CN117659196B - 一种靶向cd7的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫治疗技术领域，本发明提供了一种靶向CD7的单域抗体、利用该单域抗体构建的靶向CD7的嵌合抗原受体(CAR)以及包含该CAR的工程化的免疫效应细胞。本发明还提供了靶向CD7的单域抗体、嵌合抗原受体以及包含该CAR的工程化的免疫效应细胞在制备用于诊断、预防和/或治疗与CD7表达相关的疾病或病症的药物中的用途。

Description

一种靶向CD7的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体的，涉及特异性地靶向CD7的单域抗体、使用该单域抗体构建得到的靶向CD7的嵌合抗原受体、包含此类嵌合抗原受体的工程化的免疫效应细胞，及其在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病的药物中的用途。

背景技术

T细胞恶性肿瘤是一类来源于T细胞的淋巴系统恶性肿瘤，通常表达T细胞特征性抗原。WHO分类将T细胞肿瘤分为T淋巴细胞白血病、T淋巴母细胞性淋巴瘤和成熟T细胞肿瘤。目前针对T细胞恶性肿瘤尚无非常有效的治疗手段，主要治疗方案为化疗，必要时需联合造血干细胞移植，但其在患者中仍具有很高的复发率和死亡率。例如，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，是一种T淋巴细胞异常增生造成的血液疾病，病程进展迅速，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统和睾丸等组织器官，需要及时有效的治疗，否则患者的病情会在短期内加重甚至威胁生命。成年人和儿童急性T淋巴细胞白血病接受大剂量化疗的5年生存率分别约为50％和75％。T细胞淋巴瘤是T细胞的一种恶性肿瘤，可在淋巴组织(如淋巴结和脾脏))中或在淋巴组织之外(如胃肠道，肝脏，鼻腔，皮肤等)发展，约占非霍奇金淋巴瘤发病率的10％～15％，在我国该比例更高。外周T细胞淋巴瘤接受以CHOP方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)为基础的化疗且通过自体造血干细胞移植巩固的无进展生存率约为40％-50％。其中早期前体T急性淋巴细胞白血病的亚组预后较差，中位生存时间只有20个月。急性髓系白血病(AML)是一种非常难治的侵袭性造血干细胞恶性肿瘤，容易复发，且占全部患者大多数的老年患者的生存率低，是一种患者生存率较低的恶性肿瘤。目前临床常用的治疗T细胞恶性肿瘤的方法是化疗疗法，但其存在疾病预后差且复发率高的问题。因此，仍然存在广泛而未被满足的治疗需求。

CD7(T细胞抗原7)，又称作GP40、TP41、LEU-9，是一种40kDa的单链跨膜糖蛋白分子，包含有240个氨基酸。CD7通常表达于85％的外周血T细胞和NK细胞及其前体细胞，是一种辅助T细胞活化以及与其他免疫亚群细胞相互作用的共刺激受体蛋白。CD7在大多数的T细胞、NK细胞、髓细胞、T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、急性粒细胞性白血病和慢性粒细胞白血病的肿瘤细胞中均有表达，尤其在大多数的T细胞急性淋巴细胞白血病和部分的T细胞急性髓系白血病的肿瘤细胞中高表达，这使得CD7有望成为治疗白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的潜力治疗靶点。

单域抗体(single-domain antibody,SdAb)是只由重链抗体的可变区氨基酸组成的抗体，因而不同于传统的4链抗体，其分子量仅有12-15kDa，又被称为纳米抗体。骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的抗体，其被称为仅含重链的抗体，或简称为重链抗体(HCAb)，骆驼科动物重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域，被称为重链单域抗体(variabledomain of heavy chain of heavy-chainantibody,VHH)。单域抗体具备与传统抗体相似或更高的特异性和亲和力，此外，还具有可溶性好、稳定性高、穿透力强、结合表位广的天然优势，这些优点使其在免疫治疗领域备受关注，也正在被应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、抗感染等疾病治疗方面。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)修饰的T细胞作为一种免疫治疗策略，在许多实体肿瘤、血液系统肿瘤，尤其是淋巴细胞肿瘤的治疗中受到广泛的应用。嵌合抗原受体是一种重组多肽构建体，其代表性结构由细胞外抗原结合结构域(通常为具有抗原识别功能的单链抗体)、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域四部分组成。通常根据细胞内信号传导结构域是否加入共刺激分子以及加入的数量，将经典的嵌合抗原受体结构分为第一代(无共刺激分子)、第二代(包含一种共刺激分子)和第三代(包含两种共刺激分子)。截止目前，第二代嵌合抗原受体结构设计在上市产品和临床研究阶段中应用最多。嵌合抗原受体的原理为通过基因工程修饰，使T细胞表达可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体结构(例如，单链抗体)，并在该受体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，激活其下游的免疫共刺激分子和T细胞，突破主要组织相容性复合体(MHC)的限制性，直接特异性识别并杀伤肿瘤细胞，实现靶向清除恶性肿瘤的目的。由于这一识别与杀伤功能的实现需要使用结合活性好、结合表位高效的抗体，因此CAR-T细胞疗法成功与否的关键之一在于筛选特异性好、结合力强、结合表位有效的高亲和力抗体。

因此，目前仍有广泛的需求去筛选和开发改进的靶向CD7的单域抗体、使用其构建的靶向CD7的嵌合抗原受体以及工程化的免疫效应细胞。特别是，开发适用于更有效以及更高效的CAR-T细胞疗法的稳定靶向CD7的单域抗体。

另一方面，由于CD7抗原表达在T细胞表面，进而CAR-T细胞本身也存在CD7的表达，因此在制备靶向CD7的CAR-T细胞的过程中，会发生CAR-T细胞的自相残杀的现象，导致收获的CAR-T细胞在体外扩增困难。为解决该“自杀”现象造成的靶向CD7的CAR-T细胞体外扩增难的问题，目前的解决方案包括：

(1)通过CD7阻断剂阻断T细胞内源性CD7在细胞表面表达，如专利CN110760007B中公开的相关技术方案。该专利构建了能够阻断T细胞表面CD7表达的CD7阻断载体，通过将CD7蛋白截留在内质网和高尔基体上，阻止CD7在T细胞表面表达，进而避免靶向CD7的CAR-T细胞的自杀现象。

(2)寻找新的CD7结合表位，如专利CN114716564B中公开的相关技术方案。该专利将SECTM1的胞外域的特定区段(29-145位氨基酸序列)作为嵌合抗原受体的胞外结合域来构建CAR-T细胞。据专利记载，在该CAR-T细胞的制备过程中虽然细胞增殖受到一定影响，但仍可成功大量制备所需的CAR-T细胞。

(3)通过基因编辑方法敲除T细胞的内源性CD7分子，如专利申请CN112300282A中公开的相关技术方案。该方案为了避免CAR-T细胞之间的互相杀伤，通过CRISPR/Cas9系统敲除T细胞中的CD7基因。

CRISPR/Cas系统是一种快速、有效的基因编辑系统，其中CRISPR/Cas9是应用最广泛的CRISPR/Cas系统之一，其能够高效、精确地对DNA序列进行修饰、替换和插入。CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的机制包括：与特定靶序列(原间隔序列)同源的CRISPR阵列被转录为许多前CRISPR RNA(pre-crRNA)，这些pre-crRNA与更小的反式激活crRNA(tracrRNA)通过碱基配对形成复合物。这种复合物可以与Cas9蛋白结合，导致较长的pre-crRNA被RNA酶III切割，分离成单独的crRNA/tracrRNA复合物。当crRNA/tracrRNA将Cas9复合物引导至目标序列时，crRNA结合原间隔序列相邻基序(PAM)后的目标序列，靶序列解旋，并被Cas9蛋白的核酸酶结构域(RuvC和HNH)切割，造成双链断裂。激活细胞的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、插入或修饰。通过将crRNA和tracrRNA进行生物工程改造，组合成为一个具备crRNA和tracrRNA功能的向导RNA分子(guide RNA，gRNA)。gRNA是5’端的一段短(约20nt)的指导序列，与目标DNA序列互补匹配，并决定了Cas9蛋白定向切割的特异性。gRNA的一部分序列可以与Cas核酸酶结合，另外一部分序列可以与靶基因的部分序列互补，借助gRNA的识别作用使得Cas核酸酶可以在靶基因特定位点形成单链或双链切口，从而实现对靶基因的编辑。

