CN117535364B - 一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用，包括取毕赤酵母GS115，接种至诱导培养基中，进行磁化诱导处理后，加入甲醇溶液，进行二次磁化诱导处理，接种量接种至扩大培养基中，培养，将扩大培养液接种至发酵培养基中，培养，离心，取上清液，进行纯化除盐，得目标重组胶原蛋白。本发明纯化获得的重组胶原蛋白具有良好的抗氧化能力，其对DPPH自由基的清除率达到76％；该重组胶原蛋白可应用于表皮创面敷料，其不被表皮所吸收，符合Ⅱ类医用敷料应用的要求，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白生产技术领域，特别涉及一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。通过各个技术的研发与突破，重组胶原蛋白从最初的护肤性产品，已经扩展到了医疗器械、组织工程、保健食品等领域。目前，重组胶原蛋白的应用范围在逐步扩大，也加大了对重组胶原蛋白和下游产品的市场需求。有研究数据显示，在2022年我国重组胶原蛋白的市场规模达到185亿元，同比增长71.3％，预计到2027年，重组胶原蛋白的市场规模将达到1083亿元。目前来看，我国的重组胶原蛋白行业具有良好的发展前景。
目前，现有的重组类胶原蛋白的发酵方法是通过毕赤酵母进行发酵而得，通常是加入甲醇进行诱导毕赤酵母表达，这样容易导致重组类胶原蛋白残留有甲醇，增加了该重组胶原蛋白下游产品的甲醇毒性。同时，现有技术对毕赤酵母诱导发酵获得的重组类胶原蛋白的抗氧化能力研究较少。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明一方面提供一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，包括如下步骤：
S1取毕赤酵母GS115，以1～2％接种量接种至诱导培养基中，以27～28℃培养15～20h，得培养液；
S2取培养液，以1～2％接种量接种至扩大培养基中，以27～28℃、200～220rpm培养40～55h，得扩大培养液；
S3将扩大培养液以4～5％接种量接种至发酵培养基中，进行一次磁化诱导处理后，加入甲醇溶液，进行二次磁化诱导处理，以27～28℃培养20～25h，离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；
S4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，得目标重组胶原蛋白。
进一步的方案是，两次磁化诱导处理包括：将发酵培养基置于磁场中，以磁场强度100～150mT进行磁化处理20～60min。
更进一步的方案是，一次磁化诱导处理的磁场强度为150mT，磁化处理的时间为20min，二次磁化诱导处理的磁场强度为100mT，磁化处理的时间为60min。
进一步的方案是，所述甲醇溶液的体积浓度为2～5％，每1L所述发酵培养基添加甲醇溶液的量为80～100mL。
进一步的方案是，每1L所述诱导培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.1～2.5g、葡萄糖2.1～2.5g、乙酰肌肽180～220μg和混合液0.8～1.2g；
每1L所述扩大培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.5～2.8g和葡萄糖3～4g；
每1L所述发酵培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.1～2.5g、葡萄糖2.1～2.5g和混合液0.8～1.2g；
所述混合液包括七水合硫酸亚铁0.8～1.2g/L、七水合硫酸锌0.2～2g/L、磷酸二氢钾1.5～2.5g/L、一水合硫酸锰0.2～0.5g/L和生物素0.05～0.08g/L。
进一步的方案是，步骤S3中，所述培养20～50h还包括发酵前段6～10h、发酵中段8～20h和发酵后段6～20h。
所述发酵前段6～10h，使发酵液的溶氧量保持25～30％；
所述发酵中段8～20h，使发酵液的溶氧量保持35～40％，开始以流速梯度的方式进行补料发酵，以初始速率5～6mL/h/L流加葡萄糖溶液，以速率5～6mL/h/L进行梯度递增，最终保持25～28mL/h/L的流加速率，同时流加乙酰肌肽；
所述发酵后段6～20h，将流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12～15mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/L时，进行出料处理，出料处理后，以速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液至发酵结束。
更进一步的方案是，所述发酵中段8.1～15h，速率每隔50～60min递增一次；所述发酵后段15.1～25h，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％。
更进一步的方案是，流加乙酰肌肽至发酵液中的乙酰肌肽的浓度为250～300μg/L。
本发明还提供上述的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法得到的医用重组胶原蛋白。
此外，本发明还进一步提供上述的医用重组胶原蛋白在医用化妆品中的应用，该医用重组胶原蛋白可作为清除DPPH自由基的抗氧化剂，应用在医用化妆品中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明依次通过诱导培养基进行磁化诱导处理，扩大培养基的培育和发酵培养基的三段式培养发酵模式，结合流速梯度的补料方式与恒速补料和出料的发酵模式，并调控各步骤的发酵参数，纯化获得的重组胶原蛋白具有良好的抗氧化能力；该重组胶原蛋白可应用于表皮创面敷料，其不被表皮所吸收，符合Ⅱ类医用敷料应用的要求，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。
2、本发明通过在毕赤酵母的三段式培养发酵模式前，结合一次性甲醇进行磁化诱导处理，有助于提高毕赤酵母的发酵效率，通过发酵阶段流加乙酰肌肽可减少中间代谢物的毒性作用，提高生产率和细胞密度。
3、本发明对毕赤酵母的发酵诱导培养的工艺方法较为简单，通过控制发酵模式可达到较为理想的医用重组胶原蛋白，容错率极小，利于生产质量的控制。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的重组胶原蛋白的紫外线扫描图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，购买于美国Invitrogen公司。
实施例1-培养基成分
每1L诱导培养基的组分为：酵母粉1.0g、蛋白胨2.2g、葡萄糖2.2g、乙酰肌肽200μg和混合液1.0g；
每1L扩大培养基的组分为：酵母粉1.0g、蛋白胨2.7g和葡萄糖3.5g；
每1L发酵培养基的组分为：酵母粉1.0g、蛋白胨2.2g、葡萄糖2.2g和混合液1.0g；
其中，混合液组分如下：
| 组分 | FeSO4·7H2O | ZnSO4·7H2O | KH2PO4 | MnSO4·H2O | VH |
| 用量g/L | 1.0 | 1.2 | 2.0 | 0.35 | 0.07 |
实施例2-医用重组胶原蛋白的发酵生产方法
步骤如下：
S1取毕赤酵母GS115，以1～2％接种量接种至诱导培养基中，在27～28℃的温度条件下培养18h，得培养液；
S2取培养液，以1～2％接种量接种至扩大培养基中，在27～28℃的温度条件下，以200～220rpm的振荡频率进行振荡培养40～55h，得扩大培养液；
S3将扩大培养液以4～5％接种量接种至发酵培养基中，将发酵培养基置于磁场，以磁场强度150mT进行磁化诱导处理20min后，降低磁场强度至100mT，进行长时间的磁化诱导处理60min，同时避免过长时间导致菌体裂解死亡，磁化诱导处理后，在27～28℃的温度条件下，将发酵培养分为发酵前段、发酵中段和发酵后段的三段培养发酵模式，每段培养发酵模式如下：
设置10h为发酵前段，通过搅拌和通风操作，使发酵液中的溶氧量保持在25～30％，补料易降低溶氧量，此阶段不进行补料操作；
而后设置20h为发酵中段，为弥补溶氧量的降低，此时通过搅拌和通风操作提高发酵液中的溶氧量至35～40％，同时，以流速梯度的方式开始进行补料发酵，以初始速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，速率每隔60min递增一次，以速率5～6mL/h/L进行梯度递增，最终使葡萄糖溶液的流加速率保持在25～28mL/h/L的范围，在流加葡萄糖溶液时进行恒速流加体积浓度3％的甲醇溶液，流加速率为5～6mL/h/L；
最后设置20h为发酵后段，将葡萄糖的流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12～15mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/L时，进行出料处理，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％，出料处理后，以速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液至发酵结束，体积浓度3％的甲醇溶液以流加速率为5～6mL/h/L至发酵结束。
发酵结束后，将发酵培养液进行离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；
S4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，冷冻干燥，得目标重组胶原蛋白。
实施例3-医用重组胶原蛋白的发酵生产方法
步骤如下：
S1取毕赤酵母GS115，以1～2％接种量接种至诱导培养基中，在27～28℃的温度条件下培养18h，得培养液；
S2取培养液，以1～2％接种量接种至扩大培养基中，在27～28℃的温度条件下，以200～220rpm的振荡频率进行振荡培养45h，得扩大培养液；
S3将扩大培养液以4～5％接种量接种至发酵培养基中，将发酵培养基置于磁场，以磁场强度150mT进行磁化诱导处理20min后，每1L诱导培养基中添加体积浓度3％的甲醇溶液100mL，降低磁场强度至100mT，进行长时间的磁化诱导处理60min，同时避免过长时间导致菌体裂解死亡，磁化诱导处理后，在27～28℃的温度条件下，将发酵培养分为发酵前段、发酵中段和发酵后段的三段培养发酵模式，每段培养发酵模式如下：
设置10h为发酵前段，通过搅拌和通风操作，使发酵液中的溶氧量保持在25～30％，补料易降低溶氧量，此阶段不进行补料操作；
而后设置20h为发酵中段，为弥补溶氧量的降低，此时通过搅拌和通风操作提高发酵液中的溶氧量至38～40％，同时，以流速梯度的方式开始进行补料发酵，以初始速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，速率每隔60min递增一次，以速率5～6mL/h/L进行梯度递增，最终使葡萄糖溶液的流加速率保持在25～28mL/h/L的范围，在流加葡萄糖溶液时进行流加乙酰肌肽，至发酵液中的乙酰肌肽的浓度达到250～300μg/L的范围即可；
最后设置20h为发酵后段，将流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12～15mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/L时，进行出料处理，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％，出料处理后，以速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液至发酵结束。
发酵结束后，将发酵培养液进行离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；
S4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，冷冻干燥，得目标重组胶原蛋白。
由图1看出，在紫外线的扫描图中，实施例3目标重组胶原蛋白在280nm处基本上没有吸收峰，其分子内部不存在共轭双键，在200～220nm处有一吸收峰，存在肽键。
对比例1-医用重组胶原蛋白的发酵生产方法
步骤如下：
S1取毕赤酵母GS115，以1～2％接种量接种至诱导培养基中，在27～28℃的温度条件下培养18h，得培养液；
S2取培养液，以1～2％接种量接种至扩大培养基中，在27～28℃的温度条件下，以200～220rpm的振荡频率进行振荡培养45h，得扩大培养液；
S3将扩大培养液以4～5％接种量接种至发酵培养基中，在27～28℃的温度条件下，将发酵培养分为发酵前段、发酵中段和发酵后段的三段培养发酵模式，每段培养发酵模式如下：
设置10h为发酵前段，通过搅拌和通风操作，使发酵液中的溶氧量保持在25～30％，补料易降低溶氧量，此阶段不进行补料操作；
而后设置20h为发酵中段，为弥补溶氧量的降低，此时通过搅拌和通风操作提高发酵液中的溶氧量至38～40％，同时，以流速梯度的方式开始进行补料发酵，以初始速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液和体积浓度3％甲醇溶液，速率每隔60min递增一次，以速率5～6mL/h/L进行梯度递增，最终使葡萄糖溶液的流加速率保持在25～28mL/h/L的范围；
最后设置20h为发酵后段，将流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12～15mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/L时，进行出料处理，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％，出料处理后，以速率5～6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液至发酵结束，体积浓度3％的甲醇溶液以流加速率为5～6mL/h/L至发酵结束。
发酵结束后，将发酵培养液进行离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；
S4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，冷冻干燥，得目标重组胶原蛋白。
试验例1-重组胶原蛋白的抗氧化分析
(1)对DPPH自由基的清除作用
制备质量浓度8.0mg/mL的重组胶原蛋白样品，在1mL的DPPH溶液中加入1mL样品，迅速混匀，室温下避光静置30min，作为实验组，在1mL的无水乙醇溶液中加入1mL样品作为空白组，在1mL的无水乙醇溶液中加入1mL的DPPH溶液作为对照组，静置反应后于517nm下测定吸光度值，计算公式如下：
DPPH自由基的清除率(％)＝[(A0-A1+A2)/A0]×100％，其中，A0为对照组的吸光度值，A1为实验组的吸光度值，A1为空白组的吸光度值。
(2)重组胶原蛋白的抗氧化结果
重组胶原蛋白对DPPH自由基的清除作用结果如下表：
由上表可知，实施例2和3的重组胶原蛋白对DPPH自由基具有一定的清除力，清除率达到68％和76％，表明依次通过诱导培养基进行磁化诱导处理，扩大培养基的培育和发酵培养基的三段式培养发酵模式，结合流速梯度的补料方式与恒速补料和出料的发酵模式，并调控各步骤的发酵参数，纯化获得的重组胶原蛋白具有良好的抗氧化能力；实施例2与实施例3相比，通过多次的甲醇诱导获得的重组胶原蛋白，其对DPPH自由基的清除率反而有所降低，也说明通过在毕赤酵母的三段式培养发酵模式前，结合一次性甲醇进行磁化诱导处理，有助于提高毕赤酵母的发酵效率；对比例1与实施例3相比，通过发酵阶段流加乙酰肌肽可减少中间代谢物的毒性作用，提高生产率和细胞密度，避免成熟菌体产生破损、破坏等问题，导致发酵效率降低。
