CN117737080A - 油菜抗寒基因BnaHSFB1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种油菜抗寒基因BnaHSFB1及应用，油菜抗寒基因BnaHSFB1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种可缓解北方旱寒区冬季低温造成的冬油菜幼苗无法安全越冬与生殖生长的问题、并能促进具有超强抗寒的优质冬油菜新品种的选育和生产以及为改良农作物的抗寒特性提供借鉴和指导的油菜抗寒基因BnaHSFB1及应用。

Description

油菜抗寒基因BnaHSFB1及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种抗寒基因及应用，尤其涉及一种油菜抗寒基因BnaHSFB1及应用。

背景技术

冬油菜是一种重要的油料作物，因其能够提供优质的食用油和良好的保持水土能力在中国北方地区广泛种植。然而，由于北方旱寒区冬季低温限制，仅具有优异抗寒性的白菜型冬油菜(Brassica rape L.)可以安全越冬，该区传统白菜型冬油菜存在低产、劣质、易倒伏等问题。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)具有高产、优质、抗倒伏等优异性状，是我国油菜主要栽培类型。因此，如能选育甘蓝型冬油菜强抗寒品种，替代北方白菜型冬油菜，将促进我国北方旱寒区油菜产业的发展。随着现代分子生物学技术的飞速发展与日趋成熟，发掘和鉴定植物耐低温相关基因，使人们利用基因工程创制抗逆转基因植株，从分子水平上探知植物对低温胁迫的响应机制，对选育强抗寒优质作物新品种具有重要的指导意义。

低温对植物的伤害有两种，一种是零上低温造成的，称之为寒害(0-15℃)；另一种是零下低温造成的，称之为冻害(<0℃)。寒害会破坏细胞结构，导致蛋白质复合物不稳定，光合作用受阻。而冻害会对植物造成更严重的伤害，使植物细胞结冰形成冰晶，并使细胞严重脱水，机械性伤害最终导致植物死亡，严重影响作物的产量和品质，特别是对高纬度和高海拔地区的冬季作物。

热激转录因子(HSFs)是一类能够调控不同热胁迫基因表达的专用转录因子，在植物非生物胁迫响应中发挥着重要作用。拟南芥AtHSFB1在热应激条件下可诱导热激蛋白HSPs基因表达，并使其获得耐热性；小麦TaHSFA6改善了转基因小麦的耐热性；但从来没有关于该基因在冷冻胁迫条件下对植物生理生化影响的报道，从生理生化和分子遗传学角度深入分析该基因的功能或许可以为找到一条利用分子育种手段培育耐高温或其它逆境能力增强的作物新品种的有效途径。

发明内容

为了解决背景技术中存在的甘蓝型油菜越冬难的问题，本发明提供了一种可缓解北方旱寒区冬季低温造成的冬油菜幼苗无法安全越冬与生殖生长的问题、并能促进具有超强抗寒的优质冬油菜新品种的选育和生产以及为改良农作物的抗寒特性提供借鉴和指导的油菜抗寒基因BnaHSFB1及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种油菜抗寒基因BnaHSFB1，其特征在于：所述油菜抗寒基因BnaHSFB1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述油菜抗寒基因BnaHSFB1包括819bp的开放阅读框，编码273个氨基酸。

上述油菜抗寒基因BnaHSFB1的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示。

上述生物材料是表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在油菜抗寒时的应用。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在油菜置于应答冷冻胁迫反应中的应用。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在冬油菜应答冷冻胁迫反应中的应用。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜应答冷冻胁迫反应中的应用。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜在冷冻胁迫下清除ROS以及降低细胞膜脂过氧化程度方面的应用。

如前所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜在冷冻胁迫下对油菜根系的生长发育具促进时的应用。

