CN117647571A - 一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，包括如下步骤：(1)在基底表面形成电极层：将电极材料成型在基底表面，以形成图形化电极系统、导电线路以及触点；(2)在所述参比电极表面涂覆Ag/AgCl浆液，干燥，形成Ag/AgCl参比电极；(3)在所述工作电极表面修饰电子转移介体或催化剂；(4)在所述工作电极表面形成酶层；(5)在所述工作电极表面形成质量运输限制层：(6)在所述工作电极表面形成抗干扰层；(7)在所述工作电极的传感器电极端部形成生物相容性涂层；(8)将修饰后的电极整体浸入pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液中4‑48h，使各成分及涂层之间充分结合，增强所述电极稳定性，得到制备完成的电化学生物传感器电极。

Description

一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备 方法

技术领域

本发明创造设计分析物检测设备领域，具体地。涉及一种电化学生物传感器电极。

背景技术

现有公开技术或文献：CN110044986B、CN111803086B等。

相近技术特征：电极分层修饰的设计具有一定相似度，部分选材具有一定相似度。

背景介绍：

人体血液及体液中的众多成分与生理健康水平具有直接联系，对不同成分进行检测分析，对人体生理状况的判断具有重要的医学意义。电化学生物传感器由于能够将生化信号转化为电信号进行采集放大，被广泛用于分析物检测领域。如用于糖尿病管理的持续血糖监测设备中，微创持续监测葡萄糖水平以辅助胰岛素治疗；或用于体外分析物检测的各类电化学检测芯片及设备中。中国发明专利CN201811640898.3公开涉及了一种葡萄糖监测探头的工作电极，其具备：基底层；葡萄糖酶传感层，其形成在基底层上，具有能够与葡萄糖发生化学反应的葡萄糖酶；半透膜，其形成在葡萄糖酶传感层上，控制葡萄糖分子的通过率；以及生物相容膜，其形成在半透膜上，其中，在基底层与葡萄糖酶传感层之间，设置有催化葡萄糖反应且呈多孔状的纳米颗粒层，并且葡萄糖酶渗入纳米颗粒层。根据本公开，能够降低工作电极工作电压，降低干扰，延长葡萄糖监测探头的使用寿命，并且提高对于葡萄糖的反应灵敏度。中国发明专利CN202010720261.6一种三电极皮下植入式葡萄糖传感器及其制作方法，本发明的传感器采用工作电极、参考电极和辅助电极的三电极形式，测试的微电流从工作电极和辅助电极通过，参考电极基本没有电流通过，从而延长参考电极的使用寿命；通过对传感器电极制作工艺的改进，使得工艺变的简单、质量可控，并且保持了工作电极葡萄糖氧化酶的稳定性，确保传感器测试数据准确；此外，取消了牛血清白蛋白等载体，采用戊二醛和硅烷双功能偶联的方式保证葡萄糖氧化酶的活性和稳定性，降低了对人体的安全隐患，减轻了人体的排异反应；通过发射器和传感器可拆装的卡合连接方式，使得传感器和发射器能够方便分离，实现更换传感器后发射器还能够重复使用，降低了用户的使用成本。

通常来说，电化学生物传感器用于持续血糖监测的设备中，多使用计时安培法进行实时测量并采集电流信号，利用电流信号水平反映生理葡萄糖水平；在体外分析物检测过程中，则可使用包含循环伏安法、差分脉冲伏安法、电化学阻抗谱法、计时安培法等多种检测手段对信号进行采集并建立电信号与分析物的对应关系。

如今，各类持续检测设备与体外分析设备被成功地进行了商业化，投入医学检测应用中。尤其在糖尿病管理以及体外分析物检测领域，受众度广，普及率高。然而，由于实际存在的众多问题，如：

1.参比电极持续损耗，持续测量时间长容易导致失准。

2.贵金属电极微丝成本较高，资源浪费严重。

3.使用牛血清白蛋白作为电极抗污剂，当电极探头用于微创植入式检测时容易诱发机体排异反应。

4.使用戊二醛作为交联剂，灭活不彻底或有残留时，容易对人体产生生物毒性。

5.电极探头中工作电极与对电极距离较远，不易形成稳定回路，容易受到干扰，测量电流产生波动。

6.电极表面各修饰物质固定不稳固，存在脱落风险。

这些问题导致电化学生物传感器的应用过程中性能不稳定、安全性存在隐患以及价格偏高，受到部分患者及使用人员的质疑。为此，如何建立性能稳定、安全、工艺成本低、可持续性使用的电化学生物传感器检测平台是目前的关键问题，急需对以上问题进行解决优化。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极，