近年来，基于CRISPR/Cas9系统高效精准的基因编辑功能，其在哺乳动物细胞基因编辑中得到广泛应用，这也促进了肿瘤免疫治疗的极大进步，尤其是极大促进了嵌合抗原受体T细胞的制备和应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向CD7的单域抗体、由其构建的CAR-T细胞及其应用。本发明所述的靶向CD7单域抗体结构为天然的单链结构，具有小分子量、高溶解性、高稳定性、低免疫原性、高组织渗透性以及不需要额外的折叠和组装步骤或连接子优化改造的优势，使其成为分子量较大的scFv单链抗体的有前途的替代方案，且使用所述单域抗体构建成的CAR-T细胞具备显著的肿瘤细胞杀伤能力。

根据本公开的第一方面，提供一种靶向CD7的单域抗体。本发明提供的靶向CD7的单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1、2或3所示的任一氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:4、5或6所示的任一氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ IDNO:7、8或9所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1为如SEQ ID NO:1、2或3所示的任一氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:4、5或6所示的任一氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:7、8或9所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1、CDR2和CDR3包含如表1所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1、CDR2和CDR3为如表1所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

本发明所公开的技术方案，其中，SEQ ID NO:1-9所示的具体氨基酸序列信息如表1中所示。

表1

SEQ ID NO:	氨基酸序列
		1	GFTFPNQE(CDR1)
2	VSPSGNLR(CDR2)
		3	ARDRAGNY(CDR3)
4	GYTSRRSC(CDR1)
		5	IYTGGSST(CDR2)
6	AAHSRILCPGVAAREYDY(CDR3)
		7	GFSVRWNC(CDR1)
8	IGVSDIA(CDR2)
		9	AARRNRYCPAAFGQSDFNY(CDR3)

本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1、CDR2和CDR3的确定是根据IMGT编号方案、Kabat编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案或Contact编号方案中的任意一种。本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1、CDR2和CDR3的确定是根据IMGT编号方案。

本发明提供的单域抗体或其CDR区涵盖由上述编号方案或其他已知编号方案所定义的CDR。例如，本领域技术人员可以理解，通过任何编号方案进行确定的CDR区，只要与本发明的CDR区相同，包含本发明的CDR区，均落入本发明的保护范围之内。

本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含与表2所示或包含与SEQ ID NO:10-12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含如表2所示或包含如SEQ ID NO:10-12所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，包含如SEQID NO:12所示的氨基酸序列。

本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为与表2所示或为与SEQ ID NO:10-12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为如表2所示或如SEQ ID NO:10-12所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的靶向CD7的单域抗体，为如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

本发明所公开的技术方案，其中，SEQ ID NO:10-12所示的具体氨基酸序列信息如表2中所示。

表2

根据本公开的第二方面，提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含本发明所述的靶向CD7的单域抗体。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含如本发明所述的靶向CD7的单域抗体。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体还可包含下述的一种或多种结构：接头(例如肽接头)、信号肽、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含本公开第一方面所述的靶向CD7的单域抗体。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体，所述单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区，其中CDR1、CDR2和CDR3区包含如本公开第一方面所述的靶向CD7的单域抗体的CDR1、CDR2和CDR3区。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体，所述单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3区，其中CDR1、CDR2和CDR3区为如本公开第一方面所述的靶向CD7的单域抗体的CDR1、CDR2和CDR3区。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体；其中，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体；其中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体；其中，所述单域抗体为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含靶向CD7的单域抗体；其中，所述单域抗体为如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域来源于CD8α、CD28、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRζ、OX40、ICOS、LAG-3、2B4、BTLA、CTLA-4、PD-1或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域来源于CD8α。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域为如SEQID NO:15所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域来源于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导结构域包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导结构域为如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号结构域来源于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。在一些实施方案中，所述共刺激信号结构域来源于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD134(OX40)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、ICAM、4-1BB(CD137)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、GITR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、BTLA、CD8α、LFA-1、NKG2C、LAT、SLP-76、DAP10、PD-1、TRIM、ZAP70配体或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域来源于4-1BB(CD137)。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域为如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体还进一步包含位于细胞外抗原结合结构域C端和跨膜结构域N端之间的铰链区。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区来源于CD8α、CD28、CD137、IgG4或IgG1或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区来源于CD8α。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区为如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体还进一步包含位于嵌合抗原受体多肽N端的信号肽。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽来源于HLA-A、CD8α、CD4、CD33、CD137、GM-CSFRα、IgG1、Igκ、IL-2或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽来源于CD8α。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽来源于HLA-A。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽为如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

本发明所公开的技术方案，其中，SEQ ID NO:13-17所示的具体氨基酸序列信息如表3中所示。

表3

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体多肽从N端到C端依次包含：HLA-A信号肽或CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、源自4-1BB(CD137)的共刺激信号结构域和源自CD3ζ的细胞内信号传导结构域。

本发明提供的嵌合抗原受体，包含与表4所示或包含与SEQ ID NO:18-20所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本发明提供的嵌合抗原受体，包含如表4所示或包含如SEQ ID NO:18-20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

本发明提供的嵌合抗原受体，为与表4所示或为与SEQ ID NO:18-20所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本发明提供的嵌合抗原受体，为如表4所示或为如SEQ ID NO:18-20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的嵌合抗原受体，为如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

本发明所公开的技术方案，其中，SEQ ID NO:18-20所示的具体氨基酸序列信息如表4中所示。

表4

根据本公开的第三方面，提供一种分离的核酸，所述核酸编码本发明所述的嵌合抗原受体。

在一些实施方案中，本发明提供的核酸是DNA形式或RNA形式。在一些实施方案中，本发明提供的DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。在一些实施方案中，本发明提供的DNA是单链或双链DNA。在一些实施方案中，本发明提供的DNA是编码链或非编码链DNA。

本发明提供的分离的核酸包含如表5所示或包含如SEQ ID NO:21-23所示的核酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的分离的核酸包含如SEQ ID NO:21所示的核酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的分离的核酸包含如SEQ ID NO:22所示的核酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供的分离的核酸包含如SEQ ID NO:23所示的核酸序列。

本发明所公开的技术方案，其中，SEQ ID NO:21-23所示的具体核酸序列信息如表5中所示。

表5

根据本公开的第四方面，提供一种载体，所述载体包含本发明所述的分离的核酸。

在一些实施方案中，载体适合于在真核细胞，例如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。

在一些实施方案中，载体包含在宿主细胞中。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为杀伤性细胞。

在一些实施方案中，所述杀伤性细胞为T细胞或NK细胞。

在一些实施方案中，所述NK细胞为原代NK细胞。

在一些实施方案中，所述T细胞为外周血T淋巴细胞、脐带血T淋巴细胞。

根据本公开的第五方面，提供一种工程化的免疫效应细胞，其包含本发明所述的嵌合抗原受体或分离的核酸。

在一些实施方案中，本发明提供的工程化的免疫效应细胞可以选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞(iPSC)分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。

