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CN117479926A - 脂质纳米颗粒组合物 - Google Patents

脂质纳米颗粒组合物 Download PDF

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CN117479926A
CN117479926A CN202280042132.3A CN202280042132A CN117479926A CN 117479926 A CN117479926 A CN 117479926A CN 202280042132 A CN202280042132 A CN 202280042132A CN 117479926 A CN117479926 A CN 117479926A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
cells
cell
grna
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280042132.3A
Other languages
English (en)
Inventor
A·斯瓦米
V·拉克舍
A·普鲁德乌斯
M·梅塔尼
R·G·帕马
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intelia Therapeutics Co ltd
Original Assignee
Intelia Therapeutics Co ltd
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Publication date
Application filed by Intelia Therapeutics Co ltd filed Critical Intelia Therapeutics Co ltd
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Abstract

本公开提供了可电离脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的脂质纳米颗粒(LNP)组合物，其适用于递送生物活性剂，例如将生物活性剂递送至细胞，以制备工程化的细胞。本文所公开的LNP组合物适用于基因编辑的方法和递送生物活性剂的方法和修饰或裂解DNA的方法。

Description

脂质纳米颗粒组合物
相关申请的交叉引用
本申请案要求2021年4月17日提交的美国临时专利申请号63/176228、2021年11月1日提交的美国临时专利申请号63/274171和2022年3月4日提交的美国临时专利申请号63/316575的优先权权益，所述申请中的每一个的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
用可电离脂质配制的脂质纳米颗粒可充当用于将生物活性剂，特别是多核苷酸，诸如RNA，包括mRNA和引导RNA，递送至细胞中的载荷媒介物。含有可电离脂质的LNP组合物可有助于将寡核苷酸药剂递送跨过细胞膜，并且可用于将用于基因编辑的组分和组合物引入到活细胞中。尤其难以递送至细胞的生物活性剂包括蛋白质、基于核酸的药物及其衍生物，尤其包括诸如mRNA的相对较大的寡核苷酸的药物。用于将有前景的基因编辑技术递送至细胞中，诸如用于递送CRISPR/Cas9系统组分(例如编码核酸酶的mRNA和相关引导RNA(gRNA))的组合物尤其引人关注。
需要用于改善诸如RNA的核酸的体内和体外递送的组合物。举例而言，需要用于将CRISPR/Cas组分递送至诸如人细胞的真核细胞的组合物。具体地说，用于递送编码CRISPR蛋白质组分的mRNA和用于递送CRISPR gRNA的组合物尤其引人关注。具有可稳定和递送RNA组分的适用于体外和体内递送的特性的组合物也尤其引人关注。
发明内容
本公开提供了脂质组合物(例如纳米颗粒(LNP)组合物)。此类脂质组合物可具有有利于将生物药剂，包括例如核酸载荷，诸如CRISPR/Cas基因编辑组分递送至细胞的特性。
在一些实施方案中，LNP组合物包含：
生物活性剂；和
脂质组分，其中所述脂质组分包含：
a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-50mol％；
b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约7-25mol％；
c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约39-65mol％；和
d)PEG脂质，其量为所述脂质组分的约0.5-1.8mol％；
其中所述可电离脂质为式(I)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基或C7-11无支链炔基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
在一些实施方案中，LNP组合物包含：
生物活性剂；和
脂质组分，其中所述脂质组分包含：
a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-50mol％；
b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约7-25mol％；
c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约39-65mol％；和
d)PEG脂质，其量为所述脂质组分的约0.8-1.8mol％；
其中所述可电离脂质为式(I)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约30-45mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10-15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约39-59mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1-1.5mol％。
在一些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约30mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约59mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1-1.5mol％。
在一些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约40mol％；中性脂质的量为脂质组分的约15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约43.5mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1.5mol％。
在一些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约50mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约39mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1mol％。
在某些实施方案中，可电离脂质是
或其盐，中性脂质是DSPC；辅助脂质是胆固醇；并且PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在某些实施方案中，LNP的Z平均直径小于约145nn，例如小于约100nm、小于约95nm或小于约90nm。在某些实施方案中，LNP的数量平均直径大于约45nm，例如大于约50nm。
在某些实施方案中，LNP的多分散性指数为约0.005至约0.75，例如约0.005至约0.1。
在一些实施方案中，LNP组合物的N/P比为约5至约7，较佳约6。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中核酸组分是RNA组分。在一些实施方案中，RNA组分包含mRNA。在优选的实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中RNA组分包含RNA引导的DNA结合剂，例如Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA，或Cas9核酸酶mRNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中mRNA是修饰的mRNA。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中RNA组分包含gRNA核酸。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸是gRNA。
在某些优选的实施方案中，本公开涉及本文所述的LNP组合物，其中RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸是或编码双引导RNA(dgRNA)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA核酸是或编码单引导RNA(sgRNA)。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的LNP组合物，其包含引导RNA核酸和2类Cas核酸酶mRNA，其中mRNA与引导RNA核酸的比率为按重量计约2∶1至1∶4，优选按重量计约1∶1。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何LNP组合物，其中gRNA是修饰的gRNA，例如所述修饰的gRNA在5′端处包含前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰，或所述修饰的gRNA在3′端处包含最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰，或两者。
在某些实施方案中，本公开涉及一种将生物活性剂递送至细胞的方法，其包括使细胞与本文所述的LNP组合物接触。
在某些实施方案中，本公开涉及一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与本文所述的LNP组合物接触。在某些实施方案中，裂解步骤包括引入单链DNA切口。在其他实施方案中，裂解步骤包括引入双链DNA断裂。在某些实施方案中，LNP组合物包含2类Cas mRNA和gRNA核酸。在某些实施方案中，所述方法还包括将至少一种模板核酸引入到细胞中。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括向动物，例如人施用LNP组合物。在某些实施方案中，所述方法包括向细胞，诸如真核细胞，并且尤其是人细胞施用LNP组合物。在一些实施方案中，细胞是适用于疗法(例如过继细胞疗法(ACT))的细胞类型。ACT的实例包括自体和同种异体细胞疗法。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如造血干细胞、诱导性多能干细胞或另一种专能或多能细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，例如可发育成骨胳、软骨、肌肉或脂肪细胞的间充质干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含眼部干细胞。在某些实施方案中，细胞选自间充质干细胞、造血干细胞(HSC)、单核细胞、内皮祖细胞(EPC)、神经干细胞(NSC)、角膜缘干细胞(LSC)、组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(TSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、眼部干细胞、多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)和用于器官或组织移植的细胞。
在某些实施方案中，细胞是肝细胞。在其他实施方案中，细胞是免疫细胞，例如白细胞或淋巴细胞，优选是淋巴细胞，甚至优选是T细胞、B细胞或NK细胞，最优选是活化T细胞或非活化T细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括施用以包含mRNA、gRNA和gRNA核酸中的一种或多种的第一LNP组合物和第二LNP组合物形式配制的mRNA。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物同时施用。在其他实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物依序施用。在某些实施方案中，mRNA和gRNA核酸以单一LNP组合物形式配制。在一些实施方案中，第一LNP组合物包含第一gRNA并且第二LNP组合物包含第二gRNA，其中第一gRNA和第二gRNA包含与不同靶标互补的不同引导序列。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中细胞与LNP组合物体外接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中细胞与LNP组合物离体接触。在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其包括使动物的组织与LNP接触。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起基因敲除。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起基因校正。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所述的任何基因编辑方法，其中基因编辑引起插入。在一些实施方案中，插入是基因插入。
本文提供了用于体外基因工程化T细胞的方法，其克服先前方法的障碍。在一些实施方案中，初始T细胞与至少一种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，非活化T细胞与两种或更多种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，活化T细胞与两种或更多种脂质组合物体外接触并且被遗传修饰。在一些实施方案中，T细胞在活化前步骤中被修饰，包括使(非活化)T细胞与一种或多种脂质组合物接触，之后活化所述T细胞，之后在活化后步骤中进一步修饰所述T细胞，包括使所述活化T细胞与一种或多种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使非活化T细胞与一种、两种或三种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使活化T细胞与一种至十二种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使活化T细胞与一种至八种脂质组合物、任选地一种至四种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使所述活化T细胞与一种至六种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与两种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与三种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与四种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与五种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与六种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与七种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与八种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与九种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与十种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与十一种脂质组合物接触。在一些实施方案中，使T细胞与十二种脂质组合物接触。脂质组合物的此类示例性依序施用(任选地在活化前步骤和活化后步骤中进一步依序或同时施用)利用T细胞的活化状态并且在编辑后提供独特优点和更健康的细胞。在一些实施方案中，基因工程化的T细胞具有以下有利特性：每个靶位点处的高编辑效率、增加的编辑后存活率、低毒性(不管转染复数)、低易位(例如无可测量靶标-靶标易位)、增加的细胞因子(例如IL-2、IFNγ、TNFα)产生、在重复刺激下(例如在重复抗原刺激下)的持续增殖、增加的扩增和/或记忆细胞表型标志物的表达，包括例如早期干细胞。
附图说明
图1A是显示出在通过使用具有各种脂质组分比率的化合物3的LNP组合物将Cas9mRNA和sgRNA递送至活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图1B是显示出在通过使用具有各种脂质组分比率的化合物3的LNP组合物将Cas9mRNA和sgRNA递送至非活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图2A是显示出在通过使用具有各种脂质组分比率的化合物3的LNP组合物将Cas9mRNA和sgRNA递送至活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图2B是显示出在通过使用具有各种脂质组分比率的化合物3的LNP组合物将Cas9mRNA和sgRNA递送至非活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图3A是显示出在通过使用具有化合物1、化合物3和化合物4的LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)以及具有化合物1、化合物3和化合物4的比较LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：50％可电离脂质、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和sgRNA递送至活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图3B是显示出在通过使用具有化合物1、化合物3和化合物4的LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)以及具有化合物1、化合物3和化合物4的比较LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：50％可电离脂质、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和sgRNA递送至非活化CD3+ T细胞之后的CD3-细胞百分比的图。
图4是显示出在通过使用LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；50％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；以及50％可电离脂质(化合物8)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和靶向AAVS1的sgRNA递送至NK细胞之后，各种LNP组合物浓度对编辑百分比的影响的图。
图5A是显示出在通过使用LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；50％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；以及50％可电离脂质(化合物8)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和靶向AAVS1的sgRNA递送至单核细胞之后，各种LNP组合物浓度对编辑百分比的影响的图。
图5B是显示出在通过使用LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；50％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；以及50％可电离脂质(化合物8)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和靶向AAVS1的sgRNA递送至巨噬细胞之后，各种LNP组合物浓度对编辑百分比的影响的图。
图6是显示出在通过使用LNP组合物(其具有标称mol％比率的脂质组分：30％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、59％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；50％可电离脂质(化合物3)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG；以及50％可电离脂质(化合物8)、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG)将Cas9 mRNA和靶向AAVS1的sgRNA递送至B细胞之后，各种LNP组合物浓度对编辑百分比的影响的图。
具体实施方式
本公开提供了适用于将生物活性剂，包括核酸，诸如CRISPR/Cas组分RNA(mRNA和/或gRNA)(“载荷”)递送至细胞的脂质组合物以及制备和使用此类组合物的方法。此类脂质组合物包括可电离脂质、中性脂质、PEG脂质和辅助脂质。在一些实施方案中，可电离脂质是如本文所定义的式(I)或(II)化合物。在某些实施方案中，脂质组合物可包含生物活性剂，例如RNA组分。在某些实施方案中，RNA组分包括mRNA。在一些实施方案中，mRNA是编码2类Cas核酸酶的mRNA。在某些实施方案中，RNA组分包括gRNA和任选地编码2类Cas核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，脂质组合物是脂质纳米颗粒(LNP)组合物。“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指(不限于以下含义)包含多种(即多于一种)通过分子间力彼此以物理方式缔合的脂质组分的颗粒。
还提供了使用这些脂质组合物进行基因编辑的方法和制备工程化的细胞的方法。在一些实施方案中，LNP组合物可用于将生物活性剂递送至细胞、组织或动物。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，并且尤其是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肝细胞。在一些实施方案中，细胞是适用于疗法(例如过继细胞疗法(ACT)，诸如自体和同种异体细胞疗法)的细胞类型。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如造血干细胞、诱导性多能干细胞或另一种专能或多能细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，例如可发育成骨胳、软骨、肌肉或脂肪细胞的间充质干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含眼部干细胞。在某些实施方案中，细胞选自间充质干细胞、造血干细胞(HSC)、单核细胞、内皮祖细胞(EPC)、神经干细胞(NSC)、角膜缘干细胞(LSC)、组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(TSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、眼部干细胞、多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)和用于器官或组织移植的细胞。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，诸如白细胞或淋巴细胞。在优选的实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。在优选的实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞是活化T细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞是非活化T细胞。
在一些实施方案中，本文所提供的LNP组合物和方法使得编辑效率大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，LNP组合物和方法使得编辑效率为约80％-95％、约90％-95％、约80％-99％、约90％-99％或约95％-99％。
可电离脂质
本公开提供了可用于LNP组合物中的可电离脂质。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(I)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基或C7-11无支链炔基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是具有式I结构的化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(II)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
Z1是C2-3亚烷基；
R1是C7-9无支链烷基；并且
每个R2独立地是C8烷基；
或其盐。
在某些实施方案中，X1是C6亚烷基。在其他实施方案中，X1是C7亚烷基。
在某些实施方案中，Z1是直接键并且R5和R6各自是C8烷氧基。在其他实施方案中，Z1是C3亚烷基并且R5和R6各自是C6烷基。
在某些实施方案中，X2是并且R2不是烷氧基。在其他实施方案中，X2不存在。
在某些实施方案中，Z1是C2亚烷基；在其他实施方案中，Z1是C3亚烷基。
在某些实施方案中，Z2是-OH；在其他实施方案中，Z2是-NHC(＝O)OCH3。在其他实施方案中，Z2为-NHS(＝O)2CH3。
在某些实施方案中，R1是C7无支链亚烷基。在其他实施方案中，R1是C8支链或无支链亚烷基。在其他实施方案中，R1是C9支链或无支链亚烷基。
在某些实施方案中，可电离脂质是盐。
代表性式(I)化合物包括：
或其盐，诸如其药学上可接受的盐。所述化合物可根据WO2020/072605(例如第69页-第101页)和Mol.Ther.2018，26(6)，1509-1519(“Sabnis”)中所阐述的方法合成，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入。
本公开的式(I)或(II)化合物可根据其所处的介质的pH来形成盐。例如，在弱酸性介质中，式(I)或(II)化合物可被质子化并因此带有正电荷。相反地，在弱碱性介质中，诸如例如其中pH为大约7.35的血液中，式(I)或(II)化合物可不被质子化并因此不带电荷。在一些实施方案中，本公开的式(I)或(II)化合物可在至少约9的pH下主要被质子化。在一些实施方案中，本公开的式(I)或(II)化合物可在至少约10的pH下主要被质子化。
式(I)或(II)化合物主要被质子化的pH与其内在pKa相关。在一些实施方案中，本公开的式(I)或(II)化合物的盐的pKa在约5.1至约8.0、甚至更优选在约5.5至约7.6的范围内。在一些实施方案中，本公开的式(I)或(II)化合物的盐的pKa在约5.7至约8、约5.7至约7.6、约6至约8、约6至约7.5、约6至约7、约6至约6.5或约6至约6.3的范围内。在一些实施方案中，本公开的式(I)或(II)化合物的盐的pKa为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.6或约6.6。或者，本公开的式(I)或(II)化合物的盐的pKa在约6至约8的范围内。式(I)或(II)化合物的盐的pKa可以是配制LNP的重要考虑因素，因为已发现pKa在约5.5至约7.0范围内的某些脂质所配制的LNP对体内递送载荷至例如肝脏是有效的。此外，已发现，pKa在约5.3至约6.4范围内的某些脂质所配制的LNP对体内递送至例如肿瘤是有效的。参见例如WO2014/136086。在一些实施方案中，可电离脂质在酸性pH下带正电但在血液中是中性的。
额外脂质
适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性、不带电荷或两性离子型脂质。适用于本公开中的中性磷脂的实例包括但不限于二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1，2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1，2-双二十碳烯酰基(dieicosenoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰基胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在某些实施方案中，中性磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)，优选二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开中的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在某些实施方案中，辅助脂质可以是胆固醇或其衍生物，诸如胆固醇半琥珀酸酯。