本发明的技术方案如下：一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，包括如下步骤：

(1)在基底表面形成电极层：将电极材料成型在基底表面，以形成图形化电极、导电线路以及触点；所述电极系统包括至少一个对电极、一个工作电极和一个参比电极；

(2)在所述参比电极表面涂覆Ag/AgCl浆液，干燥，形成Ag/AgCl参比电极。

(3)工作电极表面修饰电子转移介体/催化剂：在工作电极表面通过计时电流法/循环伏安法电沉积普鲁士蓝，以形成电子转移介体。

(4)在工作电极表面形成酶层：将葡萄糖氧化酶溶于磷酸盐缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺进行处理，以使葡萄糖氧化酶表面的羧基活化。

(5)在工作电极表面浸渍或涂布或喷涂氨基化硅烷层，并以浸渍或涂布或喷涂的方式使活化后的葡萄糖氧化酶与硅烷层结合在一起，完成酶层的固定。

(6)在工作电极表面形成质量运输限制层：在工作电极表面涂覆聚乙二醇-聚氨酯共混液作为质量运输限制层，干燥后形成的聚乙二醇-聚氨酯薄膜能够起到限制葡萄糖运输速率的作用，以实现保证酶层氧气充足的目的。

(7)在工作电极表面形成抗干扰层：在工作电极表面涂覆Nafion溶液作为抗干扰涂层，干燥成膜，阻隔异物吸附在电极表面，避免电极工作性能急剧下降。

(8)在传感器电极端部形成生物相容性涂层：在工作电极表面涂覆聚乙烯吡咯烷酮溶液作为生物相容性涂层，干燥成膜，增加传感器电极的生物相容性。

(9)将修饰过各成分及涂层的电极端部整体浸入pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液中4-48h，使各成分及涂层之间充分结合，增强电极稳定性，得到制备完成的电化学生物传感器电极。

所述适用于分析物检测的电化学生物传感器电极，在衬底表面形成电极层，工作电极表面修饰电子转移介体/催化剂，以起到增强电子转移效率，降低传感器工作电位，在低电位下对分析物催化分解的作用。

进一步，在工作电极表面形成酶层，酶层起到对体系中的待检测分析物筛选识别、定向催化物质发生氧化还原反应，并将电子通过电子转移介体/催化剂为媒介传导至电极，以实现生化信号至电信号的转化。

进一步，在工作电极表面形成质量运输限制层，由于检测体系中氧气的含量波动会导致传感器电极采集信号受到影响，如氧气含量过高/过低时，传感器检测某些生化反应的灵敏度、线性范围、响应速度都会受到影响，因此需要质量运输限制层控制氧气/分析物在酶层含量的比率，以使生化反应稳定进行。

进一步，在工作电极表面形成抗干扰层，基于传感器电极端植入人体皮肤层中的分析，为避免长时间使用环境中的异物吸附包裹致使传感器的工作性能急剧下降，需在传感器电极表面形成抗干扰层。

进一步，基于可能的某些植入人体皮肤层的应用场景分析，为减少人体相关的排异反应以及传感器植入后周围皮肤组织的不适、发炎、过敏等现象出现，在传感器电极端部形成生物相容性涂层，以确保应用的安全性。

其中，制备的所述电化学生物传感器可检测的潜在分析物可以为乳酸、醇、酮、葡萄糖、胆红素、尿素、尿酸、胆固醇、乙酰胆碱、抗坏血酸、氨基酸、钠离子、钾离子、钙离子、氯离子、氧气、二氧化碳、pH、抗生素、谷氨酰胺等多种物质。

其中，所述基底可为柔性或刚性衬底，所述柔性衬底选自聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚烯烃、聚四氟乙烯等物质及以上各物质形成的共聚物，或者柔性玻璃薄片、柔性金属薄片、无机化合物氧化薄膜等；所述刚性衬底选自二氧化硅、金属、金属氧化物、硬质塑料、陶瓷、聚甲基丙烯酸甲酯、各类树脂等。

