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CN117467733B - 高手性纯度西格列汀及使用固定化转氨酶制备的方法 - Google Patents

高手性纯度西格列汀及使用固定化转氨酶制备的方法 Download PDF

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CN117467733B CN202311820581.9A CN202311820581A CN117467733B CN 117467733 B CN117467733 B CN 117467733B CN 202311820581 A CN202311820581 A CN 202311820581A CN 117467733 B CN117467733 B CN 117467733B
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Abstract

本发明涉及高手性纯度西格列汀及使用固定化转氨酶制备的方法。其中制备磷酸西格列汀一水合物的方法包括如下步骤：将双酮化合物在溶剂中在磷酸吡多醛和异丙胺、固定化转氨酶的存在下反应，反应滤渣作为固定化转氨酶待下一批次使用；向滤液有机相中滴加磷酸，滤取沉淀，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物。所述固定化转氨酶包含R‑转氨酶液、磷酸二氢钾、磷酸吡哆醛和酶固化颗粒物。本发明固定化转氨酶可以1~50使用后回收套用于下一批次。本发明还涉及用于制备磷酸西格列汀一水合物所用的固定化转氨酶，还涉及制备该固定化转氨酶的方法。本发明的固定化酶的重复利用率高、固定化酶的生产成本极低，转化产物的光学纯度和归一化纯度高。

Description

高手性纯度西格列汀及使用固定化转氨酶制备的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种将双酮化合物通过使用固定化转氨酶生物催化转化成氨基酮化合物的方法，尤其涉及一种高手性纯度西格列汀以及使用固定化转氨酶生物催化制备该高手性纯度西格列汀的方法，本发明进一步涉及一种用于制备该高手性纯度西格列汀的固定化转氨酶。
背景技术
作为二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂的西格列汀(Sitagliptin，亦常称为西他列汀)，其分子式为C16H15F6N5O，分子量为407.3，CAS登记号486460-32-6。西格列汀是2006年10月首个获得美国食品药品管理局(FDA)批准的用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶-IV(DDP-4)抑制剂类药物，该药由Merck & Co., Inc.开发，商品名为JANUVIA®。临床研究表明，西格列汀作为单药治疗II型糖尿病患者，可使糖化血红蛋白(HbA1C)水平显著降低。与二甲双胍或TZDs联合应用时，具有显著的辅助治疗作用，能针对II型糖尿病的三种主要缺陷：胰岛素抵抗、β细胞功能障碍、以及α细胞功能障碍发挥作用。
在临床上供药用的西格列汀通常以其磷酸盐一水合物(Sitagliptin phosphatemonohydrate)使用，该药用西格列汀的中文名为：7-[(3R)-3-氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氢-3-(三氟甲基)-1,2,4-三唑[4,3-a]吡嗪磷酸盐(1:1)单水合物，英文化学名称为：7-[(3R)-3-amino-1-oxo-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butyl]-5,6,7,8-tetrahydro-3-(trifluoromethyl)-1,2,4-triazolo[4,3-a]pyrazine phosphate(1:1) monohydrate，分子量为523.32，CAS登记号654671-77-9，其化学结构式为：
。
本发明提及的术语“西格列汀”一般地是指游离碱形式的分子式为C16H15F6N5O的西格列汀，当然在特别的语境中该术语还可以指分子式为C16H15F6N5O•H3PO4的磷酸西格列汀或者分子式为C16H15F6N5O•H3PO4•H2O的磷酸西格列汀一水合物。另外，本发明提及的术语“磷酸西格列汀”一般地是指分子式为C16H15F6N5O•H3PO4•H2O的磷酸西格列汀一水合物，当然在特别地语境中亦可指分子式为C16H15F6N5O•H3PO4(无水物，CAS登记号654671-78-0)的磷酸西格列汀。
西格列汀早先公开于WO03004498和US6699871(2003和2004，Merck & Co.)；西格列汀的酶抑制谱公开于D. Kim et al., J. Med. Chem. 48, 141(2005)；改进制备工艺公开于K. B. Hansen et al., Org. Process Res. Dev. 9, 634 (2005)；临床药代动力学和药效学参见G. A. Herman et al., Clin. Pharmacol. Ther. 78, 675(2005)；全面的综述可参见C. F. Deacon, Curr. Opin. Invest. Drugs 6, 419-426(2005)。
现有技术公开了一些制备西格列汀的方法。例如，US6699871公开的方法在方案1中加以概述，其涉及制备中间体(3R)-3-[N-(叔-丁氧基羰基)氨基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(07)和3-三氟甲基-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐(11)，随后通过它们的结合来获得Boc保护的西格列汀碱(12)，使用甲醇氢氯化物对其脱保护以获得西格列汀盐酸盐(13)。
WO2004/085661公开的制备方法中，其方案2描述了合成西格列汀游离碱(01)的方法，该方法涉及由米氏酸(Meldrum's)加合物(19)和3-三氟甲基-5,6,7,8-四氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐合成酮酰胺中间体(14)。中间体(14)用在异丙醇和乙酸中的(S)-苯基甘氨酸酰胺进一步处理以获得酰胺(15)，通过在催化剂PtO2存在下于90psi和22℃不对称氢化24小时，酰胺(15)被进一步转化为酰胺(16)。通过在氢氧化钯/碳存在下于40psi和50℃进行脱苄基反应使中间体(16)转化为西格列汀游离碱(01)。