本发明的优点是：

本发明提供了一种油菜抗寒基因BnaHSFB1及应用，是利用农杆菌介导的遗传转化法转化油菜中双11号，获得了转基因过表达株系和沉默表达株系，并以之为材料进行冷冻胁迫(-4℃)处理，观察冷冻胁迫表型并拍照。冷冻胁迫处理后的油菜幼苗进行耐低温相关指标的测定，包括主根长度，ROS含量测定，相关酶活性测定，丙二醛含量测定。经生物学功能验证表明：与野生型植株(WT)相比，转基因过表达植物抗寒能力明显提高，而转基因沉默表达植物抗寒能力明显降低，进而证实本发明克隆的BnaHSFB1基因具有抗寒功能。本发明是一种从油菜中分离得到的一个低温诱导的热击转录因子基因BnaHSFB1，该基因具有抗寒功能，将上述基因转化到油菜中，获得的转基因超表达植物抗寒能力明显提高，而转基因沉默植物抗寒能力明显降低。

附图说明

图1A为本发明中油菜热击转录因子基因BnaHSFB1分离的胶图，图1B为本发明中油菜热击转录因子BnaHSFB1编码蛋白的亚细胞定位图；

图2为本发明中过表达油菜阳性鉴定分析图；

图3为本发明中转BnaHSFB1基因油菜沉默株系鉴定及表达量分析图；

图4为本发明中基因BnaHSFB1转化油菜低温处理前、后的表型图；

图5为本发明中转BnaHSFB1基因油菜过表达株系(OE1)、编辑株系(GE3)及野生型(WT)生理指标测定图；

图6为本发明中转BnaHSFB1基因油菜过表达株系(OE1)、编辑株系(GE3)及野生型主根长度测定图；

图7是BnaHSFB1同源基因进化树；

图8是BnaHSFB1油菜遗传转化流程图。

具体实施方式

下面结合具体实验及实验数据对本发明所提供的技术方案做详细阐述。

实验一：BnaHSFB1基因的CDS全长扩增

1.1)设计引物

用Primer 6在BnaHSFB1基因CDS序列的两端设计引物，详见表1，然后送擎科合成引物。

表1 BnaHSFB1基因引物序列

1.2)BnaHSFB1的CDS序列扩增

用1.1)设计的引物，以中双11号叶片的cDNA为模板，用TaKaRa Ex进行PCR扩增得到一条819bp的特异性条带，经电泳后得到如图1A所示特异性条带。然后用OMEGA胶回收试剂盒Gel Extraction Kit D2500将扩增的BnaHSFB1的CDS序列进行胶回收纯化。

1.3)将BnaHSFB1的CDS序列连接到pMD19-T载体

将pMD19-T载体与BnaHSFB1胶回收片段连接，并转化大肠杆菌DH5α。

1.4)目的片段阳性克隆鉴定

挑选大肠杆菌单克隆进行菌液PCR检测，将PCR鉴定正确的单克隆送擎科测序，将测序结果与BnaHSFB1的CDS序列进行比对，挑选序列一致的单克隆为构建成功的pMD19-T-BnaHSFB1。

实验二：亚细胞定位载体构建

2.1)引物设计

以Xho I与Sal I为酶切位点，设计特异引物pA7-BnaHSFB1-F和pA7-BnaHSFB1-R，如表2所示，送擎科合成。

表2 pA7-BnaHSFB1载体引物序列

2.2)重组载体pA7-BnaHSFB1-GFP的连接、转化及测序

以2.1)所设计的引物为引物，以1.4)测序成功的pMD19-T-BnaHSFB1菌液为模板，PCR扩增后对含酶切位点Xho I与Sal I的产物进行胶回收；将含pA7-GFP的大肠杆菌DH5α菌液桉1：1000比例加入到含Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒；利用Takara的QuickCut限制酶Xho I与Sal I对空载体pA7-GFP进行酶切，通过诺唯赞同源重组酶ClonExpress Il One Step Cloning Kit将pA7-GFP载体与含有酶切位点Xho I与Sal I的BnaHSFB1 ORF的胶回收产物进行连接，再转化大肠杆菌筛选阳性克隆进行测序，最终获得pA7-BnaHSFB1-GFP重组载体。

