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CN117487804A - 一种对mRNA单碱基定点编辑的组装pRNA纳米递送体及用于基因治疗 - Google Patents

一种对mRNA单碱基定点编辑的组装pRNA纳米递送体及用于基因治疗 Download PDF

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CN117487804A CN202311280323.6A CN202311280323A CN117487804A CN 117487804 A CN117487804 A CN 117487804A CN 202311280323 A CN202311280323 A CN 202311280323A CN 117487804 A CN117487804 A CN 117487804A
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邹晓阳
张海斌
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Beijing Canier Technology Co ltd
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Fujian Junsheng Precision Medical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及基因治疗药物与细胞治疗方法。是基因错义突变造成细胞功能异常的新治疗方法，旨在对错义转录本mRNA进行突变点编辑，在细胞内源腺苷脱氨酶ADAR的作用下，将突变点腺嘌呤碱基脱氨基转换为次黄嘌呤，使突变点氨基酸改变、以改变蛋白功能而达成的基因治疗和细胞治疗。利用φ29噬菌体pRNA(在细菌膜打洞核酸注入菌体)自折叠组装为纳米颗粒、有刚性、韧性、还可自主递送进细胞的特点，重组此结构：将pRNA连接两段ADAR结合序列加突变点反义结合编辑序列组成，经克隆、转化于人肾细胞HEK 293T获编辑体外泌体；经用于绿色荧光蛋白编辑66位TAT为TGT致荧光消失，方法可行，对点突变疾病基因治疗有应用价值。

Description

一种对mRNA单碱基定点编辑的组装pRNA纳米递送体及用于基 因治疗
技术领域
本发明涉及细胞治疗与基因治疗方法，及其治疗候选物的发现与应用，以基因转录后编辑为主，用于修改功能基因转录后所翻译的蛋白结构，改变蛋白功能从而开展的基因治疗、细胞治疗。依发明方法制备的产物能下调基因的功能进行该基因所致的疾病生物治疗。
技术背景
疾病治疗药物和技术，以人类体细胞的基因组、转录本组和蛋白质组三个层次的生物大分子为目标，基因治疗的基因药物主要针对致病基因的DNA和基因转录本mRNA两类生物大分子。我们一直认为mRNA从结构上考虑是研发核酸药物的最理想靶标和策略。反义寡核苷酸、特异水解基因mRNA的核酸酶(Ribozyme和DNAzyme)以及具有干扰作用的双链RNA(siRNA)是药物设计优选候选物。
因为，基因DNA编辑技术如CRISPR/Cas9等，存在的问题是其在临床治疗应用中存在困难。首先，DNA结构复杂，难以解旋裸露解链结合靶定；其次，现有编辑体系依赖于外源编辑酶或效应蛋白表达，从而造成(1)蛋白分子量过大使得通过病毒载体进行装载及人体内递送十分困难；(2)由蛋白过表达引起的DNA/RNA水平的脱靶效应；(3)由外源蛋白表达引起的机体免疫反应及损伤；(4)机体内的预存抗体使外源编辑酶或效应蛋白被中和从而导致基因编辑失败等。
为避免上述问题，需建立新型基因编辑技术方法。作用于mRNA的干预分子可以通过工程化制备。比如表达载体转录生成大量pre-miRNA，在细胞中包裹成为miRNA外泌体，自然分泌到细胞外，以外泌体形式，经验证可以进入肿瘤细胞提高治疗效果，经动物实验证明也对肿瘤治疗和抑制转移有应用前景。除此之外，近年国际上兴起的RNA编辑，有希望成为一种有前途的纠正致病突变的治疗方法，其过程可逆、可调，而不会永久改变基因组。新的研究表明，由人胞内腺苷脱氨酶(Adenosine deaminases acting on RNA，ADAR。下文中简称ADAR)蛋白介导的RNA编辑具有明显的优势，包括高特异性和低引起免疫原性的倾向。我们从2000年开始从事mRNA结构和基因治疗研究，在这种基础上，通过将适体酶掺入基于ADAR的RNA编辑技术的引导RNA中来诱导RNA编辑策略。一旦添加或去除小分子，适体酶就会触发自裂解以释放引导RNA，从而实现小分子控制的RNA编辑。为了满足不同的RNA编辑应用，通过使用开/关合酶实现了靶mRNA的开启和关闭A-to-I mRNA编辑。从理论上讲，该策略可以应用于各种基于ADAR的编辑系统，可以提高RNA编辑技术的安全性和潜在的临床应用。