US2006/194977之方案3记载，通过使用在甲醇中的乙酸铵，使由米氏酸加合物(19)和3-三氟甲基-5,6,7,8-四氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐(11)反应制备的中间体(14)进一步转化为烯胺(20)。使用Josiphos催化剂和氯代(1,5-环辛二烯)铑(I)二聚体通过不对称还原将烯胺(20)进一步转化为对映体富集的西格列汀游离碱(01)。该不对称合成涉及在200psi和50℃下使烯胺(20)氢化13小时以获得对映体富集的西格列汀游离碱(01)。
WO2004/087650公开了西格列汀游离碱(01)的合成方法，其方案4中记载，通过回流米氏加合物(19)/甲醇来合成4-(2,4,5-三氟苯基)乙酰乙酸甲酯(21)，使用二氯化钌和(S)-BINAP使形成的β-酮酯(21)经历不对称氢化以获得(3S)-4-(2,4,5-三氟苯基)-3-羟基丁酸(23)，其通过羟基中间体(24)进一步转化为氧氮杂环丁烷(oxazetidine)(25)，该氧氮杂环丁烷(25)被转化为(3R)-3-[(苄氧基)氨基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(26)，此化合物被进一步转化为对映体富集的西格列汀游离碱(01)和西格列汀二氢磷酸盐(02)。
随着生物技术的不断发展，酶固定化技术已成为工业生产中的重要手段。固定化酶具有稳定性高、可重复利用、易于分离等优点，因此在药物合成、生物燃料生产等领域得到了广泛应用。其中，固定化转氨酶在合成西格列汀等药物方面具有重要应用价值。固定化转氨酶是一种将转氨酶固定在载体上的技术，使得酶能够在特定条件下保持较高的活性和稳定性。使用固定化转氨酶合成西格列汀的工艺是一种新兴的生物制药合成方法，其在减轻环境保护压力、降低生产成本等方面具有潜在的优势。
现在技术已有一些关于通过使用固定化转氨酶将西格列汀的前体双酮化合物(该双酮化合物在本领域以及本发明中亦可称为底物或者反应底物或者催化底物或者酶催化底物等)通过生物催化转化成氨酮化合物即西格列汀的方法，具体反应过程如下所示：
。
中国专利申请号201710008432.0(CN106834376A，宏源)公开了一种酶催化合成西格列汀的方法以及装置，包括如下步骤：培育具有催化活性的转氨酶菌体细胞，对转氨酶菌体细胞进行破碎、水悬浮、离心得到粗酶液；采用渗透压稳定剂与氯化钠溶液配置成含有渗透压稳定剂的缓冲溶剂，向缓冲溶剂中加入海藻酸钠得到海藻酸钠溶液，取与海藻酸钠溶液等体积的粗酶液，将所取的粗酶液与海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液，将混合液逐滴加入氯化钙溶液中，同时还向氯化钙溶液中加入磷酸吡哆醛得到共混溶液，搅拌共混溶液3-48h，得到含球状化固定酶的氯化钙溶液；向含球状化固定酶的氯化钙溶液中加入硅藻土，控制体系的PH为7.5-9.0，得到混合体系，抽取混合体系中的水分，控制混合体系中的水分含量不大于40%；将底物溶于二甲基亚砜的水溶液中，并加入异丙胺盐酸盐得到反应用缓冲溶液；混合体系置于恒温反应容器中，将反应用缓冲溶液以循环流动的方式充入恒温反应容器中并与混合体系反应，得到西格列汀。据信该方法操作简单、转化效率高，环保且成本低廉。
中国专利申请号202210330110.9(CN114657170B，朗坤)公开了一种高稳定性固定化酶的制备方法，在按照常规方法制备的粗酶液中加入氨基树脂LXTE-700S过滤，然后加入硼酸缓冲液、磷酸吡哆醛，震荡反应；最后加入长程交联剂和短程交联剂，震荡反应后抽滤，即获得高稳定性固定化酶；所述环氧基交联剂为长程交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚及短程交联剂丙三醇三缩水甘油醚混合物，该发明还记载了使用该固定化转氨酶将双酮化合物进行酶催化转化制备西格列汀的试验。据信该发明提供的固定化酶的制备方法操作简单，可显著延长其储存及使用寿命，在酶催化工业中具有良好的应用前景。
中国专利申请号202310455056.5(CN116694697A，朗坤)公开了一种磷酸西他列汀一水合物的制备方法，该方法以双酮(CAS：764667-65-4)为原料，在固定化酶催化条件下和异丙胺发生转氨反应，生成西他列汀；然后加入稀磷酸成盐，结晶、纯化，即得磷酸西他列汀一水合物；该方法具体步骤如下：将双酮加入溶剂I(甲醇、乙醇和/或异丙醇)中，依次加入纯化水、固定化酶、异丙胺，于40-50℃反应后，过滤，取滤液于50-60℃浓缩至干，获得浓缩物；将浓缩物溶解于稀盐酸中，再加入溶剂II(乙酸乙酯、乙酸异丙酯和/或二氯甲烷)，溶液分层，取水相并向其中加入溶剂III(乙酸乙酯、乙酸异丙酯和/或二氯甲烷)，加入碱液调节pH值为11；然后取有机相于50-60℃浓缩至干，得西他列汀；将西他列汀溶解于溶剂IV(甲醇、乙醇和/或异丙醇与水3:1混合液)中，加入磷酸溶液，于72-80℃反应反应中产物溶解，然后降温到62-66℃，再加入磷酸西他列汀一水合物作为晶种；接着于60-65℃反应3h，然后降温到20-25℃保温反应2h；然后向反应体系中滴加溶剂I，再降温到0-10℃保温反应2h；然后抽滤，滤饼以溶剂I淋洗，然后将滤饼于40-45℃减压烘干，即得所述磷酸西他列汀一水合物。据信该发明方法操作简单，条件温和，适合大规模工业化生产。
然而，现有技术关于从双酮化合物经固定化转氨酶生物催化合成西格列汀的方法仍然存在不足，本领域仍然期待有新的方法从双酮化合物经固定化转氨酶生物催化合成西格列汀，并且期待这些方法呈现一个或者多个方面的有益效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从双酮化合物经固定化转氨酶生物催化合成西格列汀的方法仍然存在不足，本领域仍然期待有新的方法从双酮化合物经固定化转氨酶生物催化合成西格列汀，并且期待这些方法呈现一个或者多个方面的有益效果。
