[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN117683786B - 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用 - Google Patents

一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117683786B
CN117683786B CN202311700493.5A CN202311700493A CN117683786B CN 117683786 B CN117683786 B CN 117683786B CN 202311700493 A CN202311700493 A CN 202311700493A CN 117683786 B CN117683786 B CN 117683786B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
rape
bnagxmt
length
seeds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311700493.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117683786A (zh
Inventor
贺亚军
钱伟
王彬
蒙姜宇
朱月琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN202311700493.5A priority Critical patent/CN117683786B/zh
Publication of CN117683786A publication Critical patent/CN117683786A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117683786B publication Critical patent/CN117683786B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用，该基因BnaGXMT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了从油菜中获得控制植物种子大小和角果长度的BnaGXMT1基因，构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效影响植物种子大小和角果长度。因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，提高作物产量，具有很好的应用潜力。

Description

一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种调控种子大小和角果长度的基因，具体涉及一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用。
背景技术
在植物中，种子大小不仅影响植物对进化的适应，还影响农作物的产量。种子大小是由微效多基因控制的数量性状，受多种生物过程影响。角果长度与种子大小呈显著正相关，每株角果数、每角果粒数和粒重是影响油菜产量的关键因素，每一种成分都与角果的发育密切相关。角果长度与每角果粒数和种子重量呈正相关，但与单株角果数无关，较长的角果给予种子更大的生长空间和充足的营养物质，产生更大更重的种子，进而影响作物的产量。同时有研究表明，长角果比短角果产生更多更大的种子(The role ofthe pod in seeddevelopment:strategies for manipulating yield New.Phytologist190,2011.838-853)，并且角果长度有很高的遗传力，角果长度也成为油菜育种的目标性状(Detection ofQTL for six yield-related traits in oilseed rape(Brassica napus)using DH andimmortalized F2 populations.Theor Appl Genet,2007,115:849-858)。
一般而言，绝大多数种子由胚、胚乳和种皮3个主要部分组成。胚乳和胚分别来源于受精卵细胞和中央细胞，而种皮来源于孢子体的珠被。母体组织和合子组织共同参与调控种子的生长发育，它们控制着胚、胚乳和种皮的协同生长，胚和胚乳均可作为植物的营养累积器官，在发育后期累积淀粉、脂肪酸和蛋白质等。模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)的角果由两个心皮在雌蕊中合生而成，两个心皮通过隔膜连接形成假二室，种子附着在隔膜上。角果由两瓣角果皮、胎座框、隔膜和果皮边缘组成，两个果皮由隔膜外缘的胎座框连接，胎座框内有维管系统(The FRUITFULL MADS-box gene mediates celldifferentiation during Arabidopsis fruit development.Development,1998,125:1509-1517)。角果的形成是一个复杂的过程，胚胎和受精后的心皮平行发育长达20天。胚珠受精后，心皮细胞进行细分裂、扩张和分化，形成成熟的角果皮，由内果皮、中果皮和外果皮组成。在油菜中，角果的大小主要由角果的长度决定。一般而言，较长的角果可以提供更大的光合面积，从而产生更多的光合产物和营养物质，为合成更多的油份和蛋白质提供基础，同时，也为籽粒生长发育提供足够大的空间(Regulation offruit dehiscenceinArabidopsis.J Exp Bot,2002,53:2031-2038)。