在一些实施方案中，LNP组合物包括聚合脂质，诸如PEG脂质，其可影响纳米颗粒可体内或离体(例如在血液或培养基中)存在的时长。PEG脂质可通过例如减少颗粒聚集并控制粒度来辅助配制方法。本文中所用的PEG脂质可调节LNP的药代动力学特性。典型地，PEG脂质包含脂质部分和基于PEG(有时被称作聚(环氧乙烷))的聚合物部分(PEG部分)。适用于具有本公开的式(I)或(II)化合物的脂质组合物的PEG脂质和关于此类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等人，Pharmaceutical Research 25(1)，2008，第55页-第71页和Hoekstra等人，Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52。额外合适的PEG脂质公开于例如WO 2015/095340(第31页第14行至第37页第6行)、WO 2006/007712和WO 2011/076807(“隐形脂质”)中，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺、包括包含具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基的那些，其中所述链可包含一个或多个官能团，诸如例如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基还可包含一个或多个取代的烷基。链长可以是对称或不对称的。
除非另外指示，否则如本文所用的术语“PEG”表示任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物，诸如乙二醇或环氧乙烷的任选取代的直链或支链聚合物。在某些实施方案中，PEG部分未被取代。或者，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。例如，PEG部分可包含PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.MiltonHarris，Poly(ethylene glycol)chemistry：biotechnical and biomedicalapplications(1992))；或者，PEG部分可以是PEG均聚物。在某些实施方案中，PEG部分的分子量为约130至约50,000，诸如约150至约30,000，或甚至约150至约20,000。类似地，PEG部分的分子量可为约150至约15,000、约150至约10,000、约150至约6,000或甚至约150至约5,000。在某些优选的实施方案中，PEG部分的分子量为约150至约4,000、约150至约3,000、约300至约3,000、约1,000至约3,000或约1,500至约2,500。
在某些优选的实施方案中，PEG部分为“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，其平均分子量为约2，000道尔顿。PEG-2K在本文中由以下式(III)表示：其中n为约45，表示所述数量平均聚合度包含约45个亚单元。然而，还可使用本领域已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数量平均聚合度包含约23个亚单元(n＝23)和/或68个亚单元(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可以是未取代的烷基，诸如甲基。
在本文所述的任一实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰基甘油、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，来自NOF，Tokyo，Japan)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，来自NOF，Tokyo，Japan)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺和PEG-二硬脂酰基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8′-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3′，6′-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3，4-二-十四氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMPE)或1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2k-DMG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，AvantiPolar Lipidss，Alabaster，Alabama，USA)、1，2-二硬脂酰基-sn-丙三醇、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo，Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1，2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在某些此类实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSG。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSPE。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DMA。在另外其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C-DMA。在某些实施方案中，PEG脂质可以是化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-DSA。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG2k-C18。
在优选的实施方案中，PEG脂质包括甘油基。在优选的实施方案中，PEG脂质包括二肉豆蔻酰基甘油(DMG)基。在优选的实施方案中，PEG脂质包含PEG-2k。在优选的实施方案中，PEG脂质是PEG-DMG。在优选的实施方案中，PEG脂质是PEG-2k-DMG。在优选的实施方案中，PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在优选的实施方案中，PEG-2k-DMG是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
脂质组合物
本文描述了包含至少一种式(I)或(II)化合物或其盐(例如其药学上可接受的盐)、至少一种辅助脂质、至少一种中性脂质和至少一种聚合脂质的脂质组合物。在一些实施方案中，脂质组合物包含至少一种式(I)或(II)化合物或其盐、至少一种中性脂质、至少一种辅助脂质和至少一种PEG脂质。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC或DPME。在一些实施方案中，辅助脂质是胆固醇、5-十七烷基间苯二酚或胆固醇半琥珀酸酯。
在优选的实施方案中，可电离脂质是在优选的实施方案中，中性脂质是DSPC。在优选的实施方案中，辅助脂质是胆固醇。在优选的实施方案中，PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在尤其优选的实施方案中，可电离脂质是中性脂质是DSPC，辅助脂质是胆固醇，并且PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在一些实施方案中，脂质组合物还包含一种或多种额外脂质组分。
在一些实施方案中，脂质组合物呈脂质体形式。在优选的实施方案中，脂质组合物呈脂质纳米颗粒(LNP)形式。在某些实施方案中，脂质组合物适用于体内递送。在某些实施方案中，脂质组合物适用于递送至器官，诸如肝脏。在某些实施方案中，脂质组合物适用于离体递送至组织。在某些实施方案中，脂质组合物适用于体外递送至细胞。
包含式(I)或(II)的脂质或其药学上可接受的盐的脂质组合物可呈各种形式，包括但不限于颗粒形成递送剂，包括微粒、纳米颗粒，和适用于递送各种分子至细胞的转染剂。特定组合物在转染或递送生物活性剂方面有效。优选生物活性剂是核酸，诸如RNA。在其他实施方案中，生物活性剂选自mRNA和gRNA。gRNA可以是dgRNA或sgRNA。在某些实施方案中，载荷包括编码RNA引导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA、gRNA或编码gRNA的核酸、或mRNA和gRNA的组合。
用于上述脂质组合物中的式(I)或(II)的示例性化合物提供于WO2020/072605中，其以全文引用的方式并入本文。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物1。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物2。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物3。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物4。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物5。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物6。在某些实施方案中，式(I)化合物是化合物7。
组合物将一般但未必包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。术语“赋形剂”包括除本公开的化合物、其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予组合物功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响和剂型性质的因素。
胃肠外制剂通常是水性或油性溶液或悬浮液。当制剂是水性时，赋形剂诸如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选为3至9的pH)，但对于一些应用，其可更适当地配制为无菌非水性溶液或干燥形式以与合适的媒介物，诸如无菌、无热原水(WFI)结合使用。
LNP组合物
脂质组合物可以LNP组合物的形式提供，并且本文所述的LNP组合物可以脂质组合物的形式提供。脂质纳米颗粒可以是例如微球体(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”-在一些实施方案中基本上是球形的层状相脂质双层-并且在更特定实施方案中可包含水性核心，例如包含大部分RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
本文描述了包含至少一种式(I)或(II)化合物或其盐(例如其药学上可接受的盐)、至少一种辅助脂质、至少一种中性脂质和至少一种聚合脂质的LNP组合物。在一些实施方案中，LNP组合物包含至少一种式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐、至少一种中性脂质、至少一种辅助脂质和至少一种PEG脂质。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC或DPME。在一些实施方案中，辅助脂质是胆固醇、5-十七烷基间苯二酚或胆固醇半琥珀酸酯。
在优选的实施方案中，可电离脂质是在优选的实施方案中，中性脂质是DSPC。在优选的实施方案中，辅助脂质是胆固醇。在优选的实施方案中，PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在特别优选的实施方案中，可电离脂质是中性脂质是DSPC，辅助脂质是胆固醇，并且PEG脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
本公开的实施方案提供了根据组合物中脂质组分的相应摩尔比描述的脂质组合物。所有mol％数目均以脂质组合物或更具体地LNP组合物的脂质组分的分数形式给出。在一些实施方案中，脂质相对于脂质组分的脂质mol％将为脂质的指定、标称或实际mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，脂质相对于脂质组分的脂质mol％将为脂质组分的指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±±0.5mol％、±±0.25mol％或±±0.05mol％。在某些实施方案中，脂质mol％将相对于脂质的指定、标称或实际mol％变化小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.5％。在一些实施方案中，mol％数字基于标称浓度。如本文所用，“标称浓度”是指按组合基于形成所得组合物的物质的输入量的浓度。例如，如果添加100mg溶质至1L水中，则标称浓度为100mg/L。在一些实施方案中，mol％数字基于实际浓度，例如通过分析方法测定的浓度。在一些实施方案中，脂质组分中的脂质的实际浓度可例如由色谱(诸如液相色谱)，随后以检测方法(诸如带电气溶胶检测)测定。在一些实施方案中，脂质组分中的脂质的实际浓度可通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或冷冻电镜技术(cryo-EM)表征。所有mol％数字以脂质组分中的脂质的百分比形式给出。
本公开的实施方案提供了根据脂质组分中的脂质的相应摩尔比描述的LNP组合物。在某些实施方案中，可电离脂质的量为约25mol％至约50mol％；中性脂质的量为约7mol％至约25mol％；辅助脂质的量为约39mol％至约65mol％；并且PEG脂质的量为约0.8mol％至约1.8mol％。在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约27-40mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10-20mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约50-60mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约0.9-1.6mol％。在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约30-45mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10-15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约39-59mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1-1.5mol％。在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约30-45mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10-15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约39-59mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1-1.5mol％。在某些实施方案中，可电离脂质是脂质组分的约30mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约59mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1-1.5mol％。在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约40mol％；中性脂质的量为脂质组分的约15mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约43.5mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1.5mol％。在某些实施方案中，可电离脂质的量为脂质组分的约50mol％；中性脂质的量为脂质组分的约10mol％；辅助脂质的量为脂质组分的约39mol％；并且PEG脂质的量为脂质组分的约1mol％。
在某些实施方案中，可电离脂质的量为约20-55mol％、约20-45mol％、约20-40mol％、约27-40mol％、约27-45mol％、约30-40mol％、约30-45mol％、约30-55mol％、约30mol％、40mol％或约50mol％。在其他实施方案中，可电离脂质的量为约20-55mol％、约20-50mol％、约20-45mol％、约20-43mol％、约20-40mol％、约20-38mol％、约20-35mol％、约20-33mol％、约20-30mol％、约25-55mol％、约25-50mol％、约25-45mol％、约25-43mol％、约25-40mol％、约25-38mol％、约25-35mol％、约25-33mol％、约25-30mol％、约27-55mol％、约27-50mol％、约27-45mol％、约27-43mol％、约27-40mol％、约27-38mol％、约27-35mol％、约27-33mol％、约27-30mol％、约30-55mol％、约30-50mol％、约30-45mol％、约30-43mol％、约30-40mol％、约30-38mol％、约30-35mol％、约30-33mol％、约32-55mol％、约32-50mol％、约32-45mol％、约32-43mol％、约32-40mol％、约32-38mol％、约32-35mol％、约35-55mol％、约35-50mol％、约35-45mol％、约35-43mol％、约35-40mol％、约35-38mol％、约37-55mol％、约37-50mol％、约37-45mol％、约37-43mol％、约37-40mol％、约40-55mol％、约40-50mol％、约40-45mol％、约40-43mol％、约43-55mol％、约43-50mol％、约43-45mol％、约45-55mol％、约45-50mol％或约50-55mol％。在一些实施方案中，可电离脂质的mol％可为约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％、约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％或约45mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％、约49mol％或约50mol％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的可电离脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的可电离脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。在某些实施方案中，可电离脂质mol％的LNP批次间变异性将小于15％、小于10％或小于5％。在一些实施方案中，mol％数字基于标称浓度。在一些实施方案中，mol％数字基于实际浓度。
在某些实施方案中，中性脂质的量为约7-25mol％、约10-25mol％、约10-20mol％、约15-20mol％、约8-15mol％、约10-15mol％、约10mol％或约15mol％。在其他实施方案中，中性脂质的量可为约5-30mol％、约5-28mol％、约5-25mol％、约5-23mol％、约5-20mol％、约5-18mol％、约5-23mol％、约5-20mol％、约5-18mol％、约5-15mol％、约5-13mol％、约5-10mol％、约10-30mol％、约10-28mol％、约10-25mol％、约10-23mol％、约10-20mol％、约10-18mol％、约10-23mol％、约10-20mol％、约10-18mol％、约10-15mol％、约10-13mol％、约12-30mol％、约12-28mol％、约12-25mol％、约12-23mol％、约12-20mol％、约12-18mol％、约12-23mol％、约12-20mol％、约12-18mol％、约12-15mol％、约15-30mol％、约15-28mol％、约15-25mol％、约15-23mol％、约15-20mol％、约15-18mol％、约15-23mol％、约15-20mol％、约15-18mol％、约17-30mol％、约17-28mol％、约17-25mol％、约17-23mol％、约17-20mol％、约17-18mol％、约17-23mol％、约17-20mol％、约20-30mol％、约20-28mol％、约20-25mol％、约20-23mol％、约22-30mol％、约22-28mol％、约22-25mol％、约22-23mol％、约22-20mol％或约22-18mol％。在一些实施方案中，中性脂质的mol％可为约1mol％、约2mol％、约3mol％、约4mol％、约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％、约15mol％、约16mol％、约17mol％、约18mol％、约19mol％或约20mol％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的中性脂质mol％将为指定、标称或实际中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的中性脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。在某些实施方案中，LNP批次间变异性将小于15％、小于10％或小于5％。在一些实施方案中，mol％数字基于标称浓度。在一些实施方案中，mol％数字基于实际浓度。
在某些实施方案中，辅助脂质的量为约39-65mol％、约39-59mol％、约40-60mol％、约40-65mol％、约40-59mol％、约43-65mol％、约43-60mol％、约43-59mol％，orabout 50-65mol％、约50-59mol％、约59mol％或约43.5mol％。在其他实施方案中，辅助脂质的量可为约30-70mol％、约32-70mol％、约35-70mol％、约38-70mol％、约40-70mol％、约42-70mol％、约45-70mol％、约48-70mol％、约50-70mol％、约52-70mol％、约55-70mol％、约58-70mol％、约60-70mol％、约30-65mol％、约32-65mol％、约35-65mol％、约38-65mol％、约40-65mol％、约42-65mol％、约45-65mol％、约48-65mol％、约50-65mol％、约52-65mol％、约55-65mol％、约58-65mol％、约60-65mol％、约30-60mol％、约32-60mol％、约35-60mol％、约38-60mol％、约40-60mol％、约42-60mol％、约45-60mol％、约48-60mol％、约50-60mol％、约52-60mol％、约55-60mol％、约58-60mol％、约30-58mol％、约32-58mol％、约35-58mol％、约38-58mol％、约40-58mol％、约42-58mol％、约45-58mol％、约48-58mol％、约50-58mol％、约52-58mol％、约55-58mol％、约30-55mol％、约32-55mol％、约35-55mol％、约38-55mol％、约40-55mol％、约42-55mol％、约45-55mol％、约48-55mol％、约50-55mol％、约52-55mol％、约30-53mol％、约32-53mol％、约35-53mol％、约38-53mol％、约40-53mol％、约42-53mol％、约45-53mol％、约48-53mol％、约50-53mol％、约30-50mol％、约32-50mol％、约35-50mol％、约38-50mol％、约40-50mol％、约42-50mol％、约45-50mol％、约48-50mol％、约30-48mol％、约32-48mol％、约35-48mol％、约38-48mol％、约40-48mol％、约42-48mol％、约45-48mol％、约30-45mol％、约32-45mol％、约35-45mol％、约38-45mol％、约40-45mol％、约42-45mol％、约30-43mol％、约32-43mol％、约35-43mol％、约38-43mol％、约40-43mol％、约30-40mol％、约32-40mol％、约35-40mol％、约38-40mol％、约30-38mol％、约32-38mol％、约35-38mol％或约30-35mol％。应当理解，约39mol％的辅助脂质不包括38.5％的辅助脂质。在某些实施方案中，基于可电离脂质、中性脂质和/或PEG脂质的量调节辅助脂质的量以使LNP组合物达到约100mol％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的辅助脂质mol％将为指定、标称或实际辅助脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的辅助脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。在某些实施方案中，LNP批次间变异性将小于15％、小于10％或小于5％。在一些实施方案中，mol％数字基于标称浓度。在一些实施方案中，mol％数字基于实际浓度。
在某些实施方案中，PEG脂质的量为约0.8-1.8mol％、约0.8-1.6mol％、约0.8-1.5mol％，0.9-1.8mol％、约0.9-1.6mol％、约0.9-1.5mol％，1-1.8mol％、约1-1.6mol％、约1-1.5mol％、约1mol％或约1.5mol％。在其他实施方案中，PEG脂质的量可为约0.5-2.5mol％、约0.7-2.5mol％、约0.8-2.5mol％、约0.9-2.5mol％、约1-2.5mol％、约1.1-2.5mol％、约1.2-2.5mol％、约1.3-2.5mol％、约1.4-2.5mol％、约1.5-2.5mol％、约1.6-2.5mol％、约1.7-2.5mol％、约1.8-2.5mol％、约1.9-2.5mol％、约2-2.5mol％、约2.2-2.5mol％、约0.5-2.2mol％、约0.7-2.2mol％、约0.8-2.2mol％、约0.9-2.2mol％、约1-2.2mol％、约1.1-2.2mol％、约1.2-2.2mol％、约1.3-2.2mol％、约1.4-2.2mol％、约1.5-2.2mol％、约1.6-2.2mol％、约1.7-2.2mol％、约1.8-2.2mol％、约1.9-2.2mol％、约2-2.2mol％、约0.5-2mol％、约0.7-2mol％、约0.8-2mol％、约0.9-2mol％、约1-2mol％、约1.1-2mol％、约1.2-2mol％、约1.3-2mol％、约1.4-2mol％、约1.5-2mol％、约1.6-2mol％、约1.7-2mol％、约1.8-2mol％、约1.9-2mol％、约0.5-1.9mol％、约0.7-1.9mol％、约0.8-1.9mol％、约0.9-1.9mol％、约1-1.9mol％、约1.1-1.9mol％、约1.2-1.9mol％、约1.3-1.9mol％、约1.4-1.9mol％、约1.5-1.9mol％、约1.6-1.9mol％、约1.7-1.9mol％、约1.8-1.9mol％、约0.5-1.8mol％、约0.7-1.8mol％、约0.8-1.8mol％、约0.9-1.8mol％、约1-1.8mol％、约1.1-1.8mol％、约1.2-1.8mol％、约1.3-1.8mol％、约1.4-1.8mol％、约1.5-1.8mol％、约1.6-1.8mol％、约1.7-1.8mol％、约0.5-1.7mol％、约0.7-1.7mol％、约0.8-1.7mol％、约0.9-1.7mol％、约1-1.7mol％、约1.1-1.7mol％、约1.2-1.7mol％、约1.3-1.7mol％、约1.4-1.7mol％、约1.5-1.7mol％、约1.6-1.7mol％、约0.5-1.6mol％、约0.7-1.6mol％、约0.8-1.6mol％、约0.9-1.6mol％、约1-1.6mol％、约1.1-1.6mol％、约1.2-1.6mol％、约1.3-1.6mol％、约1.4-1.6mol％、约1.5-1.6mol％、约0.5-1.5mol％、约0.7-1.5mol％、约0.8-1.5mol％、约0.9-1.5mol％、约1-1.5mol％、约1.1-1.5mol％、约1.2-1.5mol％、约1.3-1.5mol％、约1.4-1.5mol％、约0.5-1.4mol％、约0.7-1.4mol％、约0.8-1.4mol％、约0.9-1.4mol％、约1-1.4mol％、约1.1-1.4mol％、约1.2-1.4mol％、约1.3-1.4mol％、约0.5-1.3mol％、约0.7-1.3mol％、约0.8-1.3mol％、约0.9-1.3mol％、约1-1.3mol％、约1.1-1.3mol％、约1.2-1.3mol％、约0.5-1.2mol％、约0.7-1.2mol％、约0.8-1.2mol％、约0.9-1.2mol％、约1-1.2mol％、约1.1-1.2mol％、约0.5-1.1mol％、约0.7-1.1mol％、约0.8-1.1mol％、约0.9-1.1mol％、约1-1.1mol％、约0.5-1mol％、约0.7-1mol％、约0.8-1mol％、约0.9-1mol％、约0.5-0.9mol％、约0.7-0.9mol％、约0.8-0.9mol％、约0.5-0.8mol％、约0.7-0.8mol％或约0.5-0.7mol％.在一些实施方案中，PEG脂质的量可为约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％、约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％或约2.5mol％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的PEG脂质mol％将为指定、标称或实际辅助脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，相对于脂质组分的PEG脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。在某些实施方案中，LNP批次间变异性将小于15％、小于10％或小于5％。在一些实施方案中，mol％数字基于标称浓度。在一些实施方案中，mol％数字基于实际浓度。