为此，本发明第一方面提供了一种固定化转氨酶，其包含如下组分：R-转氨酶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵、海泡石颗粒、聚乙烯醇。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.08~0.12mol、磷酸氢二钾0.1~0.14mol、氯化钙0.16~0.24mol、磷酸吡哆醛12~18g、四丁基氢氧化铵1.6~2.4g、海泡石颗粒400~600g、聚乙烯醇4~6g。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其中所述海泡石颗粒是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其中所述聚乙烯醇是型号为PVA17-88的聚乙烯醇。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、磷酸吡哆醛15g、四丁基氢氧化铵2g、海泡石颗粒500g、聚乙烯醇5g。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇4g。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇6g。
根据本发明第一方面所述的固定化转氨酶，其是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
进一步的，本发明第二方面提供了制备磷酸西格列汀一水合物的方法，其包括如下步骤：
(1)将0.1mol双酮化合物加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛8~12mmol、异丙胺盐酸盐0.4~0.6mol、首次使用或者本方法多次使用后回收套用的固定化转氨酶40~60g，在55~75°C下搅拌使物料回流反应12~18小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水洗涤，得到包含氨酮化合物的有机相；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.12~0.15mol磷酸，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇洗涤，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下组分：R-转氨酶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵、海泡石颗粒、聚乙烯醇。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.08~0.12mol、磷酸氢二钾0.1~0.14mol、氯化钙0.16~0.24mol、磷酸吡哆醛12~18g、四丁基氢氧化铵1.6~2.4g、海泡石颗粒400~600g、聚乙烯醇4~6g。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶中的海泡石颗粒是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶中的聚乙烯醇是型号为PVA17-88的聚乙烯醇。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、磷酸吡哆醛15g、四丁基氢氧化铵2g、海泡石颗粒500g、聚乙烯醇5g。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇4g。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇6g。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述多次使用后回收套用的固定化转氨酶是指使用1~50次后回收套用的固定化转氨酶。
根据本发明第二方面所述的方法，其中所述多次使用后回收套用的固定化转氨酶是指使用1~30次后回收套用的固定化转氨酶。
根据本发明第二方面所述的方法，其包括如下步骤：
(1)将0.1mol双酮化合物加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛10mmol、异丙胺盐酸盐0.5mol、首次使用或者本方法多次使用后回收套用的固定化转氨酶50g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水洗涤，得到包含氨酮化合物的有机相；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.13mol磷酸，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇洗涤，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物。
根据本发明第二方面所述的方法，其包括如下步骤：
(1)将0.1mol双酮化合物加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛8mmol、异丙胺盐酸盐0.6mol、首次使用或者本方法多次使用后回收套用的固定化转氨酶40g，在55°C下搅拌使物料回流反应18小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水洗涤，得到包含氨酮化合物的有机相；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.12mol磷酸，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇洗涤，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物。
根据本发明第二方面所述的方法，其包括如下步骤：
(1)将0.1mol双酮化合物加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛12mmol、异丙胺盐酸盐0.4mol、首次使用或者本方法多次使用后回收套用的固定化转氨酶60g，在75°C下搅拌使物料回流反应12小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水洗涤，得到包含氨酮化合物的有机相；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.15mol磷酸，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇洗涤，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物。