试验例2-重组胶原蛋白的透皮吸收分析
依据《化学品皮肤吸收体外试验方法》(GB/T 27818-2011)，测试重组胶原蛋白的透皮吸收效果，取完整的仔猪腹部皮肤作为动物皮肤标本，采用手术刀将该动物皮肤标本制造约4mm长的创面，扩散池和接收池选用pH7.0的磷酸缓冲溶液，受试物为质量浓度0.1％、1％和5％的实施例3的重组胶原蛋白，试验24h后，收集接受液采用高效液相色谱检测重组胶原蛋白的含量，结果如下表：
| 项目 | 0.1％ | 1％ | 5％ |
| 透皮量 | - | - | - |
注：-表示未检出
由上表可知，经过24h的透皮吸收试验，重组胶原蛋白未出现创面皮肤的透皮吸收现象，接受液中的重组胶原蛋白的含量未检出，表明该重组胶原蛋白可应用于表皮创面敷料，其不被表皮所吸收，符合Ⅱ类医用敷料应用的要求，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。可见，依次通过诱导培养基进行磁化诱导处理，扩大培养基的培育和发酵培养基的三段式培养发酵模式，结合流速梯度的补料方式与恒速补料和出料的发酵模式，并调控各步骤的发酵参数，纯化获得的重组胶原蛋白，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1取毕赤酵母GS115，以1~2%接种量接种至诱导培养基中，以27~28℃培养15~20h，得培养液；
S2取培养液，以1~2%接种量接种至扩大培养基中，以27~28℃、200~220rpm培养40~55h，得扩大培养液；
S3将扩大培养液以4~5%接种量接种至发酵培养基中，进行一次磁化诱导处理后，加入甲醇溶液，进行二次磁化诱导处理，在27~28℃的温度条件下，将发酵培养分为发酵前段6~10h、发酵中段8~20h和发酵后段6~20h的三段培养模式，离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；
一次磁化诱导处理的磁场强度为150 mT，磁化处理的时间为20 min，二次磁化诱导处理的磁场强度为100 mT，磁化处理的时间为60 min；
所述发酵前段6~10h，使发酵液的溶氧量保持25~30%；
所述发酵中段8~20h，使发酵液的溶氧量保持35~40%，开始以流速梯度的方式进行补料发酵，以初始速率5~6mL/h/L流加葡萄糖溶液，以速率5~6mL/h/L进行梯度递增，最终保持25~28mL/h/L的流加速率，同时流加乙酰肌肽；
所述发酵后段6~20h，将流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12~15mL/h/L进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/L时，进行出料处理，出料处理后，以速率5~6mL/h/L进行流加葡萄糖溶液至发酵结束；
每1L所述诱导培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8~1.2 g、蛋白胨2.1~2.5 g、葡萄糖2.1~2.5 g、乙酰肌肽180~220 µg和混合液0.8~1.2 g；
每1L所述扩大培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8~1.2 g、蛋白胨2.5~2.8 g和葡萄糖3~4 g；
每1L所述发酵培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8~1.2 g、蛋白胨2.1~2.5 g、葡萄糖2.1~2.5 g和混合液0.8~1.2 g；
所述混合液包括七水合硫酸亚铁0.8~1.2g/L、七水合硫酸锌0.2~2g/L、磷酸二氢钾1.5~2.5g/L、一水合硫酸锰0.2~0.5g/L和生物素0.05~0.08g/L；
S4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，得目标重组胶原蛋白。
2.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，所述甲醇溶液的体积浓度为2~5%，每1L所述发酵培养基添加甲醇溶液的量为80~100 mL。
3.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵中段8.1~15h，速率每隔50~60min递增一次；所述发酵后段15.1~25h，出料的体积量为总发酵液体积量的10~12%。
4.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，流加乙酰肌肽至发酵液中的乙酰肌肽的浓度为250~300 µg/L。
5.一种根据权利要求1~4任意一项的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法得到的医用重组胶原蛋白。
6.一种根据权利要求5所述的医用重组胶原蛋白在医用化妆品中的应用，其特征在于，所述医用重组胶原蛋白作为清除DPPH自由基的抗氧化剂的应用。
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