在某些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物，包含脂质组分和核酸组分(也称为水性组分)，例如RNA组分，并且可测量式(I)或(II)化合物与核酸的摩尔比。本公开的实施方案还提供了待囊封的在式(I)或(II)化合物的药学上可接受的盐的带正电胺基团(N)与核酸的带负电磷酸酯基团(P)之间具有限定摩尔比的脂质组合物。这可在数学上由方程N/P表示。在一些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物可包含脂质组分，其包含式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐；和核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，其包含式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐；和RNA组分，其中N/P比为约3至10。例如，N/P比可为约4-7、约5-7或约6至7。在一些实施方案中，N/P比可为约6，例如6±1或6±0.5。在一些实施方案中，N/P比可为约7，例如7±1或7±0.5。
在一些实施方案中，水性组分包含生物活性剂。在一些实施方案中，水性组分包含任选地与核酸组合的多肽。在一些实施方案中，水性组分包含核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，水性组分是核酸组分。在一些实施方案中，核酸组分包含DNA并且其可称为DNA组分。在一些实施方案中，核酸组分包含RNA。在一些实施方案中，诸如RNA组分的水性组分可包含mRNA，诸如编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂是Cas核酸酶。在某些实施方案中，水性组分可包含编码Cas核酸酶，诸如Cas9的mRNA。在某些实施方案中，生物活性剂是Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，生物活性剂是2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，生物活性剂是Cas9核酸酶mRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含修饰的RNA。在一些实施方案中，水性组分可包含引导RNA核酸。在某些实施方案中，水性组分可包含gRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含dgRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含修饰的gRNA。在包含编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA的一些组合物中，所述组合物还包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含RNA引导的DNA结合剂和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质、任选的中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的其他组合物中，中性脂质是DSPC。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶，例如Cas9)的mRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在特定组合物中，其包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA，和式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐。在某些组合物中，组合物还包含gRNA，诸如dgRNA或sgRNA。
在一些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物可包含gRNA。在某些实施方案中，组合物可包含式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐、gRNA、辅助脂质、任选的中性脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质是胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在包含gRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。在某些组合物中，gRNA选自dgRNA和sgRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物，包含呈水性组分形式的编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA和可以是sgRNA的gRNA，以及呈脂质组分形式的式(I)或(II)化合物。例如，LNP组合物可包含式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的额外实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物包括RNA引导的DNA结合剂，诸如2类Cas mRNA和至少一种gRNA。在一些实施方案中，gRNA是sgRNA。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂是Cas9 mRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包括约1：1或约1∶2比率的gRNA与RNA引导的DNA结合剂mRNA(诸如2类Cas核酸酶mRNA)。在一些实施方案中，重量比为约25∶1至约1∶25、约10∶1至约1∶10、约8：1至约1∶8、约4∶1至约1∶4、约2∶1至约1∶2、约2∶1至1∶4(按重量计)或约1∶1至约1∶2。
本文所公开的脂质组合物，诸如LNP组合物可用于本文所公开的方法中来递送CRISPR/Cas9组分，以插入模板核酸，例如DNA模板。模板核酸可与包含式(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐的脂质组合物分开递送。在一些实施方案中，模板核酸可以是单链或双链的，其取决于所需修复机制。模板可具有与靶DNA(例如在靶DNA序列内)和/或与靶DNA相邻的序列同源的区域。
在一些实施方案中，LNP组合物通过混合RNA水溶液与有机溶剂基脂质溶液而形成。合适溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。例如，有机溶剂可以是100％乙醇。可将药学上可接受的缓冲液用于例如LNP组合物的体内施用。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，组合物的pH在约7.2至约7.7范围内。在额外实施方案中，组合物的pH在约7.3至约7.7范围内或约7.4至约7.6范围内。在其他实施方案中，组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。组合物的pH可用微型pH探针进行测量。在某些实施方案中，组合物中包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包括至多10％低温保护剂，诸如例如蔗糖。在某些实施方案中，组合物可包含tris盐水蔗糖(TSS)。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％低温保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可包括缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸酯缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，缓冲液缺乏NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液是Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案含有5％蔗糖和含45mMNaCl的Tris缓冲液。在其他示例性实施方案中，组合物含有呈约5％w/v的量的蔗糖、约45mMNaCl和pH 7.5下的约50mM Tris。盐、缓冲液和低温保护剂量可有所变化以使总组合物的容量渗透压摩尔浓度得以维持。例如，最终容量渗透压摩尔浓度可维持低于450mOsm/L。在其他实施方案中，容量渗透压摩尔浓度在350与250mOsm/L之间。某些实施方案具有300+/-20mOsm/L或310+/-40mOsm/L的最终容量渗透压摩尔浓度。
在一些实施方案中，使用微流体混合、T混合或交叉混合RNA水溶液和脂质水溶液于有机溶剂中。在某些方面，流动速率、接合部大小、接合部几何结构、接合部形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可有所变化。LNP或LNP组合物可例如经由渗析、离心过滤器、切向流过滤或色谱得到浓缩或纯化。LNP组合物可以例如悬浮液、乳液或冻干粉形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物储存于2-8℃下，在某些方面，LNP组合物储存于室温下。在其他实施方案中，将LNP组合物冷冻储存，例如在-20℃或-80℃下储存。在其他实施方案中，将LNP组合物储存于约0℃至约-80℃范围内的温度下。冷冻LNP组合物可在使用之前，例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
优选脂质组合物，诸如LNP组合物，例如是可生物降解，因为其不在治疗有效剂量下体内累及至细胞毒性水平。在一些实施方案中，组合物不在治疗剂量水平下引起导致重大不良作用的先天性免疫反应。在一些实施方案中，本文所提供的组合物不在治疗剂量水平下引起毒性。
在一些实施方案中，LNP组合物中LNP的浓度为约1-10μg/mL、约2-10μg/mL、约2.5-10μg/mL、约1-5μg/mL、约2-5μg/mL、约2.5-5μg/mL、约0.04μg/mL、约0.08μg/mL、约0.16μg/mL、约0.25μg/mL、约0.63μg/mL、约1.25μg/mL、约2.5μg/mL或约5μg/mL。
在一些实施方案中，可使用动态光散射(“DLS”)来表征本公开的LNP的多分散性指数(PDI)和大小。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光的散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度(大约平均粒度)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。
在一些实施方案中，本文所公开的LNP的PDI为约0.005至约0.75。在一些实施方案中，本文所公开的LNP的PDI为约0.005至约0.1。在一些实施方案中，本文所公开的LNP的PDI为约0.005至约0.09、约0.005至约0.08、约0.005至约0.07或约0.006至约0.05。在一些实施方案中，LNP的PDI为约0.01至约0.5。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.4。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.35。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.3范围内。在一些实施方案中，LNP的PDI可在约零至约0.25范围内。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.2范围内。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.05。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.01。在一些实施方案中，LNP的PDI小于约0.01、约0.02、约0.05、约0.08、约0.1、约0.15、约0.2或约0.4。
LNP大小可通过本领域已知的各种分析方法测量。在一些实施方案中，LNP大小可使用不对称流场流分级分离-多角度光散射(AF4-MALS)测量。在某些实施方案中，LNP大小可通过以下方式测量：通过流体动力学半径分离组合物中的颗粒，随后测量分级分离的颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。在一些实施方案中，LNP大小和颗粒浓度可通过纳米颗粒追踪分析(NTA，Malvern Nanosight)测量。在某些实施方案中，LNP样品被适当稀释并注射至显微镜载玻片上。相机在颗粒缓慢输注通过视场时记录散射光。在捕获影片之后，纳米颗粒追踪分析通过追踪像素和计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可转化成颗粒的流体动力学半径。此类方法还可对个别颗粒的数量进行计数以得到颗粒浓度。在一些实施方案中，LNP大小、形态和结构特征可通过冷冻-电子显微术(“cryo-EM”)测定。
本文所公开的LNP组合物的LNP的大小(例如Z平均直径或数量平均直径)为约1至约250nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约10至约200nm。在其他实施方案中，LNP的大小为约20至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约150nm或约70至130nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约60至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约40至约125nm、约40至约110nm、约40至约100nm、约40至约90nm、约40至约85nm、约40至约80nm、约40至约75nm、约40至约70nm、约40至约65nm、约50至约125nm、约50至约110nm、约50至约100nm、约50至约90nm、约50至约85nm、约50至约80nm、约50至约75nm、约50至约70nm、约50至约65nm、约55至约125nm、约55至约110nm、约55至约100nm、约55至约90nm、约55至约85nm、约55至约80nm、约55至约75nm、约55至约70nm、约55至约65nm、约60至约125nm、约60至约110nm、约60至约100nm、约60至约90nm、约60至约85nm、约60至约80nm、约60至约75nm、约60至约70nm、约60至约65nm、约65至约125nm、约65至约110nm、约65至约100nm、约65至约90nm、约65至约85nm、约65至约80nm、约65至约75nm、约65至约70nm、约70至约125nm、约70至约110nm、约70至约100nm、约70至约90nm、约70至约85nm、约70至约80nm或约70至约75nm。在一些实施方案中，LNP的大小小于约95nm或大于约90nm。在一些实施方案中，LNP的大小大于约45nm或大于约50nm。在一些实施方案中，粒度是Z平均粒度。在一些实施方案中，粒度是数量平均粒度。在一些实施方案中，粒度是个别LNP的大小。除非另外指示，否则本文所提及的所有大小是完全成形纳米颗粒的平均大小(直径)，如通过Malvem Zetasizer或Wyatt NanoStar上的动态光散射所测量。纳米颗粒样品稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以使得计数率为大约200-400kcps。
在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约50％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约50％至约95％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约70％至约90％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约90％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约75％至约95％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约90％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约92％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约95％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约98％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，形成的LNP组合物具有介于约99％至约100％范围内的平均囊封效率。
载荷
经由本文所述的LNP组合物递送的载荷包括生物活性剂。生物活性剂可以是核酸，诸如mRNA或gRNA。在某些实施方案中，载荷是或包含一种或多种生物活性剂，诸如mRNA、gRNA、表达载体、RNA引导的DNA结合剂、抗体(例如单克隆、嵌合、人源化、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化学治疗剂和其他类型的抗肿瘤剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反义核酸、三螺旋体成形寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA：RNA组合物、等位酶、适体、核糖核酸酶、诱骗物(decoy)及其类似物，质粒和其他类型的载体，和小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和“自复制RNA”(编码复制酶活性和能够指导其体内自身复制或扩增)分子、肽核酸(PNA)、锁核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(内部分段干扰RNA)和iRNA(不对称干扰RNA)。以上生物活性剂清单仅是示例性的，并且并不意图是限制性的。此类化合物可被纯化或部分纯化，并且可以是天然存在或合成的，并且可被化学修饰。
经由LNP组合物递送的载荷可以是RNA，诸如编码所关注的蛋白质的mRNA分子。例如，包括用于表达诸如绿色荧光蛋白(GFP)、RNA引导的DNA结合剂或Cas核酸酶的蛋白质的mRNA。提供了LNP组合物，其包括Cas核酸酶mRNA，例如允许在2类Cas核酸酶(诸如Cas9或Cpf1(也称为Cas12a)蛋白质)的细胞中表达的2类Cas核酸酶mRNA。此外，载荷可含有一种或多种gRNA或编码gRNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸还可与组合物一起包括在内或模板核酸可用于本文所述的方法中。在子实施方案中，载荷包含编码任选的化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9的mRNA和化脓链球菌gRNA。在另一子实施方案中，载荷包含编码任选的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)Cas9的mRNA和Nme(脑膜炎奈瑟菌)gRNA。
“mRNA”是指多核苷酸并且包含可翻译成多肽(即可充当通过核糖体和氨基酰化tRNA进行翻译的基质)的开放阅读框。mRNA可包含磷酸酯-糖主链，其包括核糖残基或其类似物，例如2′-甲氧基核糖残基。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2′-甲氧基核糖残基或其组合组成。一般而言，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或小于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有修饰的尿苷。
基因组编辑工具
在一些实施方案中，LNP组合物是脂质核酸组装体，也称为脂质核酸组合物。在一些实施方案中，脂质核酸组合物或LNP组合物包含基因组编辑工具或编码所述基因组编辑工具的核酸。如本文所用，术语“基因组编辑工具”(或“基因编辑工具”)是在细胞的基因组中产生编辑所需或对其有帮助的“基因组编辑系统”(或“基因编辑系统”)的任何组分。在一些实施方案中，本公开提供了用于将基因组编辑系统(例如锌指核酸酶系统、TALEN系统、大范围核酸酶系统或CRISPR/Cas系统)的基因组编辑工具递送至细胞(或细胞群体)的方法。基因组编辑工具包括例如能够在细胞的DNA或RNA中，例如在细胞的基因组中产生单链或双链断裂的核酸酶。基因组编辑工具，例如核酸酶可任选地在不裂解核酸的情况下或在切口酶的情况下修饰细胞的基因组。基因组编辑核酸酶或切口酶可由mRNA编码。此类核酸酶包括例如RNA引导的DNA结合剂和CRISPR/Cas组分。基因组编辑工具包括融合蛋白，包括例如融合至效应结构域，诸如编辑结构域的切口酶。基因组编辑工具包括实现基因组编辑目标所需或对其有帮助的任何项目，诸如例如引导RNA、sgRNA、dgRNA、供体核酸等。
本文描述了包含用脂质核酸组装组合物递送的基因组编辑工具的各种合适的基因编辑系统，包括但不限于CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；和转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。一般而言，基因编辑系统涉及使用工程化的裂解系统以诱导靶DNA序列中的双链断裂(DSB)或切口(例如单链断裂或SSB)。裂解或切口可通过使用诸如工程化的ZFN、TALEN的特异性核酸酶，或使用具有工程化的引导RNA的CRISPR/Cas系统以引导靶DNA序列的特异性裂解或切口而发生。此外，基于Argonaute系统(例如来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为‘TtAgo’，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491)：258-261)研发靶向的核酸酶，所述Argonaute系统还可具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。
在某些实施方案中，所公开的组合物包含一种或多种DNA修饰剂，诸如DNA切割剂。多种DNA修饰剂可包括于本文所述的LNP组合物中。例如，DNA修饰剂包括核酸酶(序列特异性和非特异性两者)、拓扑异构酶、甲基化酶、乙酰基酶、化学物质、药物和其他剂。在一些实施方案中，与给定DNA序列或序列组结合的蛋白质可用于诱导DNA修饰，诸如链断裂。蛋白质可通过许多方式修饰，诸如掺入125I，其放射性衰变将引起链断裂；或修饰交联试剂，诸如4-叠氮苯甲酰甲基溴，其在暴露于紫外光时与DNA形成交联。此类蛋白质DNA交联可随后通过用哌啶处理转化为双链DNA断裂。DNA修饰的又另一方法涉及针对在一个或多个DNA位点处结合的特异性蛋白(诸如转录因子或结构染色质蛋白)产生，并用于从核蛋白复合物中分离DNA的抗体。
在某些实施方案中，所公开的组合物包含一种或多种DNA切割剂。DNA切割剂包括以下技术，诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、mito-TALEN和大范围核酸酶系统。TALEN和ZFN技术使用将核酸内切酶催化结构域拴系至模块化DNA结合蛋白以在特异性基因组基因座处诱导靶向DNA双链断裂(DSB)的策略。额外DNA切割剂包括小干扰RNA、微小RNA、抗微小RNA、拮抗剂、小发夹RNA和适体(RNA、DNA或肽类(包括粘合素(affimer)))。
在一些实施方案中，基因编辑系统是TALEN系统。转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)为可被工程化以切割DNA的特定序列的限制酶。其通过使TAL效应子DNA结合结构域与DNA裂解结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而制得。转录活化因子样效应子(TALE)可被工程化以结合至所需DNA序列，从而促进特定位置处的DNA裂解(参见例如Boch，2011，NatureBiotech)。限制酶可引入到细胞中，用于基因编辑或用于原位基因组编辑，一种称为用工程化的核酸酶进行基因组编辑的技术。其中使用的此类方法和组合物是本领域已知的。参见例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，其内容特此全文并入。
在一些实施方案中，基因编辑系统是锌指系统。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域融合至DNA裂解结构域产生的人工限制酶。锌指结构域可被工程化以靶向特定的所需DNA序列，从而使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。来自II型限制性核酸内切酶FokI的非特异性裂解结构域通常用作ZFN中的裂解结构域。裂解通过内源DNA修复机制修复，允许ZFN精确改变高等生物的基因组。其中使用的此类方法和组合物是本领域已知的。参见例如WO2011091324，其内容特此全文并入。
在优选的实施方案中，所公开的组合物包含编码RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶的mRNA。在特定实施方案中，所公开的组合物包含编码2类Cas核酸酶，诸如化脓链球菌Cas9的mRNA。
如本文所用，“RNA引导的DNA结合剂”表示具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚单元，其中DNA结合活性是序列特异性的并且取决于RNA序列。示例性RNA引导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶及其失活形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚单元、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚单元和2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”是具有RNA引导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，其进一步具有RNA引导的DNA裂解酶或切口酶活性，和第2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性失活。可用于本文所述的LNP组合物的2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白及其修饰。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell，163：1-13(2015))与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以全文引用的方式并入。参见例如Zetsche，表2和4。参见例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol，13(11)：722-36(2015)；Shmakov等人，MolecularCell，60：385-397(2015)。