因此，本发明基于A-to-I mRNA编辑ADAR工作原理。设计上，利用噬菌体Φ29的、噬菌体在细菌细胞膜打洞将核酸注入菌体、能三联体聚合自组装的pRNA结构，加上ADAR识别序列结构，两种三个结构重组pRNA纳米颗粒——文中称为″pRNA 3H组装纳米颗粒″，针对某个基因也称为″pRNA 3H～XXX定点编辑纳米颗粒″在细胞外泌体中分泌，对靶细胞结合、下调和失活靶基因功能；该纳米颗粒作为药物先导物，可为一种新的基因治疗技术应用。
发明内容
本发明为一种定点靶向mRNA单碱基、编辑单碱基的″pRNA 3H组装纳米颗粒″制备技术，采用噬菌体Φ29的pRNA 3H三联体聚合RNA自组装结构、重组入两个ADAR识别结构基序，形成自组装纳米颗粒产物，应用于细胞功能基因的蛋白活性下调与失活，可用于对实验动物靶器官组织的基因表达下调，是基因治疗和细胞治疗技术创新和应用创新。
本发明经实验研究产生，发明内容为：
Φ29的pRNA分子有三个发卡结构(3H)为：3Ha、3Hb和3Hc，三个发卡上分别链接一个ADAR结合串基序、再一个ADAR结合串基序，和一个RNA靶点结合序列(约＜20nt)、；三段重组序列依碱基互补结合自组装成一个三角形纳米颗粒。
所述重构的″pRNA 3H组装纳米颗粒″的功能为：3Ha和3Hb引导ADAR高效结合靶基因mRNA的编辑位置，3Hc定点结合靶基因mRNA的编辑位点，ADAR能在两处结合集结而高效地发挥脱氨基化碱基编辑作用。
所述重构的″pRNA 3H组装纳米颗粒″制备，采用DNA重组和细胞内表达：克隆入pGEM-T载体克隆、再重组入pRNAT-U6.1/neo表达质粒；重组入pRNAT-U6.1/neo表达质粒转入人源细胞株，表达细胞株用人肾细胞HEK 293T，可体外培养繁殖；在细胞培养中可以将″pRNA 3H组装纳米颗粒″以外泌体形式分泌出胞；
所述″pRNA 3H组装纳米颗粒″的外泌体制备，采用上述细胞培养液，通过超速离心分级分离，收集纯化而成。
所述″pRNA 3H组装纳米颗粒″的外泌体，可以在培养细胞中导入到细胞并靶定基因mRNA，编辑其基因，失活基因表达。
靶定绿色荧光蛋白的″pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒″的外泌体，在培养细胞中靶定GFP基因mRNA的编码66位酪氨酸的TAT编辑后变为TGT、编辑后变为半胱氨酸，苯酚基团消失导致GFP高级结构失去苯环、荧光消失，在绿色荧光癌细胞、及绿色荧光癌细胞荷瘤动物检验有效。成功实现基因mRNA单核苷酸编辑达到基因治疗。并为密码子GAX(GAA，GAC，GAG和GAT)设计编辑为GGX(GGA，GGC，GGG和GGT)打下基础。
发明实施方式：
下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。材料方法为常规实验室条件可满足，所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。包括如下5个方面内容：
1、pRNA 3H细装纳米颗粒设计与定制
1.1、pRNA 3H片段设计
pRNA 3H片段，即pRNA 3hairpin。源于枯草杆菌噬菌体Phi29 pRNA，它是核基因组包装递送序列，为在其前衣壳中120nt的小RNA分子(图1.A)，由ATP驱动分子马达(图1.E)，含有结合域(23-97nt)包装结构及pRNA分子间配对聚合结构(图1.B，C，G，I)。可装载保护携带RNA分子不被酶降解，防止其在体内错误折叠、保持其序列靶向性。pRNA可装载达120ntRNA分子、核酶、RNA适配体(aptamer)，及化学分子基团.安全高效无免疫反应。Mg2+存在下包装分子牢固韧性十足，近期研究证实在镁离子存在下pRNA自组装的三个臂(H，hairpin)的相互结合牢固，可以承受250皮牛的对向拉力而不会发生变形和键断裂，作为药物分子载体——纳米递送体，有优越的稳定性和耐用刚性。图1.显示phi29pRNA作为装载核苷酸片段颗粒(图1.A，C)，微颗粒大小约为0.5纳米(图1.J所示)，形成2/3聚体(图1.C，I，J，K)，能递送进入细胞(下图G，细胞内标记荧光的分子)，pRNA可以携带RNA片段(图1的K，L)。pRNA装载纳米分子(http：//www.eng.uc.edu/nanomedicine/)是美国NIH资助成立″纳米药学研究中心(Nanomedicine Development Center)的核酸药物分子递送技术″，可从其相关文献介绍下载到序列，图1.中的H和L显示了其序列；ADAR集结结合基序(recruitingdomain motif)来自文献和Pubmed核酸数据库。
