CN117430614B

CN117430614B - 一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用

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Publication number: CN117430614B
Application number: CN202311753379.9A
Authority: CN
Inventors: 刘磊
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2023-12-20
Filing date: 2023-12-20
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2043-12-20
Also published as: CN117430614A

Abstract

本发明公开了一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用，属于生物医药技术领域。所述异喹啉类衍生物是一类新型的Pgk1激活剂，具有较高的Pgk1激活活性，效果强于目前本领域所用的特拉唑嗪，且不会出现抑制Pgk1的情况，临床上具有预防或治疗神经退行性疾病及代谢性疾病的潜力。

Description

一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用。

背景技术

脑组织糖代谢降低是多种神经退行性疾病发生的重要致病因素。

人体20-25%葡萄糖（glucose）是由脑组织消耗的，但脑组织的重量只占体重的2%左右，说明脑组织对能量需求巨大，是葡萄糖代谢(glucose metabolism，简称糖代谢)非常活跃的器官。然而，在老年脑组织中，葡萄糖代谢功能显著降低。大量研究表明，脑组织糖代谢降低早于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）患者出现临床症状10-15年。脑组织葡萄糖代谢降低是多种神经退行性疾病的共有的病理特征。为什么葡萄糖代谢对脑组织非常重要？首先，糖代谢是细胞产生能量(ATP)的主要通路，神经元作为身体中最活跃的细胞类型，需要大量ATP维持各种生理活动，如蛋白合成、蛋白或细胞器的长距离运输、产生动作电位、神经递质释放、胞饮、胞吐等。其次，ATP具有防止蛋白非特异性聚集的作用，称为“水溶助长剂”（hydrotrope）。在老年人群中，糖代谢降低将导致神经元ATP浓度显著下降，可低至1-2 mM；而正常人群的ATP水平处在8-10 mM；低浓度的ATP导致多种蛋白质发生病理性聚集，而高浓度的ATP可防止蛋白质非特异性聚集。因此，糖代谢降低是脑衰老的重要原因。提高糖代谢水平有望改善脑健康，预防、缓解、甚至逆转脑衰老。然而世界上尚未出现获得国际认可的、可提高糖代谢的临床药物。研究发现，白藜芦醇(Resveratrol)、二甲双胍(Metformin)、雷帕霉素(Rapamycin)、维生素B3 (Vitamin B3)、辅酶Q10 (Coenzyme Q10)、肌酸 (creatine) 、胰岛素 (Insulin)等只产生无效或少数人群中的临床效果。目前医学上广泛认可的脑和肌肉保护方式是运动和节食。运动、节食产生有益效果的原理主要是改善线粒体功能、增加多种器官中的糖代谢水平。

肌肉组织糖代谢降低是老年人群高发胰岛素抵抗的重要因素。

全球成年人糖尿病发病率在10%左右。糖尿病是一种老年相关疾病。一项研究显示，在20-39岁、40-59岁、60-74岁、及75岁人群中，糖尿病发病率分别为21.1%、47.0%、66.7%及75.7%（Cowie CC, Rust KF, Ford ES, et al. Full accounting of diabetesand pre-diabetes in the U.S. population in 1988-1994 and 2005-2006.Diabetes Care2009;32(2): 287-94.）。为什么老年人易患糖尿病？众所周知，人体中80%以上的血糖是由骨骼肌消耗的；而全身肌肉质量在40岁后每十年降低8%，70岁后每十年降低15%，导致高龄人群普遍患有肌少症。即使胰岛素水平正常，肌少症患者也无法通过骨骼肌代谢掉血糖，从而产生胰岛素抵抗。有研究发现，人体骨骼肌比重每增加10%，胰岛素抵抗风险可降低11%（Srikanthan P, Karlamangla AS. Relative muscle mass is inverselyassociated with insulin resistance and prediabetes. Findings from the thirdNational Health and Nutrition Examination Survey.J Clin Endocrinol Metab2011;96(9): 2898-903.）。除了肌少症，糖代谢功能降低可由线粒体损伤介导。多种因素可导致线粒体损伤，如脂肪酸堆积、氧化应激、基因突变、线粒体呼吸抑制剂等，这些因素皆可增加II型糖尿病风险（Sergi D, Naumovski N, Heilbronn LK, et al. Mitochondrial (Dys)function and Insulin Resistance: From Pathophysiological Molecular Mechanismsto the Impact of Diet.Front Physiol2019;10: 532.）。