2.3)基因枪转化烟草叶肉细胞及激光共聚焦显微镜扫描观察

取正常生长至30天苗龄大小的新鲜烟草叶片，平铺于固体MS培养基内，通过基因枪将2.2)得到的pA7-BnaHSFB1-GFP重组载体转化到烟草叶肉细胞中，25℃，黑暗过夜培养16h；将培养的烟草叶片置于载玻片上，用ZEISS LSM 780型激光共聚焦显微镜进行GFP蛋白表达信号的观察。通过对烟草叶肉细胞中的GFP蛋白信号进行观察，结果表明，pA7-BnaHSFB1-GFP融合蛋白信号均匀分布在烟草叶肉细胞的细胞核上，如图1B所示。

实验三：过表达载体构建

3.1)引物设计

以XbaI和BglII为酶切位点，设计载体PC1300-DsRed-BnaHSFB1-F/R特异引物，如表3所示，送擎科合成。

表3 PC1300-DsRed-BnaHSFB1载体引物序列

3.2)重组载体PC1300-DsRed-HSFB1的连接、转化及测序

以步骤1.4)测序成功的pMD19-T-BnaHSFB1菌液为模板，表3中的引物为引物，PCR扩增后对含酶切位点XbaI和BglII的产物进行胶回收；将含PC1300-DsRed的大肠杆菌DH5α菌液桉1：1000比例加入到含Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒；利用Takara的QuickCut限制酶XbaI和BglII对空载体PC1300-DsRed进行酶切后胶回收；通过诺唯赞同源重组酶ClonExpress Il One Step Cloning Kit将含有酶切位点XbaI和BglII的BnaHSFB1 ORF的胶回收产物构建到PC1300-DsRed载体的XbaI和BglII酶切位点之间，再转化大肠杆菌DH5α筛选阳性克隆进行测序，最终获得PC1300-DsRed-BnaHSFB1重组载体。

3.3)提取PC1300-DsRed-BnaHSFB1重组载体质粒，并转化农杆菌GV3101

将构建成功的PC1300-DsRed-BnaHSFB1单克隆扩大摇菌12h，用天根质粒小提试剂盒进行重组质粒的提取，并将提取的重组质粒转化到农杆菌GV3101中；挑选农杆菌单克隆，用载体PC1300-DsRed的上游引物(PC1300-DsRed-F：ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC)和PC1300-DsRed-BnaHSFB1的下游引物(表3)进行PCR扩增，验证构建好的重组质粒成功转化到农杆菌GV3101中，得到PC1300-DsRed-BnaHSFB1。

实验四：基因编辑载体构建

4.1)设计基因编辑靶点引物

根据BnaHSFB1 CDS序列，查找该基因在油菜和拟南芥中的同源基因，在油菜中共有5个同源基因，其中三个基因的CDS序列与目的基因BnaC07G0535700ZS相似性较高(图7)。根据CRISPR-Pv2.0设计基因编辑靶点，共设计2个靶点，一个靶点只编辑目的基因，另一个靶点同时编辑A03上的同源基因，表4中黑色加粗序列为靶点序列，两端为同源臂序列，将引物送擎科合成。

表4 BnaC07G0535700ZS基因编辑靶点引物

4.2)扩增U6启动子序列

以4.1)设计的引物为引物，以带有U6启动子的中间质粒PCDC为模板PCR扩增第一个靶点和第二个靶点的启动子序列加靶点序列，用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。然后用OMEGA胶回收试剂盒Gel Extraction Kit D2500将扩增的BnaHSFB1基因编辑靶点序列纯化。

4.3)连接到基因编辑载体BGK01D，并转化大肠杆菌DH5α

用同源重组的方法将纯化的BnaHSFB1的基因编辑靶点序列构建到BGK01D载体的BsaI酶切位点之间，然后转化大肠杆菌DH5α。

4.4)测序鉴定

挑选大肠杆菌单克隆进行菌液PCR鉴定，将PCR鉴定正确的单克隆送擎科测序，将测序结果与HSFB1的靶点序列进行比对，挑选序列一致的单克隆为构建成功的单克隆。

4.5)提质粒，并转化农杆菌GV3101

挑选农杆菌单克隆，用载体上的上游引物(BGK01D-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAA)和靶点下游引物(表4)进行PCR扩增，验证构建好的重组质粒转化到农杆菌GV3101中，得到BGK01D-BnaHSFB1质粒。