本发明采用的pRNA3H结构序列为185bp长度序列，其串联线性结构为：5′(3H1)TTGCCATGTGTATGTGGG----(3H2)CCCACATACTTTGTTGATCC------(3H3)GGATCAAT CATGC-3′，如图1中E和H中所示的红色H1/蓝色H2/绿色H3三段发夹自组装序列。
本发明采用的ADAR集结结合基序(motif)序列为：5′-GGTGTCGAGAAGAgGAGAACAATATGCTAAATGTTGTTCTCGTCTCCTCGACACC-3′。
本发明涉及的RNA编辑位点的片段约＜20nt，其结合序列为NNNNNNNNNCNNNNNNNNNN反义序列(见图2左侧上部灰色序列)，基因编辑点是凸起的胞嘧啶C所对应的不能配对的腺嘌呤A碱基，基因编辑发生在灰色序列结合在A腺嘌呤残基部位上(图中红色A＊)、在ADAR的酶学亚基脱氨作用下，变成次黄嘌呤残基I，而后在翻译过程中辨识成鸟嘌呤G，如见图2左图。本发明设计的″pRNA3H组装纳米颗粒″结构DNA序列为：5′-(3Ha)TTGCC ATGTGTATGTGGG--ADAR集结结合基序---------(3Hb)CCCACATACTTTGTTGATCC-------ADAR集结结合基序--(3Hc)GGATCAATCATGC------基因A-I定点编辑结合段反义序列-3′，连接起来可以书写为：5′--(3Ha)TTGCCATGTGTATGTGGGGGTGTCGAGAAGAGGAGAACAATATGCTAAATGTTGTTCTCGTCTCCTCGACACCCCCACATACTTTGTTGATCCGGTGTCGAGAAGAGGAGAACAATATGCTAAATGTTGTTCTCGTCTCCTCGACACCGGATCAATCATGCAANNNNNNCNNNNNNNNNAAAAAA-3′等。本结构将ADAR集结结合基序增加为两个相邻臂。发明构想是提高ADAR集结效率，从而加倍提高了腺苷脱氨酶的作用，这种加倍设计对基因编辑效果达到事半功倍之ADAR募集结合作用(见后续4和5章节验证内容)。
1.2、定点编辑基因的选择
绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein，简称GFP)表达在荧光显微镜下可见，因此GFP基因是所有从事分子生物学研究的常用工具，作为示踪蛋白，在荧光显微镜下发绿色荧光。GFP蛋白有11个β-折叠链形成外周β-筒，筒两端被小分子量短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个氨基酸残基是低65-67位的丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸(Ser65-Tyr66-Gly67)，三个氨基酸位于空间结构圆筒中央螺旋中部，与α-螺旋共价相连。GFP的发光现象由其生色团决定，GFP表达后折叠，第66位酪氨酸残基使Ser65-Tyr66-Gly67环化形成对羟基苯咪唑啉酮，即绿色荧光生色团。β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入，生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，发出的荧光不易被淬灭。
本发明如图3所示，pRNA 3H组装GFP基因定点编辑的纳米颗粒序列的设计，直接针对GFP的65/66/67三个氨基酸-Ser65-Tyr66-Gly67(图3序列中SYG)所编码的中间酪氨酸编码中间碱基——腺嘌呤A。pRNA装载核酸链接方式为：5′pRNA-UUG-AAC-ACC-ACA-AGA-GAA-AGU3′(红色C碱基直接对应中间酪氨酸的腺嘌呤A，编辑后变为次黄嘌呤核苷I)。
该设计靶向Ser65-Tyr66-Gly67的mRNA序列：UCU-UAU-GGU；通过RNA编辑将中间的A腺苷转换为肌苷I，mRNA序列则由UCU-UAU-GGU变为：UCU-UGU-GGU；因而蛋白质由Ser65-Tyr66-Gly67序列变为：Ser65-Cys66-Gly67，荧光基团因为缺乏酪氨酸的侧链苯环、形成荧光的基团缺乏变成半胱氨酸支链SH巯基而不能发荧光(图3)。
如果本设计被验证能获得效果，那么，依相同的A腺嘌呤编辑原理，在设计的基因定点编辑中，密码子GAX(GAA，GAC，GAG和GAT)均可设计编辑为GGX(GGA，GGC，GGG和GGT)，于是原本表达为强极性酸性可电离的天冬氨酸(GAC，GAT)或强极性酸性可电离的谷氨酸(GAA，GAG)的蛋白质序列全部变成不电离甘氨酸(GGA，GGC，GGG和GGT)，这种氨基酸改变是蛋白功能致命变异，因此蛋白质活性丧失，此即基因编辑改变蛋白质功能形成编辑的效果，见公开的氨基酸编码和性质图，未录为本发明之附图。
1.3、pRNA 3H组份各片段的合成
设计并商业合成5个片段(引物，如下表1)采用聚合酶链式反应合成DNA片段，表1：
