谷氨酸的收率，且测量结果展示于下表8中。
<种子培养基>
葡萄糖1％、牛肉萃取物0.5％、聚蛋白胨1％、氯化钠0.25％、酵母萃取物0.5％、脲0.2％，pH 7.2
<生产培养基>
粗糖6％、碳酸钙5％、硫酸铵2.25％、单磷酸钾0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸铁10mg/L、盐酸硫胺素0.2mg/L、生物素500μg/L
表8
菌株名称 L-谷氨酸浓度(g/L) L-谷氨酸浓度增加率(％)
KFCC11074 6.91 -
CA02-1630 8.10 17.2
如上表8中所展示，证实与对照组KFCC11074菌株相比，在CA02-1630菌株中，L-谷氨酸的浓度增加约17.2％。
根据以上描述，本申请所属技术领域中的普通技术人员将能够理解，本申请可以其他特定形式进行而不改变其技术精神或基本特征。就此而言，应理解，上文所描述的实施例在所有方面中为例示性的而非限制性的。本申请的范围应解释为包括由稍后将描述的权利要求书的含义及范围衍生的所有变化或修改形式以及等效概念而非以上详细描述。
[保藏编号]
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)
保藏编号：KCCM12930P
保藏日期：2021年1月18日。
(中文译文)
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
国际表格
至：CJ第一制糖株式会社
韩国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心
(邮编)100-400
上述翻译文本与原文没有相违之处。

Claims (13)

1.一种具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白活性的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白衍生自棒状杆菌属。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白由描述为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽组成。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白由描述为SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多肽编码。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中，与其中LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性未经减弱的亲本菌株或野生型相比，所述棒状杆菌属微生物具有增加的L-谷氨酸生产率。
7.一种L-谷氨酸的生产方法，其包括在培养基中培养具有减弱的LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白活性的棒状杆菌属微生物。
8.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其进一步包括根据所述培养从培养基或微生物中回收L-谷氨酸。
9.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白衍生自棒状杆菌属。
10.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白由描述为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽组成。
11.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其中，所述LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白由描述为SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多肽编码。
12.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
13.根据权利要求7所述的L-谷氨酸的生产方法，其中，与其中LacI家族DNA结合性转录调节因子蛋白的活性未经减弱的亲本菌株或野生型相比，所述棒状杆菌属微生物具有增加的L-谷氨酸生产率。
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