近年来通过遗传学和分子生物学等手段，发掘出了一些可以调控植物种子大小和角果长度的基因并初步揭示了相关的分子机制，但由于种子大小和角果长度是由多基因控制的数量性状，它们的形成机制受多个遗传体系所控制，目前对它们的分子机制还不能完全了解，仍然存在很多没有阐明的问题，所以需发掘出更多调控种子大小和角果长度的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用，本发明研究表明BnaGXMT1作为一个正调控因子调控油菜种子大小和角果长度，在油菜中深入其调控机制从而为育种工作提供理论帮助并可能为作物高产育种提供新的种质资源。
为了达到上述目的，本发明提供了一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因，该基因BnaGXMT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的是提供一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供含有所述的油菜BnaGXMT1基因的表达载体。
本发明的另一目的是提供含有所述的油菜BnaGXMT1基因的重组菌。
优选地，重组菌选用GV3101根瘤农杆菌感受态菌株。
本发明的另一目的是提供所述的油菜BnaGXMT1基因或所述的油菜BnaGXMT1蛋白在调控种子大小和角果长度上的应用。
本发明的另一目的是提供一种含有所述的油菜BnaGXMT1基因的转基因植株的构建方法，该方法包含：构建含有所述的油菜BnaGXMT1基因的表达载体，以农杆菌介导法将所述表达载体导入农作物或园艺植物中，使所述的油菜BnaGXMT1基因在植物中表达，得到种子大小和角果长度改变的转基因植物。
本发明的调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用，具有以下优点：
本发明提供了从油菜中获得控制植物种子大小和角果长度的BnaGXMT1基因，构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效影响植物种子大小和角果长度。因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，提高作物产量，具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为本发明基因定位聚丙烯凝胶电泳图。
图2为本发明基因定位图。
图3为本发明基因在亲本不同组织和胚珠不同发育时期表达分析图。
图4为本发明基因超表达植株RNA电泳图。
图5为本发明扩增目的片段电泳图。
图6为本发明表达载体pBin35SRed3质粒酶切电泳图。
图7为本发明转化连接超表达载体阳性克隆菌检电泳图。
图8为本发明阳性植株鉴定电泳图。
图9为本发明超表达BnaGXMT1与WT籽粒粒宽和粒长比较(A)；超表达BnaGXMT1与WT角果长度形态学比较(B)图。
图10为本发明超表达BnaGXMT1与WT千粒重比较图。
图11为本发明超表达BnaGXMT1与WT角果长度比较图。
图12为本发明超表达BnaGXMT1与WT种子表皮细胞图。
图13为本发明超表达BnaGXMT1与WT种子表皮细胞表面积比较图。
图14为本发明BnaGXMT1在超表达植株和WT中的相对表达量图(WT：拟南芥野生型；OE-GXMT1-1～8：异源转化拟南芥超表达植株)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实验例中所使用的植物材料与载体、菌株，具体如下：
大粒甘蓝型油菜材料DL001是本研究团队前期通过远缘杂交创建的，中双11号(ZS11)是中国农业科学院油料作物研究所选育而成的一个甘蓝型油菜品种。以ZS11为轮回亲本，DL001为受体亲本，构建BC5F2群体。DL001、ZS11和BC5F2群体都种植于重庆市北碚区油菜工程技术研究中心试验基地。拟南芥为哥伦比亚生态型野生型，在光照培养箱中种植。培养箱设置条件:黑暗条件8h、光照条件16h、湿度光照条件下60％/黑暗条件下40％、温度光照条件下16℃/黑暗条件下22℃、光照强度黑暗条件为0Lx/光照条件下10000Lx。
所选用的载体为植物表达载体pBin35SRed3(由西南大学油菜资源研究所保存)，所用到的菌株包括DH5α大肠杆菌感受态菌株(擎科生物)和GV3101根瘤农杆菌感受态菌株(擎科生物)。
以下实验例中所使用的培养基、试剂，具体如下：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠，固体培养基还需要添加15g/L琼脂粉，调pH 6.8，121℃灭菌，20min。
CTAB Buffer：20g/L CTAB、81.88g/L NaCl、40mL EDTA(0.5M，pH8.0)和100mLTris-HCl(1M，pH8.0)。
50x TAE Buffer(1L)：242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O和57.1mL冰醋酸。
抗生素：卡那霉素(kan)100mg/mL、利福平(Rif)25mg/mL。
实验例1油菜种子大小候选基因BnaGXMT1的筛选
为了找到调控油菜种子大小的候选基因，本实验室进行了QTL定位与候选基因分析，具体实验过程如下：
1、油菜千粒重考察
油菜籽粒成熟后收获，每个单株取主花序上的50个角果，自然晾干后脱粒，用托普云农智能考种分析系统考察千粒重(Thousand seed weigth，TSW，g)。