1.4、pRNA 3H片段PCR反应扩增：先在3个试管中分别进行一步延伸，每个试管20μL反应体系，三管分别加入I和i、II和ii、III和iii这三对片段为引物，将片段结合退火延伸合成。PCR反应体系如下：10×反应缓冲液5μL，Taq1.0U，4种dNTP混合物各100umol/L，各5μL正反向成对引物(50μmol/L)；加去离子水补齐50μL反应体系。反应条件：95℃变性5min，按94℃变性30s，45℃退火30s接72℃延伸1min进行10个循环；接72℃5min。再从上述三管产物中，每一管取1μL转入第二次扩增：PCR反应体系为：10×反应缓冲液5μL，Taq1.0U，4种dNTP混合物各100umol/L，1μL正反向片段I和片段iii作为引物(50μmol/L)；加去离子水补齐50μL反应体系。反应条件：95℃变性5min，按94℃变性30s，50℃退火30s接72℃延伸1min进行10个循环；再扩增的PCR反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增片段的大小和亮度，在紫外灯下切下含扩增目的片段的琼脂糖凝胶，收集并通过纯化，得到含扩增目的片段的溶液，见图4的4#约200bp条带，备克隆用。
1.5、pRNA 3H片段重组入pGEM-T载体并克隆：
将上述PCR扩增的纯化片段与克隆载体pGEM-T(常规质粒，未提供结构图)进行连接。连接反应体系如下：连接酶2x连接酶缓冲液5μL，pGEM-T vector(50mg/L)1μL；纯化片段1μL，加纯净水到反应总体积为10μL。反应条件：16℃连接12h。然后进行细菌转化和克隆：将连接产物转化入高效感受态大肠杆菌JM109；菌液于摇床摇菌1h，然后将菌液铺于氨苄(Amp)抗性的IPTG/X-GAL LB琼脂平皿中，于37℃温箱倒置培养；16h后观察平皿菌落克隆形成情况，挑取2个白色克隆菌落，接种于300μL氨苄抗性的LB培养基中，37℃继续摇菌1h后，直接取菌液PCR反应鉴定片段是否连入pGEM-T载体中。PCR反应引物采用pGEM-T载体通用T7引物和SP6引物。pGEM-T空载体PCR扩增片段大小为160bp(图5中#6，7)，pGEM-T～pRNA 3H片段克隆质粒载体PCR扩增条带预期大小应为：目的片段长度(201bp)加空载体扩增片段长度(160bp)共361bp(图4中#2-4为阳性克隆)，2％琼脂糖凝胶电泳结果显示：2/3/4号克隆产物在高出300bp处有扩增条带，表明目的片段已成功连接入pGEM-T克隆载体。
将已成功插入目的片段质粒的菌液继续摇菌扩增后，抽提pGEM-T～pRNA 3H片段克隆阳性质粒，得到pGEM-T～pRNA 3H片段克隆质粒，-20℃保存备用。
1.6、pRNA 3H片段重组入pRNAT-U6.1/neo载体表达：
1.6.1、限制性核酸内切酶获取基因片段，pRNAT-U6.1/neo为常用商业可购质粒(图5)。采用BamHI和HindIII分别对pRNAT-U6.1/neo质粒和pGEM-T～pRNA 3H片段克隆质粒进行双酶切得到线性化，获得pRNAT-U6.1/neo质粒片段和来自pGEM-T中包含pRNA 3H片段的产物。酶切反应体系如下：BamHI(8U/μL)0.5μL和HindIII(8U/μL)0.5L；10×Buffer 2μL；质粒500ng；加去离子水补齐总体积20μL。反应条件：37℃水浴10h。pRNAT-U6.1/neo质粒酶切质粒长片段则经过核酸纯化柱进行纯化而获得。pRNA 3H片段酶切产物于2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下pGEM-T～pRNA 3H片段克隆质粒去酶切序列后190bp片段切胶回收和纯化获得(图6的1和2号条带，3号为pRNA 3H的PCR片段)。
1.6.2、目的片段连接制备表达载体，将上述酶切得到的线性化pRNAT-U6.1/neo质粒质粒片段和包含pRNA 3H目的片段进行连接，连接反应体系如下：2xSolution I(Takara公司)5μL。将酶切后pRNAT-U6.1/neo质粒线性片段，和酶切胶回收纯化pRNA 3H片段，混合在10μL链接反应体系；反应条件：16℃连接10h；将连接产物转化JM109，转移至含氨苄Amp琼脂糖凝胶培养板，16h培养后挑取阳性克隆，摇菌，取菌液PCR鉴定目的片段是否连入pRNAT-U6.1/neo质粒。PCR引物采用pRNAT-U6.1/neo质粒的通用T7引物和BGM反向引物，鉴定目的片段是否插入。pRNAT-U6.1/neo-pRNA 3H片段重组质粒预期PCR扩增片段长度应为：目的片段长度(200bp)加pRNAT-U6.1/neo双酶切的空载体扩增片段长度60bp为260bp，凝胶电泳表明重组成功(图6第3道)。纯化阳性质粒备用，并测序。