在一些实施方案中，本发明提供的工程化的免疫效应细胞是T细胞。例如T细胞可以选自CD4+/CD8+T细胞、CD4+/CD8-T细胞、CD4-/CD8+T细胞、CD4-/CD8-T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞、NKT细胞、DNT细胞(双阴性T细胞)。

在一些实施方案中，T细胞是CD4+/CD8-T细胞、CD4-/CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞、CD4-/CD8-T细胞或其组合。

在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合抗原受体并结合靶细胞(例如CD7+肿瘤细胞)后产生IL-2、IFNγ和/或TNF-α等细胞因子。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达嵌合抗原受体并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。

在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。

在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是从干细胞分化而来，例如从iPSC分化而来。

在一些实施方案中，本发明提供的免疫效应细胞的内源性CD7基因被敲除、沉默或抑制。

在一些实施方案中，本发明提供的T细胞的内源性CD7基因被敲除、沉默或抑制。

在一些实施方案中，本发明提供的免疫效应细胞的内源性CD7基因是通过归巢核酸内切酶系统、锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)系统、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)系统或规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统进行敲除。

在一些实施方案中，本发明提供的T细胞的内源性CD7基因是通过归巢核酸内切酶系统、锌指核酸酶(ZFNs)系统、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)系统或规律性重复短回文序列簇(CRISPR)系统进行敲除。

在一些实施方案中，本发明提供的免疫效应细胞的内源性CD7基因是通过CRISPR/Cas9系统进行敲除。在一些实施方案中，本发明提供的T细胞的内源性CD7基因是通过CRISPR/Cas9系统进行敲除。

在一些实施方案中，本发明提供一种内源性CD7基因被敲除的T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)提供人类原代T细胞；

(2)将试剂引入人类原代T细胞，其中所述试剂包括gRNA和Cas9核酸酶，其中所述gRNA包含有crRNA和tracrRNA两个部分，并且所述crRNA包含SEQ ID NO:24或25所示的核酸序列；

(3)培养扩增步骤(2)得到的T细胞。

在一些实施方案中，所述试剂为核糖核蛋白(RNP)复合物形式。

在一些实施方案中，所述试剂的引入为电转染方式。

在一些实施方案中，所述人类原代T细胞为外周血来源的T细胞或脐带血来源的T细胞。

在一些实施方案中，所述一种内源性CD7基因被敲除的T细胞的制备方法还包括在试剂引入所述人类原代T细胞之前活化T细胞。

CRISPR/Cas系统可以通过本领域已知的任何方法递送进入细胞，例如，通过用编码Cas和gRNA的质粒转染将所述系统直接应用于人细胞，或者使用病毒载体递送。在体细胞基因治疗中通常选择腺病毒载体(AAV)用于体内基因递送。通过Cas和gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的CRISPR递送也在人细胞中表现出有效的基因编辑。CRISPR/Cas系统的病毒载体包括腺病毒、慢病毒和噬菌体；非病毒载体包括脂质体如Lipofectamine^TM、聚合物、金纳米颗粒。CRISPR/Cas基因编辑系统的递送的物理方法包括电穿孔法、显微注射法等。电穿孔技术通过将电场施加到细胞上以增加细胞膜的渗透性，从而允许将化学物、药物、DNA、RNA或蛋白质引入细胞。且由于病毒(包括慢病毒、逆转录病毒或腺病毒)转导T细胞的转导效率较低，及其存在与CRISPR/Cas的延长表达相关的毒性，因此电穿孔已作为一种高效率、低毒性的递送方式应用于CRISPR/Cas系统的递送中。

本发明所用术语“CRISPR系统”、“Cas系统”或“CRISPR/Cas系统”包括RNA引导的核酸酶或其他效应分子和向导RNA分子(gRNA)。CRISPR/Cas系统通过向导RNA引导核酸酶或其他效应分子至靶向序列上以实现对核酸的修饰。CRISPR/Cas系统可以包括向导RNA分子和Cas蛋白，例如Cas9蛋白。向导RNA分子和Cas蛋白可以形成核糖核酸蛋白(RNP)复合物。Cas蛋白具有切割DNA双链的功能，gRNA起引导作用，在原间隔序列相邻基序(PAM)存在的情况下，Cas蛋白可以在gRNA的引导作用下到达不同的靶部位，切割靶基因，实现DNA双链断裂，并激活非同源末端连接(NHEJ)达到基因敲除的目的，或通过同源定向修复(HDR)机制创建外源供体DNA可能插入的位点，实现基因插入。CRISPR/Cas系统包括两类，第1类可以使用多个Cas蛋白形成的复合物切割外源核酸的效应因子，第2类可以使用单一的大Cas蛋白用于切割外源核酸的效应因子。1类可分为I型、III型和IV型，2类可分为II型、V型和VI型。这6种系统类型可进一步划分为19个亚型。Cas9蛋白可以是从化脓链球菌(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、嗜热链球菌(StCas9)、脑膜炎奈瑟球菌(NmCas9)、新弗朗西斯菌(FnCas9)或空肠弯曲杆菌(CjCas9)中分离得到的相应Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于野生型Cas蛋白的Cas变体。示例性的Cas变体可以是高保真Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白变体具有来自其野生型序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个氨基酸突变。在一些实施方案中，Cas变体可以与另一种酶融合，例如活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。

本发明所用术语“gRNA”或“向导RNA”是指一种合成或重组的多核苷酸，其对于靶向序列具有特异性并且可以指导Cas蛋白识别并切割靶标DNA序列。gRNA分子可以包含多个结构域，例如包含两个结构域：(1)与靶向序列共享同源性的结构域(例如能够引导Cas9蛋白至靶标)；和(2)结合Cas蛋白的结构域。在一些实施方案中，gRNA包含两个或更多个结构域(1)和(2)并且可以成为“扩展gRNA”，扩展gRNA将会结合两个或更多个Cas蛋白并在两个或更多个不同区域处结合靶向序列；在一些实施方案中，gRNA分子包含靶向结构域并与Cas酶分子例如Cas9或与另一种RNA引导的核酸内切酶如Cpf1相互作用。在一些实施方案中，gRNA分子包含crRNA结构域(包括靶向结构域)和tracrRNA结构域。与crRNA对应的部分负责识别靶向序列，与tracrRNA对应的部分负责结合Cas蛋白例如Cas9蛋白。对核酸酶的引导作用是通过gRNA的一部分(例如crRNA)与DNA的杂交，另一部分(例如tracrRNA)结合到相应核酸酶或其他效应分子上来实现。通过将这两个部分组合成为一个单一的RNA分子，就可以形成单链gRNA或单向导gRNA(sgRNA)。

将crRNA和tracrRNA这两个部分分别在独立的核酸分子上提供，所述两个核酸分子本身能够结合，通常为通过杂交的方式结合，以形成gRNA分子。crRNA和tracrRNA还可以通过非核酸的化学连接子连接。在一些实施方案中，gRNA包括一种间隔序列和一种支架序列。支架序列可以包含一个发夹结构。在一些实施方案中，支架序列位于间隔序列的下游。在一些实施方案中，支架序列包含一个tracr序列。在一些实施方案中，支架序列包含一个tracr序列和一个tracr配对序列。支架序列是本领域所公知的，且能够从商业渠道获得，如US20140356958A和US11261439B2中所公开的。gRNA可以是呈独立的两部分的组合物(例如独立的crRNA和tracrRNA，可以以杂交形式相连)，也可以是只有一个部分的复合体(例如，一种crRNA-tracrRNA合成体，即sgRNA)。