进一步的，本发明第三方面提供了制备固定化转氨酶的方法，所述固定化转氨酶包含如下组分：R-转氨酶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵、海泡石颗粒、聚乙烯醇，该方法包括如下步骤：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.08~0.12mol、磷酸氢二钾0.1~0.14mol、氯化钙0.16~0.24mol、磷酸吡哆醛12~18g、四丁基氢氧化铵1.6~2.4g、海泡石颗粒400~600g、聚乙烯醇4~6g。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述海泡石颗粒是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述聚乙烯醇是型号为PVA17-88的聚乙烯醇。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、磷酸吡哆醛15g、四丁基氢氧化铵2g、海泡石颗粒500g、聚乙烯醇5g。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇4g。
根据本发明第三方面所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇6g。
本发明任一方面的任一实施方案可以与其他任一实施方案组合，只要这种组合不产生矛盾。下面对本发明作进一步的说明。
在本发明中，涉及%时，若未特别说明，对于固体溶质与液体溶剂的情形，是重量/体积百分数，对于固体分布在固体中的情形，是重量/重量百分数。
西格列汀作为一种经典的二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂，临床上用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，其在2型糖尿病患者中可通过增加活性肠促胰岛激素的水平而改善血糖控制。肠促胰岛激素包括胰高糖素样多肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)，由肠道全天释放，并且在进餐后水平升高。肠促胰岛激素是参与葡萄糖内环境稳态生理学调控的内源性系统的一部分。当血糖浓度正常或升高时，GLP-1和GIP可通过涉及环磷腺苷的细胞内信号途径增加胰腺β细胞合成并释放胰岛素。在2型糖尿病动物模型中，GLP-1或DPP-4抑制剂治疗可以改善胰腺β细胞对葡萄糖的反应性并促进胰岛素的生物合成与释放。随着胰岛素水平的升高，组织对葡萄糖的摄取作用增加。此外，GLP-1还可以抑制胰腺α细胞分泌胰高糖素。胰高糖素浓度的降低和胰岛素水平的升高可降低肝葡萄糖生成，从而降低血糖水平。GLP-1和GIP的作用具有葡萄糖依赖性，当血糖浓度较低时，GLP-1不会促进胰岛素释放，也不会抑制胰高糖素分泌。当葡萄糖水平高于正常浓度时，GLP-1和GIP促进胰岛素释放的作用增强。此外，GLP-1不会损伤机体对低血糖的正常胰高糖素释放反应。GLP-1和GIP的活性受到DPP-4酶的限制，后者可以快速水解肠促胰岛激素，产生非活性产物。西格列汀能够防止DPP-4水解肠促胰岛激素，从而增加活性形式的GLP-1和GIP的血浆浓度。通过增加活性肠促胰岛激素水平，西格列汀能够以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素释放并降低胰高糖素水平。对于存在高血糖症的2型糖尿病患者，胰岛素和胰高糖素水平发生的上述变化可降低糖化血红蛋白A1c(HbA1c)并降低空腹血糖和餐后血糖水平。西格列汀的葡萄糖依赖性作用机制与磺酰脲类药物的作用机制不同，即使在葡萄糖水平较低时，磺酰脲类药物也可增加胰岛素分泌，从而在2型糖尿病患者和正常受试者人体中导致低血糖。西格列汀是一种有效和高度选择性的DPP-4酶抑制剂，在治疗浓度下不会抑制与DPP-4密切相关的DPP-8或DPP-9[许慧，等，西格列汀临床应用最新研究进展，济宁医学院学报，2014]。对西格列汀药代动力学特征的研究已经在健康受试者和2型糖尿病患者中广泛地进行。健康受试者口服给药100mg剂量后，西格列汀吸收迅速，服药1至4小时后血浆药物浓度达峰值(Tmax中值)。西格列汀的血药AUC与剂量成比例增加。健康志愿者单剂量口服100mg后，西格列汀的平均血药AUC为8.52μM·hr，Cmax为950nM，表观终末半衰期(t1/2)为12.4小时。服用西格列汀100mg达到稳态时的血浆AUC与初次给药相比增加约14%。个体自身和个体间西格列汀AUC的变异系数较小(5.8%和15.1%)。西格列汀在健康受试者和2型糖尿病患者中的药代动力学指标大体相似。
本领域技术人员公知，生物酶由于其特有的高催化效率、高特异选择性、温和的反应条件及更少的三废排放等优点，在制药工业中的现实效应不断扩大，尤其在过程替代、实现更绿色的制药工艺中发挥了重要作用，其重要地位获得了广泛认可。已用于产业化的生物酶包括羰基还原酶、醇脱氢酶、转氨酶、脂肪酶、酰化酶、腈水解酶等等，使用此类生物酶催化合成小分子化合物时，相比原有的化学转化或拆分工艺，在采用生物酶工艺后，反应总收率明显提高、大大缩短了反应时间、显著提高了产能、化学溶剂使用大幅减少、避免使用贵金属催化剂、降低了三废排放、符合国家绿色环保理念。上述生物酶是容易从市场购得的，例如，在本发明中，若未另外说明，所用的生物酶即转氨酶购自苏州东和盛昌生物科技有限公司或其关联公司江苏美科生物科技有限公司的R-转氨酶液(固态酶浓度10%，SDS-PAGE中目标蛋白所占百分比≥75%，目标蛋白中的有效蛋白含量≥85%)。
另外，西格列汀前体双酮化合物(CAS：764667-65-4)可以参考相关文献合成或者直接容易地从市场购得(例如湖北纳诺科技公司、安庆奇创公司等或者可以容易地从盖德化工网上获取购货来源).。
在本发明中，将转氨酶固定所使用的载体是海泡石(sepiolite)或其加工品，海泡石是含水硅酸镁盐的天然矿物质，其化学构造式为(Si12)(Mg8)O30(OH)4(OH2)4·8H2O，海泡石矿在我国分布较广，例如湖南湘潭、河北易县、江西乐平、河南内乡等地均有典型分布。优选的载体是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物，该颗粒在本文中称为海泡石煅烧颗粒或海泡石颗粒。本发明实施例1所用海泡石颗粒的成本极低，是例如现有技术使用的LXTE-700S树脂十分之一以下。
磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6的一种衍生物，是维生素B6参与蛋白质、脂肪和碳水化合物的多种代谢反应的一种活性形式。其是氨基酸代谢中的转氨酶及脱羧酶的辅酶，能促进谷氨酸脱羧，增进γ-氨基丁酸的生成。磷酸吡哆醛在所有转氨基作用反应以及一些氨基酸的脱羧与脱氨反应中充当辅酶的角色。磷酸吡哆醛的醛基与氨基转移酶中特定赖氨酸基团的ε-氨基之间形成希夫碱键(内部醛亚胺)。氨基酸底物中的α-氨基置换活性位点赖氨酸残基的ε-氨基。生成的外部醛亚胺变得去质子化而形成一个醌型中间体，后者转而在不同的位置上接受一个质子以形成一个酮亚胺。酮亚胺水解，使复合酶的氨基得到再生。除此之外，磷酸吡哆醛也是某些以不常见的糖(如过氧糖胺、脱氧糖胺)作为底物的转氨酶所需的辅因子。在这些反应中，磷酸吡哆醛与谷氨酸起反应，谷氨酸的α-氨基转移到磷酸吡哆醛上，生成磷酸吡哆胺(PMP)。磷酸吡哆胺接着转移它的氮到糖上，形成一个氨基糖。磷酸吡哆醛参与的生化过程还有：β-消除反应，如丝氨酸脱水酶与GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD)参与完成的反应；血红素合成中的缩合反应；多巴至多巴胺转化的反应；兴奋性递质谷氨酸于抑制性递质γ-氨基丁酸转化的反应；组氨酸(脱羧)至组胺转化的反应等等。本发明使用的磷酸吡哆醛可以容易的从市售途径获得。
已经出人预料的发现，通过使用本发明实施例1所述的固定化转氨酶，其在实施例2中进行双酮化合物至氨酮化合物的生物催化转化时呈现诸多有益的效果，例如固定化酶的重复利用率高、固定化酶的生产成本极低，并且转化产物的光学纯度高，终产物的归一化纯度高。
附图说明
图1：氨酮化合物的典型HPLC图。
图2：前体双酮化合物的典型HPLC图。
图3：R-西格列汀和S-西格列汀典型的混合物色谱图，图中S-sit为S-西格列汀，R-sit为R-西格列汀。
图4：R-西格列汀磷酸盐一水合物供试品的典型色谱图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
本发明下面的试验中，各物料的投料量可以根据具体需求按比例放大或者缩减。
试验例1：HPLC法测定双酮化合物和氨酮化合物的含量
本试验方法可用于测定原料双酮化合物的含量，亦可用于测定氨酮化合物或其磷酸盐或其水合物的含量。
色谱条件与系统适用性试验：用氰基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(INERTSILCN-3，5µm，4.6×250mm)，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至2.0)-乙腈(17:3)为流动相，柱温30°C，检测波长为225nm；
对照品溶液的制备：称取磷酸西格列汀对照品或双酮化合物对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制至每1m1中约含相当于西格列汀80µg或双酮化合物80µg的溶液，摇匀即得；
供试品溶液的制备：取供试品(双酮化合物、氨酮化合物或磷酸西格列汀一水合物)适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制至每1m1中约含相当于西格列汀80µg或双酮化合物80µg的溶液，摇匀即得；
测定法：取供试品溶液与对照品溶液各20µl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中西格列汀的含量(西格列汀与磷酸西格列汀一水合物的换算因子为0.7783)。测定氨酮化合物时以西格列汀对照品溶液计算并折算。
使用本试验例方法测定，氨酮化合物的典型HPLC见图1，前体双酮化合物的典型HPLC图见图2。
试验例2：HPLC法测定磷酸西格列汀一水合物的光学纯度
本试验方法可用于测定磷酸西格列汀一水合物的光学纯度。
色谱柱：Chirapak AD-H柱(5µm，4.6×250mm)，柱温30°C，
流动相：含0.2%二乙胺的庚烷-乙腈(3：7)溶液，流速0.8ml/min，
检测波长：268nm，进样量20µl；
称取S-西格列汀对照品和R-西格列汀对照品(购自Sigma-Aldrich)各5mg，分别加流动相10ml溶解制备贮备液，取各贮备液2ml加2ml流动相稀释，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，S-西格列汀保留时间约6.9min，R-西格列汀保留时间约8.2min；将两种贮备液以1:1的比例混合，得到混合溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，典型的混合物色谱图如图3所示；取磷酸西格列汀一水合物供试品5mg，加流动相20ml使溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，用面积归一化法计算光学纯度，典型的供试品色谱图如图4所示；由图3和图4的结果可见，两种异构体分离良好(分离度大于3)。
实施例1：固定化转氨酶的制备
(1)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液(1L，10%，相当于包含固态酶粉100g)中加入磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、15g磷酸吡哆醛、2g四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(2)接着将该混合液加至500g海泡石颗粒(海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物)中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(3)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇(PVA17-88)溶液100ml，继续翻转容器使物料混合1小时；