其中，所述电极系统具体包括至少一个对电极、一个工作电极和一个参比电极，电极系统可以为单对电极对应单工作电极或单对电极对应多工作电极系统，参比电极只起到提供参比电位的作用。电极位置关系可以为共面、异面以及异体式。所述电极材料可为是碳基材料、金属材料、无机化合物材料、有机生化材料等，具体的形成电极涂层的工艺方法可以是丝网印刷、喷涂、涂布、浸润干燥、溅射、电子束蒸镀等。

进一步形成的电子转移介体可以是基于锇、钌、铁、钴、钒等过渡金属元素的络合物，也可以是铁氰化物，还可以是二茂铁基衍生物等。

所形成的催化剂可以是铂、银、金、铅、镍、钴、钛、铱、钌等金属纳米材料。用于形成电子转移介体/催化剂的工艺方法可以是电镀、化学镀、溅射、浸润干燥、激光消融等。

进一步，形成的酶层材料依据针对的分析物不同所选用的酶也不同，以针对糖尿病血糖管理的重要标志物葡萄糖为例，可以选用葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶等酶修饰于工作电极表面。该酶层不一定由单个酶构成，也可由多种酶组成，例如特异性酶与过氧化物酶的组合等。其中，形成酶层的方式可以是物理吸附、交联、层层组装等，其中交联剂可以是戊二醛、硅烷偶联剂、琥珀酰亚胺类物质及碳二亚胺类物质等。

进一步形成的质量运输限制膜的材料可以是聚醚、聚脲、聚氨酯、聚乙烯吡啶、聚乙烯基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、Nafion聚合物、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂等物质及以上各物质间形成的共聚物。其中，形成质量运输限制层的工艺方法可以是喷涂、涂布、浸润干燥等。

进一步形成的抗干扰层材料可以是聚醚、聚脲、聚氨酯、聚乙烯吡啶、聚乙烯基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、Nafion聚合物等物质及以上各物质间形成的共聚物。其中，形成质量运输限制层的工艺方法可以是喷涂、涂布、浸润干燥等。

进一步形成的生物相容性涂层材料可以是聚乳酸、聚氨酯、聚脲、聚醚、聚烯烃、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、Nafion聚合物、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂类物质及以上各物质间形成的共聚物。

电子转移介体/催化剂和酶可以进行预连接并共同孵育在工作电极表面。

酶可以进行前处理以使酶舒展暴露相应活性位点。

酶和质量运输限制材料可进行预混并共同孵育在工作电极表面。

步骤(5)(6)(7)中的质量运输限制材料、抗干扰材料和生物相容性材料可预混并共同孵育在工作电极表面的同一层，也可一次进行，从而使得质量运输限制材料、抗干扰材料和生物相容性材料位于工作电极表面的不同层。

本发明的有益效果为：本发明中电化学生物传感器的参比电极面积较大，为Ag/AgCl提供了比较充足的作用面积以及储备量，能够延长传感器电极的使用寿命，增强电位稳定性，相当程度上避免了因氯离子流失所致参比电极损耗快而致使传感器失准的问题发生。

本发明中电化学生物传感器采用碳材料与聚合物基底作为电极与基底的选材，能够大幅降低生产成本并减少金属资源的浪费。

本发明中电化学生物传感器采用聚乙二醇与聚氨酯类物质形成的抗污层阻隔异物吸附电极，且使用硅烷偶联剂处理过的电极表面具有大量亲水基团，协助抗污涂层共同发挥作用，摆脱了牛血清白蛋白在电极表面的使用，避免了植入人体皮肤层时可能引发的排异反应。

本发明中电化学生物传感器采用叉指状电极设计，确保了工作电极与对电极间位置关系的紧密，以在电解质体系中构成稳定的导电回路，能够减小因电极回路不稳带来的信号波动噪声。

本发明中电化学生物传感器电极完成各层的制备及修饰后，在润湿环境或缓冲液环境中进行充分浸润，以使各层间充分结合，连接紧密。

附图说明：

图1为本发明所述电化学生物传感器电极的制备工艺流程图。

图2为步骤1制备的图形化电极、导电线路以及触点的示意图。

图3a为共面单电极示意图

图3b为共面多电极示意图。

图4a为异面式的电极的正面示意图。

图4b为异面式的电极的反面示意图。

图5为异体式的电极的示意图。

图6为工作电极、对电极和参比电极分别负载于三个基底的示意图

具体实施方式

为了使本发明的发明目的，技术方案及技术效果更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。应理解，此处所描述的具体实施例，仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1所示，一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，包括如下步骤：