本发明所用术语“前间区序列邻近基序(PAM)”或“PAM样基序”是指紧随在由CRISPR系统中Cas蛋白靶向的靶向序列下游的2至6个碱基对。PAM序列可以位于切割位点下游3-4个核酸处。Cas蛋白需要PAM序列来识别靶序列。在gRNA与靶向序列配对后，Cas蛋白介导PAM上游约3-nt的双链断裂。PAM序列可以是本领域中已知的任何PAM序列。合适的PAM序列包括但不限于，NGG、NGA、NGC、NAG、NGN、NGT、NGTT、NGCG、NGAG、NGAN、NGNG、NGCN、NGTN、NNGRRT、NNNRRT、NGGNG、NNGRR(N)、TTTV、TYCV、TATV、NNNNGATT、NNAGAAW或NAAAA，其中N是任意核酸碱基；R是嘌呤；Y是嘧啶；W是A或T。例如Cas9的PAM序列可以是NGG，例如Cas变体可以识别修改后的PAM序列，如NGG、NGAN、NGNG、NGAG、NGCG、NNG、TTTN、YTN或YG。

根据本公开的第六方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的CD7单域抗体、嵌合抗原受体、工程化的免疫效应细胞，和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。

赋形剂和/或载体通常也称为辅料。药学上可接受的赋形剂和/或载体包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本领域技术人员能够意识到，药学上可接受的赋形剂和/或载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒或基本上无毒，在药理学和/或生理学上和本发明的活性成分相容，例如不影响其存活力或功效。在一些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。药学上可接受的赋形剂的其他示例描述于Remington和Gennaro，Remington’s PharmaceuticalSciences(第18版，1990)中。本发明可以使用的赋形剂和/或载体包括但不限于：水；盐水；缓冲液如中性缓冲盐水或硫酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇等；甘油；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸等；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽等；乙醇；多元醇，以及其中的一种或多种。

本发明的药物组合物在一些实施方案中，以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干、复溶、稀释之前或之后使用此方法进行灭菌。无菌制剂例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散液等。在一些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。其它药物组合物也将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体或工程化的免疫效应细胞的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所公知。药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、粘性组合物、固体、晶体或以冻干粉末的形式储存于无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复溶经处理使用的形式。

药物组合物可以以任何方便的方式进行使用，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本发明的药物组合物可通过例如经口、经鼻、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射，还可以通过持续释放系统或通过植入装置进行施用。在一些实施方案中，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

将采用的含有本发明靶向CD7的单域抗体或工程化的免疫效应细胞的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者情况(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方式中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。

给药频率将取决于所用配制物中靶向CD7的单域抗体或工程化的免疫效应细胞的药物动力学参数。临床医生典型地施用药物组合物直到达到实现所需效果的剂量。药物组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。

根据本公开的第七方面，本发明提供一种如前所述的靶向CD7的单域抗体、嵌合抗原受体、工程化的免疫效应细胞、或药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供一种治疗与CD7表达相关的疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的工程化的免疫效应细胞或药物组合物。因此，本发明提供了一种本发明所述的靶向CD7的单域抗体、嵌合抗原受体、工程化的免疫效应细胞、或药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述疾病或病症包括与CD7表达相关的疾病或病症。

在一些实施方案中，所述与CD7表达相关的疾病或病症包括淋巴瘤或白血病。

在一些实施方案中，所述疾病或病症包括T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、B细胞白血病或NK细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症包括T细胞非霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述疾病或病症包括T淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、T淋巴母细胞白血病、急性髓系白血病(AML)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

可采用本领域常规的方法制备本发明的单域抗体、纳米抗体或重链抗体，例如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的各种抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明各种抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用于表达的宿主哺乳动物细胞系为本领域所熟知，例如可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌(HepG2)细胞等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本CD7结合特性的抗体来进行选择。

可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体，可参见例如，Park et al,Trends Bio technol.,29:550-557,2011；Grupp et al,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han et al,J.Hematol.Oncol.,6:47,2013。

本领域技术人员所熟知，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的嵌合抗原受体。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％同一性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明各种嵌合抗原受体的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

本发明还涉及包含上述的核酸序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物，例如表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、多肽等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明多肽序列中。

在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的核酸可操作地连接到组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本发明的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)启动子、泛素C(UbiC)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、猿病毒40(SV40)早期启动子，以及鸡β-肌动蛋白与CMV早期增强子偶联(CAGG)启动子。这种组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中进行了广泛比较。例如Michael C.Milone等人(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在人类原代T细胞中驱动嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且维持在CD4和CD8人T细胞中是最佳的。在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的核酸可操作地连接到hEF1α启动子。

在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、诱导剂等。

在一些实施方案中，诱导条件下诱导工程化哺乳动物细胞和/或接受药物组合物的受试者中的内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自：诱导剂、辐射(例如电离辐射、光)、温度(例如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。

病毒载体技术是本领域熟知的，并且在Sambrook等人的Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor.(2001)([分子克隆：实验室手册]，纽约冷泉港的冷泉港实验室，2001年)以及其他病毒学和分子生物学手册中进行过描述。

现有技术中已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以在体外或离体分离重组病毒并将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用自灭活慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。使用本领域已知的方法，所得慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞(例如原代人T细胞)。

可以使用本领域中任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。在一些实施方案中，核酸与启动子可操作地连接。现有技术已经公开了多种用于哺乳动物细胞中的基因表达的启动子，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本发明。启动子可进一步分为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤为本领域所熟知。另一种方法是使用MgCl₂。此外，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的核酸分子所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，例如含血清培养基或无血清培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上述方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术以及这些方法的结合。

本发明的工程化的免疫效应细胞是通过将嵌合抗原受体引入免疫效应细胞(例如T细胞)中来制备的。

采用本领域已知的常规方法(如通过转染、转导、转化等)可以将编码嵌合抗原受体的核酸序列引入免疫效应细胞。

将载体或分离的核酸引入免疫效应细胞的方法是本领域已知的。所描述的载体可以通过物理、化学或生物学方法转移到免疫效应细胞中。

将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的，并且在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor.以及其他病毒学和分子生物学手册中进行过描述。在一些实施方案中，通过电穿孔方法将载体引入免疫效应细胞中。

将载体引入免疫效应细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物细胞(例如人类细胞)中最广泛使用的方法。

将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，例如包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送载体的示例性胶体系统是脂质体。

在一些实施方案中，载体还包含选择标记基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达嵌合抗原受体的细胞。选择标记和报告基因的两侧都可以有适当的调节序列以在宿主细胞中表达。例如，载体可以含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节核酸序列表达的启动子。

报告基因可用于识别可能转染的细胞和评估调节序列的功能。一般而言，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且其编码多肽，该多肽表达一些容易检测的特性，例如酶活性。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(参见Kumiko Ui-Tei.FEBS Letters,479:79-82(2000))。合适的表达系统是本领域已知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。确认工程化的免疫效应细胞中存在编码CAR的核酸的其他方法包括：本领域技术人员熟知的分子生物学测试方法，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生化测定方法，例如检测特定肽的存在或不存在；免疫学方法，例如ELISA。

在一些实施方案中，编码本文所述的任何CAR的核酸分子可以通过常规方法(例如体外转录)制备，然后通过已知方法例如mRNA电穿孔引入免疫效应细胞(参见Peter MRabinovich.Human Gene Therapy,17:1027-1035(2006))。

在一些实施方案中，经转导或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后进行离体培养增殖。在一些实施方案中，经培养转导或转染的免疫效应细胞以增殖至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天。在一些实施方案中，可以进一步评估或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化的免疫效应细胞。

术语解释

除非另有说明，否则本文中所使用的所有术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

本发明所用术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可以使用一些算法来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)、SmithWaterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和Clustal W。此外可以使用序列分析软件进行测定，例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。

本发明所用术语“来源于”表示两者之间的关系，通常是指两者之间的结构相似性。例如，在来源于CD3ζ的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。

本发明所用术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，所述蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。包括例如，单克隆抗体(包括完整抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双抗体和单链分子，和能够表现期望的生物活性的携带一个或多个CDR序列的抗体片段或合成多肽，尤其是抗原结合片段，例如Fab，F(ab’)2和Fv。在本发明一些实施例中，术语“免疫球蛋白(Ig)”和“抗体”可互换地使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

重链抗体是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。

本发明所用术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者皆有。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”。抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。

本发明所用术语“抗原结合片段”或“抗体片段”，是指包含完整抗体或其重组变体的至少一部分，一般包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、scFv、抗体的重链可变区(VH)、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、抗原的天然配体或其功能性片段等。

本发明所用术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(例如取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是保守型修饰。

单域抗体(sdAb)可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性的sdAb包括但不限于来自仅重链抗体的重链可变结构域(例如VHH)、天然没有轻链的结合分子、单结构域(例如VH或VL)衍生自常规4链抗体、由表达人类重链片段的转基因小鼠或大鼠产生的人类单域抗体，以及非衍生自抗体的工程域和单域支架。本领域已知的或由本发明公开的任何sdAb，包括本发明公开的单域抗体，可用于构建本文所述的CAR。sdAb可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鲨鱼、山羊、兔和牛。本发明的单域抗体还包括来自骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单域抗体分子。

在本发明中“单域抗体”、“靶向CD7的单域抗体”、“重链单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CD7的单域抗体。通常，单域抗体含有三个CDR区和四个FR区。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常是先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。

本发明所用术语“互补性决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的序列。一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，以及每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。

包含抗体或其抗体片段的嵌合抗原受体的部分可以以多种形式存在，例如其中抗原结合结构域表达为多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如人或人源化抗体)的一部分，参见Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426。

“抗原结合结构域”是指嵌合抗原受体的与靶抗原特异性结合的部分，嵌合抗原受体可以利用其抗原结合特性将T细胞和/或其他免疫细胞定向至所选择的靶标。抗原结合结构域可以典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，但是其不必同时包含这两个可变区。例如，可包括具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段、单一Fv片段例如scFv、单域抗体等。

“跨膜结构域”是用于连接嵌合抗原受体的细胞外结构域和细胞内结构域。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域的非限制性实例包括，TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRζ、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、OX40、ICOS、LAG-3、2B4、BTLA、CTLA-4、PD-1。

“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，即足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的功能性部分。胞内信号传导结构域负责在抗原结合区结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs,ITAM)。胞内信号传导结构域的非限制性实例包括但不限于FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d。

“铰链区”是指用于连接跨膜结构域和抗原结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，例如全部或部分源自CD8或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。

CAR的不同结构域也可以通过肽接头相互融合。这取决于单域抗体和/或各种域的结构和/或功能特征，CAR中的每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。本领域技术人员可以独立地选择和优化每个肽接头。在一些实施方案中，肽接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。如本领域技术人员所理解的，这些氨基酸中的一种或多种可以被糖基化。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域可以相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。

肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头不超过为约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少的氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。

肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅重链抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见，例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)n、(GSG)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。

“共刺激信号结构域”可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激结构域的非限制性实例包括但不限于以下蛋白质的胞内区：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD134(OX40)、CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CDS、ICAM、CD137(4-1BB)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、BTLA、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB、DAP10、PD-1、TRIM、ZAP70配体或它们的任何组合。

“信号肽”可以使得嵌合抗原受体在细胞(例如T细胞)中表达时，使新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。通常，信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽指导翻译的蛋白质穿过膜的转运和/或分泌。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。信号肽也可以被称为靶向信号、转运肽、定位信号或信号序列。例如，信号序列可以是共翻译或翻译后信号肽。

“免疫效应细胞”是指可以执行免疫效应功能(例如细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的免疫细胞。例如，免疫效应细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。当免疫效应细胞是T细胞时，T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、CD4-/CD8-T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。

本发明所用术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。

“治疗”指向受试者采用本发明所述治疗方法以达到至少一种阳性治疗效果(例如癌细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方法可根据多种因素(例如患者的疾病状态、年龄、体重以及疗法激发受试者的抗癌反应能力)调整。

附图说明

图1A显示了使用CRISPR/Cas9系统敲除T细胞的CD7基因，并将其制备成CAR-T细胞培养3天后，CD4+T细胞上的CAR表达率。

图1B显示了使用CRISPR/Cas9系统敲除T细胞的CD7基因，并将其制备成CAR-T细胞培养3天后，CD8+T细胞上的CAR表达率。

图2显示了使用CRISPR/Cas9系统敲除T细胞的CD7基因，并将其制备成CAR-T细胞后，各组效应细胞的敲除率。

图3A显示了制备得到的CAR-T细胞在培养10天后，CD4+CAR-T细胞中T_SCM+T_CM所占比例。

图3B显示了制备得到的CAR-T细胞在培养10天后，CD8+CAR-T细胞中T_SCM+T_CM所占比例。

图4A显示了制备得到的CAR-T细胞在培养10天后，其中表达Tim3的CD4+CAR-T细胞所占比例。

图4B显示了制备得到的CAR-T细胞在培养10天后，其中表达Tim3的CD8+CAR-T细胞所占比例。

图5显示了使用CRISPR/Cas9系统敲除T细胞的CD7基因，并将其制备成CAR-T细胞培养15天后，总T细胞的增殖倍数。

图6显示了分别测定各种靶细胞：Raji细胞、SUP-T1细胞、Jukat细胞的表面CD7抗原的表达情况。

图7A显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第1天的各组效应细胞对Jurkat细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图7B显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第3天的各组效应细胞对Jurkat细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图7C显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第1天的各组效应细胞对Jurkat细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图7D显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第3天的各组效应细胞对Jurkat细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图8A显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第1天的各组效应细胞对SUP-T1细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图8B显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第3天的各组效应细胞对SUP-T1细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图8C显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第1天的各组效应细胞对SUP-T1细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图8D显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第3天的各组效应细胞对SUP-T1细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图9A显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第1天的各组效应细胞对Raji细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图9B显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第3天的各组效应细胞对Raji细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图9C显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第1天的各组效应细胞对Raji细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图9D显示了效靶比(E:T)＝1:9时，第3天的各组效应细胞对Raji细胞的体外杀伤率流式测定结果。

图10A显示了效靶比(E:T)＝1:9时，各组效应细胞杀伤靶细胞(Jurkat)时的IL-2释放实验结果。

图10B显示了效靶比(E:T)＝1:9时，各组效应细胞杀伤靶细胞(Jurkat)时的TNF-α释放实验结果。

图10C显示了效靶比(E:T)＝1:9时，各组效应细胞杀伤靶细胞(Jurkat)时的IFN-γ释放实验结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1.靶向CD7的单域抗体(VHH)的制备

(1)动物免疫和免疫反应试验

选择成年健康双峰驼作为免疫对象，在免疫前取10mL血作为阴性血清对照。使用CD7-His重组蛋白连续免疫3次双峰驼，免疫过程刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体，每次免疫后第7天采集少量外周血分离血清，通过间接ELISA测定免疫效价。检测得到抗体效价为1:512000，表明免疫效果良好，准备建库。

(2)抗体噬菌体文库的构建

1)RNA的提取与反转录

冲击免疫后7天采集外周血200mL，分离出外周血淋巴细胞并用RNAiso Plus试剂提取总RNA，并通过反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。

2)PCR扩增

使用PCR法从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片段。以cDNA为模板，通过两轮PCR扩增获得VHH基因，其中第一轮PCR扩增后将PCR产物进行切胶并回收纯化700bp的VHH基因片段；第二轮以700bp的VHH基因为模板，扩增获得VHH基因。

3)酶切

使用内切酶同时酶切pMECS载体及目的基因片段，酶切完成后用T4 DNA连接酶将VHH基因连接至载体，构建重组质粒。

4)电转化

将重组质粒纯化，并通过电转的方式转化至TG1感受态细胞中，电转参数为：电穿孔仪BIO-RAD，Gene Pulser Xcell Total System，电压2.5KV，电击杯2mm。电击后立即向电击杯中加入1mL 2YT培养基(37℃预热)，吸出电击产物并用2YT培养基洗净电击杯，共计获得100mL液体，并将其于37℃、180rpm下复苏45min作为复苏产物，从中取出100μL，梯度稀释至10^-3和10^-4后涂板，用于测定库转化子数目。其余复苏产物离心，加入8mL 2YT培养基重悬后涂板。培养后获得纳米抗体文库。测定库容，并通过菌落PCR验证所建库的插入率和库多样性。

(3)噬菌体包装

接种噬菌体文库到2×300mL 2YT+A(Amp)+G(Glu)培养基(Amp：100μg/mL、Glu：1％)中，直至初始OD600为0.1-0.2。在37℃、230rpm条件下培养，直至OD600为0.8以上。根据OD值加入辅助噬菌体M13KO7(辅助噬菌体数:细菌个数＝20:1)混匀，37℃下静置30min后，继续在37℃下以180rpm振摇30min。接着以5000rpm离心10min，弃去上清液，用等体积的2YT+A(Amp)+K(Kan)培养基(Amp：100μg/mL、Kan：50μg/mL)重悬沉淀，30℃下220rpm过夜培养。将过夜培养物于4℃、10000rpm离心20min后，收集上清液并转移至新的离心管，于4℃、10000rpm离心20min，收集上清液。而后加入体积为上清液体积1/5的PEG8000/NaCl溶液，混匀，冰浴沉淀至少2h后，于4℃、10000rpm的条件下离心20min，除尽上清液。加入1mL 1×PBS悬起沉淀，再加入其1/5体积的PEG8000/NaCl溶液二次沉淀1h。二次沉淀后，于4℃、12000rpm离心10min，除尽上清液，并根据沉淀的量，加入1×PBS重悬沉淀。接着加入100％甘油，直至液体终浓度为50％，混匀后于-80℃保存。取10μL库噬菌体用2YT培养基梯度稀释，分别从10^-8和10^-9管中取10μL加到90μL的TG1菌液中，轻柔混匀。于37℃下静置15min，分别涂布Amp抗性平板，37℃下过夜培养。次日检测噬菌体文库滴度。

(4)噬菌体筛选

1)细胞淘选

将CD7(5×10⁶Cell)细胞在500g、5min条件下离心，用5％血清-PBS重悬并洗涤细胞沉淀，重复两次以清洗CD7细胞。向细胞EP管中加入500μL OVA封闭液，于4℃下轻微震荡封闭1h。使用5％血清-PBS和3％BSA稀释噬菌体文库，直至BSA浓度为2％，37℃下封闭，作为噬菌体文库稀释液备用。将CD7细胞封闭离心后去除上清液，加入2×10¹¹cfu噬菌体文库稀释液，于4℃下轻微震荡1h后离心，去除未结合噬菌体，并用5％血清-PBS洗涤细胞6次。加入100μL Gly-HCl洗脱液，并于37℃富集8min，洗脱特异性结合的噬菌体，将该洗脱液转移至无菌离心管中，立刻用10μL Tris-HCl中和缓冲液中和，获得淘选洗脱物。取10μL进行梯度稀释，用于测定滴度，计算淘选回收率。

2)淘选后文库的扩增

将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，于37℃下静置30min后加入1mL 20％葡萄糖，220rpm培养30min，按cell:phage＝1:20的比例加入M13K07噬菌体及4μL Amp，再于37℃静置30min，补加20mL 2YT培养基，220rpm条件下培养30min。将培养物于4℃下，5000rpm离心10min，得到的细胞沉淀用50mL 2×YT+A+K液体培养基重悬，并在30℃、250rpm的条件下振荡培养过夜。将过夜培养物于4℃、10000rpm离心20min，转移上清液至新离心管并加入上清液1/5体积的PEG/NaCl溶液，混匀后于4℃静置至少2h。静置结束后在4℃、10000rpm的条件下离心20min，去除上清液，将沉淀重悬于1mL PBS中，再加入其1/5体积的PEG/NaCl溶液，混匀后于4℃下静置至少1h。静置结束后再次离心，在4℃、12000rpm的条件下离心2min，去除上清液，用200μL PBS重悬沉淀，获得扩增产物。测定滴度，用于下一轮淘选或者分析，淘选重复进行三轮。

(5)单克隆ELISA检测及特异性检测

从第三轮筛选后的洗脱液TG1制备的平板中随机挑取96个单克隆，将其扩大培养至对数期，并用辅助噬菌体M13K07感染获得重组噬菌体上清，以该重组噬菌体上清液为一抗，通过间接ELISA检测并鉴定能够与CD7蛋白特异性结合的纳米抗体，同时对阳性克隆进行测序。

为了检测筛选获得的纳米抗体与CD7蛋白的结合特异性，将CD7-His蛋白及对照蛋白CD5-His、CD47-His、CD22-mFc和mFc蛋白分别包被于酶标板，封闭后将单克隆重组噬菌体上清作为一抗分别与上述蛋白孵育，通过间接ELISA检测纳米抗体与上述蛋白的反应活性。

实施例2.T细胞的基因编辑

设计gRNA以敲除T细胞的内源性CD7基因，所述gRNA分别为：

(1)gRNA-CD7-GP4：ACGGGGACAGTCGTGCAGTG(SEQ ID NO:24)，PAM序列为：GGG；

(2)gRNA-CD7-EC8：GGAGCAGGTGATGTTGACGG(SEQ ID NO:25)，PAM序列为：AGG。

分别合成包含gRNA-CD7-GP4或gRNA-CD7-EC8的crRNA，各自配制crRNA:tracrRNA复合物。将crRNA和tracrRNA按照比例1:1加入到Nuclease-Free Duplex Buffer(IDT)中，总体积为100μL。在95℃的温度下退火5min，取出后在室温下静置，待其温度恢复至20-25℃后，在Opti-MEM(Gibco，Cat#A4124802)中分别加入crRNA:tracrRNA复合物、Cas9和1μM电穿孔增强子(IDT,Cat#1075916)，配制成核糖核蛋白(RNP)复合物，总体积为25μL。室温下静置5min，得到RNP复合物待用。

活化T细胞并分组，其中没有电转进行CD7基因敲除的T细胞记为NoEp组，进行CD7基因敲除的T细胞组则根据各自使用的gRNA名称分别进行命名。取细胞离心，弃去上清液保留细胞沉淀，加入新鲜适量的Opti-MEM缓冲液以重悬细胞沉淀。将细胞悬液离心后弃去上清液，再加入新鲜适量的Opti-MEM缓冲液重悬细胞沉淀，加入配制好的RNP复合物后轻轻吹打混匀，然后加入电极杯中。使用Celetrix电转仪并设置电压为500V。电转结束后，将细胞转移至培养基中，于37℃培养箱中静置30min，然后转移到培养皿中培养，得到敲除CD7基因的T细胞。

将两组敲除CD7基因后的T细胞的细胞密度调整为400cells/μL进行铺板，每孔体积为500μL，混匀后于37℃、5％CO₂培养箱中培养，培养3天后使用PE抗人CD7抗体(PE anti-human CD7 Antibody，Biolegend，B351621)检测CD4+、CD8+T细胞上CD7的敲除率。自铺板后每三天观察T细胞扩增情况并补加新鲜完全培养基，持续培养8天后停止，使用PE抗人CD7抗体(PE anti-human CD7 Antibody，Biolegend，B351621)检测CD4+、CD8+T细胞上CD7基因的敲除率(CD7-T细胞的占比％)，检测结果显示，NoEp组未敲除CD7基因，使用gRNA-CD7-GP4进行CD7基因敲除的T细胞组的敲除率以及使用gRNA-CD7-EC8进行CD7基因敲除的T细胞组的敲除率均大于90％。