(4)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶652g(每6.52g固定化转氨酶相当于1g固态酶粉)，4°C冷藏备用。
实施例2：使用固定化转氨酶将双酮化合物转化为氨酮化合物并制备磷酸西格列 汀一水合物
总体反应过程如下：
操作步骤如下：
(1)将40.63g双酮化合物(0.1mol，C16H12F6N4O2，Mr406.3)加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛2.47g(10mmol)、异丙胺盐酸盐47.8g(0.5mol)、实施例1所得固定化转氨酶50g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相；
[分取该有机相2ml使用试验例1的HPLC法测定，液相色谱保留时间主峰与西格列汀游离碱相符吻合，该氨酮化合物的典型HPLC图见图1，其前体双酮化合物的典型HPLC图见图2；根据所得有机相体积和有机相中检测到的氨酮化合物含量计算从双酮化合物到氨酮化合物的摩尔转化率为98.6%；分取该有机相20ml，用60mL饱和食盐水分3次洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到无色油状物，经测定，该油状物的核磁氢谱与西格列汀游离碱相符：1H NMR(400MHz，CDCl3) δ 1.86(b，2H)，2.61-2.73(m，2H)，2.78-2.95(m，2H)，3.98-4.39(m，5H)，4.95(s，1H)，4.96-5.09(m，1H)，6.89-6.91(m，1H)，6.98-7.03(m，1H)]
(3)在搅拌下向有机相中滴加15g磷酸(85%，0.13mol)，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇各洗涤2次，干燥，得到白色结晶性粉末为磷酸西格列汀一水合物(49.77g，0.0951mol，总摩尔收率95.1%。元素分析测定结果：C36.72%, H3.85%,F21.78%, N13.38%, O18.34%, P5.92%，熔点：215-217°，旋光度[α]D-74.4°(c=1.0，水中)，与文献报道的结果一致。使用试验例1的HPLC法测定该磷酸西格列汀一水合物的归一化纯度为99.83%，使用试验例2的HPLC法测定该磷酸西格列汀一水合物的光学纯度为99.67%。
实施例2a：使用固定化转氨酶将双酮化合物转化为氨酮化合物并制备磷酸西格列 汀一水合物
参考实施例2进行，操作步骤如下：
(1)将40.63g双酮化合物(0.1mol)加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1.98g(8mmol)、异丙胺盐酸盐57.4g(0.6mol)、实施例1所得固定化转氨酶40g，在55°C下搅拌使物料回流反应18小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定氨酮化合物的产量进而算得从双酮到氨酮的摩尔转化率为98.2%)；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.12mol磷酸(85%)，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇各洗涤2次，干燥，得到白色结晶性粉末为磷酸西格列汀一水合物(94.6mmol，总摩尔收率94.6%。产物的熔点：215-216°，旋光度[α]D-74.5°(c=1.0，水中)，归一化纯度为99.89%，光学纯度为99.55%。
实施例2b：使用固定化转氨酶将双酮化合物转化为氨酮化合物并制备磷酸西格列 汀一水合物
参考实施例2进行，操作步骤如下：
(1)将40.63g双酮化合物(0.1mol)加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛2.96g(12mmol)、异丙胺盐酸盐38.3g(0.4mol)、实施例1所得固定化转氨酶60g，在75°C下搅拌使物料回流反应12小时，趁热过滤；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定氨酮化合物的产量进而算得从双酮到氨酮的摩尔转化率为98.8%)；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.15mol磷酸(85%)，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇各洗涤2次，干燥，得到白色结晶性粉末为磷酸西格列汀一水合物(95.6mmol，总摩尔收率95.6%。产物的熔点：216-217°，旋光度[α]D-74.1°(c=1.0，水中)，归一化纯度为99.78%，光学纯度为99.72%。
从本发明实施例2以及实施例2a和实施例2b的结果可见，本发明方法固定化转氨酶催化效率高，所得产物具有优良的纯度，并且具有相当高的产率；另外，三个实例所用酶量稍有差异但是对转氨效率无明显差异，表明固定化转氨酶使用的量足够。
实施例3：考察固定化转氨酶的重复使用性能
(1)第1次使用固定化转氨酶：将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、实施例1所得固定化转氨酶5g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；滤渣(固定化转氨酶)离心至干；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率)；
(2)第2次使用固定化转氨酶：将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、上一步骤滤渣(固定化转氨酶)5g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；滤渣离心至干；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率)；[本步骤中，可通过增加上一步骤的总体投料量获得本步骤足够量的滤渣形式的固定化转氨酶，后续步骤滤渣形式的固定化转氨酶的投料量亦如此操作以保证试验能够执行]