1.6.3、重组质粒的测序鉴定.采用U6启动子引物(5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′)进行测序，阳性质粒送测定序列，结果显示序列正确，符合设计，见1.2内容和图7。
2、pRNA 3H组装定点编辑纳米颗粒表达
2.1、细胞转染：将HEK 293T细胞铺于24孔板，待细胞长至孔板底面积95％以上时，利用脂质体lipofectamine 2000分别将pRNAT-U6.1/neo对照空白质粒和pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转入HEK 293T细胞。转染条件：lipofectamine 2000，2μl每孔，质粒，1μg每孔。Opit-MEM优化培养基(Invitrogen公司)用于分别稀释脂质体和质粒。
2.2、转染两种质粒的阳性HEK293T细胞G418筛选：转染HEK 293T细胞，生长较快，所以在96孔板中加入100ul细胞(2000/ml)，第二天每孔加入不同浓度G418筛选培养基，加入G418浓度为0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL；3天更换一次G418筛选培养基(空质粒转染组可见培养细胞发荧光，重组质粒组在荧光倒置显微镜观察发出细胞没有绿色荧光)，培养10-14天，以最低浓度细胞全部死亡为基准。前几天，低浓度的孔中细胞生长但细胞较少，中浓度和高浓度的细胞生长缓慢.约一周左右，中浓度的孔中出现死细胞，低浓度的死细胞较少，未加G418的孔长得很密。14天时，观察500μg/mL以上的细胞都死亡了，因此最终选择600μg/mLG418用于后续实验细胞。
2.3、转染阳性质粒的HEK293T细胞丧失荧光解释：上述2.2内容空质粒转染组可见培养细胞发荧光，重组质粒组在荧光倒置显微镜观察发出细胞没有绿色荧光，原因是重组质粒上游为双启动子(图6左图)：U6启动子后接CMV启动子——真核细胞强启动子，单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达。CMV作用下，pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒在HEK 293T细胞表达了GFP蛋白和pRNA 3H-GFP定点编辑纳米颗粒，两者等量持续表达，在细胞内依据设计的靶点结合，定点编辑使得每一个GFP蛋白改变了66Y为66C，因此荧光消失，而在胞内作用的pRNA3H-GFP定点编辑纳米颗粒能发挥定点脱氨基编辑作用，导致部分游离pRNA 3H-GFP定点编辑纳米颗粒可以外泌体形式分泌出细胞。
2.4、稳定转染两种质粒阳性HEK293T细胞：转染HEK 293T细胞加入24孔板培养，细胞密度稍小，转染后第2天1∶10稀释传代，设立空白细胞对照组，第3天加G418(600uq/ml)。第14天开始的5天细胞死亡较少，20天后死细胞较多，3天换液，待对照组里的细胞全部死亡，挑取单克隆细胞。单克隆种于48孔板后，生长5-7天，细胞生长较好，空质粒组发荧光而 重组质粒组仍然没有绿色荧光(图8)，待细胞密度达70％左右，将细胞传代至T25细胞培养瓶中，待细胞密度达到90％左右，再以2×106个细胞传代至T25细胞培养瓶，48小时后收集细胞培养上清，浓缩纯化外泌体进行分析。
2.5、稳定转染pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒细胞的鉴定
pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转染的人HEK 293T真核细胞培养时，RNA定点编辑改变了GFP蛋白结构丧失荧光，但在培养液可以分泌出质粒转录纳米颗粒pRNA3H组合产物，经过对其特异性反转录扩增验证、pRNA 3H-GFP定点编辑片段外泌体中有表达。过程如下：2.5.1、提取细胞总RNA反转录，RNA总样品取两份，进行两个反转录反应：用常规随机引物RT反应和RNA 3H片段反转录引物进行。pRNA 3H-GFP定点编辑片段反转录引物：5′-TTTTTACTTTCTCTTGTGGTG-3′。反转录反应体系如下：反转录酶0.5μL，10×RTBuffer1μL，常规随机引物或pRNA3H-GFP定点编辑片段反转录引物均为10μmol/L，RNA样品0.5μg，加无RNA酶水补齐至10μL体积。反应条件：37℃反应1h。