2、极端混合池构建与基因分型
从BC5F2群体的0H011株系中挑选25株千粒重极端大和25株千粒重极端小的单株构建千粒重极端大混池和千粒重极端小混池，连同亲本ZS11和DL001，通过Illumina HiSeq平台开展30×覆盖度的全基因组重测序。对原始测序数据进行过滤，去除接头adapter序列、末端低质量碱基以及长度低于50bp的Reads。然后比对到参考基因组ZS11-v20200127(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/rape/download_ext)，同时保留Unique比对信息用于后续变异检测，对变异位点进行ΔSNP-index和G-statistic统计分析，利用滑窗法预测候选区域，对候选变异的效应以及候选基因的功能进行注释，鉴定候选基因。
3、标记开发与基因型鉴定
根据DL001和ZS11重测序变异注释，找出定位区间内的InDel差异，用PrimerPrimer 5软件设计InDel标记的引物序列。用CTAB法提取基因组DNA。用开发的InDel标记的引物(DA09-25F和DA09-25R、DA09-16F和DA09-16R)进行PCR扩增。
DA09-25F的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下：
TGACAATGCAAATTTCAGTTCC；
DA09-25R的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)如下：
GCATCACTAACACTCTTGCGAC；
DA09-16F的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)如下：
CAGCTATTTGGGATCCCATAA；
DA09-16R的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)如下：
CTCTGCGTAAAACTGATTGCG。
PCR扩增体系：DNA模板50～100ng、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.25μL、2×TaqMasterMix 5μL，用ddH2O定容至10μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；16℃保存。
用10％的聚丙烯凝胶电泳鉴定基因型。如图1所示，泳道1为ZS11的基因型，泳道2为DL001的基因型，泳道3～48为BC5F2群体0H011株系里部分单株的基因型。
用WinQTLCart 2.5软件中的复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)对QTL检测，作图函数为Kosambi。扫描时，背景标记数目为5，扫描步长1cM，窗口大小为10cM，进行1000次排布检验，显著性阈值P＝0.05，当LOD≥2.5时，认为这个置信区间的QTL存在。
4、实验结果
(1)油菜粒重基因定位
利用ZS11和DL001为亲本构建的BC5F2群体进行重测序BSA分析，定位调控油菜粒重的连锁区间。定位结果显示分布于甘蓝型油菜A09染色体的1个区域出现了超过临界值水平的极显著峰，说明这个区域可能包含调控油菜粒重的候选基因，这个区域位于参考基因组Chr.A09：5.458-8.786Mb(3.328Mb)，将这个区域命名为QTL qSW-A09-DA。
(2)油菜粒重QTLqSW-A09-DA精细定位
开发的InDel标记以两亲本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到15个稳定的共显性标记。结合BC5F2群体545个单株的表型数据和基因型分析数据，进一步将QTL qSW-A09-DA缩小至85kb(Chr.A09：6.218-6.303Mb)(图2)，区间内有17个基因。
(3)油菜种子大小候选基因分析
分析这17个基因在DL001、ZS11、子代混池G_group和S_group中的结构变异，发现3个基因有大效应的结构变异。分析这3个基因在ZS11和DL001的转录表达水平，发现BnaGXMT1在7天角果、14天胚珠、28天胚珠以及花、叶都有差异表达(图3)。因此将BnaGXMT1作为调控油菜种子大小的候选基因，进行功能鉴定。
实验例2总RNA的提取及cDNA第一链的合成
选用艾科瑞生物技术公司SteadyPure植物RNA抽提取试剂盒(参照步骤有改变)操作，具体步骤：
(1)将新鲜或超低温(-80℃)冻存的油菜组织100mg于2mL的离心管(RNase free)中，立即放入液氮中；
(2)将适量已研磨成粉末状的样本转移至含有500μL裂解液Buffer RLS(BufferRLS使用加入50×DTT Solution，至终浓度为1×DTT Solution，即每1mL的Buffer RLS中加入20μL的50×DTT Solution)的1.5mL离心管(RNase free)中，立即高速涡旋混匀或用移液枪反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；
(3)裂解液室温静置2min；
(4)12,000rpm，4℃离心5min；
(5)小心吸取上清液至新的1.5mL(RNase free)离心管；
(6)向上述滤液中加入液体等体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀，若出现明显粘稠物或沉淀，用移液枪吹打多次，打散沉淀；