可衍生Cas核酸酶的非限制性示例性物种包括化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcussp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ变形菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸纤维杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德根氏产氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸消化肠状菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(NitroSococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、伊夫氏甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、变异念珠藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、螺旋藻属物种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoriasp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲高热杆菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、海鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和深海单细胞蓝藻(Acaryochlorismarina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自化脓链球菌的Cas9核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在再其他实施方案中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西斯菌的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属物种的Cpf1核酸酶。在再其他实施方案中，Cas核酸酶是来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶是来自以下的Cpf1核酸酶：土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteriabacterium)、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解靶DNA链。在一些实施方案中，Cas9核酸酶包含多于一个RuvC结构域和/或多于一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9核酸酶是野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9能够诱导靶DNA中的双链断裂。在其他实施方案中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，其可裂解dsDNA的一条链，或其可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中所述蛋白质的一个结构域或区域被不同蛋白质的一部分替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可被来自不同核酸酶(诸如Fok1)的结构域替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶或Cas切口酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即，可切割一条DNA链以产生单链断裂，也称为“切口(nick)”。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶是在dsDNA中产生切口，即切割DNA双螺旋体的一条链但不切割另一条链的酶。在一些实施方案中，Cas切口酶是其中例如通过催化结构域中的一种或多种变化(例如点突变)使核酸内切酶活性位点失活的Cas核酸酶(例如上文所论述的Cas核酸酶)的型式。关于Cas切口酶和示例性催化结构域改变的论述，参见例如美国专利号8,889,356。在一些实施方案中，Cas切口酶，诸如Cas9切口酶具有失活的RuvC或HNH结构域。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂被修饰而仅含有一个功能核酸酶结构域。例如，所述剂蛋白质可被修饰以使得核酸酶结构域中的一个突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于化脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人(2015)Cell 10月22日：163(3)：759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(，基于化脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西斯菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，编码切口酶的mRNA以与一对分别与靶序列的有义链和反义链互补的引导RNA组合形式提供。在此实施方案中，引导RNA将切口酶指导至靶序列并通过在靶序列的相对链上产生切口而引入DSB(即双重切口)。在一些实施方案中，使用双重切口可改善特异性并减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个单独引导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双切口。在一些实施方案中，连同选择以非常接近的两个单独引导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂缺乏裂解酶和切口酶活性。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶切口酶)活性。在一些实施方案中，dCas多肽是dCas9多肽。在一些实施方案中，缺乏裂解酶和切口酶活性的RNA引导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽是其中例如通过催化结构域的一种或多种变化(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点失活的Cas核酸酶的型式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包含APOBEC3脱氨酶。在一些实施方案中，APOBEC3脱氨酶是APOBEC3A(A3A)。在一些实施方案中，A3A是人A3A。在一些实施方案中，A3A是野生型A3A。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包含编辑器。示例性编辑器是BC22n，其包含通过XTEN接头与化脓链球菌-D10A Cas9切口酶融合的智人APOBEC3A。在一些实施方案中，编辑器与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(“UGI”)一起提供。在一些实施方案中，编辑器融合至UGI。在一些实施方案中，编码编辑器的mRNA和编码UGI的mRNA一起配制于LNP中。在其他实施方案中，编辑器和UGI提供于单独LNP中。
在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如是或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可促进将RNA引导的DNA结合剂输送至细胞核中。例如，异源功能结构域可以是核定位信号(NLS)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可能能够修改RNA引导的ΩNA结合剂的胞内半衰期。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂的半衰期可增加。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂的半衰期可减少。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够增加RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够降低RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施方案中，蛋白质降解可由蛋白水解酶介导，诸如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶(calpain proteases)。在一些实施方案中，异源功能结构域可包含PEST序列。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施方案中，泛素可以是泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白质的非限制性实例包括小泛素样修饰因子(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，也被称作干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰因子-1(URM1)、神经元-前体-细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中也被称作Rub1)、人白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和自噬-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰因子-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可以是标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施方案中，标志物结构域可以是荧光蛋白。适合的荧光蛋白的非限制实例包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)，和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato、)或任何其他合适的荧光蛋白。在其他实施方案中，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His、8×His、生物素羧基载体蛋白质(BCCP)、聚His和调钙蛋白。非限制性示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在其他实施方案中，异源功能结构域可将RNA引导的DNA结合剂靶向至特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施方案中，异源功能结构域可将RNA引导的DNA结合剂靶向至线粒体。
在其他实施方案中，异源功能结构域可以是效应结构域，诸如编辑结构域。当RNA引导的DNA结合剂指导至其靶序列时，例如当Cas核酸酶通过gRNA指导至靶序列时，效应结构域(诸如编辑结构域)可修饰或影响靶序列。在一些实施方案中，效应结构域(诸如编辑结构域)可选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如非Cas核酸酶结构域)、表观遗传学修饰结构域、转录活化结构域或转录阻遏结构域。在一些实施方案中，异源功能结构域是核酸酶，诸如FokI核酸酶。参见例如美国专利号9,023,649。在一些实施方案中，异源功能结构域是转录活化因子或阻遏子。参见例如Qi等人，“Repurposing CRISPR as an RNA-guidedplatform for sequence-specific control of gene expression”，Cell 152：1173-83(2013)；Perez-Pinera等人，“RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-basedtranscription factors”，Nat.Methods 10：973-6(2013)；Mali等人，“CAS9transcriptional activators for target specificity screening and pairednickases for cooperative genome engineering”，Nat.Biotechnol.31：833-8(2013)；Gilbert等人，“CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcriptionin eukaryotes”，Cell 154：442-51(2013)。因此，RNA引导的DNA结合剂基本上变成可使用引导RNA指导以结合所需靶序列的转录因子。在一些实施方案中，DNA修饰结构域是甲基化结构域，诸如去甲基化或甲基转移酶结构域。在一些实施方案中，效应结构域是DNA修饰结构域，诸如碱基编辑结构域。在特定实施方案中，DNA修饰结构域是将特异性修饰引入DNA中的核酸编辑结构域，诸如脱氨酶结构域。参见例如WO 2015/089406；US 2016/0304846。核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体描述于WO 2015/089406和U.S.2016/0304846中，所述文献中的每一个特此以全文引用的方式并入。
核酸酶可包含至少一个与引导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。另外，核酸酶可通过gRNA指导至靶序列。在2类Cas核酸酶系统中，gRNA与核酸酶以及靶序列相互作用，使其指导与靶序列的结合。在一些实施方案中，gRNA是靶向裂解提供特异性，并且核酸酶可通用并且与不同gRNA配对以裂解不同靶序列。2类Cas核酸酶可与以上列出的类型、直系同源物和示例性物种的gRNA支架结构配对。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指gRNA连同RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如Cas9)。在一些实施方案中，gRNA将RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas9引导至靶序列，并且gRNA与靶序列杂合并且所述剂结合于靶序列；在结合剂是裂解酶或切口酶的情况下，结合之后可进行裂解或切口。
在本公开的一些实施方案中，LNP组合物的载荷包括至少一种gRNA，其包含引导序列，所述引导序列将可以是核酸酶(例如Cas核酸酶，诸如Cas9)的RNA引导的DNA结合剂指导至靶DNA。gRNA可将Cas核酸酶或2类Cas核酸酶引导至靶核酸分子上的靶序列。在一些实施方案中，gRNA与2类Cas核酸酶结合并通过其提供裂解特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，诸如CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/gRNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可配对。与每种2类Cas核酸酶配对的gRNA支架结构因特定CRISPR/Cas系统而异。
“引导RNA”、“gRNA”和仅“引导”在本文中可互换使用，是指用于RNA引导的DNA结合剂的同源引导核酸。引导RNA可包括如本文所述的修饰的RNA。gRNA可以是例如单引导RNA，或crRNA与trRNA的组合(也称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可作为单一RNA分子(作为单引导RNA，sgRNA)或例如呈两个单独RNA链(双引导RNA，dgRNA)形式缔合。在一些系统中，gRNA可以是crRNA(也称为CRISPR RNA)。“引导RNA”或”gRNA”是指每种类型。trRNA可以是天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。
在一些实施方案中，编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA配制于第一LNP组合物中并且gRNA核酸配制于第二LNP组合物中。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物同时施用。在其他实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物依序施用。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物在预孵育步骤之前合并。在其他实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物分开预孵育。
在一些实施方案中，载荷可包含DNA分子。在一些实施方案中，核酸可包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含由来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的靶向序列。在一些实施方案中，核酸可包含编码tracr RNA的核苷酸序列。在某些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由两个单独的核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相同链编码。在一些实施方案中，gRNA核酸编码sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cas9核酸酶sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cpf1核酸酶sgRNA。
编码引导RNA的核苷酸序列能够可操作地连接于至少一个转录或调控控制序列，诸如启动子、3′UTR或5′UTR。在一个实例中，启动子可以是tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人，RNA.2015 21：1683-9；Scherer等人，Nucleic AcidsRes.2007 35：2620-2628。在一些实施方案中，启动子可由RNA聚合酶III(Pol III)识别。Poi III启动子的非限制性实例还包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码引导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人U6启动子可操作地连接。在一些实施方案中，gRNA核酸是修饰的核酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括修饰的核苷或核苷酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括5′端修饰，例如修饰的核苷或核苷酸以稳定和阻止核酸整合。在其他实施方案中，gRNA核酸包含双链DNA，其在每条链上具有5′端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括反向双脱氧-T或反向无碱基核苷或核苷酸作为5′端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括标记，诸如生物素、脱硫生物素-TEG、地高辛和荧光标志物，包括例如FAM、ROX、TAMRA和AlexaFluor。
如本文所用的“引导序列”是指与靶序列互补并起到通过RNA引导的DNA结合剂将gRNA指导至靶序列以用于结合和/或修饰(例如裂解)的作用的gRNA内的序列。“引导序列”还可称为“靶向序列”或“间隔序列”。引导序列的长度例如在化脓链球菌(即Spy Cas9)和相关Cas9同源物/直系同源物的情况下可以是20个碱基对。较短或较长序列还可用作例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸的引导序列。在一些实施方案中，靶序列处于例如基因中或染色体上，并且与引导序列互补。在一些实施方案中，引导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性的程度可为约或至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，引导序列和靶区域可相对于至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域100％互补或同一。在其他实施方案中，引导序列和靶区域可含有至少一个错配。例如，引导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20个或更多个碱基对。在一些实施方案中，引导序列和靶区域可含有1至4个错配，其中引导序列包含至少17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列和靶区域可含有1、2、3或4个错配，其中引导序列包含20个核苷酸。
在某些实施方案中，可协同地和/或出于单独的目的使用多种LNP组合物。在一些实施方案中，细胞可与本文所述的第一LNP组合物和第二LNP组合物接触。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物各自独立地包含mRNA、gRNA和gRNA核酸中的一种或多种。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物同时施用。在一些实施方案中，第一LNP组合物和第二LNP组合物依序施用。
在一些实施方案中，提供了一种在细胞中产生多个基因组编辑的方法(有时在本文中和其他各处称为“多重”或“多重基因编辑”或“多重基因组编辑”)。将多个属性工程化到单个细胞中的能力取决于在多个靶向基因中有效进行编辑，包括基因敲除和基因座插入，同时保持活力和所需细胞表型的能力。在一些实施方案中，所述方法包括体外培养细胞，使细胞与两种或更多种脂质核酸组装组合物接触，以及体外扩增细胞，其中每种脂质核酸组装组合物包含能够编辑靶位点的核酸基因组编辑工具。所述方法产生具有多于一个基因组编辑的细胞，其中基因组编辑不同。在某些实施方案中，第一LNP组合物包含第一gRNA并且第二LNP组合物包含第二gRNA，其中第一和第二gRNA包含与不同靶标互补的不同引导序列。在此类实施方案中，LNP组合物可允许多重基因编辑。在一些实施方案中，使细胞与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种脂质核酸组装组合物接触。在一些实施方案中，使细胞与至少6种脂质核酸组装组合物接触。
针对RNA引导的DNA结合蛋白质(诸如Cas蛋白质)的靶序列包括基因组DNA的正链和负链两者(即给定序列和所述序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物是双链核酸。因此，在称引导序列“与靶序列互补”的情况下，应了解，引导序列可引导gRNA结合至靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在引导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，引导序列与靶序列(例如不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸具有同一性，不同之处在于在引导序列中U取代T。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA靶向降低或消除T细胞受体、MHC I类或MHCII类的表面表达的基因。在某些实施方案中，本文所述的gRNA靶向TRAC。在一些实施方案中，本文所述的gRNA靶向TRBC。在其他实施方案中，本文所述的gRNA靶向CIITA。在其他实施方案中，本文所述的gRNA靶向HLA-A。在一些实施方案中，本文所述的gRNA靶向HLA-B。在其他实施方案中，本文所述的gRNA靶向HLA-C。在其他实施方案中，本文所述的gRNA靶向B2M。在一些实施方案中，提供了在体外培养细胞中产生多个基因组编辑的方法，其包括以下步骤：a)使细胞与包含第一核酸的至少第一脂质组合物体外接触，从而产生接触的细胞；b)使细胞与包含第二核酸的至少第二脂质组合物体外接触，其中第二核酸不同于第一核酸；以及c)体外扩增细胞。在某些实施方案中，提供了在体外培养细胞中产生多个基因组编辑的方法，其包括以下步骤：a)使细胞与包含第一核酸的至少第一脂质组合物体外接触，从而产生接触的细胞；b)体外培养接触的细胞，从而产生所培养的接触细胞；c)使所培养的接触细胞与包含第二核酸的至少第二脂质组合物体外接触，其中第二核酸不同于第一核酸；以及d)体外扩增细胞。在其他实施方案中，所述方法还包括使细胞与包含第三核酸的至少第三脂质组合物体外接触，其中第三核酸不同于第一核酸和第二核酸。在另外其他实施方案中，所述方法还包括使细胞与包含第四核酸的至少第四脂质组合物体外接触，其中第四核酸不同于第一核酸、第二核酸和第三核酸。在又另外其他实施方案中，所述方法还包括使细胞与包含第五核酸的至少第五脂质组合物体外接触，其中第五核酸不同于第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸。在额外实施方案中，所述方法还包括使细胞与包含第六核酸的至少第六脂质组合物体外接触，其中第六核酸不同于第一核酸、第二核酸、第三核酸、第四核酸和第五核酸。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少两种依序施用。在一些实施方案中，脂质组合物中的至少两种同时施用。在一些实施方案中，扩增的细胞表现出增加的存活率。
在一些实施方案中，在体外培养细胞中产生多个基因组编辑的任一前述方法中的核酸是RNA，诸如gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA。在一些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRBC的gRNA。在其他实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA。在另外其他实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向降低或消除MHC II类表面表达的基因的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向TRBC的gRNA。在一些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向HLA-A的gRNA，任选地其中所述细胞对于HLA-B是纯合的并且对于HLA-C是纯合的。在一些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRBC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRBC的gRNA、靶向HLA-A的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含降低或消除MHC II类表面表达的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRBC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向降低或消除T细胞受体的表面表达的基因的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向TRAC的gRNA，脂质组合物中的至少一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。在某些实施方案中，脂质组合物中的至少一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且脂质组合物中的至少一种包含靶向CIITA的gRNA。
在某些实施方案中，前述脂质组合物中的至少一种包含如本文所述的核酸基因组编辑工具。在一些实施方案中，另一种脂质组合物包含RNA引导的DNA结合剂。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合剂是Cas9。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括使细胞与供体核酸接触。在一些实施方案中，另一种脂质组合物包含供体核酸。供体核酸可插入靶序列中。在一些实施方案中，供体核酸序列以载体形式提供。在一些实施方案中，供体核酸编码靶向受体。在某些实施方案中，供体核酸包含与T细胞受体序列的对应区域具有同源性的区域。“靶向受体”是存在于细胞(例如T细胞)表面上的多肽，以允许细胞结合至靶位点，例如生物体中的特定细胞或组织。在一些实施方案中，靶向受体是CAR。在一些实施方案中，靶向受体是通用CAR(UniCAR)。在一些实施方案中，靶向受体是TCR。在一些实施方案中，靶向受体是T细胞受体融合构建体(TRuC)。在一些实施方案中，靶向受体是B细胞受体(BCR)(例如，表达于B细胞上)。在一些实施方案中，靶向受体是趋化因子受体。在一些实施方案中，靶向受体是细胞因子受体。