事实上，糖代谢功能降低往往同时出现在患者的多种器官中，包括脑和肌肉组织。因此，神经退行性疾病和胰岛素抵抗常出现在同一患者身上。有研究发现，80%的阿尔茨海默病及58%帕金森病患者伴有糖尿病或胰岛素抵抗。

唑嗪类药物可通过靶向Pgk1、激活糖代谢，对神经退行性疾病具有预防和治疗作用。

唑嗪类(Quinazoline)药物是一类a1肾上腺素受体抑制剂，用于治疗前列腺增生或高血压。市场上常见的唑嗪类药物包括特拉唑嗪(terazosin，TZ)、阿夫唑嗪(alfuzosin)、及多沙唑嗪(dosazosin)。本团队前期研究发现，特拉唑嗪可结合磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase 1, Pgk1)。糖酵解通路(glycolysis)一共有十个酶，Pgk1是第七个，也是第一个产生ATP的酶。特拉唑嗪可激活Pgk1，进而激活糖酵解通路。糖酵解通路产生的丙酮酸(Pyruvate)进入线粒体三羧酸循环(TCA cycle)引起线粒体氧化磷酸化代谢增加，细胞生成大量ATP 。糖酵解通路与线粒体三羧酸循环的级联构成糖代谢途径。

研究表明，特拉唑嗪具有预防和治疗帕金森病、阿尔茨海默病和多系统萎缩症（multiple system atrophy）等小鼠及大鼠模型药效。这种药效获得了患者数据的支持。通过对多项流行病学进行分析，发现长期使用唑嗪类药物的人群发生帕金森病及帕金森病相关疾病的发病率显著降低；而其它类型的a1肾上腺素受体抑制剂，如坦索罗辛(tamsulosin)等，没有类似药效。

唑嗪类药物存在安全隐患，改造唑嗪类药物具有研究意义。

从原理上讲，一个激活糖代谢的药物应具有降血糖效果。多项临床试验结果显示，特拉唑嗪或多沙唑嗪确实可改善糖尿病患者的血糖血脂水平，但药效极为有限或无效。此外，没有报道观察到唑嗪类可降低小鼠或大鼠血糖。联合使用a1肾上腺素受体抑制剂 (特拉唑嗪)和b肾上腺素受体抑制剂 (普萘洛尔, propranolol)，不能影响大鼠血糖。这些结果说明，唑嗪类药物激活骨骼肌中的糖代谢药效较弱或无效。

特拉唑嗪、阿夫唑嗪、多沙唑嗪、坦索罗辛等肾上腺素受体抑制剂类药物，可产生多种副作用，如虹膜松弛综合征 (intraoperative floppy iris syndrome， IFIS) 、低血压、乏力、头晕、昏厥、视力模糊等，导致10-20%的患者终止用药。有研究发现，特拉唑嗪结合a1肾上腺素受体依赖于喹唑啉环上的一个氮原子，如果将该氮原子置换为碳原子，对a1肾上腺素受体的亲和力可降低1000倍以上。目前的研究显示，改造后的特拉唑嗪（TZ-md）依然具有激活Pgk1的作用，但不具有抑制a1肾上腺素受体的作用。

另外，低浓度特拉唑嗪可激活Pgk1、高浓度特拉唑嗪可抑制Pgk1。这个现象的原理是：特拉唑嗪结合到Pgk1蛋白的位点与底物ADP和产物ATP重合，因为特拉唑嗪与Pgk1的亲和力高于ADP 10倍以上，高剂量的特拉唑嗪更多结合到Pgk1蛋白上，从而抑制底物ADP的结合，因此抑制Pgk1酶活性。Pgk1酶反应的限速步骤是ATP从Pgk1蛋白上的解离，该解离过程占酶反应近96%的时间，特拉唑嗪与Pgk1的亲和力高于ATP 100倍以上。因此，低剂量特拉唑嗪可竞争掉ATP结合、加速Pgk1酶反应，产生激活Pgk1作用。最近的一项前瞻性临床试验发现，个别帕金森病患者使用特拉唑嗪治疗以后，出现脑组织和血液中的血红细胞的ATP水平下降的现象，不同于多数患者的ATP水平上升。这一结果说明，特拉唑嗪可能在这类患者中产生了抑制Pgk1的药效，可能性在血脑屏障被破坏的患者中容易产生。同时，现有的研究表明，在平均年龄70岁的人群中，13.5%的患者存在血脑屏障破坏现象。