(7)立即将上述混合液和沉淀全部转移至Plant RNA Mini Column中，12,000rpm室温离心2min，弃滤液；
(8)向Plant RNA Mini Column中加入600μL的Buffer RWA，12,000rpm室温离心1min，弃滤液；
(9)向Plant RNAMini Column中加入750μL的Buffer RWB(RWB中已提前加入适量的无水乙醇，Buffer RWB与无水乙醇体积比为3∶7)，12,000rpm室温离心1min，弃滤液；
(10)DNase I消化：DNase I反应液包含：4μL DNase I(RNase free)、5μL 10×DNase I Buffer和41μL RNase free water。配制DNase I反应液并混匀，把50μL DNase I反应液加到Plant RNAMini Column的膜中央，室温静置15min。向Plant RNA Mini Column膜中央加入350μL Buffer RWB，12,000rpm室温离心1min，弃滤液；
(11)向Plant RNA Mini Column中加入750μL的Buffer RWB，12,000rpm室温离心1min，弃滤液；
(12)将Plant RNAMini Column的吸附柱安置于新的2.0mL Collection Tube上，12,000rpm室温离心2min；
(13)将Plant RNAMini Column的吸附柱安置于新的RNase Free Tube上，在吸附柱膜的中央处加入50μL-200μL RNase Free Water，室温静置5min，然后12,000rpm室温离心2min洗脱得到RNA，可用于后续实验。若不立即进行后续实验可将溶解后的RNA放入-80℃中保存；
(14)用紫外分光光度计测定RNA浓度，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，结果如图4所示，片段清晰，可用于后续实验的操作；
(15)选用BIO-RAD公司反转录试剂盒，对提取的RNA进行反转录获得cDNA，反应完成后，将cDNA稀释20倍保存，混匀后，置于-20℃保存，用于后续扩增目的片段。
其中，RNA反转录反应体系：4μL 5x iScript Reaction Mix、1μL iScriptReverse Transcriptase、1μL RNA template(1μg)，添加Nuclease-free water至20μL。RNA反转录PCR反应程序：25℃，5min；46℃，20min；95℃，1min；4℃，∞。
实验例3BnaGXMT1的克隆
1、设计扩增引物
表1扩增引物
以实验例2获得的cDNA为模板，用PCR仪来扩增目的片段。
PCR反应体系(25μL)：9.5μL ddH2O、12.5μL 2x Taq Master Mix、1μLBnaGXMT1-F、1μLBnaGXMT1-R和1μL cDNA。
PCR反应程序：预变性94℃5min；[变性94℃25s；退火57℃25s；延伸72℃55s]，循环35次；再延伸72℃5min；停止16℃1min。
目的基因进行PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，并对目的片段进行胶回收，扩增结果如图5所示，可以看出在±1100bp有明显条带，说明成功克隆出BnaGXMT1的编码区序列。
琼脂糖凝胶电泳：按1％胶浓度比配置琼脂糖凝胶，每100mL 1X TAE中加5μL核酸染料混匀；待胶凝固后将胶块放置于加1X TAE液体的电泳槽中；用移液枪将PCR产物全点入孔中；另取5μL DNA2000 Mark点入到空白胶孔做对照，启动电泳运行18min；停止电泳仪，将胶块放入凝胶成像系统进行观察和拍照。
目的片段的回收选用诺唯赞Gel DNA Extraction Mini Kit，操作步骤如下：
(1)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，并用纸巾吸尽凝胶表面液体。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积；
(2)加入等体积Buffer GDP。放入55℃烘箱溶解7～10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。期间颠倒混匀2次加速溶胶；
(3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNAMini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2mL收集管中，把溶胶液转移至吸附柱中，12,000rpm离心60s；
(4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000rpm离心60s；
(5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μLBuffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中，12,000rpm离心60s；
(6)重复步骤(5)；
(7)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12,000rp离心2min；
(8)将吸附柱置于在1.5mL灭菌的离心管中，加30μL ddH2O至吸附柱中央，放置2min。12,000rpm离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。