(3)第3次使用固定化转氨酶：将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、上一步骤滤渣(固定化转氨酶)5g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；滤渣离心至干；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率)；
(4)第4次使用固定化转氨酶：将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、上一步骤滤渣(固定化转氨酶)5g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；滤渣离心至干；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率)；
依此类推继续执行反应，
(n)第n次使用固定化转氨酶：将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、上一步骤滤渣(固定化转氨酶)5g，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤；滤渣离心至干；滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率)。
依次执行上述各步骤的反应共20次，转化率分别为：(1)98.8%、(2)98.4%、(3)98.6%、(4)97.4%、(5)97.1%、(6)97.3%、(7)96.8%、(8)96.4%、(9)96.2%、(10)95.5%、(11)95.8%、(12)95.1%、(13)94.6%、(14)95.1%、(15)94.4%、(16)93.8%、(17)93.4%、(18)92.7%、(19)93.2%、(20)92.4%。结果表明，实施例1所得固定化转氨经过20次重复使用后从双酮到氨酮的摩尔转化率仍然可以达到92%以上，表明本发明固定化转氨酶可以大批次的使用。
由于实施例2步骤(3)操作规模与前两步骤相比在实际生产线上容易显著地放大，因此，若能将多个批次所得包含氨酮化合物的有机相混合，然后将该多批次有机相混合物料一次性执行步骤(3)的转盐，对于扩大生产规模是相当有益的，为此，执行如下试验：
将本实施例上述第1次至第20次使用固定化转氨酶所得包含氨酮化合物的有机相共20批物料混合，测定其中双酮化合物的含量，在搅拌下向混合有机相中滴加1.3当量磷酸(85%)，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次乙醇和异丙醇各洗涤2次，干燥，得到白色结晶性粉末为磷酸西格列汀一水合物。经测定，本成盐步骤的摩尔收率96.4%，所得磷酸西格列汀一水合物的熔点：215-216°，旋光度[α]D-74.6°(c=1.0，水中)，归一化纯度为99.79%，光学纯度为99.82%。这一结果表明，本发明方法特别适合工业化大生产。
实施例4：使用固定化转氨酶将双酮化合物转化为氨酮化合物
参考实施例1方法制备固定化转氨酶，各物料的投料用量改为：R-转氨酶液100ml、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇溶液8ml，其余操作条件与实施例1相同，得到固定化转氨酶记为固酶4a。
参考实施例1方法制备固定化转氨酶，各物料的投料用量改为：R-转氨酶液100ml、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇溶液12ml，其余操作条件与实施例1相同，得到固定化转氨酶记为固酶4b。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶4a，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为98.5%)。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶4b，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为98.1%)。本实施例的结果表明，适当调整各组成用量制得的固酶亦具有与实施例基本相同的氨基转化效果。
实施例5：使用固定化转氨酶将双酮化合物转化为氨酮化合物
参考实施例1配料和制法制备固定化转氨酶，不同的仅是不添加四丁基氢氧化铵，得到固定化转氨酶记为固酶5a；参考实施例1配料和制法制备固定化转氨酶，不同的仅是将聚乙烯醇替换为等浓度等添加量的海藻酸钠，得到固定化转氨酶记为固酶5b；参考实施例1配料和制法制备固定化转氨酶，不同的仅是将海泡石替换为等添加量的硅藻土，得到固定化转氨酶记为固酶5c；参照CN114657170B之说明书[0045]至[0048]所记载的方法用LXTE-700S树脂以及本发明实施例1所用R-转氨酶液制备得到固定化转氨酶记为固酶5d。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5a，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为68.5%)；将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5a，在35°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为63.8%)；将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5a，在35°C下搅拌使物料回流反应30小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为81.3%)。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5b，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为71.2%)；将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5b，在35°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为74.7%)；将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5b，在35°C下搅拌使物料回流反应30小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为85.6%)。这些结果预示固酶5a和固酶5b不宜在高温下使用，而降低温度并延长反应时间时转化率有所提高但仍不如实施例1固酶的效果。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、5g固酶5c，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为94.7%)；鉴于使用硅藻土制备的固酶5c的酮/氨转化效率尚可，本发明人参照本文实施例3的方法测定固酶5c的重复使用性能，结果连续4次重复使用后转化率即降至70%以下：(1)95.2%、(2)91.3%、(3)86.7%、(4)64.1%。上述结果预示固酶5c重复使用效果非常差。