实验五：油菜遗传转化，过程如图8所示：

5.1)种子清洗与萌发

选取饱满、大小一致、新鲜的油菜种子用无菌水反复冲洗数次，用70％的酒精对种子消毒30s、10％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗4-5遍，无菌滤纸吸干后，将种子接种于萌发培养瓶，23℃暗培养5-6天。

5.2)农杆菌培养

取-80℃保存的农杆菌感受态GV3101于冰上融化，分别将0.1μg的步骤3.3)所得到的PC1300-BnaHSFB1与步骤4.5)所得到的BGK01D-BnaHSFB1质粒DNA加入100μl农杆菌感受态GV3101中，用移液器吸打混匀；依次于冰上静置10min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴2min；加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2～3h；25℃，6000rpm离心1min后收集菌体，留取100μl上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，于28℃培养箱培养2-3天；随机挑选6个单菌落，做菌落PCR，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；挑取做标记的农杆菌单克隆接种到5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h；25℃，5000rpm，离心15min，收集菌体；将菌体用转化Buffer吹打均匀，重悬至OD₆₀₀＝0.5～0.6。

5.3)外植体准备

分别选取油菜幼苗的真叶、子叶、下胚轴作为外植体进行转化。真叶、子叶切去叶尖、叶柄，其余部分切成0.5cm×0.5cm大小的叶块；下胚轴切成长度约0.4-0.6mm的切段，水平放置于预培养基(ZT 2.0mg/L+IAA0.2 mg/L)上，每皿15-20片，在14h光照/10h黑暗，光照强度1800lx，温度(20±2)℃的条件下预培养1天。

5.4)外植体的农杆菌接种及共培养

将外植体从预培养基上取出，放入OD₆₀₀＝0.5左右的农杆菌培养液中，转化30min，取出外植体在无菌纸上晾干，重新放入预培养基共培养2-3天。

5.5)选择培养

将共培养的外植体转接入筛选培养基(ZT 2.0mg/L+IAA0.2 mg/L+Kan 50mg/L+羧苄青霉素300mg/L)进行选择培养，选择培养几天后子叶开始变厚，下胚轴开始变粗。转化的外植体将在筛选培养基上形成愈伤组织和不定芽，每两周继代一次。

5.6)不定芽伸长培养

将带有芽原基的愈伤切成小片，并转移到茎伸长培养基(ZT 1.0mg/L+IAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+羧苄青霉素300mg/L)上进行继代，每两周转移一次。

5.7)不定芽生根培养

不定芽长至1cm左右时，选择生长健康的再生幼芽，将基部愈伤组织及培养基完全切除，转接到生根培养基上(以MS、1/2MS为基本培养基，添加0.1mg/L IAA+50mg/LKan+300mg/L羧苄青霉素)培养，使其形成完整植株。

5.8)练苗与移栽培养

待幼苗长出侧根后揭开瓶盖，向培养瓶中倒入少量无菌水，将培养瓶放置在阴凉通风处进行练苗；3天后洗净根部培养基，将幼苗转入土壤中；前7天用透明的塑料薄膜罩住小苗，弱光培养一段时间，以使再生苗适应从培养基到营养基质的转变，随后移入自然环境中炼苗培养，最后移栽至大田中。