在一些实施方案中，体外基因组编辑方法已在T细胞中的多个靶位点处产生高编辑效率。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中内源TCR被敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中内源TCR的表达被敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中两个基因具有降低的表达和/或被敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中三个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中四个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中五个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中六个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中七个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中八个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中九个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中十个基因被敲减和/或敲除。在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中十一个基因被敲减和/或敲除。
在一些实施方案中，产生工程化的T细胞，其中敲除内源TCR并插入和表达转基因TCR。在一些实施方案中，工程化的T细胞是原代人T细胞。在一些实施方案中，tgTCR靶向威尔姆斯氏(Wilms)肿瘤1(WT1)。在一些实施方案中，WT1 tgTCR使用所公开的脂质组合物插入高比例的T细胞(例如大于55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)中。
β2M或B2M在本文中可互换使用并且是指β-2微球蛋白的核酸序列或蛋白质序列；所述人基因具有登录号NC_000015(范围44711492..44718877)，参考GRCh38.p13。B2M蛋白与MHC I类分子缔合为有核细胞表面上的异二聚体并且是MHC I类蛋白表达所需的。
CIITA或CIITA或C2TA在本文中可互换使用并且参考II类主要组织相容性复合物反式活化因子的核酸序列或蛋白质序列；所述人基因具有登录号NC_000016.10(范围10866208..10941562)，参考GRCh38.p13，其以引用的方式并入本文。细胞核中的CIITA蛋白充当MHC II类基因转录的正调节因子并且是MHC II类蛋白表达所需的。
MHC或MHC分子或MHC蛋白或MHC复合物是指一个(或多个、)主要组织相容性复合体分子，并且包括例如MHC I类和MHC II类分子。在人体中，MHC分子被称为人白细胞抗原复合物或HLA分子或HLA蛋白。术语MHC和HLA的使用没有限制性；如本文所用，术语MHC可用于指人MHC分子，即HLA分子。因此，术语MHC和HLA在本文中可互换使用。
如本文所用，HLA-A蛋白的上下文中的HLA-A是指MHC I类蛋白分子，其是由重链(由HLA-A基因编码)和轻链(即β-2微球蛋白)组成的异二聚体。如本文所用，在核酸的上下文中的术语HLA-A或HLA-A基因是指编码HLA-A蛋白分子的重链的基因。HLA-A基因也称为HLA I类组织相容性Aα链；所述人基因具有登录号NC_000006.12(29942532..29945870)，其以引用的方式并入本文。已知HLA-A基因在整个群体具有数百种不同型式(也称为等位基因)(并且个体可接受HLA-A基因的两种不同等位基因)。HLA-A的所有等位基因均由术语HLA-A和HLA-A基因涵盖。
如本文所用，在核酸的上下文中的HLA-B是指编码HLA-B蛋白分子的重链的基因。HLA-B也称为HLA I类组织相容性Bα链；所述人基因具有登录号NC_000006.12(31353875..31357179)，其以引用的方式并入本文。
如本文所用，在核酸的上下文中的HLA-C是指编码HLA-C蛋白分子的重链的基因。HLA-C也称为HLA I类组织相容性Cα链；所述人基因具有登录号NC_000006.12(31268749..31272092)，其以引用的方式并入本文。
靶向序列的长度可取决于使用的CRISPR/Cas系统和组分。例如，来自不同细菌物种的不同2类Cas核酸酶具有改变的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或大于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的引导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA支架将衍生自相同CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含18-24个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含19-21个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含20个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，sgRNA是能够通过Cas9蛋白介导RNA引导的DNA裂解的“Cas9sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA是能够通过Cpf1蛋白质介导RNA引导的DNA裂解的“Cpf1sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合物并介导RNA引导的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白质形成活性复合物并介导RNA引导的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。
某些实施方案还提了供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“引导RNA核酸”在本文中用于指gRNA(例如sgRNA或dgRNA)和gRNA表达盒，其是编码一个或多个gRNA的核酸。
修饰的RNA
在某些实施方案中，脂质组合物，诸如LNP组合物包含修饰的核酸，包括修饰的RNA。
修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA或mRNA例如称作“修饰的”RNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或构型的存在。在一些实施方案中，修饰的RNA是用非典型核苷或核苷酸合成的，此处称作“修饰的”。
修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一项或多项：(i)磷酸二酯主链键联中的一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的改变，例如替换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分(例如核糖上的2′羟基)的改变，例如替换(示例性糖修饰)；(iii)用“去磷酸化”接头成批替换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或替换，包括用非典型核碱基修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的替换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)多核苷酸的3′端或5′端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或替换，或部分、帽或接头的缀合(此类3′或5′帽修饰可包含糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或替换(示例性糖修饰)。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的5′端修饰。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的修饰。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的3′端修饰。修饰的RNA可含有5′端和3′端修饰。修饰的RNA可在非末端位置含有一个或多个修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，修饰的gRNA在5′端处包含前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。在某些实施方案中，修饰的gRNA在5′端处包含前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。如权利要求52或53所述的LNP组合物，其中修饰的gRNA在3′端处包含最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
未修饰的核酸可容易通过例如细胞内核酸酶或血清中所发现的那些核酸酶降解。例如，核酸酶可使核酸磷酸二酯键水解。因此，在一个方面，本文所述的RNA(例如mRNA，gRNA)可含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如以引入针对细胞内核酸酶或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的RNA分子当引入细胞群体中时，在体内与离体均可表现出降低的先天性免疫反应。术语“先天性免疫反应”包括针对外源核酸(包括单链核酸)的细胞反应，其涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放，以及细胞死亡。
因此，在一些实施方案中，RNA或核酸包含至少一种赋予核酸增加或增强的稳定性的修饰，包括例如改善的对体内核酸酶消化的抗性。如本文所用，术语“修饰”和“修饰的”当与本文所提供核酸相关时，包括至少一种改变，其优选增强稳定性并使RNA或核酸比野生型或天然存在的RNA或核酸型式更稳定(例如对核酸酶消化具有抗性)。如本文所用，术语“稳定”和“稳定性”和此类术语涉及本文所述的核酸，并且尤其关于RNA，是指对通过例如通常能够降解此类RNA的核酸酶(即核酸内切酶或核酸外切酶)的降解具有增加或增强的抗性。增加的稳定性可包括例如对通过内源酶(例如核酸内切酶或核酸外切酶)的水解或其他破坏或靶细胞或组织内的状况的敏感性降低，从而增加或增强此类RNA或核酸在靶细胞、组织、受试者和/或细胞质中的滞留。本文所提供的稳定化的RNA或核酸分子展示出相对于其天然存在的未修饰的对应物(例如分子的野生型形式)的较长半衰期。如与本文所公开的LNP组合物的mRNA相关的术语，术语“修饰”和“修饰的”当与本文所公开LNP组合物的mRNA相关时，还涵盖改善或增强mRNA核酸翻译的改变，包括例如包含在蛋白质翻译起始中起作用的序列(例如Kozak共有序列)。(Kozak，M.，Nucleic Acids Res 15(20)：8125-48(1987))。
在一些实施方案中，RNA或核酸已经受化学或生物修饰以使其更稳定。RNA或核酸的示例性修饰包括碱基耗竭(例如通过一个核苷酸缺失或通过另一个核苷酸取代一个核苷酸)或碱基修饰，例如碱基的化学修饰。如本文所用的短语“化学修饰”包括引入不同于天然存在的RNA或核酸中所发现的化学物质的修饰，例如共价修饰，诸如引入修饰的核苷酸(例如核苷酸类似物，或包含在此类RNA中未天然发现的侧基，诸如脱氧核苷或核酸分子)。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸酯基团可通过用不同取代基替换一个或多个氧而被修饰。此外，修饰的残基，例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基可包括用如本文所述的修饰的磷酸酯基团批量替换未修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的主链修饰可包括产生不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的变化。
修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团之一替换非桥联氧之一可使得磷原子呈手性。立构磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。主链还可通过用氮(桥联的氨基磷酸酯)、硫(桥联的硫代磷酸酯)和碳(桥联的亚甲基膦酸酯)替换桥联氧(即连接磷酸酯与核苷的氧)而加以修饰。替换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。磷酸酯基团可在某些主链修饰中由不含磷的连接子替换。在一些实施方案中，带电磷酸酯基团可由中性部分替换。可替换磷酸酯基团的部分的实例可包括但不限于例如膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基。
mRNA
在一些实施方案中，本文所公开的组合物或制剂包含mRNA，其包含编码RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，或如本文所述的2类Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用mRNA，其包含编码RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶或2类Cas核酸酶的ORF。mRNA可包含5′帽、5′非翻译区(UTR)、3′UTR和聚腺嘌呤尾中的一个或多个。mRNA可包含修饰的开放阅读框，例如以编码核定位序列或使用替代密码子来编码蛋白质。
所公开LNP组合物中的mRNA可编码细胞表面或胞内多肽。所公开LNP组合物中的mRNA可编码例如分泌性激素、酶、受体、多肽、肽或通常分泌的其他相关蛋白质。在一些实施方案中，mRNA可任选地具有化学或生物修饰，其例如改善此类mRNA的稳定性和/或半衰期或改善或以其他方式促进蛋白质产生。
另外，合适的修饰包括改变密码子的一个或多个核苷酸以使得密码子编码相同氨基酸，但比在野生型型式的mRNA中发现的密码子更稳定。例如，已证明RNA的稳定性与较高数量的胞苷(C)和/或尿苷(U)残基之间呈反向关系，并且已发现不含C和U残基的RNA对于大部分RNA酶而言是稳定的(Heidenreich等人J Biol Chem 269，2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中C和/或U残基的数量减少。在另一实施方案中，C和/或U残基的数量通过将编码特定氨基酸的一种密码子取代为编码相同或相关氨基酸的另一密码子来减少。预期的对mRNA核酸的修饰还包括掺入假尿苷。将假尿苷掺入到mRNA核酸中可增强稳定性和翻译能力，以及降低体内免疫原性。参见例如Karikó，K.等人，Molecular Therapy 16(11)：1833-1840(2008)。对mRNA的取代和修饰可通过本领域普通技术人员容易已知的方法进行。
与未翻译区相比，减少序列中的C和U残基的数量的约束条件将可能在mRNA的编码区内更大(即，消除消息中存在的全部C和U残基同时仍保留消息编码所需氨基酸序列的能力可能将是不可能的)。然而，遗传密码的简并提供允许存在于序列中的C和/或U残基的数量得以减少，同时维持相同编码能力(即，取决于由密码子编码何种氨基酸，几种不同RNA序列修饰的可能性可以是可能的)的机会。
术语修饰还包括例如将非核苷酸键联或修饰的核苷酸掺入到mRNA序列中(例如对编码功能性分泌蛋白或酶的mRNA分子的3′和5′端中之一或两者的修饰)。此类修饰包括将碱基添加至mRNA序列(例如，包含poly A尾或较长poly A尾)、改变3′UTR或5′UTR、使mRNA与剂(例如，蛋白质或互补核酸分子)复合以及包含改变mRNA分子的结构的元件(例如，其形成二级结构)。
poly A尾被认为使天然信使稳定。因此，长poly A尾可添加至mRNA分子中，因此使得mRNA更稳定。可使用多种本领域公认的技术添加Poly A尾。例如，长poly A尾可使用polyA聚合酶添加至合成或体外转录的mRNA(Yokoe等人Nature Biotechnology.1996；14：1252-1256)。转录载体还可编码长poly A尾。另外，poly A尾可通过直接从PCR产物转录添加。在一些实施方案中，poly A尾的长度为至少约90、200、300、400个、至少500个核苷酸。在某些实施方案中，调节poly A尾的长度以控制修饰的mRNA分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，由于poly A尾的长度可影响mRNA分子的半衰期，因此poly A尾的长度可进行调节以改变mRNA对核酸酶的抗性水平并由此控制细胞中蛋白质表达的时程。在一些实施方案中，稳定化的mRNA分子对体内降解(例如，通过核酸酶)具有足够抵抗性，使得其可在无转移媒介物的情况下递送至靶细胞。
在某些实施方案中，mRNA可通过掺入未在野生型mRNA中天然发现的3′和/或5′未翻译(UTR)序列而被修饰。在一些实施方案中，自然侧接mRNA并编码第二不相关蛋白质的3′和/或5′侧接序列，可掺入到编码治疗或功能蛋白的mRNA分子的核苷酸序列中，以便对其进行修饰。例如，来自稳定的mRNA分子(例如珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)的3′或5′序列可掺入到有义mRNA核酸分子的3′和/或5′区中以增加有义mRNA分子的稳定性。参见例如US2003/0083272。
mRNA修饰的更详细描述可见于US2017/0210698A1的第57页-第68页，其内容并入本文。
模板核酸
本文所公开的方法可包括使用模板核酸。模板可用于在RNA引导的DNA结合蛋白，诸如Cas核酸酶，例如2类Cas核酸酶的靶位点处或其附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括将模板引入到细胞。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可发生在两个或更多个靶位点处。例如，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因，或细胞中的两种不同基因。
在一些实施方案中，模板可用于同源重组。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，其涉及核酸中裂解位点处的DNA链入侵。在一些实施方案中，同源定向修复可导致编辑的靶核酸分子中包括模板序列。在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有相似性。在一些实施方案中，掺入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接的反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由靶细胞的内源序列组成。其还可或替代地对应于、包含或由靶细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的质粒序列。
在一些实施方案中，模板含有ssDNA或dsDNA，其含有侧接的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，模板提供为载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物。
在一些实施方案中，核酸经过纯化。在一些实施方案中，核酸使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，核酸使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，核酸使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者进行纯化。在一些实施方案中，核酸通过切向流过滤(TFF)进行纯化。
细胞类型
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，包括例如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(“NK细胞”和NKT细胞或iNKT细胞))、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞或粒细胞(例如，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。在一些实施方案中，细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，免疫系统细胞可选自CD3+、CD4+和CD8+ T细胞、调节性T细胞(Treg)、B细胞、NK细胞和树突状细胞(DC)。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体的。在一些实施方案中，细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞是适应性免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞。在一些实施方案中，细胞是B细胞。在一些实施方案中，细胞是NK细胞。
如本文所用，T细胞可定义为表达T细胞受体(“TCR”或“αβTCR”或“γδTCR”)的细胞，然而，在一些实施方案中，T细胞的TCR可进行遗传修饰以降低其表达(例如通过对TRAC或TRBC基因的遗传修饰)，因此蛋白质CD3的表达可用作通过标准流式细胞术方法鉴定T细胞的标志物。CD3是与TCR相关的多亚单元信号传导复合物。因此，T细胞可称为CD3+。在一些实施方案中，T细胞是表达CD3+标志物和CD4+或CD8+标志物的细胞。
在一些实施方案中，T细胞表达糖蛋白CD8并且因此根据标准流式细胞术方法为CD8+，并且可称为“细胞毒性”T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达糖蛋白CD4并且因此根据标准流式细胞术方法为CD4+，并且可称为“辅助”T细胞。CD4+ T细胞可分化成亚群并且可称为Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、T调节(“Treg”)细胞或T滤泡性辅助细胞(“Tfh”)。每个CD4+亚群释放可具有促炎或抗炎功能、存活或保护功能的特定细胞因子。T细胞可通过CD4+或CD8+选择方法从受试者分离。
在一些实施方案中，T细胞是记忆T细胞。在体内，记忆T细胞遇到抗原。记忆T细胞可位于次级淋巴器官(中枢记忆T细胞)或最近感染的组织(效应记忆T细胞)中。记忆T细胞可以是CD8+ T细胞。记忆T细胞可以是CD4+ T细胞。如本文所用，“中枢记忆T细胞”可定义为经历抗原的T细胞，并且例如可表达CD62L和CD45RO。中枢记忆T细胞可通过还表达CCR7的中枢记忆T细胞检测为CD62L+和CD45RO+，因此可通过标准流式细胞术方法检测为CCR7+。
如本文所用，“早期干细胞记忆T细胞”(或“Tscm”)可定义为表达CD27和CD45RA的T细胞，并且因此根据标准流式细胞术方法为CD27+和CD45RA+。Tscm不表达CD45同工型CD45RO，因此如果此同工型通过标准流式细胞术方法进行染色，则Tscm将进一步为CD45RO-。因此，CD45RO-CD27+细胞也是早期干细胞记忆T细胞。Tscm细胞进一步表达CD62L和CCR7，因此可通过标准流式细胞术方法检测为CD62L+和CCR7+。已证明早期干细胞记忆T细胞与细胞疗法产品的持久性和治疗功效增加相关。
在一些实施方案中，细胞是B细胞。如本文所用，“B细胞”可定义为表达CD19和/或CD20，和/或B细胞成熟抗原(“BCMA”)的细胞，并且因此B细胞根据标准流式细胞术方法为CD19+，和/或CD20+，和/或BCMA+。根据标准流式细胞术方法，B细胞对于CD3和CD56进一步为阴性的。B细胞可以是浆细胞。B细胞可以是记忆B细胞。B细胞可以是未处理B细胞。B细胞可以是IgM+或具有类别转换的B细胞受体(例如IgG+或IgA+)。
包括用于ACT疗法的细胞，诸如间充质干细胞(例如，从骨髓(BM)、外周血液(PB)、胎盘、脐带(UC)或脂肪分离)；造血干细胞(HSC；例如，从BM分离)；单核细胞(例如，从BM或PB分离)；内皮祖细胞(EPC；从BM、PB和UC分离)；神经干细胞(NSC)；角膜缘干细胞(LSC)；或组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(TSC)。ACT疗法中所用的细胞还包括诱导以分化成其他细胞类型的诱导性多能干细胞(iPSC)，包括例如胰岛细胞、神经元和血细胞；眼部干细胞；多能干细胞(PSC)；胚胎干细胞(ESC)；器官或组织移植细胞，诸如胰岛细胞、心肌细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、神经元细胞、皮肤细胞、视网膜细胞、软骨细胞、肌细胞和角质细胞。
在一些实施方案中，细胞是人细胞，诸如来自受试者的细胞。在一些实施方案中，细胞从人受试者，诸如人供体分离。在一些实施方案中，细胞从人供体PBMC或leukopak分离。在一些实施方案中，细胞来自患有病状、病症或疾病的受试者。在一些实施方案中，细胞来自具有爱泼斯坦巴尔病毒(“EBV”)的人供体。
在一些实施方案中，细胞是单核细胞，诸如来自骨髓或外周血液。在一些实施方案中，细胞是外周血液单核细胞(“PBMC”)。在一些实施方案中，细胞是PBMC，例如淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方案中，细胞是外周血液淋巴细胞(“PBL”)。
在一些实施方案中，离体进行所述方法。如本文所用，“离体”是指其中细胞能够转移至受试者中的体外方法，例如作为ACT疗法。在一些实施方案中，离体方法是涉及ACT疗法细胞或细胞群体的体外方法。
在一些实施方案中，细胞维持于培养物中。在一些实施方案中，细胞移植至患者体内。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行遗传修饰，并且然后重新向同一患者施用。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行遗传修饰，并且然后向移出其的受试者以外的受试者施用。
在一些实施方案中，细胞来自细胞系。在一些实施方案中，细胞系衍生自人受试者。在一些实施方案中，细胞系是类淋巴母细胞细胞系(“LCL”)。细胞可冷冻保存和解冻。细胞先前可能尚未经过冷冻保存。
在一些实施方案中，细胞来自细胞库。在一些实施方案中，细胞经过遗传修饰并且然后转移至细胞库中。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行遗传修饰，并且转移至细胞库中。在一些实施方案中，将遗传修饰的细胞群体转移至细胞库中。在一些实施方案中，将遗传修饰的免疫细胞群体转移至细胞库中。在一些实施方案中，将包含第一和第二亚群的遗传修饰的免疫细胞群体转移至细胞库中，其中第一和第二亚群具有至少一个共同遗传修饰和至少一个不同遗传修饰。
在一些实施方案中，T细胞通过多克隆活化(或“多克隆刺激”)(非抗原特异性刺激)来活化。在一些实施方案中，T细胞通过CD3刺激(例如提供抗CD3抗体)活化。在一些实施方案中，T细胞通过CD3和CD28刺激(例如提供抗CD3抗体和抗CD28抗体)活化。在一些实施方案中，T细胞使用即用型试剂活化以活化T细胞(例如经由CD3/CD28刺激)。在一些实施方案中，T细胞经由珠粒所提供的CD3/CD28刺激活化。在一些实施方案中，T细胞通过CD3/CD28刺激活化，其中一种或多种组分可溶和/或一种或多种组分结合至固体表面(例如板或珠)。在一些实施方案中，T细胞通过抗原非依赖性有丝分裂原(例如凝集素，包括例如伴刀豆球蛋白A(“ConA”)或PHA)活化。
在一些实施方案中，一种或多种细胞因子用于活化T细胞。提供IL-2用于T细胞活化。在一些实施方案中，用于活化T细胞的细胞因子是结合至共同γ链(γc)受体的细胞因子。在一些实施方案中，提供IL-2用于T细胞活化和/或促进T细胞存活。在一些实施方案中，提供IL-7用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供IL-15用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供IL-21用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供细胞因子的组合用于T细胞活化，包括例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。
在一些实施方案中，T细胞通过使细胞暴露于抗原(抗原刺激)而活化。当抗原呈递为主要组织相容性复合物(“MHC”)分子中的肽(肽-MHC复合物)时，T细胞通过抗原活化。同源抗原可通过将T细胞与抗原呈递细胞(喂养细胞)和抗原共培养而呈递给T细胞。在一些实施方案中，T细胞通过与已用抗原脉冲的抗原呈递细胞共培养而活化。在一些实施方案中，抗原呈递细胞已用抗原的肽进行脉冲。
在一些实施方案中，T细胞可活化12至72小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12至48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12至24小时。在一些实施方案中，T细胞可活化24至48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化24至72小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12小时。在一些实施方案中，T细胞可活化48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化72小时。