2.5.2、PCR扩增，对两个反转录产物进行PCR，人三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，其上游引物为：5′-AGAAGGCTGGGGCTC ATTTG-3′和下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。检测pRNA 3H-GFP定点编辑片段PCR引物序列如下：pRNA3H片段正向引物：5′GCCATGTGTATGTGGGGGT-3′，下游引物：5′-TTTTTACTTTCTCTTGTGGTG-3′。PCR反应体系如下：RT产物1μL，10xTaq(Takara公司)5μL，引物(10μmol/L)各0.5μL，4种dNTP混合物各100umol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，Mg2+1.0mmol去离子水补齐总反应体积50μL。PCR反应条件：95℃ 10min.94℃ 20s，53℃ 20s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 5min。将PCR反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，分析样品中pRNA 3H-GFP定点编辑片段表达差异。
3、pRNA 3H-GFP定点编辑细装纳米颗粒制备
3.1细胞采用pRNAT-U6.1/neo转染HEK 293T细胞为阴性对照细胞，2.4来源的pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转染HEK 293T细胞为阳性细胞。两种HEK293T细胞在培养瓶密度达90％左右时，取2×106个细胞传代至T25细胞培养瓶。
3.2细胞培养采用的血清：所用胎牛血清需经过在135000gX120min离心去除沉淀。
3.3细胞培养条件：在5％CO2，37℃培养箱环境下，采用DMEM高糖培养基、10％离心处理过的胎牛血清、1％P/S青霉素加链霉素，进行培养。
3.4、外泌体中pRNA 3H-GFP定点编辑纳米颗粒分析。pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H定点编辑质粒转染的HEK 293T细胞按3.3步骤转瓶培养后到48h收获培养上清液，取1ml培养上清，用RNA提取试剂盒制备总RNA，总RNA样品用pRNA 3H-GFP定点编辑片段特异性反转录引物和正反向引物进行扩增，扩增循环为30个循环，然后法进行凝胶观察和测定扩增产物的核酸定量分析。如图9所示第6道，获取的外泌体样本含pRNA 3H-GFP定点编辑片段，说明外泌体样本含有pRNA 3H基因定点碱基编辑纳米颗粒产物。
3.5、收获外泌体：转染HEK 293T细胞在培养48h收获培养上清液，采用6000g离心获得的上清液，用0.45um膜过滤，然后在135000gX120min离心，沉淀用PBS重新悬浮，然后135000gX120min离心。获得沉淀为纯化的外泌体产物，获得的外泌体均用D-PBS缓冲液溶解并分装(D-PBS为杜氏磷酸盐缓冲液，Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline)。
4、pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体基因表达失活功能的验证
目的：考察获得的pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体在表达绿色荧光细胞培养中，外目的：考察获得的pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体在表达绿色荧光细胞培养中，外泌体与细胞共孵育，对绿色荧光蛋白表达的影响分析。过程如下：
4.1、人源非小细胞肺腺癌NCI-H1299绿色荧光标记细胞系(中国科学院细胞库)。将细胞在37℃在5％CO2培养，完整培养基含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，在24孔培养细胞，每孔起始细胞数1.0X105个，分为4组，每组6孔。
4.2、培养细胞观察和分析：人源肺腺癌NCI-H1299绿色荧光标记细胞，且稳定表达GFP。96孔培养板培养下，荧光显微镜下可见清晰均匀的分布于整个细胞内的绿色荧光(图10的0号)。取3.5章节所述收获的外泌体，按照原始上清液体积的1/100D-PBS缓冲液重悬液，为外泌体制剂成品，取HEK293T空质粒转染对照组的和3.3所述细胞的外泌体为样本，0组为HEK293T对照组外泌体样本，1/2/3组分别为pRNA 3H-GFP定点编辑片段外泌体三种浓度(外泌体成品用D-PBS缓冲液再按1/100、1/20，及1/10稀释为A/B/C三个浓度)，1/2/3组加入A/B/C三个浓度各为10μL加入细胞培养孔，继续培养36h观察细胞状态。