将双酮化合物0.01mol加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚50ml搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛1mmol、异丙胺盐酸盐0.05mol、固酶5d(相当于由R-转氨酶液7.7ml所得的固酶5d的量，此用量与实施例2操作条件具有可比性)，在65°C下搅拌使物料回流反应15小时，趁热过滤，滤液冷却至室温，用水(1:1)洗涤3次，得到包含氨酮化合物的有机相(测定并计算从双酮到氨酮的摩尔转化率为97.3%)；该结果表明使用文献方法并用树脂制备得到的固酶其酮/氨转化效率较好，但不及本实施例1~2的效果，另外树脂的成本远比本发明海泡石高，因此总体效果明显比本发明实施例1-2差，尤其是工业上大批量生产时使用本发明实施例1~2的方案具有显著优势。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.制备磷酸西格列汀一水合物的方法，其包括如下步骤：
(1)将0.1mol双酮化合物加至反应瓶中，加入甲基叔丁基醚0.5L搅拌使溶解，接着加入磷酸吡多醛8~12mmol、异丙胺盐酸盐0.4~0.6mol、首次使用或者本方法多次使用后回收套用的固定化转氨酶40~60g，在55~75°C下搅拌使物料回流反应12~18小时，趁热过滤；所述双酮化合物为下式化合物：
；
(2)滤渣离心至干，作为回收的固定化转氨酶待下一批次使用；滤液冷却至室温，用水洗涤，得到包含氨酮化合物的有机相；所述氨酮化合物为下式化合物：
；
(3)在搅拌下向有机相中滴加0.12~0.15mol磷酸，在5~10°C温度下继续搅拌4小时，过滤，沉淀依次用乙醇和异丙醇洗涤，干燥，得到磷酸西格列汀一水合物；
其中，
所述多次使用后回收套用的固定化转氨酶是指使用1~20次后回收套用的固定化转氨酶；
所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.08~0.12mol、磷酸氢二钾0.1~0.14mol、氯化钙0.16~0.24mol、磷酸吡哆醛12~18g、四丁基氢氧化铵1.6~2.4g、海泡石颗粒400~600g、聚乙烯醇4~6g；
所述固定化转氨酶是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化转氨酶中的海泡石颗粒是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化转氨酶中的聚乙烯醇是型号为PVA17-88的聚乙烯醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、磷酸吡哆醛15g、四丁基氢氧化铵2g、海泡石颗粒500g、聚乙烯醇5g。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇4g。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化转氨酶包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇6g。
7.一种固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.08~0.12mol、磷酸氢二钾0.1~0.14mol、氯化钙0.16~0.24mol、磷酸吡哆醛12~18g、四丁基氢氧化铵1.6~2.4g、海泡石颗粒400~600g、聚乙烯醇4~6g；所述海泡石颗粒是海泡石经650-750°C煅烧所得直径1-3mm的颗粒物，所述聚乙烯醇是型号为PVA17-88的聚乙烯醇；该固定化转氨酶是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
8.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉100g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.1mol、磷酸氢二钾0.12mol、氯化钙0.2mol、磷酸吡哆醛15g、四丁基氢氧化铵2g、海泡石颗粒500g、聚乙烯醇5g。
9.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.012mol、磷酸氢二钾0.010mol、氯化钙0.024mol、1.2g磷酸吡哆醛、0.24g四丁基氢氧化铵、40g海泡石、聚乙烯醇4g。
10.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其包含如下比例的组分：包含固态酶粉10g的R-转氨酶液、磷酸二氢钾0.008mol、磷酸氢二钾0.014mol、氯化钙0.016mol、1.8g磷酸吡哆醛、0.16g四丁基氢氧化铵、60g海泡石、聚乙烯醇6g。
11.制备权利要求7-10任一项所述固定化转氨酶的方法，包括如下步骤：
(i)在5~10°C温度环境下，向R-转氨酶液中加入磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、磷酸吡哆醛、四丁基氢氧化铵，搅拌2小时使溶解；
(ii)接着将该混合液加至海泡石颗粒中，将盛装此固液混合物料的容器密封，通过翻转容器使物料混合1小时后静置24小时；
(iii)翻转容器使物料混合30min后再向此固液混合物料中加入5%聚乙烯醇溶液，继续翻转容器使物料混合1小时；
(iv)通过离心沥干水分至含水量小于5%，得固定化转氨酶。
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