虽然本发明结合所说明的实施方案描述，但应理解其不意图将本发明限于那些实施方案。相反，本公开意图涵盖所有替代方案、修改和等效物，包括特定特征的等效物，其可包括在如通过所附权利要求所定义的本发明内。
前述一般描述和详细描述，以及下述实施例均仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为以任何方式限制所需主题。在以引用的方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外说明，否则本申请中给出的所有范围涵盖端点。
定义
应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本申请中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及的“组合物”包括复数个组合物并且提及的“细胞”包括复数个细胞等。除非另外说明，否则使用的“或”是包括性的并且表示“和/或”。
除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案还考虑为“由”所陈述组分“组成”或“基本上由”所陈述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”的实施方案还考虑为“包含”所陈述组分或“基本上由”所陈述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案还考虑为“处于”所陈述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”的实施方案还考虑为“由”所陈述组分“组成”或“包含”所陈述组分(此互换性不适用于在权利要求中使用这些术语)。
数值范围包括限定所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，实测值和可测量值应理解为近似值。如本申请中所使用，术语“约”和“大约”具有本领域所理解的含义；使用一个相较于使用另一个未必暗示不同范围。除非另外指示，否则本申请中所使用的具有或不具有修饰术语(诸如“约”或“大约”)的数字应理解为涵盖如相关领域中的普通技术人员将理解的正常偏差和/或波动。在某些实施方案中，除非另有说明或以其他方式从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”可指在所规定参考值的任一方向上(大于或小于)处于25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、1％、0.5％、0.1或更小的值范围内(除数字将超出可能值的100％的情况外)。
如本文所用，术语“接触(contacting)”表示在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触表示使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。使细胞与外部实体体内和离体接触的方法是生物领域众所周知的。例如，纳米颗粒组合物与置于哺乳动物内的哺乳动物细胞的接触可通过不同施用途径(例如静脉内、肌肉内、皮内和皮下)进行并且可涉及不同量的纳米颗粒组合物。此外，纳米颗粒组合物可接触多于一个哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“递送”表示将实体提供至目的地。例如，将治疗药物和/或预防药物递送至受试者可涉及向受试者施用包括治疗药物和/或预防药物的纳米颗粒组合物(例如通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用纳米颗粒组合物可涉及使一个或多个细胞与纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，“囊封效率(encapsulation efficiency)”是指相对于用于制备纳米颗粒组合物的治疗药物和/或预防药物的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的治疗药物和/或预防药物的量。例如，如果最初提供给组合物的总共100mg治疗药物和/或预防药物中，97mg治疗药物和/或预防药物囊封于纳米颗粒组合物中，则囊封效率可给定为97％。如本文所用，“囊封(encapsulation)”可指完全、实质或部分封闭、限制、围绕或包覆。
如本文所用，术语“编辑效率”、“编辑百分比”、“插入/缺失效率”和“插入/缺失百分比”是指相对于序列读段总数，具有插入或缺失的序列读段的总数。例如，基因组中的靶位置处的编辑效率可通过分离和测序基因组DNA以鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在来测量。在一些实施方案中，编辑效率以相对于最初含有基因(例如CD3)的细胞(例如CD3+细胞)的数量而言，在治疗后不再含有所述基因的细胞的百分比形式测量。
如本文所用，“基因敲减(knockdown)”是指特定基因产物(例如蛋白质、mRNA或两者)的表达降低。蛋白质的基因敲减可通过检测来自样品，诸如所关注的组织、体液或细胞群体的蛋白质的总细胞量来测量。其还可通过测量蛋白质的替代物、标志物或活性来测量。用于测量mRNA的基因敲减的方法是已知的，并且包括对从所关注样品分离的mRNA进行测序。在一些实施方案中，“基因敲减”可指一些特定基因产物的表达缺失，例如转录的mRNA的量下降或由细胞群体(包括体内群体，诸如组织中所发现的那些群体)表达的蛋白质的量下降。
如本文所用，“基因敲除(knockout)”是指细胞中的特定基因或特定蛋白质的表达缺失。基因敲除可通过检测例如细胞、组织或细胞群体中蛋白质的总细胞量来测量。例如，还可以基因组或mRNA水平检测基因敲除。
如本文所用，术语“可生物降解”用于指在引入细胞中时通过细胞机器(例如酶促降解)或通过水解而分解为使细胞可再次使用或处置而对细胞无显著毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中，由可生物降解材料分解产生的组分在体内不诱导炎症和/或其他不良作用。在一些实施方案中，可生物降解材料以酶促方式分解。或者或另外，在一些实施方案中，可生物降解材料通过水解分解。
如本文所用，“N/P比率”是例如包括脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中的含可电离氮原子的脂质(例如式I化合物)与RNA中磷酸酯基团的摩尔比。
组合物还可包括一种或多种化合物的盐。盐可以是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱金属盐或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，此类盐可通过使游离酸或碱形式的此类化合物与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；一般而言，优选非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的清单见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页；Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use，P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编)，Wiley-VCH，2008；和Berge等人，Journal ofPharmaceutical Science，66，1-19(1977)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文。
如本文所用，“多分散性指数”是描述系统的粒度分布的均匀性的比率。例如小于0.3的较小值指示窄粒度分布。在一些实施方案中，多分散性指数可小于0.1。
如本文所用，“转染”是指将物种(例如RNA)引入细胞中。转染可例如在体外、离体或体内发生。
如本文所使用的术语“烷基”是具有1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链(即直链)。烷基还可以是取代或未取代的。例如，烷基可被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜基(sulfoxo)、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所描述。“低级烷基”基团是含有一至六个(例如一至四个)碳原子的烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的脂族基团并且意图包括“未取代的烯基”与“取代的烯基”两者，后者是指烯基的一个或多个碳上的氢被取代基替换的烯基部分。此类取代基可存在于一个或多个包括或不包括于一个或多个双键中的碳上。此外，此类取代基包括如下文所论述的所有对于烷基所涵盖的取代基，除非稳定性不允许。例如，涵盖烯基可被一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代。示例性烯基包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“亚烷基”基团是指二价烷基，其可以是支链或非支链(即直链)。以上提及的单价烷基中的任一个可通过从烷基提取第二氢原子而转化为亚烷基。代表性亚烷基包括C2-4亚烷基和C2-3亚烷基。典型的亚烷基包括但不限于-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-等。亚烷基还可以是取代或未取代的。例如，亚烷基可被一个或多个包括但不限于以下的基团取代：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、亚砜基、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所描述。
术语“亚烯基”包括具有至少一个碳-碳双键的二价、直链或支链、不饱和、非环状烃基，并且在一个实施方案中，无碳-碳三键。以上提及的单价烯基中的任一个可通过从烯基提取第二氢原子而转化为亚烯基。代表性亚烯基包括C2-6亚烯基。
术语“Cx-y”当与诸如烷基或亚烷基的化学部分结合使用时意在包括链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“Cx-y烷基”是指取代或未取代的饱和烃基，包括在链中含有x至y个碳的直链和支链烷基和亚烷基。
术语“烷氧基”是指与氧连接的烷基、优选低级烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
以引用的方式并入
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实施例
实施例1-材料和方法
实施例1.1脂质纳米颗粒(“LNP”)制剂
以各种摩尔比将LNP组分溶解在100％乙醇中。将RNA载荷(例如合并的Cas9 mRNA和gRNA)溶解在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl(pH 5.0)中，产生大约0.45mg/mL的RNA载荷浓度。除非另外规定，否则以约6的脂质胺与RNA磷酸酯(N∶P)摩尔比和以1∶2重量比的sgRNA与Cas9 mRNA的比率配制LNP。
在4组分脂质系统中使用各种胺脂质制备LNP。除非另外规定，否则LNP含有可电离脂质即化合物3，8-((7，7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯、DSPC、胆固醇和PEG2k-DMG。
使用交叉流技术，利用含脂质的乙醇与两体积的RNA溶液和一体积的水的冲击射流混合来制备LNP。通过混合交叉使含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液混合。通过内联三通将第四水流与四通管的输出流混合(参见WO2016010840，图2)。将LNP在室温下保持1小时并且进一步用水稀释(大约1∶1 体积/体积)。使用切向流过滤在例如平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上浓缩LNP，并且任选地使用PD-10脱盐柱(GE)将其缓冲液交换至50mM Tris、45mM NaCl、5％(重量/体积)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。替代地，任选地使用100kDa Amicon旋转过滤器浓缩LNP，并且使用PD-10脱盐柱(GE)将其缓冲液交换至TSS中。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直至进一步使用。
实施例1.2核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)
含有N1-甲基假-U的封端和聚腺苷酸化mRNA通过使用线性化质粒DNA模板和T7RNA聚合酶的体外转录产生。通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下孵育2小时来线性化含有T7启动子、转录序列和聚腺苷酸化区域的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应20min来使XbaI失活。由酶和缓冲液盐纯化线性化质粒。用于产生修饰的mRNA的IVT反应通过在37℃下在以下条件下孵育1.5-4小时来进行：50ng/μL线性化质粒；各2-5mM的GTP、ATP、CTP和N1-甲基假-UTP(Trilink)；10-25mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)，至0.01U/μL的最终浓度，并且将反应再孵育30分钟以去除DNA模板。根据制造商的方案使用MegaClearTranscription Clean-up试剂盒(ThermoFisher)或RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。
或者，通过沉淀方案(在一些情况下，其之后是基于HPLC的纯化、)来纯化mRNA。简而言之，在DNA酶消化之后，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀来纯化mRNA。对于HPLC纯化的mRNA而言，在LiCl沉淀和复原之后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见例如Kariko等人，Nucleic Acids Research，2011，第39卷，第21期e142)。合并选择用于汇集的级分并通过如上所述的乙酸钠/乙醇沉淀来脱盐。在另一替代方法中，mRNA用LiCl沉淀法纯化，随后通过切向流过滤进一步纯化。通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)测定RNA浓度，并且通过毛细管电泳法用Bioanlayzer(Agilent)来分析转录物。
由编码根据SEQ ID NO：1-3的开放阅读框(参见表17中的序列)的质粒DNA产生化脓链球菌(“Spy”)Cas9 mRNA。当本段中引用的序列在下文中针对RNA提及时，应理解，T应替换为U(其可以是如上所述的修饰的核苷)。实施例中所用的信使RNA包括5′帽和3′聚腺苷酸化序列，例如至多100nt，并且在表17中鉴定。
引导RNA通过本领域已知的方法以化学方式合成。
实施例1.3制剂分析方法
动态光散射(“DLS”)用于表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和大小。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光的散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度(大约平均粒度)的分布，其中完全均匀群体的PDI为零。
不对称流场流分级分离-多角度光散射(AF4-MALS)用于根据流体动力学半径分离组合物中的颗粒并且然后测量分级分离颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。这允许评估分子量和尺寸分布以及二级特征，诸如Burchard-Stockmeyer图(表明颗粒的内部核心密度的随时间推移的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径的比率)和rms构象图(rms半径的对数相对于分子量的对数，其中所得线性拟合的斜率给出相对于伸长率的紧密度)的能力。
冷冻电子显微术(“cryo-EM”)可用于测定LNP的粒度、形态和结构特征。
LNP的脂质组成分析可由液相色谱继随后是电雾式检测(LC-CAD)测定。此分析可提供实际脂质含量相对于标称脂质含量的比较。
针对平均粒度、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA囊封效率和ζ电位对LNP组合物进行分析。LNP组合物可进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征。平均粒度和多分散性是通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer DLS仪器来测量。在通过DLS测量之前，用PBS缓冲液稀释LNP样品。连同数量平均直径和pdi一起报告Z平均直径。Z平均值是颗粒总集合的强度加权平均流体动力尺寸并通过动态光散射来测量。数量平均值是通过动态光散射测量的颗粒总集合的颗粒数量加权平均流体动力尺寸。MalvernZetasizer仪器也用于测量LNP的ζ电位。在测量之前，将样品在0.1X PBS(pH 7.4)中以1∶17(50μL于800μL中)稀释。
囊封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。使用基于荧光的测定(ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度和游离RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1xTE缓冲液适当稀释LNP样品以测定总RNA，或用1x TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制得组合物并且在1x TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释的起始RNA溶液制备标准曲线。然后将稀释的染料(根据制造商的说明书)添加至标准品和样品中的每一个中，并且在没有光照下，在室温下孵育大约10分钟。使用SpectraMax M5微孔板读取器(Molecular Devices)，以分别设定为488nm、515nm和525nm的激发、自动截止和发射波长来读取样品。根据适当标准曲线测定总RNA和游离RNA。
使用AF4-MALS从那些计算结果查看分子量和尺寸分布以及二次统计数据。LNP按需要稀释并使用HPLC自动进样器注射至AF4分离通道中，LNP在所述自动进样器中集中并且然后跨越通道在交叉流中以指数梯度洗脱。所有流体通过HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。从AF4通道洗脱的颗粒流经紫外检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和差示折光检测器。原始数据通过使用Debeye模型处理以从检测器信号测定分子量和rms半径。
CAD是破坏性的基于质量的检测器，其检测所有非挥发性化合物并且无论分析物结构如何，信号都是一致的。
LNP中的脂质组分通过与电雾式检测器(CAD)联用的HPLC定量分析。4种脂质组分的色谱分离通过反向HPLC来实现。
实施例1.4 T细胞制备
健康人供体血浆分离术是商购获得的(Hemacare)。通过负向选择使用EasySep人T细胞分离试剂盒(Stem Cell Technology，目录号17951)或通过CD4/CD8正向选择使用CD4/CD8微珠(Miltenyi，目录号130-122-352)在MultiMACSTM Cell24 Separator Plus仪器上按照制造商的说明分离T细胞。将T细胞冷冻保存于Cryostor CS10冷冻培养基(目录号07930)中供将来使用。
解冻后，将T细胞培养于由以下构成的完全T细胞生长培养基中：CTS OpTmizer基础培养基(补充有1X GlutaMAX、10mM HEPES缓冲液(10mM)和1％青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)，进一步补充有200IU/mL IL2(Peprotech，200-02)、5ng/ml IL7(Peprotech，200-07)、5ng/mL IL15(Peprotech，200-15)和2.5％人血清(Gemini，100-512)的CTSOpTmizer培养基(Gibco，A3705001))。在过夜静置之后，将密度为106个细胞/mL的T细胞用T细胞TransAct试剂(1∶100稀释，Miltenyi)活化并在37℃下孵育24或48小时。孵育后，将密度为0.5×106/mL的细胞用于编辑应用。
除非另有指示，否则相同过程用于非活化T细胞，但有以下例外。解冻后，将非活化T细胞培养于由以下构成的CTS完全生长培养基中：CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher，A10485-01)(1％青霉素-链霉素(Corning，30-002-CI)、1X GlutaMAX(Thermofisher，35050061)、10mM HEPES(Thermofisher，15630080))，其进一步补充有200U/mL IL2(Peprotech，200-02)、5ng/mL IL7(Peprotech，200-07)、5ng/mL IL15(Peprotech，200-15)和5％人AB血清(Gemini，100-512)，在未活化情况下孵育24小时。将T细胞以106/mL的细胞密度接种于100uL的上文所述的含有2.5％人血清和细胞因子的CTSOpTmizer基础培养基中以用于编辑应用。
实施例1.5 T细胞的LNP转染
将T细胞用如实施例1.1中所述配制的LNP转染。用于LNP转染的材料在表1中指出。在Hamilton Microlab STAR液体处理系统上进行LNP剂量反应曲线(DRC)转染。液体处理器配备有以下：(a)在深孔96深孔板的顶行中的4倍所需最高LNP剂量，(b)以20μg/mL稀释于培养基中的ApoE3，(c)由如先前实施例1中所述的CTS OpTmizer基础培养基构成的完全T细胞生长培养基和(d)在96孔平底组织培养板中以106/ml密度以100μL接种的T细胞。液体处理器首先在深孔板中从4倍LNP剂量开始进行LNP的8点两倍连续稀释。然后将等体积的ApoE3培养基添加至每个孔中，形成LNP和ApoE3的1：1稀释液。随后将100μL LNP-ApoE混合物添加至每个T细胞板中。将最高剂量下的LNP的最终浓度设定为5μg/mL。ApoE3的最终浓度为5μg/mL，并且T细胞的最终密度为0.5×106个细胞/mL。将板在37℃下以5％CO2孵育24或48小时，分别用于活化或非活化的T细胞。孵育后，收获用LNP处理的T细胞并加以分析用于在靶编辑或Cas9蛋白表达检测。在LNP处理之后培养剩余细胞7-10天并通过流式细胞术评估蛋白质表面表达。
实施例1.7流式细胞术分析
由TRAC编码的T细胞受体α链是T细胞受体/CD3复合物组装和易位至细胞表面所需的。编辑通过编辑之后CD3阴性细胞的百分比的增加来进行测定。为了通过流式细胞术测定细胞表面蛋白，将T细胞重悬于100μL抗体混合物(1∶100 PE-抗人CD3[Biolegend，目录号300441]、1∶200 FITC抗人CD4[Biolegend，目录号300538]、1∶200 APC抗人CD8a[Biolegend，目录号301049]、FACS缓冲液[PBS+2％FBS+2mM EDTA])中并在4℃下孵育30分钟。洗涤T细胞，然后重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS+2mM EDTA)中。随后在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理T细胞。使用FlowJo软件包(v.10.6.1或v.10.7.1)进行数据分析。简而言之，T细胞根据淋巴细胞继的以单细胞进行门控。这些单细胞根据CD4+/CD8+状态进行门控，CD8+/CD3-细胞是根据所述状态选择的。量化CD8+/CD3-细胞百分比以确定其中编辑的靶基因座引起TCR基因敲除的细胞群体的百分比。使用Prism GraphPad(v.9.0)利用线性回归模型产生TCR KO的剂量反应曲线。计算每种LNP的曲线的半最大有效浓度(EC50)和最大CD3-百分比值。
实施例1.6.下一代测序(“NGS”)和编辑效率分析
为了定量测定基因组中的靶位置处的编辑效率，利用测序来鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。PCR引物设计于所关注基因(例如AAVS1)内的靶位点周围，并且将所关注基因组区扩增。按本领域中的标准进行引物序列设计。
根据制造商的方案(Illumina)进行额外PCR以添加化学物质以供测序。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与参考基因组(例如，hg38)比对。将含有所述读段的所得文件映射至参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区域重叠的读段，并且计算野生型读段的数量相对于含有插入或缺失(“插入/缺失”)的读段的数量。
实施例2-T细胞中的化合物3组合物筛选
2.1 CD3+ T细胞中的LNP可电离脂质的表征
为评定编辑功效，将T细胞用LNP组合物处理，所述LNP组合物具有不同摩尔百分比的囊封Cas9 mRNA和靶向TRAC基因的sgRNA的脂质组分，并且通过流式细胞术评估T细胞受体表面蛋白的损失。
LNP一般如实施例1中所述进行制备，脂质组成分别表示为化合物3/DSPC/胆固醇/PEG的摩尔比，如表1中所指示。LNP递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID No.4)和靶向人TRAC的sgRNA(SEQ ID NO.10)。sgRNA与Cas9 mRNA的载荷比为按重量计1：2。
如实施例1中所述针对Z平均粒度和数量平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA囊封效率对LNP制剂进行分析，并且结果示于表1中。
表1.LNP制剂分析结果
评估表1中的LNP以测定LNP组成比率对CD3阳性T细胞中的编辑效率的影响。制备来自两个供体(批次号W106和W0186)的T细胞并如实施例1中所述分别针对活化T细胞和非活化T细胞对其进行转染。转染后七天，收获编辑的T细胞并如实施例1中所述通过流式细胞术进行表型分型。在用0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL、0.25μg/mL、0.63μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL的LNP浓度处理之后测量CD3阴性T细胞的百分比。活化T细胞在每个LNP剂量下的平均CD3阴性T细胞百分比、最大CD3阴性百分比值和EC50示于表2和图1A中，而非活化T细胞示于表3和图1B中。近似最大％CD3-或EC50值以波浪符标注并且无法测定的值标注为“ND”。
表2.用指定LNP制剂处理活化T细胞之后的平均CD3阴性细胞百分比。
表3.用指定LNP制剂处理非活化T细胞之后的平均CD3阴性细胞百分比。
实施例3-T细胞中的所选化合物3 LNP组合物筛选
3.1评定编辑的CD3阳性T细胞中所选的LNP组合物
为评定LNP编辑功效，将T细胞用具有不同摩尔百分比的囊封Cas9 mRNA和靶向TRAC基因的sgRNA的脂质组分的LNP组合物处理，并且通过流式细胞术评估T细胞受体表面蛋白的损失。
LNP一般如实施例1中所述进行制备，脂质组成如表4中所指示，分别表示为可电离脂质A/DSPC/胆固醇/PEG的摩尔比。LNP递送编码Cas9 mRNA的mRNA(SEQ ID No.4)和靶向人TRAC的sgRNA(SEQ ID NO.10)。sgRNA与Cas9 mRNA的载荷比为按重量计1∶2。
如实施例1中所述针对平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA囊封效率对LNP制剂进行分析，并且结果示于表4中。
表4.LNP制剂分析结果
制备来自两个供体(批次号W106和W790)的T细胞并如实施例1中所述分别针对活化T细胞和非活化T细胞对其进行转染。转染后7天，收获编辑的T细胞并如实施例1中所述通过流式细胞术进行表型分析。
在用0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL、0.25μg/mL、0.63μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL的LNP浓度处理之后测量CD3阴性T细胞的百分比。活化T细胞在每个LNP剂量下计算的平均CD3阴性T细胞百分比以及对应的EC50和最大值示于表5和图2A中，而非活化T细胞示于表6和图2B中。
表5.用指定LNP制剂处理活化T细胞之后的CD3阴性细胞百分比。
表6.用指定LNP制剂处理非活化T细胞之后的CD3阴性细胞百分比。