(1)在聚酰亚胺基底表面进行丝网印刷碳浆电极，碳浆中碳纳米管的比例为1％～20％，待印刷完成，干燥以形成图形化碳电极、导电线路以及触点。关于电极、导电线路以及触点等的说明如图2所示，其中，叉指状两电极，也即电极1、电极2，分别为工作电极和对电极；方形电极，也即电极3，为参比电极。值得注意的是，本实施例中所说明的只为优选的结果，电极之间彼此可以交换，例如电极1也可为对电极或参比电极，电极2也可为工作电极或参比电极，电极3也可为工作电极或对电极。每个电极与一个触点相连，电极与对应触点之间具有至少一条导电线路。各电极整体所构成的区域为检测区域，也即实际应用中发挥检测作用的区域。各触点整体所构成的区域为触点区域，也即实际应用中与外界电气设备进行电气连接的区域。其中，工作电极可以为一个或多个，如图3a所示为共面单电极的示意图，如图3b所示为共面多电极的示意图，除工作电极外至少各存在一个对电极和一个参比电极。如图4a和图4b所示,电极的位置关系也可为异面式，例如工作电极、对电极和参比电极位于基底正反两侧。如图5所示,电极的位置关系也可为异体式，工作电极、对电极和参比电极分别负载于三个基底。

(2)在参比电极表面涂覆Ag/AgCl浆液，干燥，形成Ag/AgCl参比电极。

(3)在工作电极表面通过计时电流法/循环伏安法电沉积普鲁士蓝，以形成电子转移介体。

(4)将葡萄糖氧化酶溶于磷酸盐缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺进行处理，以使葡萄糖氧化酶表面的羧基活化。

(5)在工作电极表面浸渍或涂布或喷涂氨基化硅烷层，并以浸渍或涂布或喷涂的方式使活化后的葡萄糖氧化酶与硅烷层结合在一起，完成酶层的固定。

(6)在工作电极表面涂覆聚乙二醇-聚氨酯共混液作为质量运输限制层，干燥后形成的聚乙二醇-聚氨酯薄膜能够起到限制葡萄糖运输速率的作用，以实现保证酶层氧气充足的目的。

(7)在工作电极表面涂覆Nafion溶液作为抗干扰涂层，干燥成膜，阻隔异物吸附在电极表面，避免电极工作性能急剧下降。

(8)在工作电极表面涂覆聚乙烯吡咯烷酮溶液作为生物相容性涂层，干燥成膜，增加传感器电极的生物相容性。

(9)将修饰过各成分及涂层的电极端部整体浸入pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液中4-48h，使各成分及涂层之间充分结合，增强电极稳定性，得到制备完成的电化学生物传感器电极，其示意如图6所示，其中，物质1代表基底，物质2代表电子转移介体/催化剂，物质3代表酶层，物质4代表质量运输限制层，物质5代表抗干扰层，物质6代表生物相容性涂层。

所述电化学生物传感器电极的搭配中空不锈钢微针辅助刺破皮肤，可植入皮肤层，通过触点进一步与电气设备相连，对传感器施加工作电压，采集测量数据，对数据进行后处理，可实现人体持续葡萄糖测量。