实验例4超表达载体的构建
1、质粒的提取
提取表达载体(pBin35SRed3)的质粒，选取艾科瑞生物技术公司质粒提取试剂盒，操作步骤如下：
(1)菌体准备。取5mL过夜培养的菌液，菌液总OD约为2～8，12,000rpm室温下离心2min，弃上清；
(2)向离心管中加入250μL的Buffer RS(含RNaseA)充分悬浮菌体沉淀，直至悬浮液中没有菌块残留；
(3)向上述悬浮液中加入250μL的Buffer LS，轻柔上下颠倒混匀8次，溶液变透明，此时溶液比较粘稠；
(4)加入350μL预冷的BufferBS，此时溶液中出现白色团状物。轻柔上下颠倒混匀8次；
(5)静置2min，室温下12,000rpm离心10min，取上清；
(6)将上述溶液转移至Plasmid DNAMini Column中，室温静置1min后，室温下12,000rpm离心1min，弃滤液；
(7)向Mini Column中加入500μL的Buffer WA，室温下12,000rpm离心1min，弃滤液；
(8)向Mini Column中加入750μL的Buffer WB，室温下12,000rpm离心1min，弃滤液；
(9)重复步骤(8)一次；
(10)将Mini Column安置于新的2ml Collection tube上，室温12,000rpm离心2min；
(11)将Mini Column安置于新的1.5mL的离心管上，向Mini Column膜的中央处加入50μL灭菌水(已预热)，室温放置1min；
(12)室温12,000rpm离心1min洗脱DNA。放-20℃保存。
2、载体双酶切
含目的基因质粒双酶切体系(50μL)：5μL 10x Fast Digest Green Buffer、2.5μLF D EcoRI、2.5μL F D XhoI、10μL含目的基因质粒和30μLddH2O。
37℃培养箱中酶切2h，对载体骨架进行胶回收，检测图6所示。
3、连接载体
使用abm公司Pro-Ligation Cloning Kit同源重组试剂盒。同源重组酶连接体系如下表2，PCR控温，50℃，1h。
表2同源重组酶连接体系
4、转化、复苏
使用擎科生物TreliefTM5αChemically Competent Cell超级感受态转化，具体实验步骤如下：
(1)从超低温冰箱拿出100μL感受态细胞冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。
(2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。
(3)向离心管中加入600μL无抗性的LB液体培养液，37℃/200rpm复苏60min。
(4)4000rpm离心5min，弃掉400微上清，余下液体吹打混匀取100μL的复苏液均匀涂布到含有Kan(卡那霉素，100mg/mL)抗生素固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。
5、菌检
挑取正常大小大肠菌斑置于灭菌后的1.5mL EP管中，提前加入700μL的LB液体培养基中，37℃/200rpm培养8h后通过PCR进行菌检。
PCR反应体系(25μL)包含：9.5μL ddH2O、12.5μL 2x Taq Master Mix、1μL引物F、1μL引物R和1μL菌液。其中，引物F选用载体通用引物QW586F，引物R选用BnaGXMT1基因引物R(BnaGXMT1-R)。
PCR反应程序：94℃，5min；[94℃，30s；58℃，30s；72℃，1kb/min]；循环30次；再延伸72℃5min；停止16℃1min。
如图7所示，为菌检结果，可以看出除编号6条带较弱外，其余均在±1100bp有明显条带，说明都是含有目的条带的阳性克隆菌。具有正确目的条带大小的菌液序列测序工作由擎科生物公司完成。
6、重组质粒转化农杆菌
质粒提取参考前述的“质粒提取”，本实验使用擎科生物公司GV3101农杆菌感受态，操作步骤如下：
从超低温冰箱取50μL农杆感受态，冰上融化后，与重组质粒轻轻吹打混匀，冰上静置5min后，放入液氮5min，之后37℃水浴5min，最后再冰浴5min后向离心管中加入600μL无抗性的LB液体培养液，28℃振荡培养2到3h，后4000rpm离心5min收集菌体，留取200μL左右。上清吹打重悬菌块取100μL涂布于含相应抗生素的LB固体平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天。
培养完毕后挑取农杆单斑到装有含有相应抗生素液体培养基(含50μg/mL Kan、20μg/mL Rif)中，28℃振荡培养至菌液浑浊，进行菌液PCR扩增。菌液PCR体系和程序与步骤7内容相同。将有正确目的条带大小的菌液加入等量的50％甘油，混匀后写上菌液名称和日期保存于-80℃超低温冰箱备用。
实验例5农杆菌介导的拟南芥转化
1、拟南芥的培养
将拟南芥种子播种于装有湿润腐殖土的小花盆中，覆盖保鲜膜，保持土壤湿润，防止水分散失太快，然后置于光照培养箱中，培养箱条件设置为：阶段一，光照16h，温度22℃，湿度40％，光照强度10000Lx；阶段二，黑暗8h，温度16℃，湿度60％。种子萌发后一周左右时间去掉保鲜膜，每周浇水一次，直至拟南芥开花结果。
2、浸花法转化拟南芥
(1)取200μL含重组质粒的农杆菌菌液于100mL含相应抗生素的LB液体培养基中28℃震荡培养2-3天；
(2)5000rmp室温离心20min，弃上清，用5％蔗糖溶液重悬农杆菌沉淀调节OD值＝0.8，再加0.2‰的表面活性剂，混匀；
(3)剪掉拟南芥荚果及开花，将拟南芥花序浸于重悬的农杆菌菌液30s，盖上保鲜膜，暗处理1d；