实施例4-T细胞中的可电离脂质筛选
4.1具有各种可电离脂质的LNP组合物的表征
为评定LNP中的其他可电离脂质对编辑的影响，用在两种不同组分比率下用3种可电离脂质化合物中的一种配制的LNP组合物处理T细胞。将化合物1、化合物3和化合物4中的每一种配制在具有标称mol％比率的脂质组分的LNP中：30％可电离脂质、10％DSPC、59％胆固醇和1.0％PEG-2k-DMG，以及具有标称mol％比率的脂质组分的比较LNP中：50％可电离脂质、10％DSPC、38.5％胆固醇和1.5％PEG-2k-DMG。LNP囊封Cas9 mRNA和靶向TRAC基因的sgRNA并且通过流式细胞术针对T细胞受体表面蛋白的损失对编辑进行评估。
LNP一般如实施例1中所述进行制备，脂质组成比率分别表示为可电离脂质/DSPC/胆固醇/PEG的摩尔比。LNP递送编码Cas9 mRNA的mRNA(SEQ ID No.5)和靶向人TRAC的sgRNA(SEQ ID NO.10)。对于所测试的LNP，sgRNA与Cas9 mRNA的载荷比为按重量计1∶1。
如实施例1中所述针对平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA囊封效率对LNP制剂进行分析，并且结果示于表7中。
表7.LNP制剂分析结果
来自单个供体(W0106)的T细胞一般如实施例1中所述进行制备、活化和转染，除了非活化T细胞须在转染之前静置48小时。转染后七天，收获编辑的活化T细胞并如实施例1中所述通过流式细胞术进行表型分型。用浓度为0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL、0.25μg/mL、0.63μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL的LNP处理后测量CD3阴性T细胞的百分比。活化T细胞在每个LNP剂量下的平均CD3阴性T细胞百分比、最大百分比CD3值和EC50示于表8和图3A中，而非活化T细胞示于表9和图3B中。
表8.用不同可电离脂质所配制的LNP处理活化T细胞之后的CD3阴性细胞百分比
表9.用不同可电离脂质所配制的LNP处理非活化T细胞之后的CD3阴性细胞百分比
实施例5.NK细胞中的编辑
5.1.LNP制剂
如实施例1中所述来配制LNP，不同的是没有进行冷冻电子显微镜来表征LNP。LNP用以下配制：以约6的脂质胺与RNA磷酸酯(N∶P)摩尔比；针对组合物26和27，按重量计以1∶2的sgRNA与Cas9 mRNA的比率(载荷比)，或针对组合物25，按重量计以1∶1载荷比，以及化合物3或化合物8(十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯)，如表10中所示。LNP递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID No.4)和靶向人AAVS1基因的sgRNA(SEQ IDNO.11)。
LNP中的脂质组分通过与电雾式检测器(CAD)联用的HPLC定量分析。4种脂质组分的色谱分离通过反向HPLC来实现。HPLC脂质分析提供了以下实施例中所述的LNP制剂的每种组分的实际摩尔百分比(mol-％)脂质水平，如表10中所示。
表10.LNP组合物的脂质分析结果
根据如实施例1中所述的方法针对Z平均粒度和数量平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA囊封效率对LNP制剂进行分析，并且结果示于表11中。
表11.LNP制剂分析
使用EasySep人NK细胞分离试剂盒(STEMCELL，目录号17955)根据制造商方案从商购获得的来自健康供体的leukopak中分离NK细胞。分离之后，冷冻储存NK细胞直至需要。在细胞解冻之后，NK细胞在具有5％人AB血清(GemCell目录号100-512)、500U/mL IL-2(Peprotech，目录号200-02)、5ng/ml IL-15(Peprotech，目录号200-15)、10ml Glutamax(Gibco目录号35050-61)、10ml HEPES(Gibco，目录号15630-080)和1％青霉素-链霉素(ThermoFisher，目录号15140-122)的CTSTM OpTmizerTM T细胞扩增培养基(Gibco，目录号A10221-01)中静置过夜。然后将静置的NK细胞与表达41BBL(SEQ ID NO：12)的照射K562细胞以1：1比率培养并且膜结合IL21(SEQ ID NO：13)用作喂养细胞以用于在以上CTSTMOpTmizerTM T细胞扩增培养基中进行NK活化3天。
活化三天后，将NK细胞用递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO：4)和靶向AAVS1基因座的sgRNA(SEQ ID NO：11)的LNP处理。在以上具有2.5％人AB血清和0.25μM DNA依赖性蛋白激酶的小分子抑制剂的CTSTM OpTmizerTM T细胞扩增培养基中，以10μg/mL LNP与2.5μg/ml的ApoE3(Peprotech 350-02)混合开始，进行1∶2倍连续稀释系列来产生12-pt剂量反应曲线。
下文称作“DNAPKI化合物4”的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂是9-(4，4-二氟环己基)-7-甲基-2-((7-甲基-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基)氨基、)-7，9-二氢-8H-嘌呤-8-酮，也描绘为：
DNAPKI化合物4制备如下：
一般信息
所有试剂和溶剂均从商业供应商购买并按原样使用或根据所引用的程序合成。所有中间体和最终化合物均使用硅胶快速柱色谱来纯化。在Bruker或Varian 400MHz光谱仪上记录NMR光谱，并且在环境温度下的CDCl3中收集NMR数据。化学位移是相对于CDCl3(7.26)，以百万分率(ppm)报告。1HNMR的数据报告如下：化学位移、多重性(br＝宽峰，s＝单重峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝双重二重峰，dt＝双重三重峰，m＝多重峰)、耦合常数和积分。在具有电喷雾电离(ESI)源的Waters SQD2质谱仪上记录MS数据。最终化合物的纯度通过UPLC-MS-ELS，使用配备有SQD2质谱仪的Waters Acquity H-Class液相色谱仪器测定，所述SQD2质谱仪配备有光电二极管阵列(PDA)和蒸发光散射(ELS)检测器。
中间体1a：(E)-N，N-二甲基-N′-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
向4-甲基-5-硝基-吡啶-2-胺(5g，1.0当量)在甲苯(0.3M)中的溶液中添加DMF-DMA(3.0当量)。在110℃下搅拌混合物2h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且通过柱色谱纯化，得到呈黄色固体状的产物(59％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ8.82(s，1H)，8.63(s，1H)，6.74(s，1H)，3.21(m，6H)。
中间体1b：(E)-N-羟基-N′-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
向中间体1a(4g，1.0当量)在MeOH(0.2M)中的溶液中添加NH2OH·HCl(2.0当量)。在80℃下搅拌反应混合物1h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。将残余物分配于H2O与EtOAc之间，接着用EtOAc萃取2次。在减压下浓缩有机相，得到残余物，并且通过柱色谱纯化，得到呈白色固体状的产物(66％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ10.52(d，J＝3.8Hz，1H)，10.08(dd，J＝9.9，3.7Hz，1H)，8.84(d，J＝3.8Hz，1H)，7.85(dd，J＝9.7，3.8Hz，1H)，7.01(d，J＝3.9Hz，1H)，3.36(s，3H)。
中间体1c：7-甲基-6-硝基-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶
在0℃下向中间体1b(2.5g，1.0当量)在THF(0.4M)中的溶液中添加三氟乙酸酐(1.0当量)。在25℃下搅拌混合物18h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(44％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.53(s，1H)，8.49(s，1H)，7.69(s，1H)，2.78(d，J＝1.0Hz，3H)。
中间体1d：7-甲基-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-胺
向Pd/C(10％w/w，0.2当量)在EtOH(0.1M)中的混合物中添加中间体1c(1.0当量)和甲酸铵(5.0当量)。在105℃下加热混合物2h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱纯化残余物，得到呈淡棕色固体状的产物。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ8.41(s，2H)，8.07(d，J＝9.0Hz，2H)，7.43(s，1H)，2.22(s，3H)。
中间体1e：8-亚甲基-1，4-二氧杂螺[4.5]癸烷
在-78℃下向溴化甲基(三苯基)鏻(1.15当量)在THF(0.6M)中的溶液中逐滴添加n-BuLi(1.1当量)，并且在0℃下搅拌混合物1h。然后，将1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮(50g，1.0当量)添加至反应混合物。在25℃下搅拌混合物12h。在0℃下将反应混合物倒入NH4Cl水溶液中，用H2O稀释并用EtOAc萃取3次。在减压下浓缩合并的有机层，得到残余物，并且通过柱色谱纯化，得到呈无色油状物的产物(51％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.67(s，1H)，3.96(s，4H)，2.82(t，J＝6.4Hz，4H)，1.70(t，J＝6.4Hz，4H)。
中间体1f：7，10-二氧杂二螺[2.2.46.23]十二烷
在-40℃下向中间体4a(5g，1.0当量)在甲苯(3M)中的溶液中逐滴添加ZnEt2(2.57当量)并且在-40℃下搅拌混合物1h。然后在-40℃下在N2下将二碘甲烷(6.0当量)逐滴添加至混合物中。然后在N2氛围下在20℃下搅拌混合物17h。在0℃下将反应混合物倒入NH4Cl水溶液中并用EtOAc萃取2次。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱纯化残余物，得到呈淡黄色油状物的产物(73％)。
中间体1g：螺[2.5]辛-6-酮
向中间体4b(4g，1.0当量)在1∶1 THF/H2O(1.0M)中的溶液中添加TFA(3.0当量)。将混合物在20℃下在N2气氛下搅拌2h。在减压下浓缩反应混合物以去除THF，并且用2MNaOH(水溶液)将残余物调节至pH 7。将混合物倒入水中并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱纯化残余物，得到呈淡黄色油状物的产物(68％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.35(t，J＝6.6Hz，4H)，1.62(t，J＝6.6Hz，4H)，0.42(s，4H)。
中间体1h：N-(4-甲氧基苄基)螺[2.5]辛-6-胺
向中间体4c(2g，1.0当量)和(4-甲氧基苯基)甲胺(1.1当量)在DCM(0.3M)中的混合物中添加AcOH(1.3当量)。将混合物在20℃下在N2气氛下搅拌1h。然后，在0℃下向混合物中添加NaBH(OAc)3(3.3当量、)，并且在20℃下在N2气氛下搅拌混合物17h。在减压下浓缩反应混合物以去除DCM，并且将所得残余物用H2O稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱纯化残余物，得到呈灰色固体状的产物(51％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ7.15-7.07(m，2H)，6.77-6.68(m，2H)，3.58(s，3H)，3.54(s，2H)，2.30(ddt，J＝10.1，7.3，3.7Hz，1H)，1.69-1.62(m，2H)，1.37(td，J＝12.6，3.5Hz，2H)，1.12-1.02(m，2H)，0.87-0.78(m，2H)，0.13-0.04(m，2H)。
中间体1i：螺[2.5]辛-6-胺
向Pd/C(10％w//w，1.0当量)在MeOH(0.25M)中的悬浮液中添加中间体4d(2g，1.0当量)并且在80℃下在50Psi下在H2气氛下搅拌混合物24h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物，其通过柱色谱进行纯化，得到呈白色固体状的产物。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ2.61(tt，J＝10.8，3.9Hz，1H)，1.63(ddd，J＝9.6，5.1，2.2Hz，2H)，1.47(td，J＝12.8，3.5Hz，2H)，1.21-1.06(m，2H)，0.82-0.72(m，2H)，0.14-0.05(m，2H)。
中间体1j：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯
在N2下一次性向2，4-二氯嘧啶-5-羧酸乙酯(2.7g，1.0当量)和中间体1i(1.0当量)在ACN(0.5-0.6M)中的混合物中添加K2CO3(2.5当量、)。在20℃下搅拌混合物12h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(54％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ8.64(s，1H)，8.41(d，J＝7.9Hz，1H)，4.33(q，J＝7.1Hz，2H)，4.08(d，J＝9.8Hz，1H)，1.90(dd，J＝12.7，4.8Hz，2H)，1.64(t，J＝12.3Hz，2H)，1.52(q，J＝10.7，9.1Hz，2H)，1.33(t，J＝7.1Hz，3H)，1.12(d，J＝13.0Hz，2H)，0.40-0.21(m，4H)。
中间体1k：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基氨基)嘧啶-5-羧酸
向中间体1j(2g，1.0当量)在1：1THF/H2O(0.3M)中的溶液中添加LiOH(2.0当量)。在20℃下搅拌混合物12h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过2MHCl将残余物调节至pH 2，并且通过过滤收集沉淀物，用水洗涤，并且在真空中干燥。产物未经另外纯化即直接用于下一步骤中(82％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ13.54(s，1H)，8.38(d，J＝8.0Hz，1H)，8.35(s，1H)，3.82(qt，J＝8.2，3.7Hz，1H)，1.66(dq，J＝12.8，4.1Hz，2H)，1.47-1.34(m，2H)，1.33-1.20(m，2H)，0.86(dt，J＝13.6，4.2Hz，2H)，0.08(dd，J＝8.3，4.8Hz，4H)。
中间体11：2-氯-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7，9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体1k(1.5g，1.0当量)和Et3N(1.0当量)在DMF(0.3M)中的混合物中添加DPPA(1.0当量)。将混合物在120℃下在N2气氛下搅拌8h。将反应混合物倒入水中。通过过滤收集沉淀物，用水洗涤，并在真空下干燥，得到残余物，其未经另外纯化即直接用于下一步骤中(67％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ11.68(s，1H)，8.18(s，1H)，4.26(ddt，J＝12.3，7.5，3.7Hz，1H)，2.42(qd，J＝12.6，3.7Hz，2H)，1.95(td，J＝13.3，3.5Hz，2H)，1.82-1.69(m，2H)，1.08-0.95(m，2H)，0.39(tdq，J＝11.6，8.7，4.2，3.5Hz，4H)。
中间体1m：2-氯-7-甲基-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7，9-二-氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体11(1.0g，1.0当量)和NaOH(5.0当量)在1∶1 THF/H2O(0.3-0.5M)中的混合物中添加MeI(2.0当量)。在N2气氛下在20℃下搅拌混合物12h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，通过柱色谱对其进行纯化，得到呈淡黄色固体状的产物(67％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(s，1H)，4.03(tt，J＝12.5，3.9Hz，1H)，3.03(s，3H)，2.17(qd，J＝12.6，3.8Hz，2H)，1.60(td，J＝13.4，3.6Hz，2H)，1.47-1.34(m，2H)，1.07(s，1H)，0.63(dp，J＝14.0，2.5Hz，2H)，-0.05(s，4H)。
DNAPKI化合物4：7-甲基-2-((7-甲基-[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基)氨基)-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7，9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
将中间体1m(1.0当量)和中间体1d(1.0当量)、Pd(dppf)Cl2(0.2当量)、XantPhos(0.4当量)和Cs2CO3(2.0当量)在DMF(0.2-0.3M)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并且在130℃下在N2气氛下搅拌混合物12h。然后将混合物倒入水中并用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱纯化残余物，得到呈灰白色固体状的产物。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ9.09(s，1H)，8.73(s，1H)，8.44(s，1H)，8.16(s，1H)，7.78(s，1H)，4.21(t，J＝12.5Hz，1H)，3.36(s，3H)，2.43(s，3H)，2.34(dt，J＝13.0，6.5Hz，2H)，1.93-1.77(m，2H)，1.77-1.62(m，2H)，0.91(d，J＝13.2Hz，2H)，0.31(t，J＝7.1Hz，2H).MS：405.5m/z[M+H]。
LNP中总RNA载荷的最终浓度如表12中所指示为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005和0μg/ml(未处理的对照)。将混合的LNP以1：1比率一式三份添加至1×106个细胞/ml的NK细胞中。
在LNP处理之后七天，从细胞中分离基因组DNA并如实施例1中所述进行NGS分析。
在指定浓度下的LNP制剂的平均编辑百分比、标准差和EC50示于表12中，并且剂量反应曲线示于图4中。
表12.NK细胞中的平均编辑百分比
实施例6.单核细胞和巨噬细胞编辑
使用CD14微珠试剂盒(人)(Miltenyi Biotec，目录130-117-020)，按照制造商方案在MultiMACSTM Cell24 Separator Plus仪器(MiltenyiBiotec)上从商购获得的leukopak(Hemacare)分离CD14+细胞。将CD14+细胞解冻并在96孔非组织培养板(Falcon，351172)上在具有细胞密度为100万/mL的10ng/mL GM-CSF(Stemcell，78140.1)的如实施例1中所述的OpTmizer基础培养基中以50,000个细胞/孔一式三份培养。每2-3天，每孔50％的OpTmizer培养基用20ng/mL的新鲜细胞因子培养基(GM-CSF(Stemcell，78140.1)、2.5％HS OpTmizer(Gibco，A3705001))替换。
用如实施例10中所述制备的LNP处理细胞。将LNP在37℃下与10μg/ml的ApoE3(Peprotech 350-02)一起预孵育15分钟。将预孵育的LNP以1∶1体积/体积比率添加至细胞，产生0-1.25μg/mL的最终总RNA载荷剂量。
在将CD14+细胞接种在非组织培养板(Falcon，351172)上的同一天，在孵育后，将50μL LNP浓缩物添加至单核细胞，并且在非组织培养板(Falcon，351172)上孵育5天之后添加至巨噬细胞。在37℃下孵育单核细胞和巨噬细胞板直至使用。
在LNP处理后六天，如实施例1中所述从单核细胞分离出基因组DNA，并且如实施例1中所述收集巨噬细胞工程化的细胞用于NGS。
针对单核细胞在指定浓度下的每种LNP制剂的平均编辑百分比、标准差和EC50示于表13中，并且针对巨噬细胞则示于表14中。单核细胞和巨噬细胞的剂量反应曲线分别示于图5A和图5B中。
表13.用具有不同可电离脂质的LNP处理单核细胞之后六天的平均编辑百分比
表14.用具有不同可电离脂质的LNP处理巨噬细胞之后六天的平均编辑百分比
实施例7.B细胞编辑
7.1.B细胞分离和培养物以及培养基制备
将B细胞(Hemacare)培养于补充有1％青霉素-链霉素(ThermoFisher，目录号15140122)、1μg/ml CpG ODN 2006(Invivogen，目录号tlrl-2006-1)、50ng/ml IL-2(Peprotech，目录号200-02)、50ng/ml IL-10(Peprotech，目录号200-10)和10ng/ml IL-15(Peprotech，目录号200-15)的Stemspan SFEM培养基(StemCell Technologies，目录号09650)中。还使用具有可变浓度的以下两种培养基组分来补充培养基：1.人血清AB(GeminiBioproducts，目录号100-512，批次号H94X00K，2.5％和5％)和2.MEGACD40L(Enzo LifeSciences，目录号ALX-522-110-0000，1ng/ml和100ng/ml)。用于制备B细胞的B细胞培养基组成描述于表15中。
表15.B细胞培养基组成
使用StraightFrom Leukopak CD19微珠试剂盒(Miltenyi，130-117-021)在MultiMACS Cell24 Separator Plus仪器上根据制造商的说明，从来自健康人供体的leukopak(Hemacare)通过CD19正向选择分离B细胞。将分离的CD19+ B细胞冷冻储存在液氮中直至需要。
当准备使用时，将B细胞在B细胞培养基1中解冻并在同一天活化。
B细胞解冻和活化后两天，将B细胞在培养基2中培养并用递送Cas9 mRNA(SEQ IDNO：4)和靶向AAVS1的gRNA(SEQ ID NO：11)的LNP处理。通过设定1：2连续稀释，以20μg/ml总RNA载荷(4倍最终剂量、)开始，针对每种LNP测试若干浓度以产生8点剂量反应曲线。随后，在B细胞培养基2中添加4μg/ml ApoE3(4倍最终剂量)，然后以1∶1体积/体积比率将B细胞添加至LNP-APOE3混合物，产生5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μg/ml的最终剂量的总RNA载荷，如表16中所指示。用如实施例5中所述制备并分析的LNP处理细胞或不用LNP处理细胞以充当对照。
在LNP处理后三天，洗涤细胞并重悬于B细胞培养基3中。在LNP处理之后七天，收集细胞并如实施例1中所述进行NGS分析。
在指定浓度下的LNP制剂的平均编辑百分比和标准差示于表16中并且剂量反应曲线示于图6中。“未处理的B细胞”未用LNP制剂处理。
表16.用所述脂质组合物进行编辑后B细胞中的平均编辑百分比
在下表和其他各处中，术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”用于表示已用2′-O-Me修饰的核苷酸。
在下表中，“*”用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可用于表示用PS键连接至下一个(例如3′)核苷酸的核苷酸。
应理解，如果相对于RNA提及DNA序列(包含T)，则T应被U(取决于上下文，其可被修饰或未被修饰)替换，并且反之亦然。
在下表中，使用个单氨基酸字母代码来提供肽序列。
表17.序列表

Claims (191)

1.一种脂质组合物，其包含：
生物活性剂；和
脂质组分，其中所述脂质组分包含：
a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-50mol％；
b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约7-25mol％；
c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约39-65mol％；和
d)PEG脂质，其量为所述脂质组分的约0.5-1.8mol％；
其中所述可电离脂质为式(I)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基或C7-11无支链炔基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
2.一种脂质组合物，其包含：
生物活性剂；和
脂质组分，其中所述脂质组分包含：
a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-50mol％；
b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约7-25mol％；
c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约39-65mol％；和
d)PEG脂质，其量为所述脂质组分的约0.5-1.8mol％；
其中所述可电离脂质为式(I)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
X2是或不存在，条件是如果X2是则R2不是烷氧基；
Z1是C2-3亚烷基；
Z2选自-OH、-NHC(＝O)OCH3和-NHS(＝O)2CH3；
R1是C7-9无支链烷基；并且
每个R2独立地是C8烷基或C8烷氧基；
或其盐。
3.如权利要求1或2所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质是式(II)化合物
其中
X1是C6-7亚烷基；
Z1是C2-3亚烷基；
R1是C7-9无支链烷基；并且
每个R2独立地是C8烷基；
或其盐。
4.一种脂质组合物，其包含：
生物活性剂；和
脂质组分，其中所述脂质组分包含：
a)可电离脂质，其量为所述脂质组分的约25-50mol％；
b)中性脂质，其量为所述脂质组分的约7-25mol％；
c)辅助脂质，其量为所述脂质组分的约39-65mol％；和
d)PEG脂质，其量为所述脂质组分的约0.5-1.8mol％；
其中所述可电离脂质是
或其盐。
5.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质是
或其盐。
6.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质是
或其盐。
7.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质是不带电脂质或两性离子脂质。
8.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质是DSPC或DPME。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质选自胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。
11.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。
12.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质包含二肉豆蔻酰基甘油(DMG)。
13.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质包含PEG-2k。
14.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质是PEG-DMG。
15.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质是PEG-2k DMG。
16.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质是
所述中性脂质是DSPC；所述辅助脂质是胆固醇；并且所述PEG脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
17.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约30-45mol％。
18.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约30-40mol％。
19.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约30mol％。
20.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约40mol％。
21.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约50mol％。
22.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10-20mol％。
23.如权利要求1至21中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10-15mol％。
24.如权利要求1至21中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10mol％。
25.如权利要求1至21中任一项所述的脂质组合物，其中所述中性脂质的量为所述脂质组分的约15mol％。
26.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约50-60mol％。
27.如权利要求1至25中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约39-59mol％。
28.如权利要求1至25中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约43.5-59mol％。
29.如权利要求1至25中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约59mol％。
30.如权利要求1至25中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约43.5mol％。
31.如权利要求1至25中任一项所述的脂质组合物，其中所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约39mol％。
32.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约0.9-1.6mol％。
33.如权利要求1至31中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1-1.5mol％。
34.如权利要求1至31中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1mol％。
35.如权利要求1至31中任一项所述的脂质组合物，其中所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1.5mol％。
36.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约27-40mol％；所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10-20mol％；所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约50-60mol％；并且所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约0.9-1.6mol％。
37.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约30-45mol％；所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10-15mol％；所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约39-59mol％；并且所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1-1.5mol％。
38.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约30mol％；所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10mol％；所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约59mol％；并且所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1-1.5mol％。
39.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约40mol％；所述中性脂质的量为所述脂质组分的约15mol％；所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约43.5mol％；并且所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1.5mol％。
40.如权利要求1至16中任一项所述的脂质组合物，其中所述可电离脂质的量为所述脂质组分的约50mol％；所述中性脂质的量为所述脂质组分的约10mol％；所述辅助脂质的量为所述脂质组分的约39mol％；并且所述PEG脂质的量为所述脂质组分的约1mol％。
41.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中每个mol％变化小于5％。
42.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中每个mol％变化小于1％。
43.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中每个mol％变化小于0.5％。
44.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中每个mol％基于所述可电离脂质、所述中性脂质、所述辅助脂质和所述PEG脂质的相对标称浓度。
45.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中每个mol％基于所述可电离脂质、所述中性脂质、所述辅助脂质和所述PEG脂质的相对实际浓度。
46.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的Z平均直径小于约100mm。
47.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的Z平均直径小于约95nm。
48.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的Z平均直径小于约90nm。
49.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的数量平均直径大于约45nm。
50.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的数量平均直径大于约50nm。
51.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物呈LNP形式；并且所述LNP的多分散性指数为约0.005至约0.75。
52.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述LNP组合物呈LNP形式；并且所述LNP的多分散性指数为约0.005至约0.1。
53.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物的N/P比为约5至约7。
54.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物的N/P比为约6。
55.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含非核酸组分。
56.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含或编码治疗活性蛋白。
57.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含或编码基因组编辑工具。
58.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含或编码一种或多种能够在DNA或RNA中产生单链或双链断裂的核酸酶。
59.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含核酸组分。
60.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述生物活性剂包含RNA。
61.如权利要求60所述的脂质组合物，其中所述RNA是mRNA。
62.如权利要求61所述的脂质组合物，其中所述核酸组分包含编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA。
63.如权利要求62所述的脂质组合物，其中所述mRNA包含Cas核酸酶mRNA。
64.如权利要求62所述的脂质组合物，其中所述mRNA包含2类Cas核酸酶mRNA。
65.如权利要求62所述的脂质组合物，其中所述mRNA包含Cas9核酸酶mRNA。
66.如权利要求59至65中任一项所述的脂质组合物，其中所述核酸组分包含修饰的RNA。
67.如权利要求59至66中任一项所述的脂质组合物，其中所述核酸组分包含引导RNA核酸。
68.如权利要求67所述的脂质组合物，其中所述引导RNA核酸是gRNA。
69.如权利要求67或68所述的脂质组合物，其中所述引导RNA核酸是或编码双引导RNA(dgRNA)。
70.如权利要求67或68所述的脂质组合物，其中所述引导RNA核酸是RNA或编码单引导RNA(sgRNA)。
71.如权利要求68至70中任一项所述的脂质组合物，其中所述gRNA是修饰的gRNA。
72.如权利要求71所述的脂质组合物，其中所述修饰的gRNA在5′端处包含前五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
73.如权利要求71或72所述的脂质组合物，其中所述修饰的gRNA在3′端处包含最后五个核苷酸中的一个或多个处的修饰。
74.如权利要求59至73中任一项所述的脂质组合物，其中所述核酸组分包含引导RNA核酸；所述mRNA是2类Cas核酸酶mRNA；并且所述mRNA与所述引导RNA核酸的比率为按重量计约2：1至1：4。
75.如权利要求74所述的脂质组合物，其中所述引导RNA核酸与所述2类Cas核酸酶mRNA的比率为按重量计约1：1。
76.如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物，其中所述脂质组合物是LNP组合物。
77.一种基因编辑方法，其包括使细胞与如前述权利要求中任一项所述的脂质组合物接触。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述基因编辑引起基因敲除。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述基因编辑引起基因校正。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述基因编辑引起插入。
81.一种裂解DNA的方法，其包括使细胞与如权利要求1至76中任一项所述的脂质组合物接触。
82.一种将生物活性剂递送至细胞的方法，其包括使所述细胞与如权利要求1至76中任一项所述的脂质组合物接触。
83.如权利要求77至82中任一项所述的方法，其中所述接触步骤产生单链DNA切口。
84.如权利要求77至82中任一项所述的方法，其中所述接触步骤产生双链DNA断裂。
85.如权利要求77至84中任一项所述的方法，其还包括将至少一种模板核酸引入到所述细胞。
86.如权利要求77至85中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述脂质组合物施用至所述细胞。
87.如权利要求77至86中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物是第一脂质组合物，并且所述方法还包括使所述细胞与包含mRNA、gRNA和gRNA核酸中的一种或多种的第二脂质组合物接触。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述第二脂质组合物是如权利要求1至76中任一项所述的第二脂质组合物。
89.如权利要求87或88所述的方法，其中所述第一脂质组合物和所述第二脂质组合物同时施用。
90.如权利要求87或88所述的方法，其中所述第一脂质组合物和第二脂质组合物依序施用。
91.如权利要求87至90中任一项所述的方法，其中所述第一脂质组合物包含第一gRNA并且所述第二脂质组合物包含第二gRNA，其中所述第一gRNA和第二gRNA包含与不同靶序列互补的不同引导序列。
92.如权利要求77至91中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
94.如权利要求77至93中任一项所述的方法，其中所述细胞适用于过继细胞疗法(ACT)。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述细胞适用于自体细胞疗法。
96.如权利要求77至95中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。
98.如权利要求77至97中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述免疫细胞是白细胞或淋巴细胞。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。
103.如权利要求100所述的方法，其中所述淋巴细胞是活化T细胞。
104.如权利要求100所述的方法，其中所述淋巴细胞是非活化T细胞。
105.如权利要求77至104中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述脂质组合物体外接触。
106.如权利要求77至105中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述脂质组合物离体接触。
107.如权利要求77至106中任一项所述的方法，其中所述方法包括使动物的组织与所述脂质接触。
108.如权利要求77至107中任一项所述的方法，其中所述方法包括向动物施用所述脂质组合物。
109.如权利要求107或108所述的方法，其中所述动物是人。
110.如权利要求77至109中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物包含靶向降低或消除T细胞受体、MHC I类或MHC II类表面表达的基因的gRNA。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述脂质组合物包含靶向TRAC的gRNA。
112.如权利要求110所述的方法，其中所述脂质组合物包含靶向TRBC的gRNA。
113.如权利要求110所述的方法，其中所述脂质组合物包含靶向CIITA的gRNA。
114.如权利要求110所述的方法，所述脂质组合物包含靶向HLA-A的gRNA。
115.如权利要求110所述的方法，所述脂质组合物包含靶向HLA-B的gRNA。
116.如权利要求110所述的方法，所述脂质组合物包含靶向HLA-C的gRNA。
117.如权利要求110所述的方法，所述脂质组合物包含靶向B2M的gRNA。
118.一种在细胞中产生多个基因组编辑的方法，其包括
使所述细胞与至少如权利要求1至76中任一项所述的第一脂质组合物和如权利要求1至75中任一项所述的第二脂质组合物体外接触，
其中所述第一脂质组合物的生物活性剂包含针对第一靶序列的第一引导RNA(gRNA)和任选的核酸基因组编辑工具，并且
所述第二脂质组合物的生物活性剂包含针对第二靶序列的第二gRNA和任选的核酸基因组编辑工具
从而在所述细胞中产生多个基因组编辑。
119.如权利要求118所述的方法，其还包括使所述细胞与如权利要求1至76中任一项所述的第三脂质组合物接触，其中所述第三脂质组合物的生物活性剂包含针对第三靶序列的第三gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
120.如权利要求119所述的方法，其还包括使所述细胞与如权利要求1至76中任一项所述的第四脂质组合物接触，其中所述第四脂质组合物的生物活性剂包含针对第四靶序列的第四gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
121.如权利要求120所述的方法，其还包括使所述细胞与如权利要求1至76中任一项所述的第五脂质组合物接触，其中所述第五脂质组合物的生物活性剂包含针对第五靶序列的第五gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
122.如权利要求121所述的方法，其还包括使所述细胞与如权利要求1至76中任一项所述的第六脂质组合物接触，其中所述第六脂质组合物的生物活性剂包含针对第六靶序列的第六gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
123.如权利要求118至122中任一项所述的方法，其中所述细胞与至少一种包含基因组编辑工具的脂质组合物接触。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述基因组编辑工具包含编码RNA引导的DNA结合剂的核酸。
125.如权利要求118至124中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步与供体核酸接触以用于插入靶序列中，任选地其中所述供体核酸以载体形式提供。
126.如权利要求118至125中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物依序施用。
127.如权利要求118至125中任一项所述的方法，其中至少两种脂质组合物同时施用。
128.如权利要求118至127中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
130.如权利要求118至129中任一项所述的方法，其中所述细胞适用于过继细胞疗法(ACT)。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述细胞适用于自体细胞疗法。
132.如权利要求118至131中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。
134.如权利要求118至133中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述免疫细胞是白细胞或淋巴细胞。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。
138.如权利要求134所述的方法，其中所述免疫细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、粒细胞、原代免疫细胞、CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、B细胞、NK细胞和树突状细胞(DC)。
139.如权利要求134所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述细胞是活化T细胞。
141.如权利要求139所述的方法，其中所述细胞是非活化T细胞。
142.如权利要求125所述的方法，其中所述细胞是T细胞，并且所述供体核酸包含与T细胞受体序列的对应区域具有同源性的区域。
143.如权利要求118至142中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA。
144.如权利要求118至143中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA。
145.如权利要求118至144中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA。
146.如权利要求118至145中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC II类表面表达的基因的gRNA。
147.如权利要求118至146中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA。
148.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
149.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC II类表面表达的基因的gRNA。
150.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
151.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除T细胞受体的表面表达的基因的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
152.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
153.如权利要求118至147中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除T细胞受体的表面表达的基因的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
154.如权利要求118至153中任一项所述的方法，其还包括体外扩增所述细胞。
155.一种在细胞群体中产生多个基因组编辑的方法，其包括以下步骤：
a)使所述细胞群体与至少如权利要求1至76中任一项所述的第一脂质组合物和如权利要求1至76中任一项所述的第二脂质组合物体外接触，
其中所述第一脂质组合物的生物活性剂包含针对第一靶序列的第一引导RNA(gRNA)和任选的核酸基因组编辑工具，并且
所述第二脂质组合物的生物活性剂包含针对第二靶序列的第二gRNA和任选的核酸基因组编辑工具；
从而在所述细胞群体中产生多个基因组编辑。
156.如权利要求155所述的方法，其还包括使所述细胞群体与如权利要求1至76中任一项所述的第三脂质组合物接触，其中所述第三脂质组合物的生物活性剂包含针对第三靶序列的第三gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
157.如权利要求156所述的方法，其还包括使所述细胞群体与如权利要求1至76中任一项所述的第四脂质组合物接触，其中所述第四脂质组合物的生物活性剂包含针对第四靶序列的第四gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
158.如权利要求157所述的方法，其还包括使所述细胞群体与如权利要求1至76中任一项所述的第五脂质组合物接触，其中所述第五脂质组合物的所述生物活性剂包含针对第五靶序列的第五gRRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
159.如权利要求158所述的方法，其还包括使所述细胞群体与如权利要求1至76中任一项所述的第六脂质组合物接触，其中所述第六脂质组合物的生物活性剂包含针对第六靶序列的第六gRNA和任选的核酸基因组编辑工具。
160.如权利要求155至159中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与至少一种包含基因组编辑工具的脂质组合物接触。
161.如权利要求160所述的方法，其中所述基因组编辑工具包含编码RNA引导的DNA结合剂的核酸。
162.如权利要求155至161中任一项所述的方法，其中所述细胞群体进一步与供体核酸接触以用于插入靶序列中，任选地其中所述供体核酸以载体形式提供。
163.如权利要求155至162中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物依序施用。
164.如权利要求155至162中任一项所述的方法，其中至少两种脂质组合物同时施用。
165.如权利要求155至164中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是真核细胞群体。
166.如权利要求166所述的方法，其中所述细胞群体是人细胞群体。
167.如权利要求155至166中任一项所述的方法，其中所述细胞群体适用于过继细胞疗法(ACT)。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述细胞群体适用于自体细胞疗法。
169.如权利要求155至168中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是干细胞群体。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述干细胞群体是造血干细胞(HSC)群体或诱导性多能干细胞(iPSC)群体。
171.如权利要求155至170中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是免疫细胞群体。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述免疫细胞群体是白细胞群体或淋巴细胞群体。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述免疫细胞群体是淋巴细胞群体。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述淋巴细胞群体是T细胞群体、B细胞群体或NK细胞群体。
175.如权利要求171所述的方法，其中所述免疫细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞、粒细胞、原代免疫细胞、CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、B细胞、NK细胞和树突状细胞(DC)。
176.如权利要求171所述的方法，其中所述细胞群体是T细胞群体。
177.如权利要求176所述的方法，其中所述细胞是活化T细胞。
178.如权利要求176所述的方法，其中所述细胞是非活化T细胞。
179.如权利要求162所述的方法，其中所述细胞群体是T细胞群体，并且所述供体核酸包含与T细胞受体序列的对应区域具有同源性的区域。
180.如权利要求155至179中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA。
181.如权利要求155至180中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA。
182.如权利要求155至181中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA。
183.如权利要求155至182中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC II类表面表达的基因的gRNA。
184.如权利要求155至183中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA。
185.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
186.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC II类表面表达的基因的gRNA。
187.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向TRBC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
188.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除T细胞受体的表面表达的基因的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
189.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向TRAC的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向HLA-A的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
190.如权利要求155至184中任一项所述的方法，其中所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除T细胞受体的表面表达的基因的gRNA，所述脂质组合物中的一种包含靶向降低或消除MHC I类表面表达的基因的gRNA，并且所述脂质组合物中的一种包含靶向CIITA的gRNA。
191.如权利要求155至190中任一项所述的方法，其还包括体外扩增所述细胞群体。
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