综上所述，唑嗪类药物作为Pgk1激活剂，存在三方面弱点：1）激活骨骼肌糖代谢能力不足、缺乏降血糖疗效。也许唑嗪类药物不是激活Pgk1的最佳化合物。 2）唑嗪类药物抑制a1肾上腺素受体的作用具有多种不良副作用，导致部分患者终止用药。3）唑嗪类药物存在抑制Pgk1风险，导致治疗相关疾病无效。

发明内容

基于上述唑嗪类药物的三点不足，本发明提供了一种异喹啉类衍生物及其合成方法和应用。所述异喹啉类衍生物作为一类新型的Pgk1激活剂，具有较高的Pgk1激活活性，临床上具有预防或治疗神经退行性疾病及代谢性疾病的潜力。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案之一：提供一种异喹啉类衍生物，所述异喹啉类衍生物的结构通式如下：

上式中，A环代表一个可选被取代的五元含氧杂环；X为O或C，Y为O或C，且X和Y中至少含有一个O；R¹代表氢原子或甲基；R²代表氢原子或甲基；R³为五元环烷基或含1个杂原子的五元杂环基团，杂原子选自氧原子、氮原子；

所述异喹啉类衍生物的结构具体如下：

。

本发明技术方案之二：提供一种基于上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐。

优选地，所述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、三氟乙酸盐、醋酸盐、磷酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁二酸盐、苹果酸盐、苯甲酸、柠檬酸盐或乳酸盐。

本发明验证了盐酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐均与异喹啉类衍生物具有相同功效，其他药学上可接受的盐与所述异喹啉类衍生物应当同样具备相同的功效。

本发明技术方案之三：提供一种异喹啉类衍生物制剂，活性成分为上述异喹啉类衍生物和/或上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐。

优选地，所述制剂为上述异喹啉类衍生物或上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐与药学上可接受的辅料，如：水、酒精、植物油、淀粉、微晶纤维素、乳糖、明胶、硬脂酸镁、海藻酸钠、麦芽糊精、滑石、交联聚维酮、树胶和凡士林等辅料共同制备的各种类型的药物制剂。

本发明技术方案之四：提供一种磷酸甘油激酶激活剂，所述激活剂为：上述异喹啉类衍生物、上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐或上述异喹啉类衍生物制剂。

本发明技术方案之五：提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物，所述药物为：上述异喹啉类衍生物、上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐或上述异喹啉类衍生物制剂。

优选地，所述神经退行性疾病包括但不限于老年痴呆症、帕金森病、渐冻症或舞蹈症等。

本发明技术方案之六：提供一种用于治疗或预防代谢性疾病的药物，所述药物为：上述异喹啉类衍生物、上述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐或上述异喹啉类衍生物制剂。

优选地，所述代谢性疾病包括但不限于糖尿病或肥胖等。

本发明技术方案之七：提供一种上述异喹啉类衍生物的制备方法，包括以下合成路线：

合成路线A：

向化合物I的溶液中加入丙二酸和哌啶，反应后得到化合物II；化合物II在催化剂和H₂氛围下发生反应，制得化合物III；化合物III先与草酰氯反应生成酰氯，再于三氯化铝催化作用下得到化合物IV；化合物IV在酸性条件下与亚硝酸异戊酯反应后得到化合物V；化合物V与三氯氧磷反应，得到化合物VI；化合物VI在N-甲基吡咯烷酮中与氨基保护试剂反应，制得化合物VII；化合物VII、化合物XI、二氧六环、Pd₂(dba)₃、RuPhos和碳酸铯共同反应，制得化合物VIII；化合物VIII脱去Boc保护基得到化合物IX；化合物IX与R³-COOH反应制得化合物X；化合物X与三氟乙酸反应脱除氨基保护，制得所述异喹啉类衍生物化合物T；反应路线如下：

；

优选地，合成路线A中各步骤的反应温度和反应时间满足反应物的原料能够得到目标产物即可，并无特殊限定；

合成路线B：

化合物XI在溶剂中与R³-COOH、O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺反应制得化合物XII；化合物XII脱去Boc保护基得到化合物XIII；化合物XIII与参照合成路线A制备的化合物VII、二氧六环、Pd₂(dba)₃ 、RuPhos和碳酸铯共同反应，制得化合物X；化合物X与三氟乙酸反应脱除氨基保护，制得所述异喹啉类衍生物化合物T；反应路线如下：

；

优选地，合成路线B中各步骤的反应温度和反应时间满足反应物的原料能够得到目标产物即可，并无特殊限定；

合成路线C：

参照合成路线A制备的化合物VI和氨水反应制得化合物XIV；化合物XIV与氨基保护试剂反应得到化合物VII；化合物VII参照合成路线A的方法制得所述异喹啉类衍生物化合物T；反应路线如下：

；

优选地，合成路线C中各步骤的反应温度和反应时间满足反应物的原料能够得到目标产物即可，并无特殊限定；

所述合成路线A、合成路线B和合成路线C中涉及化合物的R⁴基为氨基保护基团。

本发明的有益技术效果如下：

本发明合成的异喹啉类衍生物及其盐经验证，可以通过靶向作用于Pgk1，进而激活Pgk1，达到治疗或预防神经退行性疾病及代谢性疾病的目的。效果强于特拉唑嗪，且不会出现抑制Pgk1的情况。

附图说明

图1为本发明实施例制备的各异喹啉类衍生物及特拉唑嗪对细胞ATP活性的影响。

图2为药物对Pgk1酶活性的体外生化实验结果，其中，A为阳性对照，不同浓度特拉唑嗪对Pgk1酶活性的影响；B为实验组，不同浓度T6对Pgk1酶活性的影响。

图3为不同浓度的化合物T6和特拉唑嗪对细胞中Pgk1酶活性的影响，其中，A为特拉唑嗪对细胞中Pgk1酶活性的影响，B为化合物T6对细胞中Pgk1酶活性的影响。

图4为不同浓度的化合物T6和特拉唑嗪对细胞中ATP水平的影响。

图5为本发明实施例制备的各异喹啉类衍生物及特拉唑嗪对小鼠血糖的影响。

图6为利拉鲁肽及不同浓度化合物T6对糖尿病模型小鼠血糖的影响。

图7为二甲双胍、特拉唑嗪及化合物T6对糖尿病模型小鼠血液中糖化血红蛋白、胰岛素含量及体重的影响，其中，A为糖化血红蛋白含量，B为胰岛素含量，C为体重变化。

图8为特拉唑嗪及不同浓度化合物T2对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的运动能力及体内酪氨酸羟化酶含量的影响，其中，A为各药物对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的运动能力的影响，B为特拉唑嗪对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠体内酪氨酸羟化酶含量的影响，C为剂量0.1 mg/Kg的化合物T2对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠体内酪氨酸羟化酶含量的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1：化合物T1-II的合成

将35 mLDMF加入250 mL茄形瓶中，搅拌下加入胡椒醛9.01 g (60 mmol)和丙二酸8.74 g (84.0 mmol)，然后加入哌啶0.66 g (7.8 mmol)。将所得淡棕色溶液于90℃油浴中搅拌10 h。降温至室温，加入纯水60 mL搅拌1 h，过滤，滤饼用纯水洗涤，并于室温下真空干燥，得8.67 g淡棕色中间体T1-II，收率：75.2 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 12.24 (brs, 1H), 7.52 (d, J = 15.9 Hz, 1H),7.37 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.16 (dd, J1 = 8.1 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H), 6.95 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.08 (s, 2H).