(4)去掉保鲜膜，移到光照培养箱中正常培养；
(5)相隔一周时间重复步骤(1)～(5)再次转化，一共进行3次；
(6)当拟南芥荚果开始变黄裂开时，搜集脱落的种子，并37℃培养箱干燥种子，烘干的种子4℃存放。
3、阳性苗检测
在T0代种子中，在荧光激发灯的绿光照射下，挑选出显红光的种子出来单独播种。将T0代种子直播于花盆中，光照培养箱中培养，抽薹后取其叶片提DNA，PCR鉴定阳性与否，PCR鉴定为阳性的T1代拟南芥，连续种至纯合，用于后期考察表型。
上述PCR鉴定的引物组成采用载体通用引物QW586F和BnaGXMT1基因引物R。
显红光的种子播种后取叶片提DNA进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图8，除编号5、6、7和11无条带外，其余均在±1100bp有明显或较弱条带，说明其余植株都为转基因成功的阳性苗。
实验例6转基因拟南芥表型观察
播种哥伦比亚野生型种子(WT)和转基因T3代种子(BnaGXMT1)。统计转基因拟南芥的角果长度、每角果粒数、千粒重以及种子宽度和长度形态学观察的情况。
取野生型WT和T3代超表达BnaGXMT1转基因拟南芥的叶片，定量PCR，分析目的基因在各株系的表达情况，引物设计如下：
qBnaGXMT-F(SEQ ID NO.10)：
CGTCGACGAGAATCCTTACTTA；
qBnaGXMT-R(SEQ ID NO.11)：
GTTAGGTAAATCGTTGATCGCC。
RT-PCR BnaGXMT1体系(20μL)包含：6.6μL ddH2O、10μL SYBR Green MasterMix、1μL qBnaGXMT-F、1μL qBnaGXMT-R和1μL cDNA。
AtActnin7为内参，引物及序列如下：
AtActin7F(SEQ ID NO.12)：
GCCCCTGAGGAGCACCCAGTT；
AtActin7R(SEQ ID NO.13)：
CCGGTTGTACGACCACTGGCA。
RT-PCR程序为：95℃，5min；95℃，5s；60℃，30s；step to 2for 45cycles。每个样本重复3次。
拟南芥植株在光照培养箱中培养，待角果成熟后，以拟南芥千粒重、角果长度作为表型考察的主要指标，也对成熟种子和角果进行了形态学上的观察，同时利用扫描电子显微镜对成熟种子的外表皮细胞进行了观察，在细胞学水平上验证种子大小的差异。植株结果显示(图9的A；图10)所示，通过对种子的形态学观察，风干后的OE-BnaGXMT1种子无论是粒长还是粒宽，籽粒大小明显大于野生型拟南芥(WT)。进一步量化种子大小增加量，统计野生型拟南芥(WT)的千粒重平均为10.07mg，而超表达BnaGXMT1植株的千粒重平均为13.04mg。综上，BnaGXMT1比野生型拟南芥(WT)粒重增加了21.64％。
通过对角果长度的统计结果显示(图9的B；图11)：取同一部位，生长稳定、不再伸长的角果，比较二者的角果长，通过形态学比较BnaGXMT1和WT的角果长度可看出较为明显的差异。进一步量化角果长度增加量，野生型野生型拟南芥(WT)的角果长度平均为11.22cm，而BnaGXMT1的角果长度平均为11.35cm，综上，BnaGXMT1比野生型拟南芥(WT)角果长度平均增加了10.64％。
利用扫描电子显微镜对成熟种子的外表皮细胞进行了观察。结果显示(图12；图13)，野生型拟南芥(WT)种皮细胞面积平均为867.98μm2，而BnaGXMT1的种皮细胞面积平均为978.76μm2，增加了12.76％。
取WT与各株系超表达BnaGXMT1转基因拟南芥主茎的混样，基因BnaGXMT1的表达均是显著增加(图14)。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (2)

1.油菜BnaGXMT1基因或油菜BnaGXMT1蛋白在调控拟南芥种子大小和角果长度上的应用，其特征在于，所述油菜BnaGXMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述油菜BnaGXMT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种含有油菜BnaGXMT1基因的转基因植株的构建方法，其特征在于，该方法包含：构建含有所述的油菜BnaGXMT1基因的表达载体，以农杆菌介导法将所述表达载体导入拟南芥中，使所述的油菜BnaGXMT1基因在拟南芥中过表达，得到种子大小和角果长度增加的转基因拟南芥；其中，所述油菜BnaGXMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
CN202311700493.5A 2023-12-12 2023-12-12 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用 Active CN117683786B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311700493.5A CN117683786B (zh) 2023-12-12 2023-12-12 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311700493.5A CN117683786B (zh) 2023-12-12 2023-12-12 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117683786A CN117683786A (zh) 2024-03-12