5.9)检测

采用CTAB法提取5.8)中获得的油菜抗寒基因组DNA，进行PCR检测。对照与样品的电泳条带清晰、大小正确，如图2，图3所示。其中，图2中P是PC1300-DsRed空载质粒，Lane 1是Wt野生型，Lane 2-9是指PC1300-DsRed-BnaHSFB1片段阳性鉴定，M是marker，Lane 10-11是以ddH₂O为模板的PCR结果。图3中A是指BnaHSFB1沉默材料(BGK01D-BnaHSFB1)和Wt野生型材料鉴定，M代表marker，Lane 1是BGK01D空载质粒，Lane 2是Wt野生型，Lane 3-8是指BGK01D-BnaHSFB1片段阳性鉴定，Lane 9-10是以ddH₂O为模板的PCR结果；B是指随机选取5株阳性材料鉴定其表达量。

实验六：转BnaHSFB1基因油菜抗寒功能分析

将实验五获得的PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达与BGK01D-BnaHSFB1沉默株系阳性苗及未转基因的中双11(简称野生型，WT)成熟后收获T0代种子，扩繁两代收获T2代种子；继续种植(温度20℃，60％湿度，14h光照/10h黑暗，光照强度1800lx)，待T3代幼苗生长至5叶龄对其进行冷冻胁迫(温度-4℃，60％湿度，14h光照/10h黑暗，光照强度1800lx，)处理12h后，分别拍照记录。结果显示：在冷冻胁迫处理下，WT和BGK01D-BnaHSFB1沉默株系油菜叶片出现严重萎蔫现象，而PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达株系无明显变化(图4)。

为了进一步评估BnaHSFB1对油菜活性氧(ROS)清除能力的影响，通过DAB染色和H₂O₂含量测定分析了过表达株系(OE1)、沉默株系(GE3)和WT叶片中H₂O₂的含量。结果显示：与PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达株系相比，冷冻胁迫诱导了沉默株系BGK01D-BnaHSFB1和WT叶片中H₂O₂积累量的增加图(图5A，A是低温处理后DAB组织化学染色)，且BGK01D-BnaHSFB1沉默株系H₂O₂积累量显著高于WT(图5D，D是丙二醛含量测定)。PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达株系的POD活性显著高于WT，而沉默株系BGK01D-BnaHSFB1的POD活性显著低于WT(图5B，B是H₂O₂含量测定)。此外，通过测定MDA含量分析了过表达株系(OE1)、沉默株系(GE3)和WT叶片的膜脂过氧化水平，研究表明：冷冻胁迫后，PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达株系的MDA含量显著低于WT，而沉默株系BGK01D-BnaHSFB1的MDA含量著低于高于WT(图5C，C是POD含量测定)。综上所述，油菜BnaHSFB1在冷冻胁迫下对ROS的清除和细胞膜脂过氧化程度降低方面起着重要作用。

另外，通过测定过表达株系、沉默株系和WT的主根长度发现：在冷冻胁迫处理下，PC1300-DsRed-BnaHSFB1过表达株系的主根根长显著长于WT，而沉默株系BGK01D-BnaHSFB1的主根根长显著低于WT(图6)，说明BnaHSFB1基因对油菜根系的生长发育具有一定的促进作用。

Claims (10)

1.一种油菜抗寒基因BnaHSFB1，其特征在于：所述油菜抗寒基因BnaHSFB1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1，其特征在于：所述油菜抗寒基因BnaHSFB1包括819bp的开放阅读框，编码273个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1，其特征在于：所述油菜抗寒基因BnaHSFB1的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示。

4.含有如权利要求1或2或3所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1的生物材料，其特征在于：所述生物材料是表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。

5.如权利要求1或2或3所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在油菜抗寒时的应用。

6.如权利要求5所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在油菜置于应答冷冻胁迫反应中的应用。

7.如权利要求5所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在冬油菜应答冷冻胁迫反应中的应用。

8.如权利要求7所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜应答冷冻胁迫反应中的应用。

9.如权利要求6或7或8所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜在冷冻胁迫下清除ROS以及降低细胞膜脂过氧化程度方面的应用。

10.如权利要求6或7或8所述的油菜抗寒基因BnaHSFB1在甘蓝型冬油菜在冷冻胁迫下对油菜根系的生长发育具促进时的应用。