4.3、细胞状态，实验观察到1/2/3组(A/B/C三个浓度分组)细胞36小时培养下，在荧光显微镜下均呈荧光有明显差异，高浓度明显减弱。图10可见加入外泌体细胞生长正常，pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体浓度高者(3号)荧光较弱，对比差异显著，说明pRNA3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体对细胞GFP表达有沉默作用，导致GFP蛋白表达降低，GFP基因编辑蛋白荧光消失与pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体呈现剂量相关，基因编辑作用显著。
5、pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体在荷瘤裸鼠的动物试验验证。实验采用3.5章节pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H定点编辑质粒转染的HEK 293T细胞，能自分泌pRNA3H定点编辑质粒外泌体，将该细胞和绿色荧光标记细胞NCI-H1299共同混合培养，理论上前者的外泌体可以进入后者细胞并发挥基因编辑作用。两种细胞共培养以后，收集混合再注射在裸鼠皮下，让绿色荧光标记细胞NCI-H1299成瘤。实验操作如下：在6cm培养板培养细胞，每板起始细胞数(1.0+1.0)X106个。试验采用两组：NCI-H1299绿色荧光标记细胞皮下注射组，和混合细胞组，即混合外培养72小时后收集注射BALB/c裸小鼠肿瘤动物皮下按照加1∶1基质胶100μL接种(细胞悬液的浓度约为5×107个细胞/ml)，以12小时光照和12小时黑暗时间表饲喂食物和水。在开始体内研究之前小鼠适应1周。将10只小鼠平均分为2组每组5只。培养30天后采用活体荧光影像系统摄像观察(委托动物试验公司完成)。
5.1、活体成像结果，瘤细胞混合外泌体培养36小时后接种，在对照组和试验组(n＝5)可见荷瘤的肿瘤体积无差异，图11，说明NCI-H1299荧光细胞未受影响正常生长，但混合细胞组活体在细胞注射区无荧光出现，说明共培养并注射的pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转化HEK293T细胞分泌的外泌体对NCI-H1299细胞实时地、持续地、分泌并导入编辑纳米颗粒，对表达GFP基因发挥了实时地、持续地定点编辑和荧光消除作用(图11)。证明细胞实时分泌外泌体中pRNA 3H-GFP定点编辑纳米颗粒自导入NCI-H1299细胞且对GFP发挥了基因编辑作用。此部分试验验证了pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转化HEK293T细胞分泌的外泌体中pRNA 3H-GFP定点编辑纳米颗粒对动物体内细胞发挥的基因编辑作用获得验证。
6、总结.
结论1、″pRNA 3H～基因mRNA定点编辑纳米颗粒″依实验验证的上述1-5步骤5个方面内容，采用人真核细胞表达质粒生产外泌体，在稳定表达外泌体的细胞中，pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒可以获得表达，该方法对细胞治疗与基因治疗提供了方法，提供了治疗候选物的发掘与应用方式，对基因定点编辑纳米颗粒候选物制备为工程化外泌体，有重要应用价值；
结论2、本方法用GFP表达细胞株实验，表明应用pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体在抑制细胞功能基因表达、动物体内功能基因所致病症发生发展，能起基因编辑和蛋白功能的抑制作用。本发明表明，应用pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体在基因转录后编辑表达、编辑蛋白结构、从而调节细胞功能有碱基定点编辑的基因治疗作用。
结论3、本设计在模式基因GFP获得了分子学、细胞学和体内组织学效果验证，那么，依相同的A腺嘌呤编辑原理，在设计的基因定点编辑中，由鸟嘌呤-腺嘌呤-X(腺嘌呤鸟嘌呤AG或胞嘧啶胸腺嘧啶CT)三联体基因密码子GAX(含GAA，GAC，GAG和GAT)均可设计编辑为GGX(GGA，GGC，GGG和GGT)，于是原本表达为强极性酸性可电离的天冬氨酸(GAC，GAT)或强极性酸性可电离的谷氨酸(GAA，GAG)的蛋白质序列全部变成不电离甘氨酸(GGA，GGC，GGG和GGT)，这种氨基酸改变是蛋白功能致命变异，因此蛋白质活性丧失，此即基因编辑改变蛋白质功能形成编辑的效果(见公开的氨基酸编码和性质图，未录为本发明之附图)，本设计为此类定点编辑提供了类比、可实现的技术。
结论4、″pRNA 3H～基因mRNA定点编辑纳米颗粒″可自组装、可包裹分泌、可递送进入细胞、可对基因mRNA定点编辑碱基，为基因治疗和细胞治疗提供mRNA定点核苷酸人工突变技术，在单核苷酸多态性的基因疾病进行临床基因治疗与细胞治疗中应用.