MS (C₁₀H₈O₄): 191.67 [M-H]^-, 383.85 [2M-H]^-.

实施例2：化合物T1-III的合成

将250 mL四氢呋喃加入500 mL茄形瓶中，搅拌下加入4.19 g (2.18 mmol)中间体T1-II和0.84 g钯炭，将所得混合物于室温下在氢气气氛中搅拌反应20h。反应混合物通过硅藻土过滤，滤液减压浓缩，残余物用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得2.97 g白色中间体T1-III，收率：70.1 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，CDCl3) δ 11.81 (brs, 1H), 6.74 (d, J = 7.9 Hz, 1H),6.70 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.66 (dd, J1 = 7.9 Hz, J2 = 1.7 Hz, 1H), 5.93 (s,2H), 2.88 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 7.8 Hz, 2H).

MS (C₁₀H₁₀O₄): 193.57 [M-H]^-, 387.79 [2M-H]^-.

实施例3：化合物T1-IV的合成

将50 mL二氯甲烷加入250 mL茄形瓶中，搅拌下加入4.40 g (22.66 mmol)中间体T1-III和0.17 mL DMF。将所得淡棕色溶液于冰浴中搅拌。搅拌下将5.75 g (45.32 mmol)草酰氯滴加入上述反应液。所得反应液逐渐升至室温，搅拌过夜（约12h）。将反应液真空旋蒸浓缩，得棕黄色油状物。在冰浴中再次加入80 mL二氯甲烷，并加入4.53 g (33.99 mmol)三氯化铝（分3次等量加入），所得红棕色混合物于冰浴中搅拌反应3h。加入80 g冰水（分3次等量加入），并搅拌0.5 h，分液，水相用二氯甲烷（40 mL）萃取两次（括号中的体积为每次萃取或洗涤的溶液用量，在后面的实施例中表示相同的含义）。合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠（100 mL）洗三次，饱和氯化钠（50 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥，真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=200:1-150:1-100:1）得2.37 g中间体T1-IV，收率：59.4 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，CDCl3) δ 7.03 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.02 (s, 2H),2.97 (m, 2H), 2.62 (m, 2H).

MS (C₁₀H₈O₃): 176.96 [M+H]⁺.

实施例4：化合物T1-V的合成

将65 mL甲醇加入100 mL茄形瓶中，搅拌下加入6.52 g (37.01 mmol)中间体T1-IV和1.08 mL （12.95 mmol）浓盐酸。向所得近无色溶液中逐滴加入6.50 g(55.51 mmol)亚硝酸异戊酯，室温下搅拌8h。将所得反应混合物过滤，滤饼用甲醇（15 mL）洗，并于室温下真空干燥，得7.43g黄色中间体T1-V，收率：97.8 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.44 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.09 (s, 1H),6.17 (s, 2H), 3.62 (s, 2H).

MS (C₁₀H₇NO₄): 223.11 [M+H₂O]⁺, 411.17 [2M+H]⁺, 433.11 [2M+Na]⁺.

实施例5：化合物T1-VI的合成

将7.43 g中间体T1-V加入250 mL茄形瓶中，加入75 mL三氯氧磷和0.75 mLDMF，所得黄色混合物于100 ℃油浴中搅拌反应4 h，反应结束后真空旋蒸除去三氯氧磷。残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=400:1）得6.47 g中间体T1-VI，收率：73.8 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.86 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.41 (s, 1H),6.30 (s, 2H).

MS (C₁₀H₅Cl₂NO₂): 241.99 [M+H]⁺.

实施例6：化合物T1-VII的合成

将4.63 g (19.12 mmol)中间体T1-VI、7.87 g (57.35 mmol)对甲氧基苄胺和46mL N-甲基吡咯烷酮加入250 mL反应管中，所得反应混合物在氮气保护下于120℃油浴中反应3h。反应结束后加入150 mL水和150 mL乙酸乙酯，收集有机相。水相用乙酸乙酯（50 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（50 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:20-1:10-1:5-1:3-1:2）得5.51 g中间体T1-VII，收率：84.0 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.87 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H),7.31 (brs, 1H), 7.28 (brs, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.89-6.88 (m, 1H), 6.86-6.85(m, 2H), 6.15 (s, 2H), 4.58 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H).

MS (C₁₈H₁₅ClN₂O₃): 343.09 [M+H]⁺.

实施例7：化合物T1-VIII的合成

在200 mL反应管中加入二氧六环 (50 mL)、3.43 g (10.00 mmol)中间体T1-VII、N-Boc-哌嗪3.73 g (20.00 mmol)、Pd₂(dba)₃0.73 g (0.80 mmol)、RuPhos 0.56 g (1.2mmol)和碳酸铯 6.52 g (20.00 mmol)，所得反应混合物在氮气保护下于100℃搅拌反应12h。反应结束后降至室温。反应混合物通过硅藻土过滤，加150 mL水和150 mL乙酸乙酯到滤液中，收集有机相，水相用乙酸乙酯（50 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（50 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:40-1:20-1:10-1:5-1:3）得3.46 g中间体T1-VIII，收率：70.2 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz, CDCl3) δ 7.35-7.33 (m, 1H), 7.32-7.30 (m, 1H), 6.90-6.89 (m, 2H), 6.87-6.85 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.96 (s, 2H),4.98 (m, 1H), 4.68-4.66 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.58-3.53 (m, 4H), 3.46-3.43(m, 4H), 1.49 (s, 9H).

MS (C₂₇H₃₂N₄O₅): 493.28 [M+H]⁺.

实施例8：化合物T1-IX的合成

将1.38 g (2.80 mmol)中间体T1-VIII和27 mL 4N盐酸/乙酸乙酯溶液加入100mL茄形瓶中，所得反应混合物于室温搅拌反应7 h。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物用乙酸乙酯(10 mL)洗，过滤并于室温下真空干燥得1.10 g中间体T1-IX。所得产物不经进一步纯化，直接进行下一步反应。

MS (C₂₂H₂₅ClN₄O₃): 393.32 [M+H-HCl]⁺.

实施例9：化合物T1-X的合成

在50 mL茄形瓶中加入536 mg (1.25 mmol)中间体T1-IX、175 mg (1.5 mmol)(R)-(+)-四氢呋喃-2-甲酸、713 mg (1.875 mmol) HATU、485 mg (3.75 mmol) DIEA和10mL DMF，所得反应混合物在氮气保护下于室温搅拌过夜。加入水(100 ml)和乙酸乙酯(100ml)，收集有机相，水相用乙酸乙酯（30 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（30 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:20-1:10-1:5-1:3-1:1-2:1-3:1）得324 mg中间体T1-X，收率：52.9 %。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz, CDCl3) δ 7.34-7.33 (m, 1H), 7.31 (m 1H), 6.89-6.85(m, 3H), 6.82 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.97 (s, 2H), 5.01 (brs, 1H), 4.67 (m,3H), 3.98-3.86 (m, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.76-3.67 (m, 3H), 3.53-3.47 (m, 4H),2.32-2.28 (m, 1H), 2.08-1.92 (m, 3H).

MS (C₂₇H₃₀N₄O₅): 491.28 [M+H]⁺.

实施例10：化合物T1的合成

将200 mg (0.41 mmol)中间体T1-X和2 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-10:1）得62 mg化合物T1，收率：41.1 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.60 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.55 (brs, 2H),6.25 (s, 1H), 6.10 (s, 2H), 4.68 (m, 1H), 3.81-3.70 (m, 4H), 3.65-3.45 (m,6H), 2.09-1.98 (m, 2H), 1.88-1.79 (m, 2H).

MS (C₁₉H₂₂N₄O₄): 371.05 [M+H]⁺.

实施例11：化合物T1-XII的合成

将1.16 g (10.0 mmol) (R)-(+)-四氢呋喃-2-甲酸和20 ml DMF加入100 ml反应管中，向所得反应液中加入1.86 g (10.0 mmol)中间体T1-XI、4.56 g (12.0 mmol) HATU和2.59 (20.0 mmol) N,N-二异丙基乙胺。所得反应溶液于室温下搅拌12 h。反应结束后加入100 mL水和100 mL乙酸乙酯，收集有机相。水相用乙酸乙酯（50 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（50 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:20-1:10-1:7-1:5-1:2）得1.95 g中间体T1-XII，收率：68.7%。NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 4.56-4.52 (m, 1H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.63-3.59 (m, 2H), 3.44-3.28 (m, 6H), 2.32-2.21 (m, 1H), 1.99-1.87 (m, 3H), 1.41(s, 9H).