CN117683786B true CN117683786B (zh) 2024-07-23

Family

ID=90125957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311700493.5A Active CN117683786B (zh) 2023-12-12 2023-12-12 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117683786B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107227308B (zh) * 2016-03-25 2019-06-11 浙江大学 油菜BnaSPT3基因在促进双子叶植物角果生长中的应用
CN109112146B (zh) * 2018-07-17 2021-07-13 华中农业大学 控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用
CN109777809B (zh) * 2019-01-14 2022-06-24 西南大学 油菜BnaB1基因及其在调控分枝数和株型上的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PREDICTED: Brassica napus protein IRX15-LIKE-like (LOC106450000), mRNA;NCBI;NCBI GenBank database;20171004;Accession NO：XM_013891654.2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117683786A (zh) 2024-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475210B (zh) 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用
CN115843674B (zh) 玉米单倍体诱导系的选育方法及其应用
CN110066774B (zh) 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用
CN109234288B (zh) 油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用
CN108517356B (zh) 一种避免转基因水稻育种败育的方法
CN117737078A (zh) MADS-box基因RhAGL6及其在调节月季花器官发育中的应用
CN114990136B (zh) 一种仁用杏PasLEA3-2基因及其在抗寒、促进植物提前开花或种子结实中的应用
CN109777809B (zh) 油菜BnaB1基因及其在调控分枝数和株型上的应用
CN114437190B (zh) OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用
CN113322261B (zh) 大豆ABC转运蛋白基因GmALS3在耐低磷和抗铝毒胁迫植物育种中的应用
CN112680461B (zh) 雄性不育基因ZmPHD11及其在创制玉米雄性不育系中的应用
CN113583099A (zh) 培育苜蓿雄性不育系及相应保持系的方法及其相关生物材料
Pinto et al. Genetic and physiological characterization of three natural allelic variations affecting the organogenic capacity in tomato (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom)
CN117683786B (zh) 一种调控种子大小和角果长度的油菜BnaGXMT1基因及其应用
KR101206928B1 (ko) 배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대한 ｒｎａ 간섭 카세트, 그를 포함하는 벡터 및 상기 ｒｎａ 간섭 카세트가 도입된 형질전환 배추속 식물
CN106995492B (zh) 蔗糖转运蛋白及其在调控植物雄性不育中的应用
CN113652434B (zh) 一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实dna分子及其应用
CN116555301B (zh) 一种SlMETS1基因及其在调控番茄生长发育中的应用
CN116334101B (zh) 一种玉米甾醇含量调控基因ZmSCYL2及其应用
CN114181884B (zh) 一种调控植物体细胞胚胎发生的方法
CN118620952B (zh) ZmGPAT10基因在提高玉米耐盐中的应用
CN114807175B (zh) 单糖转蛋白基因OsSTP15及其转运体和在提高水稻产量中的应用、扩增引物
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN116515857B (zh) 一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用
CN112680458B (zh) 雄性不育基因ZmMYB33及其在创制玉米雄性不育系中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant