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CN117500940A - 原钙粘蛋白在诊断和治疗癌症的方法中的用途 - Google Patents

原钙粘蛋白在诊断和治疗癌症的方法中的用途 Download PDF

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CN117500940A
CN117500940A CN202280031193.XA CN202280031193A CN117500940A CN 117500940 A CN117500940 A CN 117500940A CN 202280031193 A CN202280031193 A CN 202280031193A CN 117500940 A CN117500940 A CN 117500940A
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cancer
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Reverse Biotechnology Co
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Abstract

公开了用于靶向成簇的原钙粘蛋白以获得治疗作用的组合物和方法。更具体地，公开了在不同癌症类型中修饰在α、β和γ簇中选择的亚型以促进组织再生或靶向和减少肿瘤负荷的组合物和方法。这些方法在兽医和人类医学中都有应用。

Description

原钙粘蛋白在诊断和治疗癌症的方法中的用途
相关申请
本申请要求2021年3月2日提交的美国临时申请号63/155,631；和2021年11月2日提交的美国临时申请号63/274731的优先权；其每一个的全部内容通过引用明确地并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节哺乳动物内的细胞中成簇的原钙粘蛋白亚型的活性以达到治疗作用的组合物和方法。更具体地，描述了改变哺乳动物细胞中所述亚型的相对水平以诱导组织再生或诊断和治疗癌症的方法和制剂。此外，公开了刺激身体对所述亚型的免疫应答以产生对癌症的免疫治疗应答的组合物和方法。
背景技术
干细胞技术的进步，如人多能干(hPS)细胞的分离和体外繁殖，构成了医学研究的一个重要的新领域。hPS细胞具有在未分化状态下繁殖，然后随后被诱导分化为人体中的任何和所有细胞类型，包括复杂组织的潜力。例如，这导致了对很多由细胞功能障碍引起的疾病的预测，这些疾病可以通过施用来源于各种分化类型的人类胚胎干细胞来治疗17。
关于将hPS细胞分化为所需的细胞类型，克隆分离人胚胎祖细胞系的潜力提供了一种方法来繁殖新的高度纯化的细胞谱系，更具体地，胎儿前(胚胎)的基因表达模式可用于以无瘢痕的方式再生组织，如皮肤。这种细胞类型在研究和制造基于细胞的疗法中有重要应用(参见PCT申请系列号PCT/US2006/013519；美国专利申请系列号11/604,047；和美国专利申请系列号12/504,630，其每一个的全部内容通过引用并入本文)。
最近，多能干细胞和衍生的胚状体在体外自组装成三维类器官的潜力作为获得用于移植的组织的潜在途径(Singh等，Stem Cells Dev.2015.24(23):2778-95)以及对人类胚胎发育进行建模引起了人们的兴趣。而与胚胎细胞相比，胎儿和成人来源的细胞通常显示出这种类器官形成、体外器官发生和体内割处再生的潜力降低。割处再生，有时称为“表变态”指一种组织再生类型，其中相对未分化的间充质的芽基在损伤部位增殖，随后原始组织组织学无瘢痕再生。
割处再生潜能丧失的发育时间无法精确确定，可能因组织类型而异，然而，胚胎-胎儿过渡期(EFT)或人类发育的八周(Carnegie Stage23；O’Rahilly,R.,F.Müller(1987)Developmental Stages in Human Embryos,Including a Revision of Streeter’s‘Horizons’and a Survey of the Carnegie Collection.Washington,CarnegieInstitution of Washington)似乎在时间上与胎盘哺乳动物的皮肤再生丧失相对应(Walmsley,G.G.等，2015.Scarless Wound Healing:Chasing the Holy Grail PlastReconstr Surg.135(3):907-17)。我们此前已披露，与瘢痕形成相反，组织再生反映了胚胎的存在，而不是胎儿或成人表型(参见PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601、PCT/US2017/036452和PCT/US2020/025512，其每一个的全部内容通过引用并入本文)。早期对胚胎学细胞基础的研究表明，组织形态发生的复杂性必须采用精确的细胞-细胞识别机制1,2。这样的程序对于生成细胞类型的一致性、与特定相邻细胞的关联以及形成离散边界似乎是必要的。这种细胞-细胞识别和粘附的证据始于H.V.Wilson的开创性研究，其首次报道了海绵从解离细胞中自发重新结合和再生3。
携带越来越广泛的分化细胞类型的更复杂生物体的进化可以说在更大程度上取决于这一现象。Johannes(Hans)Holtfrieter将这种选择性粘附称为“组织亲和力”，并在1939年提出理论“……在发育过程中，各种细胞类型之间存在吸引和排斥现象，且有关该系统的信息将产生有关器官发生过程中组织移位和分离的有价值的信息”。作为这些早期研究的结果，阐明差异细胞-细胞粘附在形态发生过程中的作用被广泛认为是发育生物学中的一个里程碑，与Spemann和Mangold对组织者的发现相当4。
在20世纪50年代，实验胚胎学家将这些研究扩展到小鸡胚胎发育。胚胎原质的再生性质被广泛用于实验性胚胎移植研究，如从鹌鹑到鸡的胚胎组织交叉移植。对分解的肢芽软骨细胞和肌细胞以及胚胎中肾和视网膜的研究可以毫无损伤地重新结合和再生，然而，在发育过程的后期，聚集明显减少5,6。这导致胚胎发生过程中细胞-细胞粘附调节的发育抑制和再生潜力丧失的“为什么”和“如何”的问题。
为了回答“为什么”自然选择会在衰老后的发育过程中抑制再生的问题，GeorgeWilliams提出了“拮抗性多效性”的模型，部分原因是为了解释为什么“在看似奇迹般的形态发生壮举之后，复杂的后生动物应该无法执行简单得多的任务，即仅仅维持已经形成的东西7”。该理论认为，在生命周期的生殖期早期，根据其价值选择的一些性状在生殖后几年会产生不利影响。一个例子是胚胎发育早期端粒酶表达几乎全部抑制，以及约90％的癌症类型中TERT基因的重新表达(TERT)8。TERT的抑制可能降低生命早期患恶性肿瘤的风险，但可能导致生命后期细胞衰老。
William Dreyer、William Gray和Leroy Hood于1967年在一篇关于免疫球蛋白多样性分子基础的主要理论论文中首次设想了差异性胚胎细胞粘附的“如何”调节。他们提出，在进化过程中，可能选择了一个复杂的细胞粘附分子家族来产生不同的抗体。9”1999年，William Dreyer提出，逆转录转座事件进化出一个复杂的“区域编码”细胞粘附分子家族，其可能包括免疫球蛋白、原钙粘蛋白和嗅觉受体，这些受体调节发育的复杂性10。
成簇的原钙粘蛋白基因座(CPL)的特征揭示了这样一个与免疫球蛋白基因座类似的预测的复杂连续基因家族，其包含很多可变的外显子，这些外显子可以与恒定外显子结合，以形成一个极其复杂的细胞粘附界面阵列11。超家族成员基因排列在三个簇中，分别命名为Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ。α和γ簇具有编码钙粘蛋白胞外域、一个跨膜结构域和短胞质结构域的可变外显子。而相反的是，β簇包含独特的单外显子基因。在智人中，有15个α、15个β和22个γ结构域。每个可变结构域前面都有一个启动子区。当PCDH构建图在K562细胞中表达时，这些蛋白在反式中产生同源性结合，如细胞聚集的诱导所证明的12,13。在神经元中，以双等位基因方式随机激活亚型可以产生巨大的复杂性14。据估计，单独的PCDHγ基因的Cis组合在独特的细胞界面中产生了>105的多样性。
根据他的假设，William Dreyer在1999年提出，逆转录转座事件进化出一个复杂的粘附分子家族，其调节CNS的发育，包括嗅球中的突触。随后，大多数关于CPL同源性相互作用的研究都集中在神经元的自我识别15和回路组装上12。虽然钙粘蛋白在细胞粘附和发育中的作用已经得到证实16，但CPL在CNS外的形态发生和割处再生中的潜在作用尚未阐明。
人类胚胎干细胞系的分离提供了多种人类细胞类型的体外来源，包括那些能够通过自发形成胚胎体和类器官来证明的胚胎细胞粘附的细胞17,18。利用克隆纯化的祖细胞系作为胚胎-胎儿转变(EFT)前细胞早期再生表型的模型，我们将深度神经网络算法应用于相对大量的胚胎与成年细胞和组织样品的转录组数据，并报道了EFT前后差异表达的假定基因19(参见PCT申请系列号PCT/US2017/036452，其全部内容通过引用并入本文)。在EFT前基因中有细胞粘附基因PCDHB2(参见，同上)。
我们此前公开了与哺乳动物物种中EFT标志物相关的组合物和方法，以及其在调节组织再生中的用途(参见，例如，PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601、PCT/US2017/036452、PCT/US2020/025512和美国专利申请系列号14/896,664，其每一个的全部内容通过引用并入本文)，其公开内容的全部内容通过引用并入本文。在这里，我们公开了与成人正常和癌症细胞系相比，胚胎祖细胞中CPL亚型的令人吃惊的差异表达，以及改变CPL表达以获得治疗作用的组合物和方法。
发明内容
本公开提供了可用于改变在哺乳动物细胞中成簇的原钙粘蛋白基因座的选择亚型的水平的化合物、组合物和方法。用于改变所述亚型表达的组合物和方法旨在改变所述细胞和/或组织的胚胎或胎儿/成人表型以改变细胞和/或组织中再生的自然潜力，改变所述细胞和/或组织中的老化，以及通过诱导癌细胞的成熟(诱导癌症成熟(iCM))或将成熟的癌细胞重变成回到胚胎样状态以诱导癌症干细胞中的去衰老细胞(senolysis)(iS-CSC)来改变癌细胞。本发明的组合物和方法还用于筛选在调节细胞的胚胎或胎儿/成人表型方面的功效的分子，以及用于产生用于所述研究的动物模型。在本发明中用于改变基因表达的方法包括改变参与胚胎-胎儿转变(EFT)的调节性非编码RNA和mRNA的方法，包括基因疗法、基于RNA和miRNA的疗法以及基于小分子的疗法。
根据一个方面，本公开提供了一种用于在受试者的细胞或组织中诱导哺乳动物组织再生的方法，其包括步骤：1)将细胞和/或组织与试剂接触以在一个或多个成簇的原钙粘蛋白基因座内诱导常染色质状态；和2)将细胞和/或组织与选自以下的一种或多种因子接触：OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A、LIN28B和TERT，其中所述一种或多种因子能够在不诱导多能性的情况下恢复基因表达的胚胎模式。
在一些实施方式中，试剂是组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂。在一些实施方式中，组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂是SUV39H1、SUV39H2、SETDB1或其组合。
在一些实施方式中，组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂是针对一种或多种组蛋白H3K9甲基转移酶的siRNA。在一些实施方式中，载体包含编码siRNA的序列。在一些实施方式中，载体是质粒。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体。
在一些实施方式中，受试者是人。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者的细胞或组织中诱导哺乳动物组织再生的方法，其包括步骤：1)使用组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂将细胞和/或组织与试剂接触以在一个或多个成簇的原钙粘蛋白基因座内诱导常染色质状态；和2)将细胞和/或组织与化学iTR诱导物接触，所述iTR诱导物选自以下：糖原合成酶3抑制剂(GSK3)、TGF-β信号转导抑制剂、HDAC抑制剂、H3K4/9组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂、Dot1L抑制剂、G9a抑制剂、Ezh2抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、3’磷酸肌醇依赖性激酶1的激活剂、糖酵解促进剂、RAR激动剂、模拟缺氧的药剂、端粒酶激活剂、MAPK/ERK途径抑制剂或其组合，从而使胎儿或成人来源的细胞恢复到其胚胎对应物，而不使所述组织中的细胞恢复为多能干细胞。在一些实施方式中，步骤1和步骤2是在体外进行的。在一些实施方式中，步骤1和步骤2是在体内进行的。在一些实施方式中，iTR诱导物包括能够在其他条件下提高体细胞类型中诱导多能性的效率，即在产生iPS细胞中的那些。
在一些实施方式中，组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂是SUV39H1、SUV39H2、SETDB1或其组合。
在一些实施方式中，组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂是针对一种或多种组蛋白H3K9甲基转移酶的siRNA。在一些实施方式中，载体包含编码siRNA的序列。在一些实施方式中，载体是质粒。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体。
在一些实施方式中，受试者是人。
在本公开的另一个方面中，公开了一种用于诱导哺乳动物组织再生的方法，其包括步骤：1)使用组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂将细胞和/或组织与试剂接触以在一个或多个成簇的原钙粘蛋白基因座内诱导常染色质状态；和2)将细胞和/或组织与一个或多个编码TERT的核酸接触；和将细胞和/或组织与化学iTR诱导物接触，所述iTR诱导物选自以下的组合：糖原合成酶3抑制剂(GSK3)、TGF-β信号转导抑制剂、HDAC抑制剂、H3K4/9组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂、Dot1L抑制剂、G9a抑制剂、Ezh2抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、3’磷酸肌醇依赖性激酶1的激活剂、糖酵解促进剂、RAR激动剂、模拟缺氧的药剂、端粒酶激活剂、MAPK/ERK途径抑制剂或其组合，从而使胎儿或成人来源的细胞恢复到其胚胎对应物，而不使所述组织中的细胞恢复为多能干细胞。在一些实施方式中，步骤1和步骤2是在体外进行的。在一些实施方式中，步骤1和步骤2是在体内进行的。在一些实施方式中，iTR诱导物包括能够在其他条件下提高体细胞类型中诱导多能性的效率，即在产生iPS细胞中的那些。
在一些实施方式中，受试者是人。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用包含抗原的抗癌疫苗，从而诱导免疫应答。
在一些实施方式中，鉴定的一个或多个亚型是α成簇的原钙粘蛋白和/或β成簇的原钙粘蛋白的成员。
在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在一些实施方式中，抗原是α成簇的原钙粘蛋白和/或β成簇的原钙粘蛋白的一个或多个亚型。
在一些实施方式中，抗癌疫苗是mRNA。
在一些实施方式中，mRNA编码α成簇的原钙粘蛋白和/或β成簇的原钙粘蛋白的一个或多个亚型。
在一些实施方式中，mRNA编码PCDHA1。
在一些实施方式中，mRNA编码PCDHA3。
在一些实施方式中，mRNA编码PCDHA6。
在一些实施方式中，mRNA编码PCDHB3。
在一些实施方式中，抗癌疫苗是α成簇的原钙粘蛋白和/或β成簇的原钙粘蛋白的亚型的一个或多个多肽或其片段。
在一些实施方式中，一个或多个多肽是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
在一些实施方式中，一个或多个多肽是PCDHA1或其片段。
在一些实施方式中，一个或多个多肽是PCDHA3或其片段。
在一些实施方式中，一个或多个多肽是PCDHA6或其片段。
在一些实施方式中，一个或多个多肽是PCDHB3或其片段。
在一些实施方式中，载体包含mRNA。
在一些实施方式中，载体是质粒。
在一些实施方式中，载体是病毒载体。
在一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体。
在一些实施方式中，脂质制剂包含抗癌疫苗。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用能够在受试者中产生对癌症的免疫应答的遗传修饰的免疫细胞。在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在一些实施方式中，遗传修饰的免疫细胞来源于多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自受试者的细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自供体的细胞。
在一些实施方式中，遗传修饰的免疫细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。在一些实施方式中，CAR包含抗原结合结构域，其结合在癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型。在一些实施方式中，亚型是α成簇的原钙粘蛋白和/或β成簇的原钙粘蛋白的成员。
在一些实施方式中，亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
在一些实施方式中，CAR T细胞来源于多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自受试者的细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自供体的细胞。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用免疫球蛋白超家族成员以引导特异性针对癌症细胞的免疫应答。在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在一些实施方式中，免疫球蛋白超家族成员是单克隆或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体结合PCDHA3。在一些实施方式中，抗体结合PCDHB3。
在另一个方面中，本公开提供了公开了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用T细胞激活双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分结合由α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座编码的一个或多个多肽或其片段，和第二抗原结合分子结合CD3，从而激活T细胞。
在一些实施方式中，一个或多个亚型是由α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座编码的。在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用呈递在癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型的遗传修饰的树突状细胞，从而在受试者中诱导对癌症的免疫应答。
在一些实施方式中，在癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型是来自α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型。在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在一些实施方式中，遗传修饰的树突状细胞来源于多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自受试者的细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于来自供体的细胞。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用来自成簇的原钙粘蛋白基因座的所述亚型的肽序列，从而在受试者中竞争性干扰癌细胞-细胞粘附。
在一些实施方式中，肽序列来自由α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座编码的多肽或其片段。在一些实施方式中，一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向受试者施用小分子，所述小分子干扰成簇的原钙粘蛋白基因座的所述亚型的同源相互作用，从而在受试者中竞争性干扰癌细胞-细胞粘附。
在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用化学治疗剂。
在一些实施方式中，化学治疗剂是DNA损伤剂、检查点抑制剂、抗体、烷化剂、抗代谢物、蒽环类、亚硝基脲类、拓扑异构酶抑制剂、异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或其组合。
在一些实施方式中，DNA损伤剂是高剂量铂基烷化化疗、铂化合物、噻替哌、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲类、氮芥衍生物、丝裂霉素类、表鬼臼毒素类、喜树碱类、蒽环类、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、电离辐射、ABT-888、奥拉帕尼(AZT-2281)、吉西他滨、CEP-9722、AG014699、AG014699与替莫唑胺、BSI-201、或其组合。
在一些实施方式中，表现出胚胎表型的癌症细胞表达SOX2、KLF4、OCT4、MYC、NANOG、LIN28A、LIN28B、ESRRB、NR5A2、TERT、SSEA、TRA和CEBPA中的一种或多种。在一些实施方式中，表现出胚胎表型的癌症细胞表达低水平或不表达COX7A1。
在一些实施方式中，在表现出胚胎表型的癌症细胞中表达的原钙粘蛋白成簇蛋白的一个或多个亚型是PCDHA2、PCDHA4、PCDHA10、PCDHA12、PCDHB2、PCDHB5、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB16、PCDHGB4、PCDHGB6或其组合。
在一些实施方式中，受试者是人。
在一些实施方式中，癌症是B细胞癌症、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经癌症、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽部癌症、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌症、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯氏瘤、骨癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、口腔癌、头颈癌或皮肤癌。在其他实施方式中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。
在一些实施方式中，生物样品来自乳腺癌或肺癌。
在本发明中教导的衰老和与年龄相关的疾病的很多方面可以通过改进本文公开的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型的表达来解决。这种应用的广度反映了在发育和致癌过程中与再生丧失相关的表达的泛组织改变。这些衰老的表现包括年龄相关的血管功能障碍，包括外周血管、冠状动脉和脑血管疾病；肌肉骨骼病症，包括骨关节炎、椎间盘退变、骨折、肌腱和韧带撕裂以及肢体再生；神经系统病症，包括中风和脊髓损伤；肌肉病症，包括肌营养不良、少肌症、心肌梗死和心力衰竭；内分泌病症，包括I型糖尿病、艾迪生氏病、甲状腺功能减退和垂体功能不全；消化系统病症，包括胰腺外分泌功能不全；眼部病症，包括黄斑变性、视网膜色素变性和神经性视网膜变性病症；皮肤病况，包括皮肤烧伤、撕裂伤、手术切口、脱发、头发变白和皮肤老化；肺部病症，包括肺气肿和肺间质纤维化；以及听觉障碍，包括听力受损。
在另一个方面中，本公开提供了在离体显微活检物(microbiopsies)中改进成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型表达的方法，以将其恢复到移植时能够无缝再生组织的状态。
在另一个方面中，本公开提供了在体内改进成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型表达的方法，以将其恢复到能够参与诱导组织再生(iTR)的状态。
在本发明的另一个方面中，提供了在患有退行性疾病的组织中引起iTR的方法，包括但不限于与年龄相关的疾病，其中在患病组织中实现iTR的方法利用一种或多种基因表达载体，所述基因表达载体引起本文公开的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型的外源性表达，包括但不限于α和β簇的成员以及端粒酶催化组分，如人TERT。
在本发明的另一个方面中，提供了在患有退行性疾病的组织中引起iTR的方法，包括但不限于与年龄相关的疾病和癌症，其中在患病组织中实现iTR的方法利用一种或多种基因表达载体，所述基因表达载体引起本文公开的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型的外源性表达，包括但不限于α和β簇的成员。
在本发明的另一个方面中，提供了在患有退行性疾病的组织中引起iTR的方法，包括但不限于与年龄相关的疾病和癌症，其中在患病组织中实现iTR的方法利用一种或多种基因表达载体，所述基因表达载体引起本文公开的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型的外源性表达，包括但不限于□簇的成员。
在本发明的另一个方面中，提供了在患有退行性疾病的组织中引起iTR的方法，包括但不限于与年龄相关的疾病和癌症，其中在患病组织中实现iTR的方法利用一种或多种基因表达载体，所述基因表达载体抑制本文公开的成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型的表达，包括但不限于PCDHGA12。
在另一个方面中，本公开提供了一种鉴定成簇的原钙粘蛋白亚型活性的候选调节物的方法，其包括：(a)所述亚型活性的一种或多种候选调节物处于纯化状态或在与其他分子的混合物中；(b)表现出胎儿或成人基因表达模式而不是胚胎基因表达模式的体细胞；(c)存在于体细胞内或所述细胞的提取物内的报告构建体，所述报告构建体不能以其他方式表达胚胎的目标亚型，其中在胚胎发育阶段的体细胞中与胎儿和成人阶段相比差异调控的基因启动子驱动报告基因的表达；和(ii)确定是否一种或多种候选调节物影响报告基因的表达，其中与不存在候选调剂物的基因表达相比，报告基因表达的改变表明该化合物调节亚型活性以类似于胚胎表达。
在另一个方面中，本公开提供了一种鉴定成簇的原钙粘蛋白亚型活性的候选调节物的方法，其包括：(a)所述亚型活性的一种或多种候选调节物处于纯化状态或在与其他分子的混合物中；(b)与成人基因表达模式相反，表现出目标成簇的原钙粘蛋白基因亚型的胚胎基因表达模式的体细胞；(c)存在于体细胞内或所述细胞的提取物内的报告构建体，所述报告构建体不能以其他方式表达成人的目标亚型，其中在胚胎发育阶段的体细胞中与胎儿和成人阶段相比差异调控的基因启动子驱动报告基因的表达；和(ii)确定是否一种或多种候选调节物影响报告基因的表达，其中与不存在候选调剂物的基因表达相比，报告基因表达的改变表明该化合物调节亚型活性以类似于成人表达。
在一些实施方式中，一种鉴定成簇的原钙粘蛋白亚型表达的候选调节物的方法，其还包括向受试者施用鉴定为成簇的钙粘蛋白亚型表达的调节物的一种或多种候选化合物。
在一些实施方式中，一种鉴定成簇的原钙粘蛋白亚型表达的候选全局调节物的方法，其还包括向来自胎儿或成人来源的细胞施用用于诱导组织再生的候选化合物，并通过使用易于测量的读取(如由所述亚型的启动子驱动的GFP产生的荧光)从α或β簇表达中测定表达成簇的原钙粘蛋白亚型。
在一些实施方式中，一种鉴定成簇的原钙粘蛋白亚型表达的候选调节物的方法，其还包括向来自胎儿或成人来源的细胞施用用于诱导组织再生的候选化合物，并通过测定与所述亚型相关的CpG岛的甲基化程度来测定α或β簇表达的表达。
在一些实施方式中，一种鉴定化合物的方法，其还包括向受试者施用化合物。在一些实施方式中，受试者是非人动物，例如，作为组织再生、伤口愈合或癌症模型的非人动物。在一些实施方式中，受试者是人。
在另一个方面中，本公开提供了一种药物组合物，其包含：(a)成簇的原钙粘蛋白亚型表达的调节物；和(b)药学上可接受的载体。
在另一个方面中，调节成簇的原钙粘蛋白亚型表达的基因改变，使得癌细胞被将基因表达从胚胎状态改变为胎儿或成人状态以引起诱导的癌症成熟(iCM)的试剂处理。
在另一个方面中，调节成簇的原钙粘蛋白亚型表达的基因改变，使得癌症细胞被将基因表达从胎儿或成人状态改变为胚胎状态以引起癌症干细胞的诱导的去衰老细胞(senolysis)(iS-CSC)的试剂处理。
在本领域技术范围内的某些常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组核酸(例如，DNA)技术、免疫学等的技术可被用于本发明的方面中。这些技术中的某些的非限制性描述可在以下出版物中找到：Ausubel,F.等(编著)，Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols in Immunology,Current Protocols inProtein Science和Current Protocols in Cell Biology,all John Wiley&Sons,N.Y.，2008版；Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3.sup.rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies--A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,1988；Burns,R.,Immunochemical Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press；第3版，2005,Monoclonal antibodies:apractical approach(P.Shepherd和C Dean编著，Oxford University Press,2000)；Freshney,R.I.,"Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique"，第5版，John Wiley&Sons,Hoboken,N J,2005)。本文提及的所有专利、专利申请、网站、数据库、科学文章和其他出版物的全部内容均通过引用并入本文。
在另一个方面中，本发明提供了一种工程化动物模型的方法，优选地是能够具有强大再生潜力的小鼠模型，所述小鼠处于常见的小鼠实验室品系中，从而促进分子遗传学和动物临床前研究。所述强力再生小鼠是通过产生在所有组织或选定组织中诱导性表达，或组成型表达来自α、β和γ簇的亚型的各种组合的小鼠而产生的，其中所述小鼠和将所述小鼠一起繁殖提供再生、衰老和癌症的小鼠模型。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于在受试者中鉴定癌细胞的方法，所述方法包括a)提供来自受试者的样品，其中所述样品包含细胞；b)确定样品中的一个或多个细胞表现出的胚胎表型；和c)鉴定在样品中的一个或多个细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型表现出的胚胎表型，其中一个或多个表现出胚胎表型并表达成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型的细胞是癌细胞。
在一些实施方式中，所述方法还提供了向受试者施用a)编码成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型或者成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型的多肽或其片段的多核苷酸；或b)能够对受试者中的癌症产生免疫应答的遗传修饰的免疫细胞。
附图说明
专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的附图。在收到请求并支付必要费用后，将提供给专利局带有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。
图1描述了通过RNA-seq确定的差异表达转录物亚型的火山图。绘制了Log2倍数变化(FC)对比-log10(Bonferroni调整的p值)关系图。基础数据来源于42种不同的人克隆胚胎祖细胞系和92种不同的成人来源的基质细胞和实质细胞类型的RNA测序FPKM值。水平虚线表示线性x调整的p值为0.05和垂直虚线表示线性倍数变化(FC)为2。通过p<0.05和FC<2(在成人中表达升高)临界标准的转录物用红色点表示；p<0.05和FC<-2(在胚胎中表达升高)的转录物用绿色点表示。用蓝色标记的点是CPL亚型。
图2A描述了在胚胎对比成人细胞类型中CPL基因的差异表达。在不同多能干细胞(PC)、hES衍生的克隆胚胎祖细胞(EP)、胎儿衍生的细胞(FC)、成人衍生的细胞(AC)和神经元细胞(NC)类型中PCDHA2、PCDHA4、PCDHA10和PCDHA12的RNA-seq读取的FPKM中的平均表达。
图2B描述了在胚胎对比成人细胞类型中PCDHB2、PCDHB2、PCDHB2、PCDHB2、PCDHB2和PCDHB2的平均表达。
图2C描述了在不同胚胎、成人和癌细胞类型中PCDHGB4、PCDHGB5、PCDHGB6和PCDHGA12的平均表达。ES和iPS细胞系包括4种不同的人ESPN细胞系和两种iPS细胞系；不同EP包括42种不同人克隆胚胎祖细胞系，胎儿衍生的细胞包括来自妊娠8-16周胎儿的3种培养的棕色前脂肪细胞和5种胎儿手臂皮肤成纤维细胞培养物。不同正常体细胞包括87种不同的基质细胞和实质细胞类型；5种神经元细胞培养物包括神经元和不同星形胶质细胞细胞类型；上皮细胞包括25种不同人上皮细胞类型；肉瘤包括39种不同人肉瘤细胞系；癌包括33种不同的癌和腺癌细胞系；(完整的细胞类型描述参见补充表I。)(ns-不显著)(*p<0.05)(**p<0.01)(***p<0.001)(****p<0.0001)。误差线S.E.M.。
图3描述了在不同胚胎、成人和癌细胞类型中PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12的差异表达。来自多能干细胞系的RNA-seq读取的FPKM中的平均表达包括四种不同人ES细胞系和两种iPS细胞系(PC)；42种不同的hES衍生的克隆胚胎祖细胞(EP)；成人非上皮(ANE)细胞包括97种不同基质细胞和实质细胞类型；成人上皮细胞(AEC)包括25种不同人上皮细胞类型；肉瘤细胞(SC)系包括39种不同肉瘤细胞类型；癌和腺癌(CAC)包括33种不同癌和腺癌细胞系。(完整的细胞类型描述参见补充表III。)(ns-不显著)(*p<0.05)(**p<0.01)(***p<0.001)(****p<0.0001)。误差线S.E.M.。
图4A-4C描述了肉瘤细胞系中胚胎和成人标志物的相关性。在39种不同肉瘤细胞系中将胚胎标志物图4A)PCDHA4、图4B)PCDHB2和图4C)PCDHGA12的FPKM值对成人标志物COX7A1作图。
图5描述了来自CPL的染色体特征和RNA序列读取的IGV视图。行表示：1)胚胎祖细胞成骨间充质系4D20.8的ATAC-seq(Embr Mesen)；胚胎血管内皮细胞系30-MV2-6(EmbrEndo)；成人衍生的成骨间充质细胞(MSC)；和成人衍生的人主动脉内皮细胞(HAEC)。蓝色星号是成人细胞中可及性明显降低的区域；2)从UCSC下载的CpG岛(CpGI)(cpgIslandExt.hg38.bed)，其中长度>200bp和基于G和C的含量预期的CpG>60％；3)基于ATAC足迹的TOBIAS分析(TOB-CTCF)，在Embr Mesen、Embry Endo、成人Mesen和成人Endo中的CTCF结合位点；4)显示了不同甲基化区域(DMR)，其中升高的绿色表示胚胎细胞中的高甲基化，而降低的红色信号表示与成人细胞相比胚胎中的相对低甲基化；和5)α、β和γ基因座的RNA序列读取。(hg38染色体位置：Chr5:140,650,000-141,700,000)，从IGV捕获的图像。
图6描述了CPL内代表性显著DMR的甲基化百分比。甲基化CpG的百分比是针对胚胎祖细胞(EP)、成人非上皮基质细胞和实体细胞类型(ANE)和肉瘤细胞系(SC)的α、β和γ簇(分别为PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12)的代表性DMR编写的。误差线S.E.M。
图7描述了CPLD中的染色质结构。行表示：1)通过Hi-C分析确定的染色质顺式相互作用显示了CPL区域中超级增强子的位置与成人细胞中(箭头)亚型的γ基因座的启动子之间的关联；2)胚胎祖细胞成骨间充质系4D20.8(Embr Mesen)和成人衍生的成骨间充质细胞(MSC)的ATAC-seq。蓝色星号是成人细胞中可及性明显降低的区域；3)显示了不同甲基化区域(DMR)，其中升高的绿色表示胚胎细胞中的高甲基化，而降低的红色信号表示与成人细胞相比胚胎中的相对低甲基化；4)基于ATAC足迹的TOBIAS分析(TOB-CTCF)，在Embr Mesen和成人Mesen中的CTCF结合位点；5)针对CTCF的ChIP-seq值；针对LMNB1、LMNA(微球菌核酸酶处理(MNase))、LMNA(声波处理的)的ChIP-seq值；6)在CPL区域中超级增强子的位置。7)针对整个CPLD使用针对H3K27me3、H3K27Ac、H2K4me3、H2K9me3、和H4K20me3、和H3K9Ac的抗体由染色质沉淀得到的在配对的胚胎和成人细胞中的ChIP-seq数据。(hg38染色体位置：Chr5:140,650,000-141,700,000)，从IGV捕获的图像。
图8描述了在人ES细胞、不同胚胎祖细胞类型和成人细胞中所有CPL基因表达的热图。在CPL中α、β和γ簇的每个亚型的亚型表达的RNA-seq FPKM值被热图用于选择多能干细胞(人ES细胞)、EP细胞系和成人细胞类型。
图9描述了在体外和HGPS中衰老期间PCDHGB4和PCDHGA12基因的表达。在同步的不同皮肤成人成纤维细胞(年龄11-83岁)；年轻(P19)和衰老(P38)GM00498(3岁门)皮肤成纤维细胞，来自Hutchinson-Gilford早衰综合征(HGPS)患者和年龄匹配对照的皮肤成纤维细胞中PCDHGB4(蓝色)和PCDHGA12(红色)亚型表达的RNA-seq FPKM值。(***p<0.001)(****p<0.0001)误差线表示平均值和平均值的标准误差。
图10描述了在发育、细胞衰老和癌症期间在染色质构造中的潜在转变模型。在胚胎发育过程中(大约达到哺乳动物发育的卡内基分期23)，层粘连蛋白B1占主导地位，并促进CTCF结合、拓扑结构域以及来自α和β簇的细胞类型特异性CPL亚型的表达。一旦器官发育完成，层粘连蛋白A的上调促进促进了拓扑结构域的改变，使得仅来自γ簇的亚型表达。在复制衰老中，LMNB1表达与在γ簇中的基因表达一起下调。大多数癌细胞系在本文指定为CIMP-E的CPL基因座中显示CpG岛甲基化表型(CIMP)。
图11显示了在用同种型抗体对照，或针对β簇CPL亚型PCDHB3的多克隆抗体，或针对PCDHA3、A6和B3以及PBMC的多克隆抗体的组合处理后，表达CPL亚型PCDHB3的乳腺癌细胞系BT-20的细胞计数。(*表示统计学显著性p<0.05)
图12显示了在用同种型抗体对照，或针对β簇CPL亚型PCDHA3的多克隆抗体，或针对PCDHA1、A3和B6以及PBMC的多克隆抗体的组合处理后，表达CPL亚型PCDHA3的肺癌细胞系NCI-H358的细胞计数。(*表示统计学显著性p<0.05)
图13显示了在用同种型对照抗体，或针对β簇CPL亚型PCDHA3,PCDHB3的多克隆抗体，针对PCDHA1、A3和B6的多克隆抗体的组合，针对PCDHA3、A6和B3以及PBMCs的多克隆抗体的组合处理后，不表达α或βCPL亚型的正常人皮肤成纤维细胞株MDW-1的细胞计数。
具体实施方式
缩略语
Ab-抗体
AC-成人衍生的细胞
AEC-成人上皮细胞
AMH-抗缪勒管激素
ANE-成人非上皮细胞
ASC-成人干细胞
ATAC-seq-测序后的转座酶可及染色质
CAC-癌和腺癌细胞
CAR T细胞-嵌合抗原受体修饰的T细胞
cGMP-现行良好生产工艺
CIMP-CpG岛甲基化子表型
CIMP-E-CpG岛甲基化子表型指与其胎儿和成人对应物相比在胚胎细胞中的超甲基化位点的独特DMR。
CM-癌症成熟
CNS-中枢神经系统
CpG-CpG二核苷酸
CPL-成簇的原钙粘蛋白基因座，其包括由α、β和γ基因座编码的所有亚型
DMEM-Dulbecco改良的Eagle培养基
DMR-差异甲基化区域
DMSO-二甲基亚砜
DNAm-DNA甲基化的变化，其提供了细胞和组织的年龄的标志物或“时钟”。
DPBS-Dulbecco磷酸盐缓冲液
ED细胞-胚胎衍生的细胞；hED细胞是人ED细胞
EDTA-乙二胺四乙酸
EFT-胚胎-胎儿转变
EP-胚胎祖细胞
ES细胞-胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞
ESC-胚胎干细胞
EV-细胞外囊皮
FACS-荧光激活细胞分选
FBS-胎牛血清
FC-胎儿细胞
FPKM-从RNA测序中读取的每百万个映射读取的转录物的每千碱基片段。
GFP-绿色荧光蛋白
GMP-良好的生产质量管理规范
HAEC-人主动脉内皮细胞
hEC细胞-人胚胎癌细胞
hED细胞-人胚胎衍生的细胞
hEG细胞-“人胚胎干细胞”是衍生自胎儿组织的原始生殖细胞的干细胞。
hEP细胞-人胚胎祖细胞
hES细胞-如本文所用，包括人ES样细胞的人胚胎干细胞(因此，“hES细胞”或“hESC”)指引发的和幼稚的多能干细胞。
hiPS细胞-“人诱导多能干细胞”是指在暴露于hES特异性转录因子如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2或其他使衰老的体细胞分化细胞恢复为多能性的手段后，从体细胞获得的具有类似hES细胞性质的细胞。
hPS细胞-人多能干细胞，如hES细胞、hiPS细胞、EC细胞和人孤雌生殖干细胞。
HSE-“人体皮肤等效物”是为测试目的或促进伤口修复的治疗应用而制造的细胞和生物或合成基质的混合物。
iCM-诱导癌症成熟。
iPS细胞-“诱导多能干细胞”是暴露于ES特异性转录因子，如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2、SOX2、KLF4、OCT4、MYC和(LIN28A或LIN28B)，和OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B的其他组合，或其他能够将分化细胞的发育衰老逆转回与hES细胞的基因表达谱基本匹配的多能干细胞状态的因子后，具有与从体细胞获得的hES细胞相似性质的细胞。
iS-CSC-“癌症干细胞诱导性去衰老细胞”指对化疗剂或放射疗法不易消融的恶性肿瘤治疗的细胞，其中所述iS-CSC治疗使所述难治性细胞恢复到胎儿前基因表达模式，并对化疗剂或放射疗法敏感。
iTM-诱导组织成熟
iTR-诱导组织再生
MEM-最低必需培养基
MSC-间充质干细胞
NC-神经元细胞，如CNS和外周神经系统的细胞，包括神经元和神经胶质细胞，如星形胶质细胞和少突胶质细胞。
NT-新生儿转变
PBS-磷酸盐缓冲盐水
PC-多能干细胞
PCDH-成簇的原钙粘蛋白
PCR-聚合酶链反应
PS成纤维细胞-“瘢痕形成前成纤维细胞”是来源于妊娠早期皮肤或来源于ED细胞的成纤维细胞，这些细胞表现出产前基因表达模式，可以促进皮肤伤口的快速愈合，而不会形成瘢痕。
PT-多能性转变
qRT-PCR-定量实时PCR
RFU-相对荧光单位
RNAi-RNA干扰
RNA-seq-RNA测序
SC-肉瘤细胞
SFM-无血清培养基
siRNA-小干扰RNA
St.Dev.-标准偏差
TR-组织再生
定义
如本文和在所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。还应当指出，权利要求书的起草可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为在陈述权利要求要素时使用“单独”、“仅”等专有术语或使用“负面”限制的先行依据。
本文给出的某些范围的数值前面加上术语“约”。术语“约”在本文中用于为其前面的确切数字以及接近或近似于该术语前面的数字提供文字支持。在确定一个数是否接近或近似于具体列举的数时，接近或近似的未列举数可以是在其呈现的上下文中提供与具体列举数实质上等价的数。
如在本文中所使用的，术语“分化细胞”指与亲本多能干细胞相比分化潜力降低的细胞。尽管如此，分化潜力降低的细胞如果没有最终分化，也可以进一步分化。
在一个数或一系列数(例如，“至少两个”)之前的术语“至少”被理解为包括与术语“至少“相邻的数，以及逻辑上可以包括的所有后续数或整数，从上下文中可以清楚地看出。当“至少”出现在一系列数或范围之前时，可以理解为“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数。
如在本文中所使用的，“至多10”中的“至多”应理解为至多10(包括10)，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
如在本文中所使用的，术语“施用”指给予或应用。如在本文中所使用的，术语“施用”包括体内施用，以及直接向离体组织施用。“施用”可以通过以下公开的任何途径来实现。
如在本文中所使用的，术语“抗体”指由至少一个结合结构域组成的多肽或多肽组，所述结合结构域由具有与抗原的抗原决定簇特征互补的结合表面的多肽链的折叠形成。
抗体的基本结构单元由四条多肽链组成，两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)。抗体可以是寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化抗体、人源化抗体、全人抗体和抗独特型抗体以及其片段、变体或衍生物，其单独或与公知技术提供的其他氨基酸序列组合。
如在本文中所使用的，术语“抗体”指引发免疫应答的物质。
如在本文中所使用的，术语“抗原结合位点”指抗体每个臂末端与抗原发生物理接触并非共价结合的位点。抗原结合位点的抗原特异性由其形状和存在的氨基酸决定。
术语“α或βCPL亚型”指由α簇基因(PCDHA1、PCDHA2、PCDHA3、PCDHA4、PCDHA5、PCDHA6、PCDHA7、PCDHA8、PCDHA9、PCDHA10或PCDHA11)，或β簇基因(PCDHB1、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、CDHB6、PCDHB7、PCDHB8、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB17P、PCDHB18P或PCDHB19P)编码的基因或产物之一。
如在本文中所使用的，术语“抗癌疫苗”或“疫苗”指在受试者中诱导对癌症细胞的免疫应答的核酸，例如，mRNA或多肽，例如，蛋白质或其片段。例如，编码被鉴定存在于受试者的癌症细胞上的抗原的mRNA可施用于受试者以诱导免疫应答。在一些实施方式中，抗癌疫苗是由α原钙粘蛋白簇和/或β原钙粘蛋白簇的一个或多个亚型编码的mRNA。在一些实施方式中，mRNA编码PCDHA3和/或PCDHB3。另一个实例，其中多肽或其片段可以向受试者施用的多肽或其片段是α原钙粘蛋白簇和/或β原钙粘蛋白簇的一个或多个亚型。在一些实施方式中，抗癌疫苗是α原钙粘蛋白簇和/或β原钙粘蛋白簇的一个或多个亚型的多肽或其片段。在一些实施方式中，多肽或其片段是PCDHA3和/或PCDHB3。
如在本文中所使用的，术语“生物标志物”或“生物特征”指用作生物状态指示物的肽、蛋白、核酸、抗体、基因、代谢产物或任何其他物质。其是一种客观测量的特征，并作为正常生物过程、致病过程或对治疗组合物的药理学应答的细胞或分子指示物进行评价。如在本文中所使用的，术语“指示物”指从一系列观察到的事实中得出的任何物质、数量或比率，这些事实可以揭示作为时间函数的相对变化。生物标志物可用于诊断个体的疾病风险、疾病的存在或确定疾病的治疗。
术语“双特异性”指能够特异性结合至少两个不同抗原决定簇的抗原结合分子。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，其每一个针对不同抗原决定簇是特异性的。在某些实施方式中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，特别是在两个不同细胞上表达的两个抗原确定簇。
嵌合抗原受体细胞
如在本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体T细胞”或“CAR-T细胞”指表达嵌合抗原受体或CAR的工程化的T细胞。
如在本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指在免疫细胞(例如，T细胞)中表达的工程化受体，用于基于表达的CAR的抗原特异性。CAR包含也称为抗原靶向区的抗原结合结构域、胞外间隔子结构域或绞链区、跨膜结构域和至少一个胞内信号转导结构域或至少一个共刺激结构域和至少一个胞内信号转导结构域。
一般而言，CAR可以包含含有抗原结合结构域的胞外域(胞外部分)、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。胞外域可以通过接头连接指跨膜结构域。胞外域还可以包含信号肽。
“信号肽”指引导细胞内的蛋白例如向特定细胞器(如内质网)和/或细胞表面转运和定位的肽序列。
“抗原结合结构域”指与抗原特异性结合(并且从而能够靶向含有抗原的细胞)的CAR区域。CARS可以包含一个或多个抗原结合结构域。一般而言，CAR上的靶向区是胞外的。抗原结合结构域可以包含抗原或其片段。例如，抗原结合结构域可以包含全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。与给定抗原特异性结合的任何分子，如来自天然存在的受体的亲合体或配体结合结构域，可以用作抗原结合结构域。
如在本文中所使用的，术语“接触”及其各种语法形式指接触或直接局部接近的状态或条件。
如在本文中所使用的，术语“衍生自”指用于从来源或源头接收、获得或修改某物的任何方法。
术语“有效量”在本文中使用以包括当向受试者施用以治疗患有疾病或病症(例如，癌症)的受试者时足以实现疾病治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病或其相关病症的一种或多种症状)的药剂的量。“有效量”可以根据药剂、施用方式、疾病及其严重程度、病史、年龄、体重、家族史、基因构成、病理过程阶段、此前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗受试者的其他个体特征而改变。通常优选使用最大剂量，即根据某些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换使用。
如在本文中所使用的，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的胸部，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、γ-ΔT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞或巨噬细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒性效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAKe细胞或γ-ΔT细胞。“效应功能”指细胞的特殊功能，例如，在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如在本文中所使用的，术语“免疫应答”指对抗原的综合身体应答，优选地指细胞免疫应答或细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性的、预防性的、防止性的和/或治疗性的。
如在本文中所使用的，术语“诱导免疫应答”可能意味着在诱导前没有针对特定抗原的免疫反应，但也可能意味着诱导前对特定抗原有一定水平的免疫应答，诱导后，所述免疫应答增强。因此，“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”。优选地，在受试者中诱导免疫应答后，保护所述受试者免于发展诸如癌症疾病的疾病，或者通过诱导免疫应答来改善疾病状况。
如在本文中所使用的，术语“免疫球蛋白超家族成员”是具有免疫球蛋白(Ig)结构域的蛋白，并且包括抗体如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、纳米抗体、T细胞受体、共受体分子如CD4、CD8和CD19、共刺激分子如CD28、自然杀伤细胞受体如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIL)和抗原受体附属分子如CD3和CD79a和CD79b。如在本文中所使用的，术语“核酸分子”是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更优选RNA，并且可以是体外转录RNA(IVT RNA)或合成RNA。核酸包括根据本发明的基因组DNA、cDNA、mRNA、重组生产和化学合成的分子。
如在本文中所使用的，术语“原钙粘蛋白”指钙粘蛋白多肽，钙依赖性细胞粘附分子的一个大亚家族。原钙粘蛋白细分为成簇的和非成簇的原钙粘蛋白，并且参与发育和疾病(例如，癌症)。
如在本文中所使用的，术语“受试者”包括任何哺乳动物，优选人。
如在本文中所使用的，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可以互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)，其包括细胞溶解性T细胞。T细胞属于一组被称为淋巴细胞的白细胞，在细胞介导的免疫中发挥着核心作用。其可以通过细胞表面存在一种称为T细胞受体(TCR)的特殊受体而与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了几种不同的T细胞亚群，每种亚群都有不同的功能。术语“分析重编程技术”指将体细胞的基因表达模式重新编程为更多能状态的方法，如iPS、ES、ED、EC或EG细胞，其中重编程是以多个离散的步骤进行的，并且不仅仅依赖于体细胞转移到卵母细胞和激活卵母细胞(参见PCT专利申请系列号PCT/US02/37899和PCT/US06/30632，其每一个的公开内容的全部内容通过引用并入本文)。
术语“卵裂球/桑椹胚细胞”指哺乳动物胚胎中的卵裂球或桑椹胚，或者在体外培养的具有或不具有其他细胞(包括那些细胞的分化衍生物)的卵裂球或桑椹胚。
术语“癌症成熟”指癌前或恶性癌细胞中基因表达的改变，使得最初表达胚胎细胞标志物的所述癌前或恶性癌细胞改变为表达胎儿或成人细胞的标志物。
术语“表达基因X的细胞”、“在细胞中表达的基因X”(或细胞群)或其等价物，指使用特定测定平台对细胞的分析提供了阳性结果。反之亦然(即，不表达基因X的细胞或其等价物指使用特定测定平台对细胞的分析提供了阴性结果)。因此，本文所述的任何基因表达结果都与在一个或多个测定平台中使用的一种或多种特定探针相结合。
术语“细胞系”指能够在体外繁殖和扩增的非永生化或永生化细胞群。
术语“细胞重构”指将染色质的细胞核转移到胞质中以获得功能细胞。
术语“克隆”指通过将单个细胞扩增成全部来源于原始单个细胞并且不包含其他细胞的细胞群而获得的细胞群。
术语“克隆胚胎祖细胞”指在体外从单细胞衍生的胚胎祖细胞。
术语“胞质泡”指由完整或透化但在其他方面完整的质膜结合的细胞的胞质，但缺乏细胞核。
术语“DNA损伤剂”指在基因组中诱导DNA断裂的治疗剂。在一些实施方式中，DNA损伤剂是高剂量的铂基烷化化疗、铂化合物、噻替哌、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲类、氮芥衍生物、丝裂霉素类、表鬼臼毒素类、喜树碱类、蒽环类、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、电离辐射、ABT-888、奥拉帕尼(AZT-2281)、吉西他滨、CEP-9722、AG014699、AG014699与替莫唑胺以及BSI-201。
如在本文中所使用的，术语“分化”及其各种语法形式指未成熟细胞为履行特定功能而分化的过程。术语“分化细胞”当用于涉及通过本发明的方法从多能干细胞制备的细胞时，指与亲本多能干细胞相比具有降低的分化潜力的细胞。本发明的分化细胞包括可以进一步分化的细胞(即，其可能不是终末分化的)。
如在本文中所使用的，术语“胚胎”指哺乳动物细胞的分化状态，其中细胞具有无瘢痕再生表型，因此将其与相同分化类型但处于胎儿或成人非再生发育状态的细胞区分开来，这些细胞几乎没有无瘢痕再生能力。术语“胚胎”通常指发育到约卡内基第23阶段，然而，根据组织不同，可能在发育后期发生。定义中排除了能够在成年状态下无瘢痕再生的细胞类型，如肝细胞和血细胞。在人类物种的情况下，从胚胎发育到胎儿发育的转变发生在产前发育的约8周，在小鼠中发生在16天或约16天，在大鼠物种中发生在交配后约17.5天。(参见，网站：www.php.med.unsw.edu.au/embryology/index.php？title＝Mouse_Timeline_Detailed)。
在一些实施方式中，在胚胎细胞中表达的基因包括但不限于SOX2、KLF4、OCT4、MYC、NANOG、LIN28A、LIN28B、ESRRB、NR5A2、TERT、SSEA、TRA和CEBPA。在一些实施方式中，在胚胎细胞中抑制的基因包括但不限于COX7A1。
术语“CPL亚型表达的胚胎模式”是指以激活α和β簇成员和抑制γ基因座成员为特征的基因表达模式，PCDHGB4和PCDHGB6除外，其在胚胎细胞中相对高表达。在一些实施方式中，在胚胎细胞中α簇的一个或多个成员的表达升高，例如，PCDHA2、PCDHA4、PCDHA10和PCDHA12。在一些实施方式中，在胚胎细胞中β簇的一个或多个成员的表达升高，例如，PCDHB2、PCDHB5、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB13、PCDHB14和PCDHB16。在一些实施方式中，在胚胎细胞中γ簇的一个或多个成员的表达升高，例如，PCDHGB4和PCDHGB6。
术语“胎儿-成人CPL亚型表达模式”或“成人CPL亚型表达模式“指一种基因表达模式，其特征是α和β簇成员的表达激活，γ基因座成员的表达减少，但PCDHGB4和PCDHGB6除外，其在胚胎细胞中相对高表达。
术语“胚胎祖细胞”指所有体细胞谱系的细胞，这些细胞比多能干细胞(例如，胚胎干细胞)更分化，但尚未成熟以表达胎儿或成人细胞类型的标志物。在人类胚胎祖细胞的情况下，其将表达妊娠少于八周的细胞标志物，如与胎儿或成人来源的细胞相比，COX7A1的表达相对较低或不表达。
术语“胚胎干细胞”(ES细胞)是指衍生自胚泡、卵裂球或桑椹胚的内部细胞团的细胞，这些细胞已作为细胞系连续传代，同时保持未分化状态(例如，表达对该物种的ES细胞特异性的TERT、OCT4、SSEA和TRA抗原)。ES细胞可来源于卵细胞与精子或DNA受精、核转移、孤雌生殖，或通过在MHC区产生半合性或纯合性的hES细胞。虽然ES细胞在历史上被定义为当移植到植入前胚胎中时能够分化为所有体细胞类型和种系的细胞，但包括人类在内的许多物种的候选ES培养物在培养中具有更扁平的外观，通常不会促进种系分化，因此被称为“ES样细胞”。人们普遍认为，人类ES细胞实际上是“ES样”细胞，然而，在本申请中，我们将使用术语ES细胞来指代ES和ES样细胞系。ES细胞可来源于卵细胞与精子或DNA受精、核转移、孤雌生殖，或通过在MHC区产生半合性或纯合性的hES细胞。术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)指人ES细胞。
术语“TR的全局调节物”或“iTR的全局调节物”指能够调节多种iTR基因或iTM基因的药剂，包括但不限于，在胎儿或成人来源的细胞中能够下调COX7A1同时刺激PCDHB2上调，或下调NAALADL1同时刺激AMH上调的药剂，以及能够诱导一种基因表达模式，从而增加对组织损伤或退行性疾病应答的无瘢痕组织再生。
术语“人诱导多能干细胞”指具有与hES细胞相似性质的细胞，包括当移植到免疫受损小鼠中时形成全部三个胚层的能力，其中所述iPS细胞来源于暴露于去分化因子(例如，hES细胞特异性转录因子组合：KLF4、SOX2、MYC；OCT4或SOX2、OCT4、NANOG和LIN28；或OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBPA、MYC、LIN28A和LIN28B的各种组合)或诱导体细胞达到具有类似hES细胞特性的多能干细胞状态的其他方法后的不同体细胞谱系的细胞。然而，通过体细胞核转移(SCNT)对体细胞的重编程通常称为NT-ES细胞，而不是iPS细胞。
术语“诱导癌症成熟”或“iCM”指导致癌前或恶性细胞表型变化的方法，从而在所述诱导之后，细胞在胎儿或成人发育阶段(而不是胚胎阶段)表达该细胞类型中正常表达的标志物。当应用于癌症和腺癌时，本文使用的术语与上皮-间质转化(EMT)同义。
术语“诱导组织再生”指使用本发明的方法以及在(参见PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601和没过专利申请系列号14/896,664)中公开的方法以改变胎儿或成人哺乳动物细胞的分子组成，以使得所述细胞能够或在所述组织损伤后再生功能性组织，其中所述再生不会是该物种动物的正常结局。术语“iCM因子”指以导致肿瘤中的CM达到治疗效果的方式改变CM激活剂和CMA抑制剂水平的分子。术语“iCM基因”指当表达改变时，可以在肿瘤中引起CM达到治疗效果的基因。
术语“分离的”指(i)与自然界中通常存在的至少一些其他物质通常是通过涉及人工的过程分离的，(ii)人工生产的(例如，化学合成的)，和/或(iii)存在于人工环境或背景(即，自然界中通常不存在的环境或背景)的物质。
术语“iTR因子”指以导致组织中不能自然进行TR的方式改变TR激活剂和TR抑制剂水平的分子。
术语“iTR基因”指当表达改变时能够在通常不能引起诱导的组织再生的组织中引起这种再生的基因。
术语“核酸”可与“多核苷酸”互换使用，并且在各种实施方式中包含天然存在的核苷聚合物(如DNA和RNA)和非天然存在的核苷聚合物或核苷类似物。在一些实施方式中，核酸包含标准核苷(缩写的A、G、C、T、U)。在其他实施方式中，核酸包含一种或多种非标准核苷。在一些实施方式中，一种或多种核苷是非天然存在的核苷或核苷酸类似物。核酸可以包含修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)，修饰的糖(2’-氟核糖、阿拉伯糖或己糖)，修饰的磷酸基团或核苷或核苷类似物之间的其他键(例如，硫代磷酸酯或5’-N-亚磷酰胺键)，锁核酸或吗啉代。在一些实施方式中，核酸包含通过磷酸二酯键连接的核苷，如在DNA和RNA中。在一些实施方式中，至少一些核苷通过一个或多个非磷酸二酯键连接。核酸可以是单链、双链或部分双链的。至少部分双链核酸可具有一个或多个突出端，例如5’和/或3’突出端。预期将本领域已知可为研究或治疗目的用于RNA干扰(RNAi)、适体或反义分子的背景中的核酸修饰(例如，核苷和/或主链修饰，包括非标准核苷的使用)用于本发明的各种实施方式中。参见，例如，Crooke,S T(编著)Antisense drug technology:principles,strategies,andapplications,Boca Raton:CRC Press,2008；Kurreck,J.(编著)Therapeuticoligonucleotides,RSC biomolecular sciences.Cambridge:Royal Society ofChemistry,2008。在一些实施方式中，修饰相对于相同长度和链度的RNA或DNA增加了(例如，体内)核酸的半衰期和/或稳定性。在一些实施方式中，修饰相对于相同长度和链度的RNA或DNA降低了核酸的免疫原性。在一些实施方式中，核酸的一条或两条链中5％至95％的核苷被修饰。修饰可以均匀或不均匀地分布，并且可以选择修饰的位置(例如，在中间附近、在末端或末端附近、交替的等)以增强所需的特性。核酸可包含可检测的标记，例如荧光染料、放射性原子等。“寡核苷酸”是指相对较短的核酸，例如通常为约4至约60个核苷酸的长度。在本文中提及多核苷酸的地方，应理解都提供了DNA、RNA，并且在每种情况下都提供了单链和双链形式(和每个单链分子的互补物)。
如在本文中所使用的，“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或指生物化学表征特定核酸的序列信息(即用作碱基缩写的字母序列)。除非另有说明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5’至3’方向呈现。
术语“寡克隆”是指源自小的细胞群(通常是2-1000个似乎具有相似特征(如形态或与同一培养中的其他细胞的分化标志物不同的分化标志物的存在或缺失)的细胞)的细胞群。从不具有这些共同特征的细胞中分离出寡克隆细胞，并允许其增殖，从而产生基本上完全源自相似细胞的原始群的细胞群。
术语“多能干细胞”是指能够分化为一种以上的分化的细胞类型的动物细胞。这样的细胞包括hES细胞、卵裂球/桑椹胚细胞及其衍生的hED细胞、hiPS细胞、hEG细胞、hEC细胞和源自成体的细胞(包括间充质干细胞、神经元干细胞和源自骨髓的干细胞)。多能干细胞可以是遗传修饰的，也可以不是遗传修饰的。遗传修饰的细胞可以包括标志物(如荧光蛋白)以促进其在卵内的鉴定。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2至60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常包含标准氨基酸(即在蛋白中最常见的20个L-氨基酸)。然而，在某些实施方式中，多肽可包含一种或多种非标准氨基酸(其可以是天然存在的或非天然存在的)和/或本领域已知的氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如通过用于缀合、官能化等的化学实体(如糖类基团、磷酸基团、脂肪酸基团、接头)的添加。具有与之共价或非共价结合的非多肽部分的多肽仍被认为是“多肽”。多肽可以从天然来源纯化而得，使用重组DNA技术生产而得，通过化学手段(如常规固相肽合成等)合成而得。
如在本文中所使用的，术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或生物化学表征多肽的序列信息(即用作氨基酸名称的缩写的连续的字母或三个字母的代码)。除非另有说明，否则本文呈现的多肽序列以N-末端至C-末端的方向呈现。多肽可以是环状的或含有环状部分。当本文讨论天然存在的多肽时，应理解，本发明包括与其任何同源异构体有关的实施方式(例如，由于mRNA的选择性剪接或编辑或由于一个基因的不同等位基因(例如具有一个或多个单核苷酸多态性区别的等位基因(通常此类等位基因与参照序列或共有序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性))而从相同基因产生的不同蛋白)。多肽可包含靶向其分泌或特定细胞内区室(例如细胞核)的序列和/或靶向该多肽以进行翻译后修饰或降解的序列。某些多肽可以被合成为前体，所述前体经过翻译后切割或其他加工成为成熟的多肽。在某些情况下，这种切割可能仅在特定的激活事件后发生。在相关的情况下，本发明提供了与前体多肽有关的实施方式和与多肽的成熟版本有关的实施方式。
术语“出生前”是指胎盘哺乳动物的胚胎发育阶段，在所述阶段之前，动物在子宫外无法存活。
术语“原始干细胞”统指能够分化为所有三个主要胚层(内胚层、中胚层和外胚层)以及神经嵴的细胞的多能干细胞。因此，原始干细胞的实例包括但不限于人或非人哺乳动物的ES细胞或细胞系、卵裂球/桑椹胚细胞及其衍生的ED细胞、iPS和EG细胞。
术语“纯化的”是指已从自然界中或最初产生时与之相关的大多数组分中分离出来的试剂或实体(例如，化合物)。通常，这种纯化涉及人手的动作。纯化的试剂或实体可以是部分纯化的、基本纯化的或纯的。此类试剂或实体可以是例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％纯度的。在某些实施方式中，纯化核酸或多肽，使其构成分别存在于制剂中的核酸或多肽材料的总数的至少75％、80％、855％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。纯度可基于例如干重、色谱追踪图上峰的大小、分子丰度、凝胶上带的强度或与分子丰度相关的任何信号的强度或任何本领域公认的定量方法。在某些实施方式中，水、缓冲液、离子和/或小分子(例如诸如核苷酸或氨基酸的前体)可以任选地存在于纯化的制剂中。纯化的分子可通过将其与其他物质(例如，其他细胞物质)分离或通过以达到所需纯度的方式生产来制备。在某些实施方式中，纯化的分子或组合物是指使用任何本领域公认的纯化方法制备的分子或组合物。在某些实施方式中，“部分纯化”是指细胞产生的分子不再存在于细胞内，例如，细胞已被裂解，并且任选地，至少某些细胞物质(例如，细胞壁、细胞膜、细胞器)已被移除。
术语“小干扰RNA”(siRNA)和“RNA干扰”(RNAi)可以互换使用，并且与其在本领域中的含义一致地用于指一种现象，凭借所述现象，双链RNA(dsRNA)触发与dsRNA链互补的对应mRNA的序列特异性降解或翻译抑制。应当理解，dsRNA链与mRNA之间的互补性不必是100％，而仅需要足以介导基因表达的抑制(也被称为“沉默”或“敲低”)。例如，互补程度使得所述链能够(i)引导RNA诱导沉默复合物(RISC)中的mRNA的切割；或(ii)引起mRNA的翻译抑制。在某些实施方式中，RNA的双链部分的长度小于约30个核苷酸，例如长度在17至29个核苷酸之间。在某些实施方式中，dsRNA的第一链与靶mRNA有至少80％、85％、90％、95％或100％的互补性，并且dsRNA的另一链与第一链具有至少80％、85％、90％、95％或100％的互补性。在哺乳动物细胞中，可以通过将适当的双链核酸引入细胞内或在细胞内表达核酸(然后在细胞内被处理以在其中产生dsRNA)来实现RNAi。能够介导RNAi的核酸在本文中被称为“RNAi试剂”。能够介导RNAi的示例性核酸是短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA)前体。这些术语是众所周知的，并且在本文中以与其在本领域中的含义一致的含义被使用。siRNA通常包含两条独立的核酸链，所述核酸链彼此杂交形成双链体。其可以例如通过使用标准核酸合成技术在体外合成。siRNA通常是双链寡核苷酸，每条链中都有16-30个核苷酸(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸(nt))，其中所述双链寡核苷酸包含长度在15至29个核苷酸之间的双链部分，并且任何一条或两条链都可包含例如长度在1-5个核苷酸之间的3’突出端，或者任一或两个末端可以是钝性的。在某些实施方式中，siRNA包含在19至25nt之间的链(例如，在21至23个核苷酸之间的链)，其中一条或两条链包含1-2个核苷酸的3’突出端。siRNA的双链部分的一条链(被称为“引导链”或“反义链”)与mRNA中的靶区域基本上互补(例如，至少80％或更多(例如85％、90％、95％或100％))或互补(例如，具有3、2、1或0个错配的核苷酸)，而另一双链部分与第一双链部分基本上互补。在许多实施方式中，引导链与mRNA中的靶区域100％互补，而另一条过客链与第一双链部分100％互补(应理解，在各种实施方式中，如果所述引导链的3’突出部分存在，则所述3’突出部分在所述引导链与mRNA杂交时可能与mRNA互补或不互补)。在某些实施方式中，shRNA分子是包含茎环的核酸分子，其中所述双链茎的长度为16-30个核苷酸，而环的长度为约1-10个核苷酸。siRNA可以包含多种修饰的核苷、核苷类似物，并且可以包含化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等。没有限制地，可以使用本领域公认对RNAi有用的任何修饰。某些修饰导致增加的稳定性、细胞摄取、效力等。某些修饰导致降低的免疫原性或清除率。在某些实施方式中，siRNA包含长度约19-23(例如，19、20、21、22或23)个核苷酸的双链体，以及任选地长度为1-5个核苷酸的一个或两个3’突出端，其可以是由脱氧核糖核苷酸组成。shRNA包含一条核酸链，所述核酸链包含两个互补部分，所述互补部分之间主要由非自身互补区域隔开。所述互补部分杂交以形成双链体结构，而所述非自身互补区域形成连接所述双链体的一条链的3”端和另一条链的5’端的环。shRNA经历细胞内加工以生成siRNA。通常，所述环的长度为1至8个(例如，2-6个)核苷酸。
微小RNA(miRNA)是(在哺乳动物系统中)约21至25个核苷酸的小的天然非编码单链RNA，其以序列特异性方式抑制基因表达。它们在细胞内从前体(pre-miRNA)产生，所述前体具有特征性的二级结构，所述二级结构由短发夹(长度约70个核苷酸)组成，所述短发夹包含一个双链体，所述双链体通常包含一个或多个互补性不完善的区域，而所述区域又是由较大的前体(pri-miRNA)产生的。天然存在的miRNA通常仅与其靶mRNA部分互补，并且通常通过翻译抑制发挥作用。以内源性miRNA或miRNA前体为模型的RNAi试剂可用于本发明的某些实施方式中。例如，可以设计siRNA以使一条链与靶mRNA杂交，具有模仿由miRNA及其靶mRNA形成的双链体的一个或多个错配或凸起。这种siRNA可以被称为miRNA模拟物或miRNA样分子。miRNA模拟物可以由前体核酸编码，所述前体核酸的结构模仿天然存在的miRNA前体的结构。
在某些实施方式中，RNAi试剂是载体(例如，质粒或病毒)，所述载体包含用于siRNA(例如，作为能够彼此杂交的两条独立链)、shRNA或microRNA前体的转录的模板。如本领域中已知的，通常，编码siRNA、shRNA或miRNA前体的模板是与表达控制序列(例如，启动子)可操作地连接的。此类载体可用于将模板引入脊椎动物细胞(例如，哺乳动物细胞)并导致siRNA、shRNA或miRNA前体的瞬时或稳定表达。在细胞内加工前体(shRNA或miRNA前体)以产生siRNA或miRNA。
通常，小RNAi试剂(如siRNA)可以化学合成，也可以从DNA模板体内或体外转录成两条独立的链然后杂交，或作为shRNA进行加工以生成siRNA。通常，RNAi试剂，特别是那些包含修饰的RNAi试剂，是化学合成的。寡核苷酸的化学合成方法是本领域众所周知的。
如在本文中所使用的，术语“小分子”是质量小于约2千道尔顿(KDa)的有机分子。在某些实施方式中，小分子小于约1.5KDa，或小于约1KDa。在某些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(Da)、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常，一个小分子的质量至少为50Da。在某些实施方式中，小分子包含多个碳-碳键并且可以包含一个或多个杂原子和/或一个或多个对于与蛋白的结构性相互作用(如氢键)重要的官能团，例如胺、羰基、羟基或羧基，并且在某些实施方式中，至少两个官能团。小分子通常包含任选地被一个或多个上述官能团置换的一个或多个环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。在某些实施方式中，小分子是非聚合的。在某些实施方式中，小分子不是氨基酸。在某些实施方式中，小分子不是核苷酸。在某些实施方式中，小分子不是糖。
术语“受试者”可以是任何多细胞动物。受试者通常是脊椎动物，例如哺乳动物或禽类。示例性哺乳动物包括例如人，非人灵长类，啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、家兔)，有蹄类动物(例如，绵羊、牛、马、山羊物种)，犬和猫。通常，受试者是(例如，出于实验、诊断和/或治疗目的)向其递送化合物的个体或从其获得样品或对其进行诊断程序的个体(例如，将被用于评估组织损伤和/或评估本发明化合物作用的样品或程序)。
本文使用的术语“组织损伤”是指对细胞、组织、器官或其他身体结构的任何类型的损伤或损害。该术语在各种实施方式中包括由于疾病引起的退行性，由于物理创伤或手术引起的损害，由于暴露于有害物质而引起的损害以及细胞、组织、器官或其他身体结构的结构和/或功能的其他破坏。
术语“组织再生”或“TR”是指组织、器官或其他身体结构或其一部分在丢失、损坏或变形之后的至少部分再生、置换、恢复或再生长，其中所述组织再生除非以本发明中描述的方法发生，否则将不会发生。组织再生的实例包括断指或断肢的再生长，包括软骨、骨骼、肌肉、肌腱和韧带的再生长，由于损伤或疾病而丧失的骨骼、软骨、皮肤或肌肉的无瘢痕再生长，其伴随受伤或患病器官的大小和细胞数量的增加，以使组织或器官接近所述组织或器官的正常大小或其在受伤或患病之前的大小。取决于组织类型，组织再生可通过多种不同的机制(例如，预先存在的细胞和/或组织的重排(例如，通过细胞迁移)，成年体干细胞或其他祖细胞的分裂及其至少某些后代的分化，和/或细胞的去分化、转分化和/或增殖)发生。
术语“TR激活因子基因”是指在胎儿和成年细胞中缺乏表达但其在胚胎发育阶段的表达促进TR的基因。
术语“TR抑制因子基因”是指其在胎儿和成年动物中的表达抑制TR的基因。
关于受试者的术语“治疗”、“疗法”、“治疗的”和类似术语是指提供对所述受试者的医学和/或外科护理。治疗可以包括但不限于将化合物或组合物(例如，药物组合物)施用于受试者。根据本发明所述的对受试者的治疗通常是在促进再生的努力下进行的，例如在遭受组织损伤或预期遭受组织损伤的受试者(例如，将进行手术的受试者)中进行的。治疗的效果通常可以包括组织再生后增加的再生、减少的瘢痕形成和/或改善的结构性或功能性结果(与不进行治疗的结果相比)，和/或可包括退行性疾病的严重程度或进展的逆转或减轻。
应用于特定多肽的术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸的变化(例如，添加、删除和/或置换)而与该多肽(有时被称为“原始多肽”)不同的多肽。有时，原始多肽是天然存在的多肽(例如，来自人或非人动物的多肽)或与其相同的多肽。变体可以是天然存在的或使用例如重组DNA技术或化学合成产生的。添加可以是多肽内的插入或在N-或C-末端的添加。在某些实施方式中，置换、删除或添加的氨基酸的数目可以例如为约1至30，例如约1至20，例如约1至10，例如约1至5，例如1、2、3、4或5。在某些实施方式中，变体包含多肽，所述多肽的序列与原始多肽的序列在至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸或更多的直至原始多肽的全长的氨基酸上同源(但在序列上与原始多肽不相同)，例如，变体多肽的序列与原始多肽的序列在至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸或更多的直至原始多肽的全长的氨基酸上具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在某些实施方式中，变体包含与原始多肽的序列在至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的原始多肽长度上具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99.5％或更高的序列同一性。在某些实施方式中，变体包含至少一个功能或结构域，例如，在国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(www.ncbi.nih.gov)的保守域数据库(Conserved Domain Database，CDD)中如此标识的域(例如，NCBI策展的域)。
在某些实施方式中，变体或片段的一种、一种以上或全部生物学功能或活性与原始分子的对应生物学功能或活性基本相似。在某些实施方式中，功能变体保留至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的原始多肽的活性，例如约相等的活性。在某些实施方式中，变体的活性高达原始分子的活性的约100％、约125％或约150％。在其他非限制性实施方式中，如果产生特定作用所需的变体的量或浓度在产生这种作用所需的原始分子的量或浓度的0.5至5倍之内，则认为变体或片段的活性与原始分子的活性基本相似。
在某些实施方式中，变体中的氨基酸“置换”是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸的结果，即保守氨基酸替换。可以基于所涉及残基的多种性质(例如，侧链大小、极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性)中任一种的相似性进行“保守”氨基酸置换。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性(亲水)、中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。可能对特定组中的某些置换(例如，异亮氨酸对亮氨酸的替换(反之亦然)、苏氨酸对丝氨酸的替换(反之亦然)或甘氨酸对丙氨酸的替换(反之亦然))特别感兴趣。当然，非保守置换通常也与保留的功能相容。在某些实施方式中，置换或删除不改变或删除对于活性重要的氨基酸。插入或删除的大小范围可为约1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸。在某些情况下，可以删除较大的结构域，而基本上不会影响功能。在本发明的某些实施方式中，变体的序列可以通过对天然酶的序列进行总共不超过5、10、15或20个氨基酸的添加、删除或置换而获得。在某些实施方式中，多肽中不超过1％、5％、10％或20％的氨基酸是相对于原始多肽的插入、删除或置换。可通过比较特定多肽的序列与同源多肽(例如，来自其他生物的)的序列并最小化高同源性区域(保守区域)中氨基酸序列变化的次数或通过用同源序列中的氨基酸替换氨基酸来获得确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或删除而又不消除或基本不降低目标活性的指导，因为在各种物种中保守的氨基酸残基比不保守的氨基酸更可能对活性重要。
在某些实施方式中，多肽的变体包含异源多肽部分。异源部分通常具有不存在于原始多肽中或与原始多肽不同源的序列。异源部分的长度可以为例如5至约5,000个氨基酸之间或更长。通常，它的长度在5至1,000个氨基酸之间。在某些实施方式中，异源部分包含在不同多肽(例如，功能域)中发现的序列。在某些实施方式中，异源部分包含用于纯化、表达、溶解和/或检测多肽的序列。在某些实施方式中，异源部分包含多肽“标签”，例如亲和标签或表位标签。例如，标签可以是亲和标签(例如，HA、TAP、Myc、6xHis、Flag、GST)，荧光或发光蛋白(例如，EGFP、ECFP、EYFP、Cerulean、DsRed、mCherry)，溶解度增强的标签。(例如，SUMO标签、NUSA标签、SNUT标签或噬菌体T7的Ocr蛋白的单体突变体)。参见，例如，EspositoD和Chatterjee D K.Curr Opin Biotechnol.；17(4):353-8(2006)。在某些实施方式中，标签可以起到多种功能。标签通常相对较小，例如从几个氨基酸到约100个氨基酸长。在某些实施方式中，标签长于100个氨基酸，例如高达约500个氨基酸长或更长。在某些实施方式中，多肽具有位于N-或C-末端的标签，例如作为N-或C-末端融合物。多肽可以包含多个标签。在某些实施方式中，例如在N-末端存在6xHis标签和NUS标签。在某些实施方式中，标签是可切割的，从而可以例如通过蛋白酶将其从多肽中除去。在某些实施方式中，这是通过在编码与原始多肽同源的部分的序列和标签之间包括编码蛋白酶切割位点的序列来实现的。示例性蛋白酶包括例如凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、PreScission蛋白酶等。在某些实施方式中，使用“自切割”标签。参见例如PCT/US05/05763。编码标签的序列可以位于相对于编码多肽的多核苷酸(或两者)的5’或3’。在某些实施方式中，通过多肽连接子将标签或其他异源序列与其余多肽分开。例如，连接子可以是短多肽(例如，15-25个氨基酸)。连接子通常由小的氨基酸残基(例如，丝氨酸、甘氨酸和/或丙氨酸)组成。异源结构域可以包括跨膜结构域、分泌信号结构域等。
在本发明的某些实施方式中，如果片段或变体(任选地不包括异源部分)存在，则其与原始多肽具有足够的结构相似性，使其在其三维结构(实际或预测的结构)叠加在原始多肽的结构上时，重叠的体积为原始多肽结构总体积的至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％。片段或变体的部分或全部三维结构可以通过使用标准方法来使蛋白结晶确定。或者，也可以使用标准方法生成NMR溶液结构。可以使用诸如MODELER(Sali,A.和Blundell,T L,J.Mol.Biol.,234,779-815,1993)的建模程序或任何其他建模程序来生成预测的结构。如果存在相关多肽的结构或预测结构，则模型可以基于该结构。可以使用PROSPECT-PSPP程序套件(Guo,J T等，Nucleic Acids Res.32(Web Server issue):W522-5,Jul.1,2004)。当本发明的实施方式涉及多肽的变体时，其应被理解为提供了编码该变体的多核苷酸。
本文所用的术语“载体”是指能够介导核酸分子进入(例如转移、转运等)细胞的核酸或病毒或其部分(例如病毒衣壳或基因组)。当载体是核酸时，通常将待转移的核酸分子与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。核酸载体可包含指导自主复制(例如复制起点)的序列，或可包含足以允许部分或全部核酸整合入宿主细胞DNA的序列。有用的核酸载体包括例如DNA或RNA质粒、粘粒和天然存在的或修饰的病毒基因组或其部分或可以包装成病毒衣壳的核酸(DNA或RNA)。质粒载体通常包括复制起点和一个或多个可选择的标志物。质粒可以包括部分或全部病毒基因组(例如，病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可以用于将核酸分子引入细胞的病毒或其部分被称为病毒载体。有用的病毒载体包括腺病毒，腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒和其他痘病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)和其他。当被引入宿主细胞时，病毒载体可以包含或可以不包含足以产生感染性病毒的足够的病毒遗传信息，即病毒载体可能是复制缺陷型的，并且这种复制缺陷型病毒载体对于治疗用途可能是优选的。在缺少足够信息时，它可以但不一定由宿主细胞或引入该细胞的另一载体提供。可以将待转移的核酸引入天然存在的或修饰的病毒基因组或其部分中，或者其可以作为单独的核酸分子存在于病毒或病毒衣壳中。应当理解，包含部分或全部病毒基因组(通常包含足以指导可被包装到病毒衣壳中的核酸的转录和/或足以产生可被整合到宿主细胞基因组中和/或引起感染性病毒的核酸的病毒遗传信息)的某些质粒载体在本领域中有时也被称为病毒载体。载体可包含一种或多种编码适于在鉴定和/或选择已经或尚未被载体转化或转染的细胞中使用的标志物的核酸。标志物包括例如增加或降低对抗生素的抗性或敏感性的蛋白(例如，编码赋予对抗生素抗性的蛋白的抗生素抗性基因，如嘌呤霉素、潮霉素或杀稻瘟菌素)或活性为可通过本领域已知的测定法测定的其他化合物、酶(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)，和可检测地影响转化或转染的细胞的表型的蛋白或RNA(例如，荧光蛋白)。表达载体是包含足以指导可操作连接的核酸转录的调控序列(例如，表达控制序列(如启动子))的载体。调控序列也可以包括增强子序列或上游激活子序列。载体可以任选地包含5’前导序列或信号序列。载体可以任选地包含切割和/或聚腺苷酸化信号和/或3’非翻译区域。载体通常包括一个或多个适当定位的限制性酶切位点以便于将要表达的核酸引入载体。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件。宿主细胞或体外表达系统可以提供表达所需或有助于表达的其他元件。
可以采用各种技术将核酸分子引入细胞。此类技术包括使用化合物(如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物)的化学促进的转染，脂质体介导的转染，非化学方法(如电穿孔、粒子轰击或显微注射)和使用含有感兴趣的核酸分子的病毒的感染(有时被称为“转导”)。标志物可用于鉴定和/或选择已摄取载体并通常表达核酸的细胞。可以在合适的培养基中培养细胞以选择此类细胞，并任选地建立稳定的细胞系。
如在本文中所使用的，术语指一种药物制剂(药物组合物)或产品，其在施用后诱导免疫应答，特别是细胞免疫应答，识别并攻击病原体或患病细胞(如，癌细胞)。疫苗可以用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”涉及特定的癌症患者，意味着癌症疫苗适用于个体癌症患者的需求或特殊情况。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
在提供数值范围时，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值均应达到下限单位的十分之一并介于该范围的上限和下限之间，所述范围内的任何其他所述值或中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
成簇的原钙粘蛋白基因座的基因
本发明涉及成簇的原钙粘蛋白基因座(CPL)的基因。该基因座由称为α、β和γ的三个基因簇组成。α包括亚型PCDHA1、PCDHA2、PCDHA3、PCDHA4、PCDHA5、PCDHA6、PCDHA7、PCDHA8、PCDHA9、PCDHA10、PCDHA11、PCDHA12、PCDHA13、PCDHAC1和PCDHAC2。β簇包括基因PCDHB1、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB7、PCDHB8、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB17P和PCDHB18P。γ簇包括CPL亚型PCDHGA1、PCDHGA2、PCDHGA3、PCDHGA4、PCDHGA5、PCDHGA6、PCDHGA7、PCDHGA8、PCDHGA9、PCDHGA10、PCDHGA11、PCDHGA12、PCDHGB1、PCDHGB2、PCDHGB3、PCDHGB4、PCDHGB5、PCDHGB6、PCDHGB7、PCDHGB8P、PCDHGC3、PCDHGC4和PCDHGC5。我们之前披露，CPL的某些成员在大多数体细胞类型的胚胎(胎儿前)细胞中差异表达，而其他成员在胎儿和成人发育阶段以同样出乎意料的大量体细胞类型表达(参见PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601和PCT/US2017/036452，其每一个的全部内容通过引用并入本文)。因此，我们在本文中提出，CPL亚型在胚胎发育阶段的特异性细胞-细胞粘附和器官发生中起着关键作用，亚型的精确组合取决于特定的分化细胞类型，并且向胎儿和成人表达模式的转变反映了胚胎后对该组织再生潜力的抑制。我们进一步教导，类似多样且数量惊人的癌症类型的癌症恢复到CPL表达的胚胎模式，但所述癌细胞是双相的，并且可以在成年和胚胎CPL亚型表达模式之间转移。此外，本发明教导了所产生的异质性导致肿瘤内的一系列特征。CPL亚型表达的胚胎模式导致细胞-细胞聚集，并与快速增殖、有氧糖酵解增加和对细胞凋亡的敏感性有关，如暴露于放疗或化疗时。CPL亚型表达的成人模式导致细胞-细胞聚集的丧失，而不是上皮-间充质转化，与增殖速率减慢、氧化磷酸化增加和对细胞凋亡相对不敏感有关，如暴露于放疗或化疗时。后一种细胞通常被称为经历了上皮-间质转化(EMT)或癌症干细胞(CSC)的癌症细胞。因此，本发明教导了相反的学说，即CSC并不比其他癌细胞更未分化，但恰恰相反，其更成熟且更成人化。此外，本发明提供了CPL亚型表达的成年状态向胚胎表达的转变可以在癌症发病机制的早期发生。作为非限制性实例，胚胎亚型表达可能在进展为腺癌之前发生在肠腺瘤中。这提供了在本文公开的所有不同细胞和癌症类型中检测癌症发生的早期阶段的手段，以及靶向所述细胞以获得治疗效果的手段。
此外，我们揭示了与层粘连蛋白A/C(LMNA)相比，层粘连蛋白B1(LMNB1)基因的相对高表达率在CPL中组织染色质，导致CPL亚型CGI的超甲基化，以及CPL亚型表达的胚胎模式，其特征在于激活α和β簇成员以及抑制γ基因座的成员，但在胚胎细胞中相对高表达的PCDHGB4和PCDHGB6除外。相反，与LMNB1相比，LMNA基因的相对高表达率组织了CPL中的染色质，导致CPL亚型CGI的甲基化减少，以及CPL亚型表达的成年模式，其特征在于抑制α和β簇成员的表达以及增加γ基因座成员的表达，但在胚胎细胞中相对高表达的PCDHGB4和PCDHGB6除外。
α和βCPL亚型PCDHGB4和PCDHGB6的上调和γ亚型(PCDHGB4与PCDHGB6除外)的下调可以通过上调LMNB1/LMNA的表达比率来实现。这反过来可以通过在抑制或不抑制LMNA表达的情况下外源性诱导LMNB1表达，或者在诱导或不诱导LMNB1表达的情况下外源性抑制LMNA来有效实现。这种改变的基因表达可以通过使用本文所述方法的RNA或DNA介导的诱导表达或siRNA来实现。
在一些实施方式中，通过转染将外源核苷酸RNA和/或DNA引入细胞来抑制LMNA和/或LMNB1的表达。可以使用Lipfectamine或等效脂质转染试剂进行转染。在将外源性核苷酸(例如，RNA和/或DNA)引入细胞之后，RNA，如siRNA抑制靶基因的表达，如本文所述。改变基因表达的其他方法可以包括针对靶基因(例如LMNA/LMNB1)的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9。例如，构建tracrRNA和crRNA或单一向导RNA(sgRNA)以将Cas9靶向目标基因(例如，LMNA/LMNB1)。Cas9或死亡Cas9酶能够抑制靶基因的表达。可以通过将表达构建体转导进入细胞将Cas9和向导RNA引入细胞。
除了调节细胞的再生和癌症表型外，CPL亚型γ家族的一些成员在体内细胞衰老和组织衰老中发挥作用。例如，我们在此公开了与胚胎(胎儿前)细胞相比，基因PCDHGC3在成人细胞中上调，并且在体外培养至衰老的细胞中进一步上调3-5倍。与成人细胞相比，PCDHGC3基因的启动子在胚胎和癌症细胞中相对甲基化，在衰老细胞中进一步去甲基化。因此，下调基因表达或将RNAi引入细胞和组织能够诱导成人组织中的组织再生。此外，上调PCDHGC3的表达或将PCDHGC3基因编码的RNA或蛋白引入癌细胞可诱导癌症成熟并降低癌细胞的增殖率。
因此，这些出乎意料的结果提供了如下所述的新的诊断和治疗组合物和方法。
诊断应用
鉴定癌症中CPL亚型表达的改变可用于诊断和检测体内癌症细胞的靶向清除。在诊断的情况下，胎儿或成人中胚胎CPL亚型表达的存在表明细胞向恶性或完全恶性细胞发展的可能性，这些细胞相对快速增殖并对放疗或化疗敏感。相反，对表达胎儿或成人CPL亚型表达模式的癌症细胞的检测鉴定了经过EMT的细胞，其对放化疗具有相对耐药性，并且易于转移。可以通过检测胚胎超甲基化DMR(参见PCT专利申请系列号PCT/US2020/047707，其全文通过引用并入本文)，或者通过检测本文所述的胚胎CPL亚型的转录RNA，或者通过检测CPL亚型细胞外抗原，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)、生物素标记的检测抗体或检测细胞表面抗原的等效方法实现胚胎与胎儿成人细胞状态的检测。
能够在体内安全检测胚胎CPL亚型表达模式的试剂可用于实时检测癌症，其中通过循环、局部注射将配体引入组织，或局部应用，其中所述配体可以直接发光如荧光，从而允许外科医生精确地标定癌前细胞或癌细胞的位置以进行破坏或去除。在美国专利9451882中描述了方法，其全部内容通过引用并入本文。
治疗应用
本发明的教导，特别是中枢神经系统外的不同体细胞胚胎细胞表达CPL亚型的胚胎模式的新见解，以及不同细胞类型的癌细胞经常恢复到CPL亚型表达的胚胎模式，但所述癌细胞可以在通常称为上皮-间质转化(也不恰当地称为“癌症干细胞”)中恢复到CPL亚型的人年模式的见解，允许多种治疗策略。
使用CPL亚型诱导组织再生(iTR)和癌症干细胞诱导性去衰老细胞(iS-CSC)
我们此前公开了使用PCDHB2和PCDHB17(参见PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601，其全部内容通过引用并入本文)以及PCDHA2、PCDHA4、PCDHA5、PCDHA10、PCDHA11、PCDHAC1、PCDHB2、PCDHB5、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB14、PCDHB16、PCDHGB3、PCDHGB4、PCDHGB6、PCDHGA6、PCDHGA7、PCDHGA9、PCDHGA10和PCDHGA12(参见PCT专利申请系列号PCT/US2017/036452，其全部内容通过引用并入本文)诱导组织再生(iTR)和诱导癌症成熟(iCM)，本文中，我们提供了通过靶向CPL亚型将不同的成人细胞类型重新编程到促进癌症干细胞的无瘢痕再生(iTR)或癌症干细胞诱导性去衰老细胞(iS-CSC)的状态的改进方法。
如图7中所示，CPL基因座出乎意料地被异常严格控制的染色质包围，这反映了胚胎细胞中与层粘连蛋白B1的结合，以及各种体细胞类型的胎儿和成人细胞中层粘连蛋白A的增加。该区域具有非常高的H3K9me3和H4K20me3组蛋白修饰的相对水平，所述组蛋白修饰具有异染色质的特征，如在着丝粒周围或端粒周围的DNA中。因此，重新编程因子，甚至是先驱因子，如由基因SOX2、OCT4、KLF4和NANOG编码的因子，都不能有效地重新编程成人细胞中胚胎CPL亚型的表达。因此，iTR和/或iS-SCS的改进方法利用了可以同时执行或在时间上分开执行的两个步骤，优选地，第一步骤首先发生。在第一步中，通过抑制一种或多种负责H3K9me3甲基化的甲基转移酶来放松H3K9me3异染色质；即由基因SUV39H1、SUV39H2和SETDB1编码的那些。这些基因产物活性的降低可以通过本领域公知的方法容易地实现，如使用靶向SUV39H1转录物的siRNA，或优选SUV39H1、SUV39H2和SETDB1转录物。可替代地，或除此之外，可以使用酶的小分子抑制剂，如SUV39H1抑制剂毛壳素、SUV39H2抑制剂OTS186935盐酸盐和SETDB1抑制剂光神霉素A、去甲氧羰基-3D-β-D-digitoxosyl-光神霉素SK(DIG-MSK)(也称为“EC-8042”)、链黑素和吐根碱。
在第二步中，将具有CPL亚型表达的成年模式的靶正常成年细胞或癌症细胞瞬时暴露于在其他条件下能够将细胞重编程为多能性的因子。这些因子可以包括直接或通过基因表达载体将RNA引入细胞的构建体，如果允许其与细胞反应足够长的时间，则所述构建体能够诱导多能性，但较短的时间可以引起iTR。基因表达载体是本领域公知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒载体。将基因表达载体引入细胞的方法是本领域公知的。例如，可以使用Lipofectamine或等效试剂进行转染。优选地，RNA不包含重编程为多能性所需的所有RNA，而是仅包含LIN28A或LIN28B，任选地与增加端粒长度的试剂一起，例如端粒酶催化成分(TERT)的RNA。最优选地，，诱导iTR的试剂是由LIN28A或LIN28B编码蛋白(例如GFER)诱导的基因/因子，任选地与增加端粒长度的试剂(例如编码TERT的RNA或基因)组合，和/或与本文公开的对iTR重要的因子组合，例如0.05-5mM的丙戊酸(优选1.0mM的丙戊酸)、1-100ng/mL的AMH(优选10ng/mL的AMH)和2-200ng/mL的GFER(优选20ng/mL)。当在体内施用时，这些因子优选在缓慢释放的水凝胶基质(例如，包含化学修饰和交联的透明质酸和胶原蛋白的水凝胶基质(如HyStem基质))中施用。
更优选地，因子选自能够在其他条件下诱导体细胞类型的多能性的试剂。此类试剂包括单独或组合的下述化合物：单独和组合的基因OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、ESRRB、NR5A2、CEBP、MYC、TERT、LIN28A和LIN28B。非限制性实例是通过AAV载体的瞬时表达，所述AAV载体从1-2周起瞬时表达因子LIN28B、OCT4、SOX2、NANOG和TERT的组合，或者可替代地，KLF4、OCT4，SOX2和TERT，其水平与正常hES细胞中的水平相当。所述因子还可以包括小分子化合物，如以下化合物的组合：糖原合酶3(GSK3)的抑制因子，其包括但不限于CHIR99021；TGF-β信号传导的抑制因子，其包括但不限于SB431542、A-83-01和E616452；HDAC抑制因子，其包括但不限于脂族酸化合物，所述脂族酸化合物包括但不限于丙戊酸、苯基丁酸和正丁酸，环四肽(包括曲霉毒素B和二肽)，异羟肟酸(例如曲古抑菌素A、伏立诺他(SAHA)、贝洛司他(PXD101)、LAQ824、帕诺贝司他(LBH589)和苯甲酰胺恩替司他(MS-275)、CI994、mocetinostat(MGCD0103))；特异针对I类(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8)，IIA类(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)，IIB类(HDAC6和HDAC10)，III类(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7)(包括sirtuin抑制因子烟酰胺、NAD的各种衍生物、二氢香豆素、萘并吡喃酮和2-羟基萘乙醛)，或IV类(HDAC11)脱乙酰基酶的那些；H3K4/9组蛋白脱甲基酶LSD1的抑制因子(包括但不限于parnate)；DotlL的抑制因子(包括但不限于EPZ004777)；G9a的抑制因子(包括但不限于Bix01294)；EZH2的抑制因子(包括但不限于DZNep)；DNA甲基转移酶的抑制因子(包括但不限于RG108)；5-氮杂-2’脱氧胞苷(商品名为Vidaza和Azadine)；维生素C，其能够抑制DNA甲基化，并能够增加Tetl，从而增加5hmC，这是脱甲基化的第一步；3’磷酸肌醇依赖性激酶1的激活因子(包括但不限于PS48)；糖酵解的启动子(包括但不限于槲皮素和果糖2，6-二磷酸(磷酸果糖激酶1的激活因子))；促进HIF1转录复合物活性的试剂(包括但不限于槲皮素)；RAR激动剂(包括但不限于AM580、CD437和TTNPB)；模拟缺氧的试剂(包括但不限于白藜芦醇)；增加端粒酶活性的试剂，包括但不限于端粒酶催化成分(TERT)的外源表达；通过下调LSD 1(H3K4特异性组蛋白脱甲基酶)促进表观遗传修饰的试剂(包括但不限于锂)；或MAPK/ERK通路的抑制因子(包括但不限于PD032590)。可以以各种组合、浓度和在不同的时间段内施用此类化合物以优化iTR对使用整体iTR标志物体外培养的细胞的影响，所述优化可例如通过测定COX7A1或NAALADL1或如本文所述的其他iTR抑制因子的表达的减少，和/或测定如本文所述的PCDHB2或AMH或其他激活因子或iTR的表达的增加或在体内受伤或患病的组织中的表达的增加，或在体内调节动物的生命历程来实现。
筛选、报告分子、细胞和膜
通常，可用于本发明的报告分子的可检测部分包含产生或猝灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号的光发射或吸光化合物。在某些实施方式中，CPL亚型基因的激活或其他亚型基因抑制导致可检测部分释放到液体培养基中，并且检测由存在于培养基(或其样品)中的释放的可检测部分产生或猝灭的信号。在某些实施方式中，所得信号引起可检测部分的特性的改变，并且这种改变可以例如作为光信号被检测到。例如，所述信号可以通过可检测部分改变电磁辐射(例如，波长在光谱的红外、可见或UV部分内的辐射)的发射或吸收。在某些实施方式中，报告分子包含荧光或发光部分，第二分子用作猝灭荧光或发光部分的猝灭剂。可以使用本领域已知的设备和方法来检测这种改变。
在本发明的许多实施方式中，报告分子是可以由细胞表达的可遗传编码的分子，并且可检测部分包含例如可检测多肽。因此，在某些实施方式中，报告分子是包含荧光多肽(例如绿色、蓝色、蓝宝石色、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白及其衍生物(例如增强的GFP)，单体红色荧光蛋白及其衍生物(例如被称为“mFruit”的衍生物(例如mCherry、mStrawberry、mTomato等))，和发光蛋白(例如水母发光蛋白))的多肽。(应当理解，在某些实施方式中，所述荧光或发光在一种或多种另外的分子(例如离子(如钙离子)和/或辅基(例如腔肠素)的存在下发生)。在某些实施方式中，可检测部分包括作用在底物上以产生荧光、发光、有色或其他可检测产物的酶。可以用作可检测部分的酶的实例包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。(将理解的是，通过检测反应产物来检测酶。)在某些实施方式中，可检测部分包含可以通过使用第二试剂(例如标记的(例如荧光标记的)抗体)来容易地检测的多肽标签。例如，可获得与HA、Myc或多种其他肽标签结合的荧光标记的抗体。因此，本发明包括可直接检测可检测部分的实施方式(即其不需要与第二试剂相互作用而产生可检测信号)和可检测部分与第二试剂相互作用(例如结合和/或反应)的实施方式。这种相互作用例如通过导致产生可检测信号或由于第二试剂可直接检测而使得可检测部分可检测。在可检测部分与第二试剂相互作用以产生可检测信号的实施方式中，可检测部分可以与第二试剂反应，由第二试剂作用以产生可检测信号。在许多实施方式中，信号强度提供了(例如在待评估的样品中或在待成像区域中存在的)可检测部分的量的指示。在某些实施方式中，任选地(例如基于相对或绝对信号强度)定量可检测部分的量。
本发明提供了包含编码本发明报告分子多肽的序列的核酸。在某些实施方式中，核酸编码本发明的报告分子多肽的前体多肽。在某些实施方式中，编码多肽的序列与适于指导编码所述多肽的mRNA的转录的表达控制元件(例如启动子或启动子/增强子序列)可操作地连接。本发明进一步提供了包含核酸的表达载体。合适的表达控制元件的选择可以基于例如要表达的核酸的细胞类型和种类。本领域普通技术人员可以容易地选择合适的表达控制元件和/或表达载体。在某些实施方式中，表达控制元件是可调控的，例如可诱导的或可抑制的。适用于细菌细胞的示例性启动子包括例如Lac、Trp、Tac、araBAD(例如在pBAD载体中)、噬菌体启动子(例如T7或T3)。可用于指导在哺乳动物细胞中表达的示例性表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子，腺病毒或巨细胞病毒极早期启动子，或病毒启动子/增强子序列，逆转录病毒LTR，来自哺乳动物基因的启动子或启动子/增强子(例如肌动蛋白、EF-1α、磷酸甘油酸激酶等)。可调控的(例如可诱导或可抑制的)表达系统(例如Tet-On和Tet-Off系统(可被四环素和类似物(例如强力霉素)调控的))和其他可被小分子(例如激素受体配体(例如可以是或不是类固醇的类固醇受体配体))调控的表达系统、金属调节系统(例如金属硫蛋白启动子)等。
本发明进一步提供了包含此类核酸和/或载体的细胞和细胞系。在某些实施方式中，细胞是真核细胞，例如真菌、植物或动物细胞。在某些实施方式中，细胞是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类细胞或啮齿动物细胞。通常，细胞是细胞系(例如已获得了在培养基中无限增殖的能力的(例如，由于突变或基因操作(例如端粒酶催化成分的组成型表达)而产生的)已建立的或永生化的细胞系)的一员。许多细胞系是本领域已知的，并且可以用于本发明中。哺乳动物细胞系包括例如HEK-293(例如HEK-293T)、CHO、NIH-3T3、COS和HeLa细胞系。在某些实施方式中，细胞系是肿瘤细胞系。在其他实施方式中，细胞是非致瘤性的和/或不是源自肿瘤的。在某些实施方式中，细胞是贴壁细胞。在某些实施方式中，使用非贴壁细胞。在某些实施方式中，所使用的细胞类型或细胞系已被证明天然地具有表达的iTR重编程基因或不表达的iTR抑制剂基因的子集。如果细胞缺乏一个或多个TR激活因子或抑制因子基因，则可以对该细胞进行基因工程改造以表达这种蛋白。在某些实施方式中，本发明的细胞系来自单个细胞。例如，可以用编码报告多肽的核酸转染细胞群，并且可以选择衍生自单个细胞的菌落并在培养物中扩增。在某些实施方式中，用编码报告分子的表达载体瞬时转染细胞。可以用对照质粒共转染细胞，该质粒任选地表达不同的可检测多肽，以控制转染效率(例如，多次测定间的)。
iTR、iS-CSC和ICM因子的使用
药物组合物
iTR、iS-CSC和iCM因子有各种不同的用途。本文讨论了这种用途的非限制性实例。在某些实施方式中，iTR因子用于增强器官或组织的再生。在某些实施方式中，使用iTR因子来增强肢体，手指，软骨，心脏，血管，骨骼，食道，胃，肝脏，胆囊，胰腺，肠，直肠，肛门，内分泌腺(例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺的内分泌部分)，皮肤，毛囊，胸腺，脾脏，骨骼肌，局灶性受损心肌，平滑肌，脑，脊髓，外周神经，卵巢，输卵管，子宫，阴道，乳腺，睾丸，输精管，精囊，前列腺，阴茎，咽，喉，气管，支气管，肺，肾，输尿管，膀胱，尿道，眼睛(例如视网膜、角膜)或耳朵(例如柯蒂氏器)。在某些实施方式中，iTR因子用于增强基质层(例如支持组织实质的结缔组织)的再生。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强手术后的再生，例如，手术需要去除至少一部分患病或受损的组织、器官或其他结构，例如肢体、手指等。这样的手术可以去除肝脏、肺、肾、胃、胰腺、肠、乳腺、卵巢、睾丸、骨头、四肢、手指、肌肉、皮肤等的至少一部分。在某些实施方式中，该手术是去除肿瘤。在某些实施方式中，iTR因子用于促进创伤、手术、疾病和烧伤后皮肤的无疤再生。
在各种实施方式中，增强再生可包括以下的任何一种或多种：(a)提高再生速率；(b)增加再生程度；(c)促进在再生的组织或器官或其他身体结构中建立适当的结构(例如，形状、图案、组织结构、组织极性)；(d)以保持和/或恢复功能的方式促进新组织的生长。尽管特别关注使用iTR因子来增强再生，但是本发明总体上包括使用iTR因子来增强修复或创口愈合，而不一定产生可检测的再生增强。因此，本发明提供了增强修复或创口愈合的方法，其中根据本文所述的任何方法将iTR因子施用于需要其的受试者。
在本发明中教导了衰老和与年龄有关的疾病的许多方面，其可以用iTR疗法解决。这些衰老表现包括与年龄有关的血管功能障碍，包括周围血管、冠状动脉和脑血管疾病；肌肉骨骼疾病，包括骨关节炎、椎间盘退变、骨折、肌腱和韧带撕裂以及肢体再生；神经系统疾病，包括中风和脊髓损伤；肌肉疾病，包括肌肉营养不良、肌肉减少症、心肌梗塞和心力衰竭；内分泌疾病，包括I型糖尿病、艾迪生氏病、甲状腺功能减退和垂体功能不全；消化系统疾病，包括胰腺外分泌功能不全；眼部疾病，包括黄斑退行性、色素性视网膜炎和神经视网膜退行性疾病；皮肤病，包括皮肤烧伤、撕裂伤、手术切口、脱发、头发变白和皮肤老化；肺部疾病，包括肺气肿和肺间质纤维化；听觉障碍，包括听力损失；和血液系统疾病，例如再生障碍性贫血和造血干细胞移植失败。
在某些实施方式中，本发明提供了一种在需要其的受试者中增强再生的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的iTR因子。在某些实施方式中，化合物(例如iTR因子)的有效量是与参照值(例如合适的对照值)相比导致受损组织再生的速率或程度增加的量。在某些实施方式中，参照值是在不存在化合物的情况下预期的(例如平均或典型的)再生速率或再生程度(任选地与安慰剂一起施用)。在某些实施方式中，iTR因子的有效量是与在不存在化合物的情况下预期的(例如平均或典型的)结构或功能结果相比改善的结构和/或功能结果的量。在某些实施方式中，有效量的化合物，例如iTR因子，导致增强的芽基形成和/或减少的瘢痕形成。例如，可以基于再生组织的尺寸或体积来评估再生的程度或速率。可以基于例如视觉检查(可选地包括使用显微镜或成像技术(例如X射线、CT扫描、MRI扫描、PET扫描))和/或通过评估组织、器官或其他身体部位执行通常由此类组织、器官或身体部位执行的一个或多个生理过程或任务的能力来评估结构和/或功能结果。通常，改善的结构结果是相比于不使用iTR因子进行治疗预期的结构结果(例如平均或典型结果)与正常结构(例如组织损伤之前存在的结构或正常、健康个体中存在的结构)更相似的结构结果。本领域普通技术人员可以选择适当的测定或功能测试。在某些实施方式中，再生速率或程度相比于对照值的增加在统计学上是显著的(例如，p值<0.05，或p值<0.01)和/或临床上显著的。在某些实施方式中，结构和/或功能结果相比于对照值的改善在统计学上和/或临床上是显著的。“临床上的显著改善”是指在医学或外科医师的合理判断范围内，赋予受试者有意义的益处(例如，足以使治疗值得的益处)的改善。将理解的是，在许多实施方式中，施用于特定物种的受试者(例如出于治疗目的)的iTR调节子(例如iTR因子)是调节(例如抑)所述物种的受试者中表达的内源TR基因的化合物。例如，如果受试者是人，通常将施用抑制人TR抑制因子基因产物的活性并激活人TR激活因子基因产物的活性的化合物。
在某些实施方式中，iTR因子用于例如在烧伤(热或化学的)、刮擦损伤或涉及皮肤损失的其他情况(例如感染(例如坏死性筋膜炎或暴发性紫癜))之后增强皮肤再生。在某些实施方式中，烧伤是二级烧伤或三级烧伤。在某些实施方式中，皮肤损失的区域具有至少10cm2的面积。一方面，iTR因子增强移植皮肤的再生。一方面，iTR因子减少过度的和/或病理的创口收缩或瘢痕形成。
在某些实施方式中，例如在诸如不愈合骨折、植入物固定、牙周或牙槽隆起、颅面外科手术或认为新骨生成合适的其他条件的情况下，使用iTR因子来增强骨再生。在某些实施方式中，将iTR因子应用于需要骨再生的部位。在某些实施方式中，将iTR因子结合到骨移植材料中或与之结合使用。骨移植材料包括多种陶瓷和蛋白材料。骨移植材料包括自体骨(例如从髂骨、腓骨、肋骨等处收集的骨)，来自尸体的同种异体骨和异种骨。合成骨移植材料包括多种陶瓷(例如磷酸钙(例如羟基磷灰石和磷酸三钙))，生物玻璃和硫酸钙，以及蛋白材料(例如脱矿质骨基质(DBM))。可以通过研磨皮质骨组织(通常至100-500μm筛分的粒度)，然后用盐酸(通常为0.5至1N)处理研磨的组织来制备DBM。在某些实施方式中，将iTR因子与一种或多种骨移植材料一起施用于受试者。可以将iTR因子与骨移植物材料组合(在包含iTR因子和骨移植物材料的组合物中)，或者例如在放置移植物之后单独施用。在某些实施方式中，本发明提供了包含iTR因子的骨膏。骨膏是具有适当稠度和成分的产品，因此可以将它们引入到骨骼缺陷中(例如空隙、缝隙、空腔、裂缝等)并用于修补或填充此类缺陷，或应用于现有的骨骼结构。骨膏通常具有足够的延展性，以允许使用者将其操纵和模制成各种形状。这种处理的期望结果是将发生骨形成以替代膏剂，例如保持膏剂被施加的形状。骨膏为新的骨形成提供支撑结构，并且可以包含促进骨形成的物质。除了一种或多种陶瓷或蛋白骨移植材料(例如DBM、羟基磷灰石)外，通常还包含一种或多种赋予材料膏状或腻子状稠度的成分，例如透明质酸、壳聚糖、淀粉成分(如支链淀粉)。
在某些实施方式中，iTR因子增强骨祖细胞从未分化的间充质细胞的形成和/或募集和/或增强骨祖细胞向形成新骨的细胞(成骨细胞)的分化。
在某些实施方式中，向患有骨质减少或骨质疏松的受试者施用iTR因子，例如以增强受试者的骨再生。
在某些实施方式中，使用iTR因子来增强关节(例如纤维、软骨或滑膜关节)的再生。在某些实施方式中，关节是椎间盘。在某些实施例中，关节是髋，膝，肘或肩关节。在某些实施方式中，使用iTR因子来增强牙齿和/或牙周组织或结构(例如牙髓、牙周韧带、牙齿、牙周骨)的再生。
在某些实施方式中，iTR因子用于减少CNS和PNS损伤中的神经胶质瘢痕形成。
在某些实施例中，iTR因子用于减少内部手术中的粘连和狭窄形成。
在某些实施方式中，iTR因子用于减少肌腱和韧带修复中的瘢痕形成，从而改善活动性。
在某些实施方式中，iTR因子用于减少眼外伤后的视力丧失。
在某些实施方式中，将iTR因子与细胞组合施用于受试者。iTR因子和细胞可以分别施用或在相同的组合物中施用。如果分开施用，它们可以在相同或不同位置施用。在各种实施方式中，细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。所述细胞可包含祖细胞或干细胞，例如成年干细胞。如本文所用，干细胞是具有至少以下性质的细胞：(i)自我更新，即经历许多细胞分裂循环而仍保持未分化状态的能力；(ii)多潜能或多分化潜能，即产生几种不同细胞类型(例如特定组织或器官的许多、大多数或所有不同细胞类型)的后代的能力。成人干细胞是源自非胚胎组织(例如胎儿、出生后或成体组织)的干细胞。如本文所用，术语“祖细胞”涵盖比多能干细胞更分化但未完全分化的多能细胞。与胚胎祖细胞相比，这种更高分化的细胞(可能来自胚胎祖细胞)具有较低的自我更新能力。在某些实施方式中，将iTR因子与间充质祖细胞、神经祖细胞、内皮祖细胞、毛囊祖细胞、神经嵴祖细胞、乳干细胞、肺祖细胞(例如支气管肺泡干细胞)、肌肉祖细胞(例如卫星细胞)、源自脂肪的祖细胞、上皮祖细胞(例如角质形成细胞干细胞)和/或造血祖细胞(例如造血干细胞)联合施用。在某些实施方式中，细胞包括诱导的多能干细胞(iPS细胞)或已经从iPS细胞至少部分分化的细胞。在某些实施方式中，祖细胞包括成体干细胞。在某些实施方式中，至少某些细胞是分化的细胞，例如软骨细胞、成骨细胞、角质形成细胞、肝细胞。在某些实施方式中，所述细胞包括成肌细胞。
在某些实施方式中，在包含一种或多种化合物的组合物(例如溶液)中施用iTR因子，所述一种或多种化合物在施用给受试者后原位聚合或变得交联或经历相变，通常形成水凝胶。该组合物可以包含单体、聚合物、引发剂、交联剂等。该组合物可以被施加(例如使用注射器)到需要再生的区域，在该区域它就地形成凝胶，iTR因子从该区域随时间释放。可以例如通过与体液中的离子接触或通过改变温度或pH或通过光或通过组合反应性前体(例如使用多管注射器)来触发胶凝。(参见，例如，美国专利号6,129,761；Yu L,DingJ.Injectable hydrogels as unique biomedical materials.Chem Soc Rev.37(8):1473-81(2008))。在某些实施方式中，水凝胶是透明质酸或透明质酸和含胶原蛋白I的水凝胶(例如本文所述的HyStem-C)。在某些实施方式中，组合物还包含细胞。
在某些实施方式中，将iTR因子与表达端粒酶催化成分的载体组合施用给受试者。载体可以单独或在相同的组合物中施用。如果分开施用，它们可以在相同或不同位置施用。载体可以从与被治疗的组织相同的物种或从另一物种表达端粒酶催化组分。所述iTR因子与端粒酶催化组分的共同施用特别有用，其中靶组织来自老年个体，并且所述个体来自人物种。
本发明的其他方法包括在活体、功能组织、器官或含细胞的组合物的离体生产中使用iTR因子以修复或替换由于损伤而损失的组织或器官。例如，从个体(未来的接受者、相同物种的个体或不同物种的个体)中去除的细胞或组织可以在体外培养，任选地与基质、支架(例如三维支架)或模具(例如，包含生物相容性，任选地可生物降解的材料，例如聚合物(例如HyStem-C))一起培养，并且可以通过接触iTR因子来促进它们向功能组织或器官的发育。所述支架、基质或模具可以至少部分由天然存在的蛋白(例如胶原蛋白、透明质酸或藻酸盐(或其中任何一种的化学修饰衍生物)，或乳酸、己内酯、乙醇酸的合成聚合物或共聚物酸等，或自组装的肽，或衍生自诸如心脏瓣膜、肠粘膜、血管和气管等组织的脱细胞基质组成。在某些实施方式中，支架包含水凝胶。在某些实施方式中，支架可以用iTR因子包被或浸渍，所述iTR因子可以随时间从支架中扩散出来。离体生产后，将组织或器官移植到受试者内或受试者上。例如，可以植入组织或器官，或者在某些组织(例如皮肤)的情况下，可以将其放置在体表上。组织或器官可继续在体内发育。在某些实施方式中，至少部分离体产生的组织或器官是膀胱、血管、骨骼、筋膜、肝脏、肌肉、皮肤块等。合适的支架可以例如模拟细胞外基质(ECM)。任选地，在离体产生的组织或器官的移植之前、期间和/或之后将iTR因子施用于受试者。在某些方面，生物相容性材料是在所使用的浓度下对体外细胞基本上无毒的材料，或者在向活体受试者施用的材料的情况下，一定量的生物相容性材料对受试者的细胞基本上无毒。并且在所使用的位置上不会引起或对受试者产生显著的有害或不利影响(例如免疫学或炎性反应、不可接受的瘢痕组织形成等)。应当理解，某些生物相容性材料可能在一小部分受试者(通常小于约5％、1％、0.5％或0.1％)的体内引起此类不良反应。
在某些实施方式中，用iTR因子或包括能够引起iTR基因表达的全局模式的因子的因子的组合包被或浸渍的基质或支架任选地与细胞组合，植入需要再生的受试者中。基质或支架可以是需要再生的组织或器官的形状。所述细胞可以是产生这种组织或器官和/或在这种组织或器官中发现的一种或多种类型的干细胞。
在某些实施方式中，将iTR因子或因子的组合直接施用至组织损伤部位或附近。“直接到达组织损伤部位”包括将化合物或组合物注射入组织损伤部位或使扩散、倾倒或将化合物或组合物直接与组织损伤部位接触。在某些实施方式中，如果施用发生在距组织损伤部位或至少部分位于受损的组织或器官内的血管(例如动脉)的可见或明显边缘约10cm以内的位置，则被认为施用在“组织损伤部位附近”。“在组织损伤部位附近”施用有时是在受损器官内，但损伤不明显的位置施用。在某些实施方式中，在组织、器官或其他结构的损坏或丢失之后，将iTR因子施加到组织、器官或其他结构的其余部分。在某些实施方式中，将iTR因子施加到仍与身体连接的被切断的手指或肢体的末端，以增强已丢失的部分的再生。在某些实施方式中，将切断的部分通过外科手术重新连接，并且将iTR因子施加至创口的一个或两个表面。在某些实施方式中，施用iTR因子以增强移植器官或其部分的植入或愈合或再生。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强神经再生。例如，可以将iTR因子注入到切断的神经中(例如在近端和/或远端残端附近)。在某些实施方式中，将iTR因子置于人工神经导管内，所述人工神经导管是由生物或合成材料组成的管，神经末梢和介入间隙被封闭在其中。可以将一种或多种因子配制成基质以促进其随时间的受控释放。所述基质可以包含生物相容性，任选地可生物降解的材料，例如聚合物，例如包含透明质酸的聚合物，包括与PEGDA交联的交联透明质酸或羧甲基透明质酸酯，或由PEGDA交联的羧甲基透明质酸酯与羧甲基改性的明胶的混合物(HyStem-C)。
在某些实施方式中，iTR因子是本文所述的AgeXl547，并且可以配制成或不配制成用于在PEGDA与羧甲基改性的明胶(HyStem-C)交联的羧甲基透明质酸酯中的定位和缓慢释放以诱导iTR。
iTM和iCM因子(例如来自胎儿或成年细胞的外来体)可以在生理溶液(例如生理盐水)中施用，也可以在PEGDA与羧甲基修饰的明胶(HyStem-C)交联的羧甲基透明质酸中缓慢释放以诱导iTM或iCM。
在某些实施方式中，使用iTR因子或因子的组合来促进毛囊的产生和/或头发的生长。在某些实施方式中，iTR因子触发通常不形成头发的上皮细胞的毛囊再生。在某些实施方式中，iTR因子用于治疗男性或女性的脱发、头发稀疏、部分或完全秃发。在某些实施方式中，秃头是没有或基本上没有头发或在其经常生长的地方(例如在头部的顶部、背面和/或侧面)缺少头发的状态。在某些实施方式中，头发稀疏是这样的状态：其头发少于正常或普通头发，或者在某些实施方式中，头发少于个体过去的头发，或者在某些实施方式中，头发少于个体认为理想的头发。在某些实施方式中，iTR因子用于促进眉毛或睫毛的生长。在某些实施方式中，将iTR因子用于治疗雄激素性脱发或“男性型秃发”(其可影响男性和女性)。在某些实施方式中，使用iTR因子来治疗斑秃(其涉及头皮上的斑状脱发)、总秃发(其涉及所有头毛的损失)或通用秃头(其涉及头和身体的所有毛发的损失)。在某些实施方式中，将iTR因子应用于需要毛发生长的部位，例如头皮或眉毛区域。在某些实施例中，将iTR因子施加到眼睑的边缘或边缘附近，以促进睫毛的生长。在某些实施方式中，将iTR因子应用于液体制剂中。在某些实施方式中，将iTR因子应用于乳膏、软膏、膏剂或凝胶中。在某些实施方式中，将iTR因子用于增强烧伤、手术、化学疗法或其他引起脱发或带发皮肤损失的事件之后的毛发生长。
在某些实施方式中，将iTR因子或因子的组合施用于患有与年龄相关的退行性变化的组织以再生年轻化功能。所述与年龄有关的退行性变化包括但不限于与年龄有关的黄斑退行性、冠状动脉疾病、骨质疏松、骨坏死、心力衰竭、肺气肿、外周动脉疾病、声带萎缩、听力丧失、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮肤溃疡以及其他与年龄有关的退行性疾病。在某些实施方式中，所述iTR因子与表达端粒酶的催化成分的载体共同施用以延长细胞寿命。
在某些实施方式中，施用一种或多种iTR因子以增强由于诸如化学疗法、放射或毒素之类的伤害而丢失或损坏的细胞的替换。在某些实施方式中，这样的细胞是实体器官和组织的基质细胞。
本发明的治疗方法可以包括鉴定或提供患有疾病或病况或处于其中的风险或风险中的受试者的步骤，其中增强再生将对所述受试者有益。在某些实施方式中，所述受试者经历了损伤(例如身体创伤)或对组织或器官的损伤。在某些实施方式中，损伤的是肢体或手指。在某些实施方式中，受试者患有影响心血管、消化、内分泌、肌肉骨骼、胃肠道、肝、皮肤、神经、呼吸或泌尿系统的疾病。在某些实施方式中，组织损伤是指对组织、器官或结构的损害，例如软骨、骨骼、心脏、血管、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、直肠、肛门、内分泌腺、皮肤、毛囊、牙齿、牙龈、嘴唇、鼻子、嘴巴、胸腺、脾脏、骨骼肌、平滑肌、关节、大脑、脊髓、末梢神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、肾、输尿管、膀胱、尿道、眼睛(例如视网膜、角膜)或耳朵(例如柯蒂氏器)。
在某些实施方式中，在受试者遭受组织损伤(例如，创伤或急性疾病相关事件，例如心肌梗塞或中风)后约2、4、8、12、24、48、72或96小时内向受试者施用化合物或组合物至少一次，并且任选地在该次之后至少再施用一次。在某些实施方式中，在受试者遭受组织损伤后约1-2周、2-6周或6-12周内将化合物或组合物施用于受试者至少一次，并且任选地在该次之后至少再施用一次。
在本发明的某些实施方式中，通过例如在需要再生或从头发展的部位去除皮肤、去除至少一些组织，摩擦需要再生或从头开始发展的关节或骨表面，和/或在受试者上造成另一类型的创口，来刺激或促进缺失或发育不良的组织、器官或结构的再生或从头发展可能是有用的。在组织损伤后再生的情况下，可能希望去除(例如通过手术切除或清创术)至少某些损伤的组织。在某些实施方式中，在这样的去除或磨损的部位或附近施用iTR因子。
在某些实施方式中，将iTR因子用于增强受试者中组织或器官的生成，在所述受试者中，由于先天性疾病(例如遗传性疾病)而至少部分不存在这种组织或器官。许多先天畸形会导致发育不全或缺乏各种组织、器官或身体结构，例如四肢或手指。在其他情况下，导致组织、器官或其他身体结构发育不全的发育障碍在出生后变得很明显。在某些实施方式中，将iTR因子施用于患有发育不全或缺乏组织、器官或其他身体结构的受试者以刺激此类组织、器官或其他身体结构的生长或发育。在某些方面，本发明提供了一种在发育不全或先天性缺乏这种组织、器官或其他身体结构的受试者中增强所述组织、器官或其他身体结构的产生的方法，所述方法包括将iTR因子施用于受试者。在某些实施方式中，将iTR因子在出生前即在子宫内施用于受试者。本文中描述的本发明的关于再生的各个方面和实施方式适用于组织、器官或其他身体结构的这种从头产生，并且包括在本发明内。
在某些方面，在新的组织生长于之前不存在这种组织的位置且所述生长有益的多种情况中的任一情况下，使用iTR因子来增强组织的产生。例如，在脊柱或其他关节融合的情况下，在关节之间生成骨组织通常是有用的。
可以在多种再生动物模型中测试iTR因子。一方面，在鼠类物种中测试了iTR的调节子。例如，可以使小鼠受伤(例如通过切口、截肢、横切或组织碎片的去除)。将iTR因子应用于创口部位和/或去除的组织碎片，并评估其对再生的影响。可以在多种用于组织或器官再生的脊椎动物模型中测试脊椎动物TR调节子的作用。例如，如在(Mathew L K,Unraveling tissue regeneration pathways using chemical genetics.J BiolChem.282(48):35202-10(2007))中所述的，可以在斑马鱼中评估鳍的再生，并且可将其用作肢体再生的模型。啮齿动物、犬、马、山羊、鱼、两栖动物和其他可用于测试治疗对组织和器官(如心脏、肺、四肢、骨骼肌、骨骼等)再生作用的动物模型已被广泛使用。例如，在Tissue Eng Part B Rev.16(1)(2010)中讨论了用于肌肉骨骼再生的各种动物模型。用于研究肝再生的常用动物模型包括通过手术切除较大部分的啮齿动物肝脏。肝再生的其他模型包括急性或慢性肝损伤或由毒素(例如四氯化碳)引起的肝衰竭。在某些实施方式中，用于毛发再生或皮肤创口愈合的模型涉及例如从小鼠切下皮肤块。可以评估毛囊的再生、毛发生长、上皮再形成、腺体形成等。
可以通过任何合适的方式(例如口服、鼻内、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、气管内、眼内、舌下、阴道、直肠、皮肤或通过吸入(例如作为气雾剂))施用本文公开的和/或使用本文描述的方法和/或测定系统鉴定的化合物和组合物。当然，所选择的特定模式将取决于所选择的特定化合物、所治疗的特定病症以及治疗功效所需的剂量。一般而言，本发明的方法可以使用医学上或兽医学上可接受的任何施用方式来实施，这是指产生可接受水平的功效而不会引起临床上不可接受的(例如，医学上或兽医学上不可接受的)副作用的任何方式。可以将一种或多种化合物的合适制剂，例如基本上纯的制剂与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂等组合，以产生适合于给予受试者的合适的药物组合物。这样的药学上可接受的组合物是本发明的一个方面。术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指不会明显干扰活性成分的生物学活性或有效性的载体(该术语包括载体、介质、稀释剂、溶剂、媒介物等)或赋形剂。在组合物的使用或施用浓度下，该组合物对宿主没有过度毒性。组合物中也可以存在其他药学上可接受的成分。合适的物质及其在制备药物活性化合物中的用途是本领域众所周知的(参见例如"Remington's PharmaceuticalSciences",E.W.Martin，第19版，1995，Mack Publishing Co.：Easton,Pa.,和更新的版本，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第21版，Philadelphia,Pa.Lippincott Williams&Wilkins,2005，其为对药学上可接受的物质和制备各种类型药物组合物的方法的进一步探讨)。此外，本发明的化合物和组合物可以与本领域中用于治疗特定疾病或目的病症的任何化合物或组合物组合使用。
通常将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。例如，肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液(包括盐水和缓冲介质，例如氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液)。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；防腐剂，例如抗菌剂(例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。这样的肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体混合来容易地配制化合物。这样的载体使本发明的化合物可以配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。用于口服剂型的合适的赋形剂是例如填充剂，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
为了通过吸入施用，本发明的组合物可以以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器中输送，所述压力容器或分配器包含合适的推进剂，例如诸如二氧化碳、碳氟化合物或喷雾器之类的气体。可以使用液体或干燥的气雾剂(例如干燥的粉末、大的多孔颗粒等)。本发明还考虑了使用鼻喷雾剂或其他形式的鼻腔施用来递送组合物。
对于局部应用，可以将药物组合物配制成合适的软膏、洗剂、凝胶或乳膏，其中含有悬浮或溶解在一种或多种适用于该组合物的药学上可接受的载体中的活性成分。
为了局部递送至眼睛，可将药学上可接受的组合物配制成在等渗的pH调节的无菌盐水中的溶液或微粉化的悬浮液，例如用于滴眼剂或软膏中，或用于眼内施用，例如通过注射。
可以配制药物组合物用于经粘膜或经皮递送。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中可以使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。本发明药物组合物可以配制成栓剂(例如，与常规的栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或配制成用于直肠递送的灌肠剂。
在某些实施方式中，组合物包含一种或多种旨在保护活性剂免于迅速从体内清除的试剂，例如控释制剂、植入物、微囊递送系统等。组合物可掺入试剂以改善稳定性(例如在胃肠道或血液中)和/或增强吸收。可以将化合物包封或掺入颗粒(例如微粒或纳米颗粒)中。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、PLGA、胶原蛋白、聚原酸酯、聚醚和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。例如但不限于，本领域已知许多基于颗粒、脂质和/或聚合物的递送系统用于递送siRNA。本发明考虑了此类组合物的用途。脂质体或其他基于脂质的颗粒也可以用作药学上可接受的载体。
可以在满足监管机构规定的标准、要求或指南的条件下制造药物组合物和用于此类组合物的化合物。例如，此类组合物和化合物可以根据良好操作规范(GMP)进行生产和/或遵循适用于向人施用的药剂的质量控制程序，并可以得到由负责管理药品、外科手术或其他具有有益治疗性的产品的政府监管机构批准的标签。
本发明的药物组合物，当出于治疗目的而施用于受试者时，优选地以足以治疗其所施用的疾病或病状的时间和量施用。活性剂的治疗功效和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序进行评估。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于配制一系列适用于人或其他受试者的剂量。如本领域已知的，可以在人的临床试验中进一步测试用于人施用的不同剂量。使用的剂量可以是最大耐受剂量或较低剂量。药物组合物中活性剂的治疗有效剂量可以在约0.001mg/kg至约100mg/kg体重、约0.01至约25mg/kg体重、约0.1至约20mg/kg体重、约1至约10mg/kg的范围内。其他示例性剂量包括例如约1μg/kg至约500mg/kg、约100mg/kg至约5mg/kg。在某些实施方式中施用单剂，而在其他实施方式中施用多剂。本领域普通技术人员将理解，在任何特定情况下的适当剂量取决于所使用的药剂的效力，并且可以任选地针对特定接受者进行调整。受试者的具体剂量水平可能取决于多种因素，包括所用特定药剂的活性、特定的疾病或状况及其严重性、年龄、体重、受试者的总体健康状况等。为了易于施用和剂量均匀，可能需要以单位剂型配制药物组合物，特别是用于口服或肠胃外组合物的药物组合物。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元均包含预定量的活性剂，该活性剂经计算可产生所需的治疗效果，并包含适当的药学上可接受的载体。将理解的是，治疗方案可以包括在一段时间内施用多种剂量，例如单位剂型，其可以持续数天、数周、数月或数年。受试者可以在治疗期内每天接受一剂或多剂，或者每隔一天或更不频繁地接受一剂。例如，可以每两周、每周等施用。例如，可以继续施用直到组织或器官的适当结构和/或功能已经至少部分恢复和/或直到继续施用该化合物似乎并未促进进一步的再生或改善为止。在某些实施方式中，受试者向他或她施用一剂或多剂本发明的组合物。
在某些实施方式中，例如为了增强再生的目的，组合施用两种或更多种化合物或组合物。组合施用的化合物或组合物可以在相同的组合物中一起施用或分开施用。在某些实施方式中，“组合”施用是指进行相对于第一和第二化合物或组合物的施用的以下施用：(i)在第一试剂的最近施用剂量的90％以上被代谢为无活性形式或从体内排出之前施用第二化合物剂量；或(ii)在彼此之间的48、72、96、120或168小时内施用第一剂和第二剂剂量，或(iii)在重叠的时间段内(例如连续或间歇输注)施用药物；(iv)上述各项的任何组合。在某些实施方式中，施用两个或更多个iTR因子或表达端粒酶和iTR因子的催化组分的载体。在某些实施方式中，将iTR因子与与一种或多种生长因子、生长因子受体配体(例如激动剂)、激素(例如类固醇或肽激素)或信号分子结合使用，以促进再生和极性。特别有用的是组织中心分子，其可用于组织再生感受态细胞(例如使用本发明的方法产生的感受态细胞)。在某些实施方式中，生长因子是表皮生长因子家族成员(例如EGF、神经调节蛋白)，成纤维细胞生长因子(例如FGF1-FGF23中的任何一种)，肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子，骨形态发生蛋白(例如BMP1-BMP7中的任何一种)，血管内皮生长因子(VEGF)，wnt配体，wnt拮抗剂，视黄酸，NOTUM，卵泡抑素，音猬因子(sonic hedgehog)或其他组织性中心因子。
iTM和iCM因子的来源
iTM和iCM因子可通过将缺乏EFT标志物的胚胎细胞(例如，作为非限制性示例，不表达COX7A1的基质细胞)暴露于多种试剂中并检测所述标志物(如COX7A1或报告基因构建体(例如用COX7A1基因启动子表达的GFP构建体))的诱导来鉴定。
由于外泌体携带能够重编程细胞以赋予新的生长、迁移和分化特性的有效蛋白和RNA因子，因此我们检测了它们是否能够重编程细胞的发育状态，即iTM和iCM。因此，我们测试了成年细胞的外泌体在胚胎细胞中诱导成年基因的能力。我们通过对15种同系列的hESC衍生的克隆胚胎祖细胞系的Illumina微芯片分析评估了总RNA表达谱，并将它们与从各种解剖部位(未显示)获得的18种原代内皮细胞系(新生至成年)进行了比较。我们确定，来自已经通过EFT的细胞的外泌体能够诱导COX7A1在先前缺乏这种表达的胚胎细胞中表达，以及使用本文所述的其他标志物使细胞成熟。
仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方式的许多等同方式。本发明的范围不旨在限于说明书或其中阐述的细节。除非有相反的指示或从上下文中可以明显看出，否则诸如“一个/种(a、an)”和“所述(the)”的冠词可以表示一个或多个。通常使用例如体外或体内细胞群来实践本发明的某些方法。因此，对“细胞”的提及应理解为包括其中细胞是细胞群的成员的实施方式，所述细胞群例如是包含遗传上基本相同的细胞的群或由其组成的群。然而，本发明包括将本发明的方法应用于单个细胞的实施方式。因此，对“细胞”的提及应理解为包括适用于细胞群内单个细胞的实施方式和适用于单个分离的细胞的实施方式。
除非另有说明或从上下文中显而易见，否则如果在给定的产品或方法中存在、使用组成员的一个、多于一个或全部，或组成员的一个、多于一个或全部与给定的产品或方法相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或说明将被认为是满足条件的。本发明包括给定产品或方法中存在、使用的组的正好一个成员或与给定产品或方法相关的组的正好一个成员的实施方式。本发明还包括组成员的一个或多个存在于、用于给定产品或方法中或组成员的一个或多个与给定产品或方法相关的实施方式。可以预期的是，本文所述的所有实施方式均适用于本发明的所有不同方面。还可以想到，任何实施方式都可以在适当的时候与一个或多个其他这样的实施方式自由地组合。此外，应理解，本发明涵盖所有的将来自一个或多个权利要求(无论是原始权利要求还是随后添加的权利要求)的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等引入另一个权利要求(无论是原始权利要求还是随后添加)的变化、组合和置换。例如，可以将从属于另一个权利要求的任何权利要求修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个要素或限制，并且可以将引用不同权利要求中存在的要素的任何权利要求修改为包括在与所述权利要求从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个要素或限制。此外，在权利要求中记载组合物的情况下，本发明提供了例如根据本文公开的方法制备该组合物的方法，以及例如出于本文公开的目的使用该组合物的方法。在权利要求书中记载方法的情况下，本发明提供了适于执行该方法的组合物以及制备该组合物的方法。同样地，除非另有说明或除非本领域的普通技术人员意识到矛盾或不一致之处的出现，否则在权利要求中记载了制备组合物的方法的情况下，本发明提供了根据本发明的方法制备的组合物和使用该组合物的方法。在要素以列表(例如以马库什(Markush)组形式)表示的情况下，还公开了要素的每个子组，并且可以从组中删除任何要素。为了简洁起见，这里仅具体描述了这些实施方式中的某些，但是本发明包括所有这样的实施方式。还应该理解的是，通常，在将本发明或本发明的方面称为包含特定要素、特征等的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方式由或基本上由这样的要素、特征等组成。
在本文提到数值范围的情况下，本发明包括包括端点的实施方式，两个端点都被排除的实施方式，和其中一个端点被包括而另一端点被排除的实施方式。除非另有说明，否则应假定包括两个端点。此外，除非另有指示或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施方式中，表示为范围的值可以采用所述范围内的任何特定值或子范围，直至范围下限单位的十分之一。在使用诸如“小于X”、“大于X”或“至少X”之类的短语(其中X是数字或百分比)时，应理解可以选择任何合理的值作为范围的下限或上限。还应理解，在本文中列出数值列表的情况下(无论是否以“至少”开头)，本发明包括与列表中的任何两个值所限定的任何中间值或范围有关的实施方式，并且最小值可以取为最小值，最大值可以取为最大值。此外，在数字列表(例如百分比)以“至少”作为前缀的情况下，该术语适用于列表中的每个数字。对于本发明的其中数值以“约”或“近似”开头的任何实施方式，本发明包括其中记载了精确值的实施方式。对于其中数值不以“约”或“近似”开头的本发明的任何实施方式，本发明包括其中数值以“约”或“近似”开头的实施方式。除非另外说明或从上下文中可以明显看出(例如该数字不允许超过可能值的100％)，否则“约”或“大约”通常包括落在任一方向上的数字的1％范围内的数字，在某些实施方式中为5％，在某些实施方式中为10％(大于或小于该数字)。除非另有说明，否则本文所用的“组合物”可以包括一种或多种组分。例如，“包含激活因子或TR激活因子的组合物”可以由TR激活因子的激活因子组成或基本由其组成，或者可以包含一种或多种另外的组分。应当理解的是，除非另有说明，否则本发明的任何实施方式中的抑制因子或TR抑制因子(或本文中提及的其他化合物)可以以包含一种或多种另外的组分的组合物的形式使用或施用，所述另外的组分包括TR激活因子的激活因子。
新型癌症治疗策略
本发明的方法和组合物还提供了新的癌症治疗和伴随诊断。α和βCPL的亚型在不同类型的胚胎细胞中大量表达，直到胚胎-胎儿转变(即胎儿前)，但除了在CNS细胞(如CNS神经元)中的一些表达外，在随后的胎儿和成人发育中，在不同的体细胞类型中不表达。由于由CPL亚型基因编码的蛋白在细胞表面上表达并暴露于细胞外，本发明教导所述蛋白可以用作癌症免疫疗法的靶抗原，所述靶抗原使用特异性识别所述α和βCPL亚型蛋白的免疫球蛋白超家族成员。作为非限制性实例，可以向患者施用针对由α簇基因PCDHA1、PCDHA2、PCDHA3、PCDHA4、PCDHA5、PCDHA6、PCDHA7、PCDHA8、PCDHA9、PCDHA10或PCDHA11，或β簇基因PCDHB1、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB7、PCDHB8、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB17P、PCDHB18P或PCDHB19P编码的蛋白的单克隆或多克隆抗体以促进对癌症的体液免疫应答。
或者，靶向α或βCPL亚型的双特异性抗体，如双特异性T细胞衔接子，可用于触发癌细胞中特异性的免疫破坏。作为非限制性实例，所述双特异性抗体可由两个单链可变片段组成，其中一个可变片段与靶α或βCPL亚型结合，另一个与T细胞抗原如CD3结合。
或者，靶向α或βCPL亚型的抗体可以与毒素(抗体-药物缀合物)偶联，以特异性靶向并破坏肿瘤细胞。本发明的抗体-药物缀合物包括靶向α或βCPL成员的多克隆、更优选单克隆抗体，并且与毒性有效载荷化学连接。(Chao等，2019The Lancet 394:793-804；Teicher等，2022Curr Cancer Drug Targets Feb 24，通过引用并入)。作为非限制性实例，所述抗体药物缀合物可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，其与毒素(DM4、单甲基奥瑞西汀F(MMAF)、单甲基奥瑞西汀E(MMAE)、刺孢霉素、DM1)化学连接，使用接头(如缬氨酸瓜氨酸、磺基SPDB或腙赖氨酸、半胱氨酸)或位点特异性缀合。
或者，可以利用CAR T细胞，其中对T细胞受体进行工程化以识别α或βCPL亚型。所述CAR T细胞可以工程化为自体T细胞并重新引入患者体内，或者更优选地，同种异体CAR T细胞在体外由多能干细胞如iPSC或hESCs产生，然后引入患者体内作为癌症的过继免疫疗法。
或者，将特异性针对α或βCPL亚型的多克隆，或更优选第，单克隆抗体与药剂缀合，以促进通过MRI、SPECT的体内成像或PET成像。顺磁性或超顺磁性颗粒如氧化铁可与所述抗体缀合用于MRI。放射性核素可以与所述抗体结合用于核成像。124I和89Zr可以与所述抗体缀合以通过PET对肿瘤成像。在癌症中使用α或βCPL亚型的特异性表达的这些和相关成像技术可用于检测和诊断癌症，以及提供关于治疗方案后肿瘤减少程度的有用的伴随诊断数据，包括本文所述的那些。
此外，本发明教导了与EFT相关的某些分子途径部分地进化为抑制内源性转座元件和病毒复制的方法，所述病毒包括I类转座元件(逆转录转座子)、II类转座元件(DNA转座子)、LINES、SINES以及其他病毒如逆转录病毒。在EFT之前和在哺乳动物植入前胚胎中，一些细胞，如内部细胞团的细胞或从内部细胞团分离的细胞，如培养的hES细胞，允许病毒复制。一些胚胎(胎儿前)细胞对内源性转座元件复制的相对允许性是本领域公知的。例如，有文献表明，人类内源性逆转录病毒如HERVK在一些多能干细胞系中复制(Grow,E.J.等，(2015)Nature 522:221-225)。然而，层粘连蛋白A与EFT的结合以及对病毒复制的抑制尚未被描述。
本发明教导了层粘连蛋白A，特别是其加工成成熟细丝并与LRRK2和PLPP7结合进化为保护基因组完整性的手段，特别是，重复序列的区域，如与端粒重复相关的区域和串联重复的旁系同源物，如成簇的原钙粘蛋白基因座的区域或锌指蛋白的串联重复旁系同源物的区域，其进化为灭活不同的病毒序列。此外，层粘连蛋白A的进化是限制不同分化体细胞类型可塑性的一种手段，也就是说，将其稳定在分化状态。在限制其可塑性的同时，其限制了不同体细胞类型和组织在损伤或疾病后通过利用不同途径再生的潜力。这些途径包括成簇的原钙粘蛋白基因座的胚胎细胞-细胞识别系统的下调和与上皮-间质转化(EMT)相关的信号转导增加，如细胞外基质蛋白的表达增加，如由以下基因编码的细胞外基质蛋白：FN1、COL1A1、SPARC和VIM，其导致成年组织的纤维化瘢痕形成以代替损伤后胚胎组织中所见的再生。因此，层粘连蛋白A作为组织再生的抑制剂发挥着重要的调节作用(参见，例如，2021年3月2日提交美国临时专利申请号63/155,628，其公开内容全部通过引用并入本文)，而且癌症干细胞(CSC)的形成，其已被公开为不是如目前普遍认为的更未分化的细胞类型，而是与来自不同体细胞来源的很多恶性细胞类型的胚胎(胎儿前)状态相反的与胎儿/成人细胞相对应的更成熟的细胞类型。
溶瘤病毒疗法
因此，EFT前体细胞的允许状态与癌细胞中多种病毒的允许复制一致。尽管目前没有有效的方法预先确定哪些肿瘤或癌细胞类型将被所述载体有效地破坏，但是在此前的公开内容中胚胎和成人基因表达标志物(参见，例如，美国临时专利申请号61/831,421，2013年6月5日提交，PCT专利申请PCT/US2014/040601，2014年6月3日提交和美国专利号10,961,531，2015年12月7日提交，PCT专利申请PCT/US2017/036452，2017年6月7日提交和美国专利申请号16/211,690，2018年12月6日提交，以及美国临时专利申请号63/256,286，2021年10月15日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)，以及与胚胎细胞与胎儿/成人细胞相关的差异甲基化DNA序列(参见，例如，PCT专利申请PCT/US2020/047707，2020年8月25日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)，提供了有用的方法来确定哪些癌细胞或肿瘤将对溶瘤病毒治疗作出应答。癌细胞或肿瘤表达胚胎(胎儿前)标志物，如缺乏COX7A1表达、LMNA相对低表达，或可替代地表达胚胎(胚胎前)标志物，如PCAT7的表达，允许病毒复制，因此对溶瘤病毒疗法敏感。此外，诱导组织再生的方法，如在(参见，例如，美国临时专利申请号61/831,421，2013年6月5日提交，PCT专利申请PCT/US2014/040601，2014年6月3日提交和美国专利号10,961,531，2015年12月7日提交，例如，PCT专利申请PCT/US2017/036452，2017年6月7日提交和美国专利申请号16/211,690，2018年12月6日，美国临时专利申请号63/155,628，2021年3月2日提交和美国临时专利申请号63/256,286，2021年10月15日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)中公开的那些有助于将CSC转化成其胚胎对应物中，其中癌细胞将对溶瘤病毒疗法产生应答。
本发明的新型溶瘤病毒疗法包括使用目前公开的选择性破坏恶性癌细胞的病毒，包括：I型单纯疱疹病毒(HSV-1)，如Talimogene laherparepvec(T-VEC)，其经修饰以表达GM-CSF，具有胚胎(胎儿前)基因启动子的启动子，如PCAT7、CPT1B或PURPL启动子或此前公开的其他胚胎启动子(参见，例如，美国临时专利申请号63/256,284，2021年10月15日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)。
此外，用于靶向癌细胞的病毒，如HSV-1、呼肠孤病毒、小核糖核酸病毒(柯萨奇病毒、里加病毒)，弹状病毒如水疱性口腔炎病毒和马拉巴病毒，以及副粘病毒如新城疫病毒和麻疹病毒，以及痘苗病毒可以被修饰以表达毒性基因产物或可用于在癌细胞中特异性表达的基因，如GM-CSF，其有助于促进树突状细胞激活，其中所述引入的基因由基因启动子表达，如PCAT7、CPT1B或PURPL启动子或此前公开的其他胚胎启动子(参见，例如，美国临时专利申请号63/256,284，2021年10月15日，其公开内容的全部内容通过引用并入)。
此外，用于靶向癌细胞的病毒，如HSV-1、呼肠孤病毒、小核糖核酸病毒(柯萨奇病毒、里加病毒)，弹状病毒如水疱性口腔炎病毒和马拉巴病毒，以及副粘病毒如新城疫病毒和麻疹病毒，以及痘苗病毒可以被修饰以表达在胎儿/成人细胞中激活的锌指蛋白基因的RNAi，其中所述锌指蛋白抑制病毒复制。因此，受感染的细胞，如具有胎儿/成人表型的癌细胞，更容易发生裂解。所述胎儿/成人发病锌指基因被层粘连蛋白A激活，包括：ZNF280D(参见，例如，美国临时专利申请号61/831,421，2013年6月5日和美国专利号10,961,531，2015年12月7日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)，ZNF300P1、ZNF-572(参见，例如，PCT专利申请PCT/US2017/036452，2017年6月7日提交和美国专利申请号16/211,690，2018年12月6日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)以及ZNF578、ZNF585B、ZNF736和ZNF790-AS1(参见，例如，美国临时专利申请号63/256,286，2021年10月15日提交，其公开内容的全部内容通过引用并入)。
此外，本发明提供了一种新的溶瘤病毒疗法，其当单独使用或与免疫检查点抑制或过继免疫疗法组合使用时，可用于选择性地破坏具有胚胎表型的癌细胞。用于治疗癌症的很多免疫检查点抑制剂在本领域中是公知的，并且可用作与本文所述的癌症治疗剂的联合治疗。免疫检查点抑制剂的非限制实例，靶向PD-1的抗体，如纳武单抗、西米普利单抗、斯巴达珠单抗和派姆单抗，靶向PD-L1的抗体，如阿特朱单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗，以及靶向CTLA4的抗体，如伊匹单抗。其他免疫检查点抑制可以通过T细胞过继癌症免疫疗法实现。使用所述T细胞，其中其表达降低水平的CISH(含细胞因子诱导的SH2蛋白)或CBLB(Cbl原癌基因，E3泛素蛋白连接酶B)或具有敲除。
可通过将本发明的溶瘤病毒与上述免疫检查点抑制剂、树突状细胞治疗和/或靶向胚胎(胎儿前)抗原的CAR-T细胞(如本文所述的那些)组合，来实现可用于实现更大水平的肿瘤负荷降低的其他组合。
EFT的表型改变与大多数体细胞类型是共同的。类似地，很多癌细胞的异常胚胎表型(胚胎-胚胎表型)和CSC的胎儿/成人表型为很多癌症类型所共有的(即，全癌表型改变)。其可用于原发性和转移性癌症的诊断和治疗，包括：棘皮瘤、腺泡腺癌、酸性细胞癌、肢端汗腺瘤、急性嗜酸粒细胞白血病、急性红白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性巨核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性髓细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺样囊性癌、牙源性腺样瘤、腺鳞癌、腺鳞状肺癌、脂肪组织肿瘤、肾上腺皮质癌、儿童肾上腺皮质癌、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、肺泡横纹肌肉瘤、肺泡软部肉瘤、成釉纤维瘤、肛门癌、未分化癌、间变性大细胞淋巴瘤、未分化甲状腺癌、血管免疫母T细胞性淋巴瘤、血管肉瘤、阑尾癌、轻表型家族性腺瘤性息肉病、儿童中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆管癌、胆管癌(Bileductcancer)—胆管细胞型肝癌(Cholangiocarcinoma)、膀胱癌、膀胱癌-小细胞癌、膀胱癌-移行细胞癌、儿童膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨癌-骨肉瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤-其他、脑肿瘤-多形性胶质母细胞瘤、脑肿瘤-间变形少突胶质瘤、脑肿瘤-小脑星形细胞瘤(儿童和成人)、脑肿瘤-小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(儿童和成人)、脑肿瘤-室管膜瘤、脑肿瘤-髓母细胞瘤、脑肿瘤-幕上原始神经外胚层肿瘤、脑肿瘤-视觉通路与下丘脑神经胶质瘤、儿童脑和脊髓肿瘤、乳腺癌、乳腺癌导管腺癌、儿童乳腺癌、布伦内罗氏瘤、支气管腺瘤/类癌、支气管肿瘤、儿童支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、儿童类癌肿瘤、胃肠道类癌肿瘤、阴茎癌、癌肉瘤、牙骨质瘤、中枢神经系统癌症、宫颈癌-腺癌、宫颈癌-鳞状细胞、宫颈癌-神经内分泌、宫颈癌、儿童宫颈癌、儿童癌症、儿童白血病、胆管细胞型肝癌、胆管肉瘤、软骨粘液样纤维瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、退化性脊索瘤、成绒膜细胞瘤、绒毛膜癌、脉络丛肿瘤、绒毛膜癌、透明细胞腺癌、阴道透明细胞腺癌、卵巢透明细胞癌、肾透明细胞肉瘤、结肠癌、结肠癌-腺癌、结直肠癌、儿童结直肠癌、粉刺性癌、颅咽管瘤、儿童颅咽管瘤、皮肤淋巴瘤、囊腺癌、Degos病、隆突性皮纤维肉瘤、粘液样小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、消化系统肿瘤、视网膜胚瘤、原位导管癌(DCIS)、“导管、小叶和髓质肿瘤”、十二指肠癌、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、无性细胞瘤、ELM4-ALK阳性肺癌、胚胎瘤、胚胎癌、胚胎横纹肌肉瘤、儿童中枢神经系统胚胎肿瘤、内分泌腺肿瘤、内胚层窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜-间质肉瘤、子宫内膜-腺癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、儿童上皮母细胞瘤、儿童室管膜瘤、肺上皮性肌上皮癌、上皮样肉瘤、上皮瘤、食管癌、儿童食管癌、儿童嗅神经母细胞瘤、尤因家族肿瘤、在尤因家族肿瘤中的尤因氏肉瘤、外分泌癌、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳房外佩吉特氏病、眼癌、“眼癌，眼内黑色素瘤”、“眼癌，视网膜母细胞瘤”、输卵管癌、家族性腺瘤性息肉病、胎儿型腺癌、纤维上皮肿瘤、纤维板层肝细胞癌、纤维肉瘤、纤维组织肿瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、GCB弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胆囊癌、节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、Gardner综合征、胃类癌、胃癌、胃癌-腺癌、胃癌-胃食管交界处腺癌、儿童胃癌、胃淋巴瘤、胃泌素瘤，胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、巨细胞胶质母细胞瘤、骨巨细胞肿瘤、巨大牙骨质瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、多型性胶质母细胞瘤、胶质瘤、儿童视觉通路与下丘脑胶质瘤、胶质肉瘤、胰高血糖素瘤、杯状细胞类癌、性腺胚细胞瘤、卵巢颗粒细胞瘤、两性胚细胞瘤、头颈癌、儿童头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液恶性肿瘤、肝癌-胆管细胞型肝癌、肝母细胞瘤、肝细胞(肝)癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺-卵巢癌症综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌、组织细胞肉瘤、组织细胞瘤、下咽癌、炎性乳腺癌、炎症性髓母细胞瘤、导管内癌、导管内乳头状粘液性肿瘤、眼内黑色素瘤、生精小管生殖细胞内瘤、浸润性小叶癌、胰岛细胞癌、胰岛细胞肿瘤(内分泌胰腺)幼年性颗粒细胞肿瘤、幼年性髓单核细胞性白血病、肾球旁细胞瘤、卡波西肉瘤、儿童肾癌、克拉茨金瘤、克鲁肯伯格肿瘤、郎格汉斯细胞组织细胞增多症、具有横纹肌样表型的大细胞肺癌、喉癌、喉癌-鳞状细胞癌、儿童喉癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑痣样黑素瘤、软脑膜癌、白血病、莱迪细胞肿瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病、皮革胃、唇部和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发)、小叶癌、原位小叶癌(LCIS)、肺巨细胞癌、大细胞肺癌、具有横纹肌样表型的大细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺-腺癌、肺-大细胞癌、肺-小细胞癌、肺-鳞状细胞癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴瘤、淋巴瘤-淋巴组织的结外边缘区B细胞、淋巴瘤-淋巴组织的滤泡癌、AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(CNS)、华氏巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤与骨肉瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、乳腺导管癌、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、“Marcus Whittle，致死性疾病”、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞肿瘤、纵隔肿瘤、髓样癌、乳腺髓样癌、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、儿童髓母细胞瘤、髓上皮瘤、儿童髓上皮瘤、黑色素瘤、儿童黑色素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌、间叶性软骨肉瘤、成人恶性间皮瘤、成人恶性间皮瘤-胸膜混合、儿童间皮瘤、转移性乳腺癌、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、颌骨转移瘤、转移性尿路上皮癌、混合性穆勒管肿瘤、口腔癌、肺粘液性囊腺癌、粘液性肿瘤、儿童多发性内分泌肿瘤综合征、2b型多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、肌肉组织肿瘤、蕈样霉菌病、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、骨髓增生异常综合症、成人急性髓白血病、儿童急性髓性白血病、髓性肉瘤、慢性骨髓增生性疾病、肌肉瘤、粘液软骨肉瘤、粘液脂肪肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽纤维血管瘤、鼻咽癌、儿童鼻咽癌、神经鞘瘤、神经系统肿瘤、神经母细胞瘤、神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、乳头腺瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、结节性黑色素瘤、牙源性肿瘤、大嗜酸粒细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、视神经肿瘤、眼癌、儿童眼癌、口咽癌、口咽鳞状细胞癌、骨脂软骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌-卵巢浆液性腺癌、儿童卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢癌生殖细胞肿瘤、乳腺佩吉特氏病、肺上沟瘤、胰腺癌、儿童胰腺癌、胰腺癌-神经内分泌、胰腺癌胰岛细胞肿瘤、胰腺-胰腺导管腺癌、胰腺浆液性囊腺瘤、乳头状腺癌、乳头状浆液性囊腺癌、乳头状甲状腺癌、儿童乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺腺瘤、甲状旁腺癌、甲状旁腺肿瘤、PEComa、壶腹周围癌、腹膜间皮瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、儿童中分化松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤、儿童松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、松细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞病、浆细胞白血病、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、多形性未分化肉瘤、多形性黄色星形细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、儿童胸膜肺母细胞瘤、多伞状瘤、后尿道癌症、前体T淋巴细胞淋巴瘤、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、前列腺癌-腺癌、腹膜假性粘液瘤、直肠癌、直肠癌-腺癌、肾细胞癌(肾癌)、肾髓质癌、肾盂输尿管移行细胞癌、肾素瘤、呼吸道肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、儿童横纹肌肉瘤、里希特转化、唾液腺癌、儿童唾液腺癌、唾液腺样肺癌、唾液腺肿瘤、尾部畸胎瘤、肉瘤、葡萄状肉瘤、软组织肉瘤、肉瘤样癌、神经鞘瘤病、硬化性横纹肌肉瘤、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性癌、浆液性囊腺癌、浆液性肿瘤、支持细胞瘤、Sertoli Leydig细胞瘤(支持间质细胞瘤)、性索性腺间质瘤、综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、儿童皮肤癌、皮肤癌-基底细胞癌、皮肤癌-基底样癌、皮肤癌-黑色素瘤、小细胞癌、小肠癌、“小型圆形蓝细胞肿瘤”、生长抑素瘤、煤烟疣、精母细胞型精原细胞瘤、脊柱肿瘤、梭形细胞癌、梭形细胞横纹肌肉瘤、绒毛淋巴细胞脾淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、鳞状细胞癌、具有隐匿性原发转移的鳞状颈癌、Stewart_Treves综合征、间质瘤、儿童期原始神经外胚层肿瘤、表面上皮间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞淋巴瘤、T淋巴母细胞性淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、睾丸癌-精原细胞瘤、儿童睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、咽喉癌、“儿童胸腺瘤”、胸腺瘤和胸腺癌、儿童胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌-滤泡性、甲状腺癌-乳头状、儿童甲状腺癌、扁桃体-扁桃体鳞状细胞癌、小梁癌症、气管肿瘤、移行细胞癌、妊娠期滋养细胞肿瘤、管状绒毛状腺瘤、脐尿管癌、输尿管癌、输尿管肿瘤、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、尿路上皮癌、尿路上皮细胞癌、子宫癌、子宫内膜子宫癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、子宫浆液性癌、阴道黑色素瘤、阴道癌、儿童阴道癌、疣状癌、前庭神经鞘瘤、VIPoma、视觉通路胶质瘤、冯-希佩尔-林道病、外阴癌、“儿童威尔姆氏瘤(肾癌)”。
实施例
本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组核酸(例如，DNA)技术、免疫学等的某些常规技术可用于本发明的各方面。在以下出版物中可以找到对这些技术中的某些技术的非限制性描述：Ausubel,F.等(编著)，Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols in Immunology,Current Protocols inProtein Science和Current Protocols in Cell Biology，均为John Wiley&Sons,N.Y.，2008年版；Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988；Burns,R.,Immunochemical Protocols(Methods inMolecular Biology)Humana Press；第3版，2005,Monoclonal antibodies:a practicalapproach(P.Shepherd和C Dean编著，Oxford University Press,2000)；Freshney,R.I.,"Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique",第5版，John Wiley&Sons,Hoboken,N J,2005。本文提及的所有专利、专利申请、网站、数据库、科学文章和其他出版物均通过引用整体并入本文。
方法
除了下面描述的方法之外，在生产和使用具有与无瘢痕再生潜力相对应的胚胎基因表达模式的细胞中发现用途的方法可以在以下中找到：PCT申请系列号PCT/US2006/013519；美国专利申请系列号11/604,047；以及美国专利申请系列号12/504,630(参见，例如，PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601和美国专利申请系列号14/896,664，其每一个的全部内容通过引用并入)，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
细胞培养
将多能干细胞(PSC)(hESC和iPSC)在37℃下含有5％O2和10％CO2的湿润培养箱中在mTeSR1培养基中在Matrigel上培养，将胚胎祖细胞(PC)在其特定生长培养基中在0.1％明胶上培养，该培养基最初用于在37℃下含有5％O2和10％CO2的湿润培养箱中克隆和扩增该细胞系。EP细胞系4D20.8和分别在DMEM 20％FBS和PromoCell内皮(MV2)生长培养基中培养。使用0.05％胰蛋白酶在汇合或接近汇合时以1:3常规传代细胞。成人来源的细胞在各自的最佳生长培养基中在0.1％明胶上在Corning培养基中培养，培养温度为37℃，含有5％O2和10％CO2，或者在选定的情况下，总RNA购自ScienCell(Carlsbad CA)。癌症细胞系从ATCC获得，并在收获前按照ATCC的建议进行培养。在分析之前，通过在10％的正常血清或相关生长因子补充剂中培养5天，尽可能使所有细胞系在静止状态下同步。
RNA分离
按照生产厂商的指示，使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒(Cat#74104)，在用含1％2-βME的RLT裂解后制备RNA。然后使用NanoDrop(ND-1000)分光光度计对提取的RNA进行定量，并将标记的试管储存在-80℃以备日后使用。
RNA测序
按照生产厂商的指示，使用Illumina Truseq mRNA文库制备试剂盒进行文库构建。使用Technologies 2100 BioanalyzerTM完成文库QC和文库混合以测定文库片段。将qPCR用于定量文库。在一个泳道中将具有不同条形码/索引和排序的文库混合。使用Illumina HiSeq4000TM测序仪器进行配对末端测序，产生100bp的配对末端读取。通过BGIAMERICAS CORPORATION进行测序。
RNA-Seq数据分析
使用Tuxedo方案62分析通过测序获得的每个样品至少包含2500万次读取的fastq文件。使用TopHat(2.1.1版)剪接点映射器内的短读取对准器Bowtie2(2.2.7版)将读取与GRCh38对准。Bowtie2指数以及GRCh38基因组注释从Illumina,Inc.iGenomes获得。将比对文件组装成转录物，并使用cufflinks 2.2.1版估计丰度。为了允许高丰度的转录物，使用参数-最大束碎片2000000。使用Cuffmerge(2.2.1版)将Cufflinks gtf文件与GRCh38注释的genes.gtf合并到统一的转录物目录中。使用Cuffquant计算转录物丰度水平，并使用Cuffnorm对所得数据进行归一化(均为2.2.1Cufflinks版)。
火山图
转录水平(FPKM值)的数据分析在R中进行。对数据进行过滤以从Y染色体上删除基因。FPKM值四舍五入到小数点后两位，通过过滤胚胎组或成人组FPKM平均值>0.5和两组平均值>0的实体来去除低表达实体。P值采用带Bonferroni校正的t检验生成。在R中生成图。
统计学分析
假设两个样品的方差相等(同方差)，使用双侧T检验确定FPKM值差异的统计显著性。误差线表示平均值的标准误差，除非另有说明。
ATAC-seq
收获胚胎祖细胞系(4D20.8和30-MV2-6)、成人细胞系(MSC和HAEC)、PSC细胞系和癌细胞系，并且冻存在含FBS和5％DMSO的培养基中。将冷冻保存的细胞送至Active Motif以进行ATAC-seq测定。然后，将细胞在37℃的水浴中复苏，离心，用冷PBS洗涤，并如前所述进行标记21,63。简言之，将细胞球团重悬于裂解缓冲液中，离心，并使用NexteraTM文库制备试剂盒(Illumina)中提供的酶和缓冲液进行标记。然后使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化标记的DNA，用10个循环的PCR扩增，并使用Agencourt AMPure SPRITM小珠(Beckman Coulter)纯化。使用用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒(KAPABiosystems)对所得材料进行定量，并在NextSeq 500测序仪(Illumina)上用PE42测序对其进行测序。
ATAC-seq数据的分析与ChIP-Seq数据的分析非常相似。使用BWA算法(mem模式；默认设置)对读取进行比对。删除了重复的读取，仅使用映射为匹配对的读取和唯一映射的读取(映射质量>＝1)进行进一步分析。比对在其3’-端在计算机上延伸到200bp的长度，并分配到基因组中的32nt仓。生成的直方图(基因组“信号图”)存储在bigWig文件中。使用MACS2.1.0算法在p值1e-7的截止点处鉴定峰值，不使用控制文件，并使用–nomodel选项。去除了已知假ChIP-Seq峰的ENCODE黑名单上的峰。信号图和峰值位置被用作Active Motifs专有分析程序的输入数据，该程序创建Excel表，其中包含样品比较、峰值指标、峰值位置和基因注释的详细信息。
TOBIAS分析
为了鉴定转录因子与以ATAC-Seq为特征的开放区的潜在结合，我们使用了TOBIAS算法64。使用MACS的MACS2调用峰值函数从BAM文件中表征直方图峰值65。为了补偿Tn5转座酶位点插入偏差，使用了TOBIAS ATACorrect函数，并将数据存储在bigwig输出文件中。使用具有以下参数的MACS2调用峰值函数对校正后的bigwig文件的峰值进行表征：--shift-100-extsize 200-broad。使用TOBIAS足迹评分函数搜索获得的转录因子结合足迹的峰。针对JASPAR 2020数据库，用TOBIAS BINDetect对成对样品(4D20对比HMSC，30MV2-6对比HAEC)的转录因子结合事件的结合位点足迹评分进行表征66。
染色质免疫沉淀
将细胞用1％甲醛固定15min，并用0.125M甘氨酸猝灭。将冷冻的细胞颗粒送至Active Motif进行ChIP-Seq测定。通过加入裂解缓冲液分离染色质，然后用Dounce匀浆器进行破碎。对裂解物进行超声处理，并将DNA剪切至300-500bp的平均长度。基因组DNA(输入)是通过用RNase、蛋白酶K和热处理染色质的等分试样进行脱交联，然后用乙醇沉淀来制备的。将球团重悬，并在NanoDrop分光光度计上对所得DNA进行定量。对原始染色质体积的外推允许对总染色质产量进行定量。
用蛋白A或G琼脂小珠(Invitrogen)预切染色质的等分试样(30μg)。使用针对目标特异性组蛋白修饰的4μg抗体分离目标基因组DNA区域。洗涤复合物，用SDS缓冲液从小珠中洗脱，并进行RNase和蛋白酶K处理。交联通过在65℃下孵育过夜而逆转，并通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化ChIP DNA。
使用SYBR Green Supermix(Bio-Rad)在特定基因组区域上进行一式三份的定量PCR(QPCR)反应。通过使用输入DNA对每个引物对进行QPCR，对得到的信号进行引物效率的标准化。
ChIP测序
Illumina测序文库由ChIP和输入DNA通过末端抛光、dA添加和衔接子连接的标准连续酶步骤制备。在自动系统(Apollo 342,Wafergen Biosystems/Takara)上进行这些步骤。在最后的PCR扩增步骤后，在Illumina的NextSeq 500上对所得DNA文库进行定量和测序(75nt读取，单末端)。使用BWA算法(默认设置)将读取与人类基因组(hg38)进行比对。删除重复的读取，仅使用唯一映射的读取(映射质量>＝25)进行进一步分析。比对在其3’-端在计算机上延伸到200bp的长度，这是所选尺寸文库中的平均基因组片段长度，并分配到基因组上的32nt仓。生成的直方图(基因组“信号图”)存储在bigWig文件中。对于活性组蛋白标记，使用MACS算法(v2.1.0)确定峰值位置，p值的截止值为1e-7。对于具有广泛分布的抑制性组蛋白标记或组蛋白修饰，使用SICER算法在FDR 1E-10的截止值和600bp的最大空位参数下鉴定富集区域。去除了已知假ChIP-Seq峰的ENCODE黑名单上的峰。信号图和峰值位置被用作Active Motifs专有分析程序的输入数据，该程序创建Excel表，其中包含样品比较、峰值指标、峰值位置和基因注释的详细信息。
全基因组重亚硫酸盐测序
根据生产厂商的说明，使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒(Cat#69504)从细胞系制备DNA。标记的微量荧光管随后被储存在-80℃。将样品测序为150bp的配对末端读取，达到每个样品约90G原始数据的水平。通过BGI AMERICAS CORPORATION进行测序。
WGBS数据分析
使用具有默认参数的Bismark套件对获得的fastq-reads文件进行全基因组重亚硫酸盐测序数据分析68。
DMR的鉴定
使用Metilene软件从WGBS数据中鉴定DMR69。DMR的定义是，在队列中四个胚胎或成人细胞系中的至少三个细胞系中，在至少250nt、8个CpG和信号的窗口内，q值<0.01，平均甲基化差异>0.15。
TAD法
染色质构象捕获数据使用Phase Genomics(Seattle,WA)Proximo Hi-C 2.0试剂盒生成，该试剂盒是Hi-C方案的商业版本70。按照生产厂商对试剂盒的说明书，使用甲醛溶液交联来自两个样品的完整细胞，使用Sau3AI限制性酶消化，并与生物素化核苷酸近距离连接，以产生由来自基因组不同区域的片段组成的嵌合分子，这些片段在体内物理上接近，但不一定在基因组上接近。按照生产厂商的方案，用链霉亲和素小珠拉下分子，并将其加工成Illumina兼容的测序文库。在Illumina HiSeq 4000上进行测序。
将读取与智人基因组组装GRCh38(hg38)进行比对，也根据生产厂商的建议。简言之，读取是使用BWA-MEM71具有指定的-5SP和-t 8选项比对的，所有其他选项都是默认的。SAMBLASTER72用于标记PCR重复，这些重复后来被排除在分析之外。然后使用samtools73使用-F 2304过滤标志对比对进行过滤，以去除非主要和次要比对。TopDomTM74用于在50kb分辨率下鉴定拓扑相关结构域(TAD)，方法是在50kb仓周围的一个小窗口(w＝5)中计算染色质区域对(一个上游和一个下游)之间的平均接触频率。所得曲线用于鉴定每个染色体上的局部极小值或染色质低接触区域。使用matplotlib Python包75中的pyplot和补丁绘制目标区域。TopDom记录TAD调用的BED文件被简化，并在USCS基因组浏览器中视为轨迹。使用Juicebox套件对获得的.hic文件进行数据可视化。
癌症干细胞的诱导的去衰老细胞(iS-CSC)
此外，或者相反，在恶性细胞已经恢复到EFT后表型(AC细胞)(令人吃惊的是，也被称为通常被称为癌症干细胞)，从而变得相对抗凋亡的情况下，抗药性的“癌症干细胞”可以被诱导回到胎儿前表型，以增加其对诱导凋亡的治疗的易感性。这些包括使用本文公开的和先前在PCT专利申请系列号PCT/US2014/040601、PCT/US2017/036452、PCT/US2020/025512和PCT/US2019/028816，其中的每一个都整体并入，(也称为癌症干细胞的诱导的去衰老细胞(iS-CSC))，抑制PI3K/AKT/mTOR(磷酸肌苷3-激酶/AKT/雷帕霉素的哺乳动物靶点)途径，如用雷帕霉素或mTOR的其他抑制剂，饮食限制，或饮食限制模拟物的使用。与EFT相关的途径在癌症的诊断和治疗中的这些和相关用途是本发明的主题。
实施例1：成簇的原钙粘蛋白亚型在胚胎、胎儿和成人非神经元体细胞类型中的差异表达
多能干细胞(PSC)衍生的祖细胞，如克隆衍生的那些，尽管在体外广泛传代或分化，但仍显示出原始胚胎原基的标志物19,20。因此，我们将这些细胞系命名为“克隆胚胎祖细胞”，以将其与胎儿和成人细胞的对应物区分开来。这些细胞系主要代表不同的基质和实质祖细胞，而不是上皮细胞类型，因此，与基质胎儿细胞(“FC”)和基质成人非上皮细胞系(“ANE”)相比，我们将不同的克隆胚胎祖细胞系命名为“EP”。我们利用EP及其胎儿和成人细胞类型的对应物作为显示EFT前和后表型的细胞的体外模型。
RNA序列数据来自不同的胚胎、成人和癌症细胞类型，包括四个不同的人类ES细胞系和两个iPSC细胞系(“PC”细胞)；42个不同的克隆EP细胞系；8个FC，包括3个棕色前脂肪细胞培养物和5个胎儿皮肤皮肤成纤维细胞，其跨越发育8-16周；89个不同的基质和实质非上皮细胞类型(ANE)，以及5个成年神经元细胞(NC)类型，包括神经元和星形胶质细胞。由于EP细胞表现出胎儿前的基因表达模式，我们将其称为“胚胎”，而多能干细胞(PC)和与不同ANE和成人上皮细胞(AEC)相关的数据则称为“成人”。
为了鉴定基因表达的整体发育变化，包括很多可能解释EFT前再生表型的分化细胞类型，我们对亚型数据进行了筛选，以获得高度统计学意义的基因表达差异，从而区分胚胎细胞和成人细胞，而不考虑分化细胞类型。1079个亚型在EP与ANE细胞中的表达有显著差异(调整后的p值<0.05)，很多最显著和最大的倍数变化是CPL的亚型(图1)。胚胎上调的CPL亚型通常来自α和β簇，而成人上调的亚型来自γ簇。在胚胎细胞中具有统计学意义的显著上调的γ亚型是PCDHA2、PCDHA4、PCDHA10和PCDHA12。在胚胎细胞中具有统计学意义的显著上调的γ亚型是PCDHB2、PCDHB5、PCDHB9、PCDHB10、PCDHB13、PCDHB14和PCDHB16。在胚胎细胞中具有统计学意义的显著上调的γ亚型是PCDHGB4和PCDHGB5。在胎儿和成人细胞中，全部α和β亚型均下调，而在成人细胞中具有统计学意义的显著上调的γ亚型是PCDHGB6和PCDHGA12。
我们从每个α和β基因座(PCDHA4和PCDHB2)中选择了一个代表性成员进行进一步研究，与成人细胞相比，这些基因座在大多数胚胎细胞中显著上调(p值分别为8.8x 10-21和3.3x 10-21)，并显示胚胎与成人表达(FPKM)的平均倍数变化分别为36.1和18.2(图2A-2C)。从γ基因座来看，PCDHGA12亚型在大多数成人细胞类型中显示出成人上调，调整后的p值为1.0x 10-7，成人与胚胎表达(FPKM)的平均倍数变化为686倍。
实施例2：在胚胎-胎儿转变时或之前发生的成人CPL亚型表达的起始
EFT通常与哺乳动物身体的很多组织中无瘢痕再生能力的丧失有关。在人类皮肤的情况下，这似乎与卡内基第23阶段(妊娠八周)大致一致。因此，我们检验了从胚胎无瘢痕再生表型到胎儿/成人非再生状态的转变与CPL亚型表达的改变在时间上相关的假设。我们考察了与EP和ANE对应物相比来自静止期同步的上臂内侧的早期传代成纤维细胞(胎儿细胞(FC))中CPL亚型的表达(图2A-2C)。在代表性基因PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12的情况下，8-16周龄FC中的CPL亚型表达表现出成人样的表达模式，但PCDHA4可能除外，其中FC表现出比成人对应物(ANE细胞)适度显著的升高(p<0.05)。对来自11-83岁成人的34个早期传代皮肤成纤维细胞的更广泛分析均显示出成人模式(低PCDHA4、低PCDHB2和高PCDHGA12)，在体内衰老过程中没有显著变化。因此，我们得出结论，CPL表达的转变可能发生在体内EFT(人类卡内基第23阶段)之前。
PC细胞如胚胎干细胞(ES)和诱导多能干细胞(iPS)似乎显示出包括PCDHA2、PCDHA4、PCDHA10、PCDHA12、PCDHB2、PCDHB5等的亚型，并且类似的EP表达低水平的成人标志物PCDHGB5和PCDHGA12(图2)。重要的是，CPL亚型在胚胎细胞(PC和EP)中的表达水平上调，与CNS衍生的细胞类型(包括不同来源的神经元和星形胶质细胞)相当。鉴于有证据支持CPL亚型在CNS发育中的作用，EP中CNS外不同体细胞类型的CPL亚基的转录物水平相当甚至更高，这与CPL亚型在胚胎(EFT前)状态下表达的关键作用一致，因此可能在发育过程中的细胞-细胞识别中发挥作用。
实施例3：不同的癌细胞系通常表现出CPL亚型表达的胚胎模式(胚胎-癌表型)
胚胎器官发生后，跨越不同体细胞类型的共享基因表达变化可能反映了拮抗性多效性。也就是说，对细胞-细胞识别和形态发生至关重要的途径的抑制可能会限制再生，但具有提供有效肿瘤抑制的选择性优势。我们之前通过筛选不同正常体细胞类型及其恶性反对应物的抑制证据，证明了端粒酶催化成分(TERT)的这种作用8。因此，我们使用基于RNA-seq的转录组数据对先前描述的PC、不同的EP、不同的ANE细胞类型以及24个不同的正常人成人上皮细胞(AEC)类型、39个不同的人肉瘤细胞(SC)系(包括来源于所有三个胚层的细胞，包括很多肉瘤和癌症的正常对应物)以及35个不同的癌和腺癌细胞(CAC)系进行了类似的调查。
如图3所示，与EP相比，代表性的胚胎CPL亚型转录标志物PCDHA4和PCDHB2在ANE细胞和AEC中显著下调(p＜0.0001)。类似地，与EP相比，PCDHGA12在ANE细胞和AEC中的表达显著升高(p＜0.0001)。有趣的是，与正常ANE和AEC培养物相比，不同的癌细胞系，如SC和CAC(分别代表源于基质细胞和上皮细胞类型的癌症)分别显示出向CPL基因表达的胚胎模式的高度显著转变。在α基因座的情况下，所有α亚型(PCDHA1-13)以及PCDHAC1和PCDHAC2在不同的SC和CAC中上调，包括与成人对应物相比在神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤(包括子宫、滑膜、横纹肌肉瘤、肾横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤)；癌(包括乳腺导管癌和支气管肺泡癌)；和乳腺腺癌；以及B细胞淋巴母细胞白血病中的标志物上调。
与正常ANE和AEC对应物相比，SC和CAC中的α和β基因座、PCDHA4和PCDHB2显著上调(PCDHA4的情况下分别为p<0.01和p<0.05，PCDHB2的情况下则分别为p<0.0001和p<0.001)。在β基因座的情况下，所有β亚型(PCDHB1-6和PCDHB8-16)以及PCDHB17P、PCDHB18P和PCDHB19P在不同的SC和CAC中上调，包括与成人对应物相比在神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤(包括pagetoid、子宫、滑膜、横纹肌肉瘤、肾横纹肌肉瘤，尤因肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、骨巨细胞肉瘤、脂肪肉瘤)；癌(包括乳腺癌、导管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌和支气管肺泡癌)；前列腺癌和乳腺腺癌；和B细胞淋巴母细胞白血病中的标志物上调。
类似地，PCDHGA12的表达显著降低，在SC和CAC中显示出更多的胚胎模式(SC与正常ANE对应物相比p＜0.001，CAC与正常AEC对应物相比p＜0.05)。在γ基因座的情况下，PCDHGB5和/或PCDHGA12在不同的SC和CAC中下调，包括与成人对应物相比在神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤(包括子宫、pagetoid、滑膜、肌肉横纹肌肉瘤、肾横纹肌肉瘤，尤因肉瘤、威尔姆瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤)；癌(包括鳞状细胞癌、表皮样癌、肝细胞癌、乳腺导管癌、前列腺癌、肾癌和支气管肺泡癌)；结肠直肠癌和乳腺腺癌；和B细胞淋巴母细胞白血病中的标志物显著下调。出乎意料的是，尽管PCDHGB4和PCDHGB6在胚胎细胞中上调，但其在SC和CAC中的表达并未升高。因此，当本发明涉及表达CPL亚型表达的胚胎模式的癌前或癌症细胞时，我们不是指PCDHGB4和PCDHGB6。
类似地，RNA-seq分析显示一个或多个α基因座、亚型(PCDHA1-13)以及PCDHAC1和PCDHAC2在肺、食道、卵巢、子宫内膜、胰腺、间变性大细胞淋巴瘤、尿道、自主神经节、伯基特淋巴瘤、胆道、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、黑色素瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、急性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤癌细胞，而其正常成年对应物表达低水平至无水平的转录物。
类似地，RNA-seq分析显示一个或多个β基因座(PCDHB1-6和PCDHB8-16)以及PCDHB17P、PCDHB18P和PCDHB19P在肺、浆细胞性骨髓瘤、黑色素瘤、胸膜、卵巢、急性髓性白血病、子宫内膜、肾、伯基特淋巴瘤、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、肝脏、星形细胞瘤、食道、胰腺、胃、浆细胞性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、自主神经节、间变性大细胞淋巴瘤、胆道、B细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、原发性血小板增多症、急性髓性白血病和慢性髓性白血病的急性期，而其正常对应物不表达所述亚型。
类似地，RNA-seq分析显示，γ簇亚型PCDHGB5和/或PCDHGA12中的一种或两种在肺、胃、尿道、食道、胰腺、卵巢、胆道、胸膜、甲状腺和唾液腺中低表达至不表达，而其正常对应物表达该基因。此外，与正常血细胞对应物相比，造血或淋巴样癌细胞系中γ簇同亚型PCDHGB5和/或PCDHGA12中的一种或两种的表达显著更高。
虽然肉瘤和癌细胞系似乎经常显示出CPL基因表达的胚胎模式(即，上调的PCDHA4和PCDHB2以及下调的PCDHGA12)，但细胞系中个体亚型表达的组合似乎是异质的。这与CPL亚型在分化的细胞类型特异性细胞-细胞识别以及调节EFT特有的改变中发挥双重作用的假设一致。此外，肉瘤细胞系在胚胎和成人样CPL亚型方面表现出异质性，癌症更常见于胚胎。在标志物PCDHGA12的情况下，大多数正常成人细胞表达该亚型，而大多数癌症细胞系不表达。例如，使用0.5FPKM的截止值作为表达的下限，只有2/97个成人来源的基质细胞和实质细胞类型(在两种情况下都是肝细胞)和1/23个培养的上皮细胞类型不表达PCDHGA12。然而，21/39(54％)个肉瘤细胞系和33/35(94％)个癌和腺癌细胞系不表达至少0.5FPKM水平的PCDHGA12。以癌细胞系特有的方式，6/39(15％)个肉瘤和5/35(14％)个癌细胞系以大于0.5FPKM的水平表达PCDHA1，而没有PC、EP、FC、ANE或BC以该阈值水平表达该基因。
为确定胚胎肿瘤表型是否延伸到CPL以外的基因，我们检测了PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12表达与COX7A1的相关性，COX7A1先前报道为很多基质和实质细胞类型中EFT的强大标志物19。COX7A1的表达大约在EFT开始，在成年期趋于平稳，在大多数癌症细胞系中不表达19。如图4中所示，成人标志物COX7A1似乎与胚胎标志物PCDHA4和PCDHB2呈负相关，同时在不同的肉瘤细胞系中显示出与成人标志物PCDHGA12的表达直接相关的趋势(R2＝0.52，p＜0.0001)。因此，这些数据表明，大多数肉瘤、癌症和腺癌细胞系显示出CPL亚型表达的胚胎模式，其与COX7A1的下调相关，以支持胚胎肿瘤表型，包括多个基因表达的改变。
实施例4：在血细胞中诊断CPL亚型状态以及相关治疗方法
如上文实施例3中所公开的，血细胞癌症，特别是淋巴样癌，令人吃惊地异常表达胚胎和/或胎儿标志物CPL亚型。本领域技术人员将认识到，这一观察结果导致了治疗这些癌症患者的很多新的诊断和治疗策略。
肿瘤细胞表达的CPL亚型的诊断可以通过基于RNA、DNA或蛋白的测定来确定。在RNA测定的情况下，作为非限制性实例，可以使用基因表达微阵列、PCR或RNA测序来测量来自患者的肿瘤细胞的转录组。
作为确定造血和淋巴样癌中CPLα亚型表达的一个实例，来自170个血液癌细胞系的RNA序列数据显示，急性髓性白血病、慢性髓性白血病的急性期、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤通常表现出异常高水平的LMNA和PCDHA12表达，这是成人CPL亚型表达模式的特征。因此，PCDHGA12抗原是基于树突状细胞或CAR-T细胞的治疗策略的新靶点。
实施例5：胚胎与成人基因表达的改变与染色质可及性、CTCF结合和高甲基化CpG岛的修饰一致
接下来，我们从ATAC(转座可及染色质测定)测序开始，检查了α、β和γ基因座的表观遗传学状态，以确定染色质的可及区域以及与DNA结合蛋白的潜在相互作用21。通过信使核糖核酸读取覆盖率确定，可及性与成骨间充质和血管内皮的胚胎和成人对应物中表达的CPL基因一致(图5)。ATAC的可及性也经常与TOBIAS确定的CTCF足迹相吻合。CTCF先前已被报道通过调节染色质结构域的结构和调节与增强子的顺式相互作用参与CPL中的基因调节22。
接下来，我们通过全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)检测了α、β和γ基因座中的CpG甲基化。对四种hES细胞衍生的克隆EP细胞系及其各自的成人衍生的对应物进行测序，即：4D20.8，克隆的胚胎骨软骨祖细胞23和成人骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)；30-MV2-6，克隆胚胎血管内皮细胞系和成人来源的主动脉内皮细胞(HAEC)；SK5，克隆胚胎骨骼肌祖细胞和成人骨骼肌成肌细胞和；以及E3，胚胎白色前脂肪细胞系24和成人皮下白色前脂肪。使用Metilene软件，基于四对EP/ANE中三对的甲基化CpG的显著差异(p<0.05)，鉴定了差异甲基化区域(DMR)。如此前所描述的，在图5中显示了在CPL中的DMR(参见PCT专利申请系列号PCT/US2020/047707和美国专利申请系列号17/251,145，其每一个的全部内容通过引用并入)。DMRs与α和γ亚型的第一个外显子和β亚型的基因体共定位，其具有CpG岛(CpGI)，读取覆盖模式，并且与成人对应物相比，无论亚型是胚胎特异性还是成人特异性，DMR在胚胎细胞中都均匀地超甲基化。在整个基因组中鉴定的21,317个显著的DMR中，大多数(20,022个)是高甲基化的(数据未显示)，然而，EP的总体基因组CpG甲基化与成人相比没有显著差异。
实施例6：在不同的癌细胞系中观察到CPL内的胚胎DMR，并表现出与CpG岛甲基化表型(CIMP)不同
接下来，我们根据与间充质、内皮、成肌细胞和前脂肪细胞分化状态的EP和AC相对应的细胞类型，确定肉瘤细胞(SC)系中DMR甲基化状态。针对基因PCDHA4、PCDHB2和PCDHGA12的结果总结在图6中。在PCDHA4和PCDHB2的情况下，胚胎细胞和成人细胞之间甲基化百分比的差异非常显著(p＜0.0001)。在PCDHA4和PCDHB2的情况下，DMR倾向于与基因体而不是启动子区域结合。与成人起始基因PCDHGA12相关的DMR与该基因的启动子重叠，并且在胚胎细胞中显著(p＜0.001)超甲基化，尽管该基因的可及性和表达是成人起始的。因此，我们得出结论，所研究的肉瘤细胞系表现出比其成人对应物更接近于甲基化的胚胎模式的DMR模式(图6)。
CpG岛甲基化表型(CIMP)是癌症中一种常见的高甲基化DMR研究类别25。一组常用于结直肠癌的CIMP DMR标志物包括与CACNA1G、CDKN2A、CRABP1、IGF2、MLH1、NEUROG1、RUNX3和SOCS1基因相关的标志物26。虽然在很多癌细胞系中，CpGI中的这些DMR显示出高甲基化，但在胚胎细胞和成人细胞类型中，其似乎没有显著(q值<0.05)的甲基化差异。然而，在与CPL基因座中的CMR接触中，IGF2和RUNX3CpGI是一个例外，其在成人细胞中显著超甲基化。因此，我们得出结论，与CPL中胚胎肿瘤表型相关的DMR并不像通常描述的那样反映CIMP，而是可能反映胚胎特异性甲基子表型，我们在本文中称之为CIMP-E。
实施例7：CPL中的染色质结构在胚胎细胞与成人细胞类型中与层粘连相关结构域比对时发生的变化
如图5所示，与胚胎对应物相比，跨越α和β簇(用星号标记)的～0.6MB区域在成人成骨间充质细胞(MSC)和成人主动脉内皮细胞系中显示出明显更低的可及性。层粘连蛋白相互作用，如与层粘连蛋白A/C和层粘连蛋白B1相关的相互作用，可以在染色质中赋予异色性改变，所述染色质跨越与核外周相关的＞0.1兆碱基(层粘连蛋白相关结构域(LAD))，因此我们检测了LAD与CPL基因座的关联。认识到层粘连蛋白A在核外周(通过超声分离)和核内(通过微球菌核酸酶消化分离)似乎具有双重作用，我们利用了此前在HeLa细胞中鉴定的与层粘连蛋白B1和层粘连蛋白A相关的层粘连蛋白相互作用结构域(LiD)，该结构域来自通过ChIP-seq27测定的超声处理和微球菌核酸酶制备的样品，这是作为染色质与层粘连素相互作用的更全面的调查。
如图7中所示，层粘连蛋白B1-LAD与成人细胞中CPL基因座的不可接近区域紧密共定位，并通过CTCF结合位点进行划界28。此外，微球菌核酸酶制备的层粘连蛋白A ChIP-seq样品似乎与层粘连蛋白B1相关的区域紧密重叠，但也延伸到γ基因座和使用dbSuper鉴定的3’超级增强子区域29。
LAD通常与H3K9me3标记的外周异染色质有关，CTCF结合位点被认为在募集转录因子方面发挥作用，并在定义的拓扑结构域中充当绝缘子，从而调节增强子的功能，并为基因表达建立抑制性环境28,30。与LAD的这些标志物一致，我们在胚胎和成人细胞中观察到异色标志物H3K9me3和H4K20me3的明显岛与CPL-LAD重叠。此外，观察到H3K27me3标志物在MNase衍生的(可能是亚核(核质)，而不是外周内核膜相关的)层粘连蛋白A特异性结合区域的γ基因座中显著更高。H3K27me3是EZH2甲基转移酶的产物，与H3K9me3和H4K20me3一样，其通常被认为抑制基因表达。然而，如上所述，尽管存在这些异色标志物，但是CPL亚型仍然在不同的胚胎和成人细胞类型中表达。此外，与公认的H3K4me3标志物在LAD28的抑制性环境中减少的观点不同，我们观察到强的H3K4me3以及H3K27Ac和H3K9Ac标志物与具有α、β和γ基因座的所有表达的亚型相关(图7)。H3K27Ac和H3K9Ac，与H3K4me3一样，被认为是活性基因表达的标志物31，与上述基因表达模式一致。
ATAC-Seq显示了CTCF结合位点的开放印迹，如通过TOBIAS在与CPL-CpGI相关的区域以外的区域中确定的(图7，用黑色箭头标记)。这两个CTCF位点中最多的3’位于γ簇之外，并位于超级增强子区内。通过TOBIAS在所有测定的细胞中测定的CTCF结合在这两个位点的存在(图5)表明，在胚胎和成人细胞中都存在潜在的拓扑结构域。为了证实这个潜在的组成性拓扑结构域，我们利用染色体构象捕获(Hi-C)来重建基于结构域拓扑的潜在成对相互作用。如在图7中所示，胚胎细胞和成人细胞似乎都显示出上述双CTCF位点之间的相互作用(用黑色箭头标记)。
实施例8：CPL亚型在不同类型分化细胞和解剖位置中的同源表达CPL亚型的同源表达此前已被证明可导致细胞-细胞聚集13,32。虽然据报道，CPL亚型是从神经元细胞中的每个等位基因随机表达的，可能是为了调节自我认知33，但如果CPL亚基与胞外域形成同源性相互作用，从而在胚胎组织形态发生中发挥作用，则预计其在特定分化的细胞类型中会独特而均匀地表达。我们通过检查特定分化细胞类型的生物复制中CPL亚型表达的模式，用分层聚类客观地确定表达同源性，在计算机上测试了我们的数据是否与这一假设一致。因此，我们对EP和AC的子集进行了分层聚类。如图8中所示，ES细胞(ESI-017和ESI-053)聚集在一起，但与不同分化的细胞类型的差异最大。正如预测的那样，下一层聚类有效地分化了EP和ANE细胞，因为这项研究的基础是其在这两类细胞之间的α、β和γ亚型的差异表达。最显著的是，胚胎ES衍生的血管内皮(30-MV2-10和30-MV2-17)的复制紧密聚集在一起。类似地，ES衍生的软骨祖细胞(4D20.8和SK11)34和产生的软骨细胞紧密聚集在一起。在成人细胞的情况下，表皮衍生的细胞类型，如角质形成细胞、黑色素细胞和星形胶质细胞，与牙髓和骨骼成肌细胞一样紧密聚集。有趣的是，成人主动脉内皮细胞和成人主动脉平滑肌细胞可重复聚集在一起，这与其解剖位置和自组装能力一致35。因此，这种计算机模拟与以下假设一致，即不同体细胞类型中CPL亚型表达的组合可能对其进行独特的描述，可能在类似细胞的粘附或其与解剖相关细胞的粘附中发挥作用。
实施例8：CPLγ亚型在体外细胞衰老过程中下调
我们在胚胎-胎儿发育过程中观察到的α、β和γ亚型基因表达的变化可能反映了胚胎器官发生完成后肿瘤抑制的进化选择。由于胚胎发育早期的端粒酶抑制导致随后的体细胞复制死亡据信反映了拮抗性多效性的类似实例，我们询问在体内和体外皮肤成纤维细胞老化过程中CPL亚型表达是否发生任何变化。
γ亚型在EFT过程中下调，如PCDHGB4，或在EFT过程中上调的(如PCDHGA12)，以及实际上所有γ亚型在体外衰老过程中都表现出下调。关于体内衰老，与胎儿相比，在出生后衰老的成纤维细胞中观察到γ亚型的显著上调，包括PCDHGB4和PCDHGA12(分别来自年龄11-83岁和妊娠8-16周上臂内侧的同步皮肤成纤维细胞系)。然而，在出生后的体内衰老过程中没有观察到显著的趋势。此外，来自Hutchinson-Gilford早衰综合征(HGPS)的皮肤成纤维细胞与12岁年龄匹配的对照细胞系相比没有显示出显著差异。然而，如图9中所示，γ基因座的亚型在体外随着复制衰老而显著减少。在10％血清中对数生长的细胞培养物与在0.5％血清中静止的细胞培养物相比，似乎增加了PCDHGA12的表达，突出了生长和培养同步在CPL亚型表达分析中的重要性。
实施例9：层粘连蛋白和CPL亚型在发育、衰老和癌症中的表达
接下来，我们询问在发育、衰老或癌症期间，CPL亚型表达是否与层粘连蛋白A或层粘连蛋白B1的表达相关。如此前所报道的36，与胎儿或成人对应物相比，我们观察到多能干细胞表达的LMNA水平明显较低，而LMNB1水平相对较高。关于体外衰老，我们再次观察到血清和/或生长相关的对两种层粘连蛋白表达的影响。如此前所报道的37，当比较早期传代(P19)的皮肤成纤维细胞和衰老的成纤维细胞(P38)时，我们发现LMNA显著增加，LMNB1显著减少。
在本研究中使用的多种肉瘤和癌细胞系的情况下，我们发现在癌细胞系中，LMNA表达增加和LMNB1表达减少与PCDHGA12表达相关，具有显著相关性。层粘连蛋白A和B1在组织表达结构域中的作用导致了一个有趣的问题，即其是否在正常发育和癌症期间的胚胎-胎儿转变中对改变的基因表达的调节中发挥致病作用，或者是其他未知调控事件的下游。
尽管本文的描述包含很多细节，但这些不应被理解为限制本公开的范围，而应被解释为仅提供当前优选实施方式中的一些实施方式的说明。因此，应当理解，本公开的范围完全包括对本领域技术人员来说可能变得显而易见的其他实施方式。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
实施例10：用免疫球蛋白超家族成员靶向癌细胞上的胚胎(胎儿前)CPL亚型以诱导细胞死亡
α和βCPL亚型成员在胚胎(胎儿前或前EFT)细胞和不同癌细胞类型(但不是除CNS细胞外的大多数成人细胞类型)中的令人吃惊的表达，提供了促进对所述α和βCPL亚型成员的免疫攻击的机会，其作为不同类型癌症的治疗策略。我们首先证实，胚胎(胎儿前)特异性CPL亚型，如PCDHB2和PCDHB2，在类似于mRNA水平的蛋白水平上表达。hESC衍生的克隆胚胎(胎儿前)祖细胞系4D20.8(骨软骨祖细胞)和30-MV2-6(胚胎血管内皮细胞)与正常人主动脉内皮细胞和间充质干细胞对应物中的蛋白强度(蛋白强度分别为1和73)相比，分别显示出3301和6807的蛋白强度。PCDHB2和PCDHB3蛋白是通过质谱法测定的7418个蛋白中差异表达最显著的蛋白。因此，由于CPL蛋白在质膜上表达并暴露于细胞外，其可能被免疫球蛋白超家族成员靶向，包括对α或βCPL亚型的成员具有特异性亲和力的单克隆或多克隆抗体，如IgG或IgM，或与毒素或成像配体(用于诊断目的)缀合的所述抗体，或双特异性抗体，例如通过非限制性实例，由两个单链可变片段组成的双特异性T细胞接合子，其中一个可变片段与靶α或βCPL亚型结合，另一个与T细胞抗原(如CD3)结合。
检测表达胚胎(胎儿前)CPL亚型的两种类型的癌症细胞，以测试免疫球蛋白靶向和促进特异性裂解成人衍生的人癌细胞而不是正常成人细胞的能力。检测表达8.57FPKM的PCDHB3转录物的乳腺癌细胞系BT-20和表达6.56FPKM的PCDHA3转录物的肺癌细胞系NCI-H358以及不表达α或βCPL亚型的正常人成纤维细胞(MDW-1)。将细胞暴露于对癌细胞或同种型抗体对照上表达的CPL亚型特异性的家兔多克隆抗血清。然后在暴露于针对癌细胞系上的胚胎PCDH的特异性多克隆Ab和含有CD8T细胞和自然杀伤细胞的家兔PBMC后对细胞进行计数。
在37℃和5％CO2下的湿润培养箱中在含补充了glutamax和10％FBS的DMEM的T-175培养瓶中培养两个人癌细胞细(1)BT-20(ATCC HTB-19乳腺癌，上皮)和(2)NCI-H358(ATCC CRL-5807支气管肺泡癌，非小细胞)和一个皮肤成纤维细胞系MDW-1(AgeXTherapeutics,Alameda)。
分离、计数每个系的细胞，并将25,000个细胞均匀接种到24孔板中。
次日，贴壁后，使用每种Ab(0.1mg/ml，100μL，多克隆家兔IgG抗人，来自ThermoFisher(Cat#PA5-119380、101272-2-AP、PA5-31297、PA5-110079、PA5-31129、BS-13726R、PA5-63484))或IgG同种型对照(Cat#02-6102)和Ab组合处理细胞。每个癌症细胞系基于其此前确定的PCDH转录物的表达而暴露于Ab。此外，用癌细胞系上使用的每个Ab和每个Ab组合作为附加对照，类似地处理正常成人衍生的皮肤成纤维细胞系(MDW-1)。
每个孔向250μL培养基(DMEM+10％FBS)中加入2μL和4μL单独的Ab(分别代表125和62.5的Ab稀释度)，以及Ab组合(每个Ab为2μL和4μL)。
在添加Ab之后，将培养板置于37℃下的湿润培养箱中在环境O2和5％CO2中培养90分钟。然后，将孔用PBS(含Ca和Mg)洗涤3次，以去除未结合的Ab。
在250μL培养基中，将体积为10μL的家兔PBMC(SKU:IQB-RbPB102,IQBiosciences,Berkeley CA)以5.0x10e6个细胞/mL添加到每个孔中，并放置在培养箱中24小时。除去含PBMC的培养基并将孔用PBS洗涤3次。
为了检查是否存在任何细胞损失或细胞裂解，用活/死活力/细胞毒性试剂盒(ThermoFisher Cat.V13154)2.0μM的试剂Calcein AM和4μM的溴化乙锭在20mM HEPES缓冲的HANKS平衡盐培养基中在37℃、5％CO2的湿润培养箱中染色45min。然后冲洗孔以除去游离染料，并加入新鲜的生长培养基。
染色后，使用配备有荧光的EVOS细胞成像系统(Invitrogen)对细胞进行可视化。最后，分离细胞(75μL TrypLE和225μL培养基)后使用ThermoFisher Countess细胞计数器获得每个孔的总细胞计数。
对每个孔进行总细胞计数，以评估任何细胞损失或裂解。对于两种癌细胞系，PCDHAb处理的孔中的剩余细胞数量统计学上显著(p<0.05)减少，这在可能预期的较高Ab浓度下最为明显。图11和图12显示了具有与同种型抗体一起显示的CPL亚型抗体的乳腺癌和肺癌中的细胞计数。特别地，当PCDHB3-Ab用于治疗BT-20HTB-19(乳腺癌，上皮)时，观察到最大的细胞损失。在这种情况下，与同种型对照处理(46,250和45,750)相比，使用2.0μL和4.0μL的PCDHB3Ab的剩余细胞数(41,500和32,500)，并且如预期的那样，在较高的Ab浓度下是最低的。与这一观察结果一致，在测试的两种Ab浓度下，包括PCDHB3的抗体组合(PCDHA3、PCDHA6和PCDHB3)具有平均细胞数(39,500和38,000)少于同种型对照(分别为43,000和44,000)的趋势。
类似地，与同种型处理的对照相比，用支气管肺泡癌细胞系NCI-H358表达的PCDH抗体(包括PCDHA1、A3和B6)处理显示统计学上显著更少的剩余细胞(P＜0.05)。关于肺癌细胞系的最引人注目的数据是使用PCDHA3抗体获得的，与同种型对照36,750和37,000相比，在较低和较高的Ab浓度下，该抗体分别显示更少的细胞32,000和29,000。与乳腺癌细胞系一样，与同种型对照35,000和36,500相比，包括PCDHA3(即，PCDHA1、A3、B6)的抗体组合治疗也具有减少细胞的趋势，即32,000和31,000。
最后，用癌细胞系中使用的所有相同的PCDH Ab和Ab组合处理的成纤维细胞系对照，如预期的那样，在所有孔中显示出一致的细胞数量，因为其缺乏Ab相互作用的胚胎表面PCDH抗原(图13)。
因此，CPL亚型在蛋白水平上表达，并可被免疫球蛋白超家族成员靶向，如基于抗体的疗法或T细胞受体策略，如CAR-T细胞。此外，saif免疫球蛋白超家族成员的使用具有靶向癌细胞的潜力，同时保留正常成人组织，可能的CNS细胞除外。
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Claims (60)

1.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用包含抗原的抗癌疫苗，从而诱导免疫应答。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定的一个或多个亚型是α簇原钙粘蛋白和/或β簇原钙粘蛋白的成员。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗原是所述α簇原钙粘蛋白和/或β簇原钙粘蛋白的一个或多个亚型。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗癌疫苗是mRNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述mRNA编码所述α簇原钙粘蛋白和/或β簇原钙粘蛋白的一个或多个亚型。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述mRNA编码PCDHA1。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述mRNA编码PCDHA3。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述mRNA编码PCDHA6。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述mRNA编码PCDHB3。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗癌疫苗是所述α簇原钙粘蛋白和/或β簇原钙粘蛋白的亚型的一个或多个多肽或其片段。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一个或多个多肽是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个多肽是PCDHA1或其片段。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个多肽是PCDHA3或其片段。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个多肽是PCDHA6或其片段。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个多肽是PCDHB3或其片段。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中载体包含一个或多个所述mRNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体是质粒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中脂质制剂包含所述抗癌疫苗。
22.公开了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用能够对所述受试者中的所述癌症产生免疫应答的遗传修饰的免疫细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述鉴定的一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述遗传修饰的免疫细胞包含抗原结合结构域。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的免疫细胞来源于多能干细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自所述受试者的细胞。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自供体的细胞。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的免疫细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域结合在所述癌细胞中表达的所述成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述亚型是所述α簇原钙粘蛋白和/或β簇原钙粘蛋白的成员。
32.根据权利要求30或权利要求31的任一项所述的方法，其中所述亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述CAR T细胞来源于多能干细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自所述受试者的细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自供体的细胞。
36.公开了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用免疫球蛋白超家族成员以引导特异性针对所述癌细胞的免疫应答。
37.根据权利要求36所述的方法，其中在所述癌细胞中鉴定的所述一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
38.根据权利要求36或权利要求27所述的方法，其中所述免疫球蛋白超家族成员是单克隆抗体或多克隆抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体结合PCDHA3。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体结合PCDHB3。
41.公开了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用T细胞激活双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分结合由所述α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座编码的一个或多个多肽或其片段，和第二抗原结合分子结合CD3，从而激活T细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中第一抗原结合部分与一个或多个亚型结合，所述亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3、其片段或其组合。
43.公开了一种用于在受试者中诱导针对哺乳动物癌细胞的免疫应答的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用呈递在所述癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型的遗传修饰的树突状细胞，从而在所述受试者中诱导对所述癌症的免疫应答。
44.根据权利要求43所述的方法，其中在所述癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的所述一个或多个亚型是来自所述α和/或β成簇的原钙粘蛋白基因座的亚型。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中由所述遗传修饰的树突状细胞呈递的成簇的原钙粘蛋白基因座的所述一个或多个亚型来自所述α和/或β原钙粘蛋白簇。
46.根据权利要求45所述的方法，其中由所述遗传修饰的树突状细胞呈递的成簇的原钙粘蛋白基因座的所述一个或多个亚型是PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的树突状细胞来源于多能干细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自所述受试者的细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述多能干细胞来源于来自供体的细胞。
50.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用来自所述成簇的原钙粘蛋白基因座的所述亚型的肽序列，从而在所述受试者中竞争性干扰癌细胞-细胞粘附。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肽序列来自所述α和/或β原钙粘蛋白簇的所述亚型或其片段。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述肽序列来自PCDHA1、PCDHA3、PCDHA6、PCDHB3或其组合。
53.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：1)从所述受试者中获得包含癌细胞的生物样品；2)鉴定显示出胚胎表型的癌细胞；3)鉴定在所述显示出胚胎表型的癌细胞中表达的成簇的原钙粘蛋白基因座的一个或多个亚型；和4)向所述受试者施用小分子，所述小分子干扰所述成簇的原钙粘蛋白基因座的所述亚型的同源相互作用，从而在所述受试者中竞争性干扰癌细胞-细胞粘附。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用化学治疗剂。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述化学治疗剂是DNA损伤剂、检查点抑制剂、抗体、烷化剂、抗代谢物、蒽环类、亚硝基脲类、拓扑异构酶抑制剂、异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或其组合。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述DNA损伤剂是高剂量铂基烷化化疗、铂化合物、噻替哌、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲类、氮芥衍生物、丝裂霉素类、表鬼臼毒素类、喜树碱类、蒽环类、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、电离辐射、ABT-888、奥拉帕尼(AZT-2281)、吉西他滨、CEP-9722、AG014699、AG014699与替莫唑胺、BSI-201、或其组合。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞癌症、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经癌症、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽部癌症、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌症、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯氏瘤、骨癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、口腔癌、头颈癌或皮肤癌。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、癌、肺癌或结肠癌。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述生物样品是乳腺癌或肺癌。
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