实施例3.靶向CD7的嵌合抗原受体的构建及免疫细胞表达

(1)CD7-CAR的构建

设计并人工合成了各组靶向CD7的CAR核苷酸序列(SEQ ID NO:21-23)，各组序列中包含HLA-A信号肽(SEQ ID NO:13)、CD7-VHH的细胞外抗原结合结构域(SEQ ID NO:10-12)、CD8α铰链区(SEQ ID NO:14)、CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO:15)、4-1BB(CD137)共刺激信号结构域(SEQ ID NO:16)和CD3ζ细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:17)的编码核苷酸序列，用于表达各实验组完整的CD7-CAR多肽分子(SEQ ID NO:18-20)，分别记为T2、T19和T60组。通过同源重组将CD7-CAR核苷酸序列插入至慢病毒表达载体pK1的多克隆位点从而获得pK1-CD7-CAR，通过电泳及测序结果确认慢病毒表达载体序列构建成功。

另外，按照同样的方法构建阳性对照CAR分子，阳性对照CAR分子分别为T6和TH69，其中T6使用了专利CN110760007B中公开的VHH6(专利中的氨基酸序列SEQ ID NO:6)作为抗原结合结构域；T6的CAR分子氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示(记为T6组)，其核酸序列如SEQ ID NO:27所示。TH69使用了文献“Baum W,Steininger H,Bair HJ,Becker W,Hansen-Hagge TE,Kressel M,Kremmer E,Kalden JR,Gramatzki M.Therapy with CD7monoclonal antibody TH-69is highly effective for xenografted human T-cellALL.Br JHaematol.1996Nov；95(2):327-38.”中公开的TH-69作为抗原结合结构域，TH69的CAR分子氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示(记为TH69组)，其核酸序列如SEQ ID NO:29所示。

阳性对照CAR分子T6的氨基酸序列：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMDVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGYPYSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGRTRYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMNRMKPEDTAMYYCAARFGPMGCVDLSTLSFGHWGQGTQVTVSITTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:26)

阳性对照CAR分子T6的核酸序列：

ATGCTGCTGCTGGTGACCTCTCTGCTGCTCTGCGAACTGCCTCACCCAGCCTTTCTGCTGATCCCCATGGACGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGGCAGGAGGATCTCTGAGGCTGTCTTGCGCAGTGTCCGGATACCCCTACAGCAGCTACTGCATGGGTTGGTTCAGACAGGCCCCAGGAAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCCGCTATCGATAGCGACGGAAGAACCAGATACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCAGGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACCGGATGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCTCGCTTCGGACCTATGGGTTGCGTGGATCTGAGCACCCTGAGCTTTGGCCATTGGGGACAGGGAACCCAGGTCACCGTGTCCATCACTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:27)

阳性对照CAR分子TH69的氨基酸序列：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGFTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARDEVRGYLDVWGAGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:28)

阳性对照CAR分子TH69的核酸序列：

ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCCGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCAGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTATTATTGTCAGCAGTATAGCAAGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGAGGCGGGTCTGAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGAAGCCAGGAGGATCTCTGAAACTGAGTTGTGCCGCTTCAGGCCTGACCTTCTCAAGCTACGCCATGAGCTGGGTGCGACAGACACCTGAGAAGCGGCTGGAATGGGTCGCTAGCATCTCCTCTGGCGGGTTCACATACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCAGATTTACTATCTCTCGGGATAACGCAAGAAATATTCTGTACCTGCAGATGAGTTCACTGAGGAGCGAGGACACCGCAATGTACTATTGTGCCAGGGACGAAGTGCGCGGCTATCTGGATGTCTGGGGAGCTGGCACTACCGTCACCGTCTCCAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:29)

(2)慢病毒载体的包装

复苏293T细胞并培养于含有10％ FBS的DMEM培养基中。经过2-3代细胞扩增培养后，按照4×10⁴个/cm²的密度接种到2层细胞工厂中。在细胞接种3天后进行质粒转染，加入40mL Opti-MEM到质粒转染用无菌50mL离心管中后，根据pK1-CD7-CAR:pLP1:pLP2:pLP-VSVG＝5:4:3:1的比例加入病毒包装载体和病毒包膜载体，并加入800μL PEI转染试剂，立即混匀，于室温下孵育15min。接着将质粒/载体/转染试剂复合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中，24h后收集病毒上清液至50mL离心管中，250g离心5min，离心后用0.45μm的滤器过滤，将过滤后的上清液超速离心(25000g，4℃，3h)获得浓缩的CD7-CAR慢病毒。离心后弃去上清液，用4℃预冷的PBS重悬慢病毒，对重悬后的CD7-CAR慢病毒液进行分装，放入-80℃条件下贮存备用。

(3)T细胞的复苏与活化

取出冻存的脐血并于38℃水浴融化。转移脐血至50mL离心管中，并加入适量RPMI1640培养基，混匀后取样计数，并于300g、5min条件下离心，离心后收集下层细胞，用完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基，补加谷氨酰胺、2-巯基乙醇、IL-7(10ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、IL-2(200U/mL))重悬至T淋巴细胞密度为1×10⁶个/mL，根据重悬体积加入活化磁珠Anti-human CD3 antibody和Anti-human CD28 antibody，其中Anti-human CD3antibody使用浓度为0.15μg/mL，Anti-human CD28 antibody使用浓度为0.625μg/mL，将细胞放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)T细胞的分选与纯化

T细胞活化2天后，混匀取样20μL，加入稀释后的荧光标记抗体10μL，染色10min，加入PBS稀释10倍后使用流式细胞仪检测计数，记录CD45+、CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度，观察活化标志物CD69和CD25分子表达情况。记录细胞体积，确认T细胞总数。将细胞悬液转移至离心管中离心(500g、5min)，弃上清液收集下层细胞；加入MACS Buffer洗涤，再次离心(500g、5min)后收集下层细胞，并用适量MACS Buffer重悬细胞。根据细胞量及磁珠说明书计算CD4+磁珠(Miltenyi Biotec，130-045-101)、CD8+磁珠(Miltenyi Biotec，130-045-201)使用量，并按照磁珠说明书使用CD4+和CD8+磁珠进行分选，得到分选后T细胞。

(5)T细胞的内源性CD7基因敲除和CD7-CAR慢病毒转导

使用实施例2中得到的gRNA-CD7-EC8敲除步骤(4)中得到的T细胞的内源性CD7基因。将敲除后的T细胞密度调整为400cells/μL进行铺板，每孔体积为500μL。将其培养24h后根据每孔实际细胞数量加入CD7-CAR慢病毒液，混匀后于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养3天后分别检测T细胞表面的CD7-CAR分子的表达率及T细胞的增殖情况。使用FITC标记的人CD7蛋白检测各实验组CAR的表达率，检测结果如图1A和1B所示。使用PE抗人CD7抗体检测UnT组和实验组的CD7敲除率，各组效应细胞的CD7敲除情况如图2所示，说明成功获得了内源性CD7被敲除的靶向CD7的CAR-T细胞。自铺板后定期检测CAR-T细胞的增殖情况并补加新鲜完全培养基，培养10天后检测T细胞T_SCM+T_CM表型和表达Tim3的CAR-T细胞所占比例，T_SCM+T_CM表型的检测结果如图3A和3B所示，表达Tim3的检测结果如图4A和4B所示。持续培养15天后收获，用于后续体外杀伤实验。同时检测并统计T细胞的增殖情况，T细胞的增殖情况如图5所示，表明成功避免了CAR-T细胞的大量自杀，制备得到了CD7靶向的CAR-T细胞。构建得到的靶向CD7的CAR-T细胞分别为T2(SEQ ID NO:18)、T19(SEQ ID NO:19)和T60(SEQ ID NO:20)，阴性对照T细胞组UnT(未转导CAR)，阳性对照CAR-T细胞组为T6(SEQ ID NO:26)和TH69(SEQ ID NO:28)。