实施例2

与实施例1不同的在于：

步骤(1)中，在聚对苯二甲酸乙二醇酯基底表面进行丝网印刷碳浆电极。

步骤(3)中，在工作电极表面通过计时电流法沉积银纳米粒子作为催化剂。

步骤(5)中，在工作电极表面固定乳酸氧化酶作为酶层。

步骤(7)中，在工作电极表面涂覆聚乙二醇-聚氨酯-Nafion共混液，干燥成膜，作为质量运输限制层以及抗干扰涂层。

骤(8)中，在工作电极表面涂覆聚乳酸作为生物相容性涂层。

本实施例制备的电化学生物传感器电极可用于人体血液/体液中的乳酸检测。

实施例3

与实施例1不同的在于：

步骤(1)中，在聚二甲基硅氧烷基底表面进行丝网印刷碳浆电极，掺杂1％～20％的含有氨基/羧基/羟基/琥珀酰亚胺基等活性基团的碳纳米管。

步骤(4)中，将葡萄糖氧化酶与锇络合物预先共混，将锇络合物负载到葡萄糖氧化酶表面。

步骤(5)中，在工作电极表面偶联负载有锇络合物的葡萄糖氧化酶作为电子转移介体-酶层。

步骤(7)中，在工作电极表面涂覆聚氨酯-聚脲嵌段共聚物作为质量运输限制层和抗干扰层。

步骤(8)中，在工作电极表面涂覆聚乙烯吡啶-苯乙烯共聚物作为生物相容性涂层。

实施例4

与实施例1不同的在于：

步骤(3)中，在工作电极表面浸润二茂铁溶液，干燥形成二茂铁电子转移介体。

步骤(5)中，在工作电极表面固定乳酸氧化酶作为酶层。

步骤(7)中，在工作电极表面涂覆聚乙二醇-聚氨酯-Nafion共混液，干燥成膜，作为质量运输限制层以及抗干扰涂层。

步骤(8)中，无需生物相容性涂层。

本实施例制备的电化学生物传感器电极可用于体外检测液相体系中的乳酸成分。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在基底表面形成电极层：将电极材料成型在基底表面，以形成图形化电极系统、导电线路以及触点；所述电极系统包括至少一个对电极、一个工作电极和一个参比电极；每个所述电极与一个所述触点相连，所述电极与对应所述触点之间具有至少一条所述导电线路；各所述电极整体所构成的区域为检测区域；各所述触点整体所构成的区域为触点区域，也即与外界电气设备进行电气连接的区域；

(2)在所述参比电极表面涂覆Ag/AgCl浆液，干燥，形成Ag/AgCl参比电极；

(3)在所述工作电极表面修饰电子转移介体或催化剂；

(4)在所述工作电极表面形成酶层；

(5)在所述工作电极表面形成质量运输限制层：

(6)在所述工作电极表面形成抗干扰层；

(7)在所述工作电极的传感器电极端部形成生物相容性涂层；

(8)将修饰后的电极整体浸入pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液中4-48h，使各成分及涂层之间充分结合，增强所述电极稳定性，得到制备完成的电化学生物传感器电极。

2.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，所述基底可为柔性或刚性衬底；所述柔性衬底选自聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚烯烃、聚四氟乙烯或其任意共聚物，或者柔性玻璃薄片、柔性金属薄片、无机化合物氧化薄膜等；所述刚性衬底选自二氧化硅、金属、金属氧化物、硬质塑料、陶瓷、聚甲基丙烯酸甲酯、树脂或其任意共聚物；

所述电极材料选自碳基材料、金属材料、无机化合物材料、有机生化材料中的一种，所述成型电极涂层的方法是丝网印刷、喷涂、涂布、浸润干燥、溅射或电子束蒸镀；

所述电极系统的位置关系为共面、异面以及异体式。

3.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，所述电子转移介体选自过渡金属元素锇、钌、铁、钴、钒的络合物，或铁氰化物，二茂铁基衍生物；所述催化剂选自铂、银、金、铅、镍、钴、钛、铱、钌金属纳米材料；用于形成电子转移介体/催化剂的工艺方法为电镀、化学镀、溅射、浸润干燥或激光消融。

4.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，在工作电极表面形成酶层的方式是物理吸附、交联、层层组装，其中交联剂选自戊二醛、硅烷偶联剂、琥珀酰亚胺类物质或碳二亚胺。

5.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，在工作电极表面形成质量运输限制层的材料选自聚醚、聚脲、聚氨酯、聚乙烯吡啶、聚乙烯基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、Nafion聚合物、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂及其任意共聚物；在工作电极表面形成质量运输限制层的方法是喷涂、涂布或浸润干燥。

6.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，在工作电极表面形成抗干扰层的材料选自聚醚、聚脲、聚氨酯、聚乙烯吡啶、聚乙烯基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、Nafion聚合物及其任意的共聚物；在工作电极表面形成抗干扰层的方法是喷涂、涂布或浸润干燥。

7.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，在工作电极表面形成生物相容性涂层的材料选自聚乳酸、聚氨酯、聚脲、聚醚、聚烯烃、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、Nafion聚合物、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂及其任意共聚物。

8.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，步骤(2)后，将电子转移介体/催化剂和酶进行预连接并共同孵育在工作电极表面，而后进行步骤(5)。

9.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，步骤(3)后，酶和质量运输限制材料进行预混并共同孵育在工作电极表面；而后进行步骤(6)。

10.如权利要求1所述的适用于分析物检测的电化学生物传感器电极的其制备方法，其特征在于，步骤(5)(6)(7)中的质量运输限制材料、抗干扰材料和生物相容性材料可预混并共同孵育在工作电极表面的同一层。