附图说明
图1.pRNA结构、自组装和荷载寡核苷酸纳米微粒结构。
图2.本发明所用的ADAR介导mRNA定点编辑的工作原理。
图3.pRNA 3H组装定点编辑GFP基因纳米颗粒的序列的设计(左图为GFP基因蛋白序列，右图为pRNA3H定点编辑GFP纳米颗粒的结合靶点与序列设计)
图4.pRNA 3H片段PCR反应扩增(通过合成5个片段分别组合延伸扩增pRNA 3H片段，#4号条带为全长产物)
图5.pRNA 3H片段PCR反应扩增(2/3/4号条带的克隆在高出300bp处有扩增产物，表明目的片段已成功连接入pGEM-T克隆载体。)
图6.pRNAT-U6.1/neo质粒，和pRNA 3H片段双酶切纯化(右图第1和2条带)。
图7 pRNA 3H组装GFP定点编辑纳米颗粒阳性克隆测序结果(序列正确，符合理论设计；靶基因为绿色荧光蛋白基因，编辑的靶序列为5’-ACT TTC TCT TAT GGT GTT CAA--3’、蛋白序列为：64F65S66Y67G68V69Q，编辑pRNA3H定点结合靶序列设计为5’-TTG AAC ACC ACAAGA GAA AGT-3’，编辑位点将TAT编辑为TGT密码子，原66 Y翻译变为66 C，见上图测定的222-242序列和说明书1.2文字内容)
图8，HEK293T细胞状态(400×，A和B为可见光与紫外光下的空载体pRNAT-U6.1/neo组，C和D为可见光与紫外光下的pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒组，定点编辑GFP纳米载体组丧失荧光)
图9，总RNA在进行的RT-PCR的结果。1#和2#样本分别为转染pRNAT-U6.1/neo空质粒和2.4内容重组pRNAT-U6.1/neo-pRNA3H-GFP定点编辑质粒两种HEK293T细胞提取的RNA扩增条带，图中2#第3条带为pRNA 3H-GFP定点编辑片段扩增带，第4第5条带为内参条带。说明只有2.4重组质粒转染细胞能表达pRNA 3H-GFP定点编辑片段。第6道为外泌体RT-PCR扩增结果(阳性)。
图10，制备的pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体对细胞GFP基因表达沉默(0为NCI-H1299细胞对照组，1/2/3组加入外泌体纳米颗粒三个从低到高浓度，细胞生长正常，pRNA 3H～GFP定点编辑纳米颗粒外泌体浓度高者即3组图的荧光小时，基因表达作用于1/2组差异显著)。
图11，NCI-H1299荧光细胞未受影响正常生长，但混合细胞组活体在细胞注射区无荧光，说明共培养并注射的pRNAT-U6.1/neo～pRNA 3H-GFP定点编辑质粒转化HEK293T细胞分泌的外泌体对NCI-H1299细胞导入了编辑纳米颗粒，对NCI-H1299表达GFP基因发挥了定点编辑和荧光消除作用。

Claims (5)

1.″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″的设计，即：pRNA 3H的第一段发卡序列连接靶基因mRNA识别结合序列，其第二和第三段发卡均加入ADAR结合序列。
2.依权利要求1的″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″，于任何基因mRNA基因编辑中的应用。
3.依权利要求2，为基因治疗和细胞治疗提供mRNA定点核苷酸人工突变技术，在单核苷酸疾病的临床治疗应用。
4.依权利要求1的″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″通过人细胞表达，从细胞分泌出胞外，在外泌体中可以收集纯化为制品。
5.绿色荧光蛋白mRNA基因编辑中，采用定点编辑针对66位密码子TAT编辑为TGT、使该密码子蛋白序列从Tyrosin氨基酸突变为Cystine的应用。即对GFP核糖核酸密码子序列的胸腺嘧啶-腺嘌呤-胸腺嘧啶编辑变成胸腺嘧啶-鸟嘌呤-胸腺嘧啶、从而将其蛋白翻译从酪氨酸变成半胱氨酸。
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