干细胞样记忆T细胞(T_SCM)是一种具有自我更新和效应T细胞产生能力的T细胞亚群，具有能够在体内长期生存的特性，起到维持长期的抗肿瘤能力的作用。中央记忆T细胞(T_CM)是T_SCM分化的后一阶段，通常通过分析T_SCM+T_CM所占比例来判断效应T细胞的体内持久性和治疗潜力。本发明通过分析CD45RO-CD62L+和CD45RO+CD62L+T细胞百分比和来评价T_SCM+T_CM(CD45RO:APC/Cyanine7 anti-human CD45RO,Biolegend,B350148；CD62L:PE/Cyanine7anti-human CD62L,Biolegend,B373155)的所占比例，预示着CAR-T细胞在体内的持久性越强。因此，若能在CAR-T细胞中保持更高比例的T_SCM+T_CM也将有利于其用于体内治疗。

本发明通过分析表达Tim3的T细胞(Brilliant Violet 421^TM anti-human CD366，Biolegend，B355191)所占T细胞百分比来判断T细胞的耗竭情况，表达Tim3的CAR-T细胞所占比例越高，预示着CAR-T细胞的效应功能越低。

实施例4.靶向CD7的CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤效果验证

(1)CD7抗原在靶细胞表面的表达情况测定

按照CD7荧光标记抗体(PE anti-human CD7 Antibody,Biolegend,B327127)说明书的记载，对Raji(ATCC,CCL-86)、SUP-T1(ATCC,CRL-1942)、Jurkat细胞(成都飞鸥尔生物科技有限公司)避光染色7min后，通过流式细胞仪检测细胞表面CD7抗原的表达情况，检测结果如图6所示。该结果显示，CD7抗原在Raji细胞上无表达，在Jurkat细胞(CD7阳性细胞)和SUP-T1细胞(CD7阳性细胞)上为高表达。

(2)靶向CD7的CAR-T细胞的体外杀伤效果流式测定

在24孔板中分别加入下列靶细胞(9×10⁵个/孔)：Jurkat细胞、SUP-T1细胞、Raji细胞，并且按照效靶比(E:T)为1:3或1:9，以CAR-T细胞中CD8+CAR-T细胞的细胞量计算需要加入的效应细胞量，按照相应的效应细胞量将实施例3中构建得到的各组CAR-T细胞添加至24孔板中。未转导CAR的阴性对照组UnT也按照相应效靶比加入相同量的UnT细胞和靶细胞。所有组均补加完全培养基至500μL/孔，将孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。在培养1天和3天后分别通过流式细胞仪检测每孔中靶细胞剩余量并计算杀伤率。检测结果如图7A、7B、7C、7D、8A、8B、8C、8D、9A、9B、9C、9D所示。

计算公式为：杀伤率％＝靶细胞减少量/靶细胞铺板细胞量×100％。

(3)靶向CD7的CAR-T细胞的细胞因子释放测定

在实施例4的第(2)项体外杀伤实验铺板后18h，收集各组CAR-T细胞培养液上清液，通过CBA检测试剂盒LEGENDplex^TMHU Th Cytokine Panel(12-plex)w/FP V02，货号741027，检测各组CAR-T细胞的细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)的释放情况，检测结果如图10A、10B和10C所示。

具体实施步骤如下：

在体外杀伤实验铺板后18h，分别收集各组CAR-T细胞培养液上清液。将捕获微球(Beads)恢复至室温后，涡旋2min使其充分混匀，配制为每样品15μL备用。将20xWashBuffer恢复至室温，使其中的盐分充分溶解，并用超纯水将其配制成1x Wash Buffer，备用。用250μLAssay Buffer溶解并混匀标准品，并对其进行梯度稀释，按照稀释倍数4倍稀释，共稀释6次以获得6个梯度浓度点，用以建立细胞上清液标准曲线。在EP管中加入AssayBuffer、Beads、标准品各15uL，混匀，配制标准品孔。在EP管中加入Assay Buffer、Beads、各样品各15μL，混匀，配制样品孔。将标准品孔和样品孔在避光条件下，900rpm震荡并室温孵育2h。将样品真空抽滤，加入200μL 1xWash buffer到各EP管震荡混匀，重复洗涤一次。加入15μL检测抗体和15μL Assay buffer至各EP管，吹打混匀，避光条件下，900rpm震荡并室温避光孵育1h。然后加入15μL链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)到各EP管，避光条件下900rpm震荡，并室温避光孵育0.5h，使捕获微球(Beads)、目的分析物与生物素化的检测抗体、SA-PE结合。加入200μL 1xWash buffer到各EP管以二次洗涤，震荡混匀，重复洗涤一次。每管加入200μL 1xWash buffer，避光待测。每个样品在检测前均震荡90s混匀，流式细胞仪参数选择FSC、SSC、PE和APC通道，分别检测细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的释放情况。

Claims (22)

1.一种靶向CD7的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3；

其中CDR1为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或

其中CDR1为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其中CDR2为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，其中CDR3为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的任一氨基酸序列。

4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向CD7的单域抗体。

5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，和

(c)细胞内信号传导结构域；

其中，所述细胞外抗原结合结构域包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向CD7的单域抗体。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于CD8α、CD28、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4或它们的任何组合。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于CD8α。

8.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域来源于CD134(OX40)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD278(ICOS)或它们的任何组合。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述共刺激信号结构域来源于4-1BB(CD137)。

11.根据权利要求5-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于细胞外抗原结合结构域C端和跨膜结构域N端之间的铰链区。

12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述铰链区来源于CD8α、CD28、CD137、IgG4、IgG1或它们的任何组合。

13.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于嵌合抗原受体多肽N端的信号肽。

14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述信号肽来源于HLA-A、CD8α、CD4、CD33、CD137、GM-CSFRα、IgG1、Igκ、IL-2或它们的任何组合。

15.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其为如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的任一氨基酸序列。

16.一种分离的核酸，其特征在于，包含编码如权利要求4-15中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。

17.根据权利要求16所述的分离的核酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22所示的任一核酸序列。

18.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求16或17所述的分离的核酸。

19.一种工程化的免疫效应细胞，其特征在于，包含如权利要求4-15中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求16或17所述的分离的核酸、或权利要求18所述的载体。

20.根据权利要求19所述的工程化的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、DNT细胞、巨噬细胞、树突状细胞、由诱导性多能干细胞分化而成的免疫效应细胞或它们的任何组合。

21.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向CD7的单域抗体、权利要求4-15中任一项所述的嵌合抗原受体、或权利要求19-20中任一项所述的工程化的免疫效应细胞，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。

22.一种如权利要求1-3中任一项所述的靶向CD7的单域抗体、权利要求4-15中任一项所述的嵌合抗原受体、或权利要求19-20中任一项所述的工程化的免疫效应细胞，或权利要求21所述的药物组合物在制备用于诊断、预防和/或治疗与CD7表达相关的疾病或病症的药物中的用途，其特征在于，所述与CD7表达相关的疾病或病症为T淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、T淋巴母细胞白血病、急性髓系白血病(AML)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。