MS (C₁₄H₂₄N₂O₄): 285.14 [M+H]⁺.

实施例12：化合物T1-XIII的合成

将1.42 g (5.0 mmol) 中间体T1-XII和28 mL 4N盐酸/乙酸乙酯溶液加入100 mL茄形瓶中，所得反应混合物于室温搅拌反应5h。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物用乙酸乙酯(10 mL)洗，过滤并于室温下真空干燥得0.95 g中间体T1-XIII。所得产物不经进一步纯化，直接进行下一步反应。

MS (C₉H₁₇ClN₂O₂): 185.17 [M+H-HCl]⁺.

实施例13：化合物T1-X的合成

在200 mL反应管中加入二氧六环(40 mL)、2.58 g (7.50 mmol)中间体T1-VII、3.3 g (15.00 mmol)中间体T1-XIII、0.55 g (0.60 mmol) Pd₂(dba)₃、0.42 g (0.90mmol) RuPhos和4.89 g (15.00 mmol)碳酸铯，所得反应混合物在氮气保护下于100℃搅拌反应12h。反应结束后降至室温。反应混合物通过硅藻土过滤，加120 mL水和120 mL乙酸乙酯到滤液中，收集有机相，水相用乙酸乙酯（50 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（50mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:20-1:10-1:5-1:3-1:1-2:1-3:1）得1.85 g 中间体T1-X，收率：50.1 %。

实施例14：化合物T1-XIV的合成

向100 mL水热反应釜中加入1.09 g (4.50 mmol)中间体T1-VI、30 mL二氧六环和30 mL氨水，所得反应混合物于150℃搅拌反应48h。反应结束后降至室温。向反应混合物中加入30 mL水和30 mL二氯甲烷，收集有机相，水相用二氯甲烷（15 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（30 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经乙酸乙酯(20mL)室温打浆两次，得0.64 g中间体T1-XIV，收率：64.0 %。¹H NMR解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.61 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.94 (brs, 2H),6.84 (s, 1H), 6.14 (s, 2H).

MS (C₁₀H₇ClN₂O₂): 223.08 [M+H]⁺.

实施例15：化合物T1-VII的合成

向100 mL水热反应釜中加入520 mg (2.34 mmol)中间体T1-XIV、79 mg (0.35mmol)醋酸钯、256 mg (0.70 mmol) 3-二苯膦基苯磺酸钠、1.29 g (9.36 mmol)对甲氧基苄醇和15 mL水，所得反应混合物于140℃搅拌反应24h。反应结束后将反应混合物通过硅藻土过滤，加入30 mL水和30 mL乙酸乙酯，收集有机相。水相用乙酸乙酯（15 mL）萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠（30 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。真空旋蒸除去溶剂，所得残留物经柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚=1:20-1:10-1:7-1:5-1:2）得592 mg中间体T1-VII，收率：74.0 %。

实施例16：化合物T2的合成

起始原料T2-X的合成参照T1-X的合成方法。

将180 mg (0.37 mmol) 中间体T2-X和1.8 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-10:1）得65 mg化合物T2，收率：47.8 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.46 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.44 (brs, 2H),6.10 (s, 1H), 6.04 (s, 2H), 4.71 (m, 1H), 3.82-3.70 (m, 4H), 3.66-3.56 (m,6H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.88-1.80 (m, 2H).

MS (C₁₉H₂₂N₄O₄): 371.20 [M+H]⁺.

实施例17：化合物T3的合成

起始原料T3-X的合成参照T1-X的合成方法。

将200 mg (0.37 mmol)中间体T3-X和2.0 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-15:1）得78 mg化合物T3，收率：51.3 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.42 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.52 (brs, 2H),6.30 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 6.19(s, 1H), 4.75 (m, 1H), 3.85-3.68 (m, 4H), 3.72-3.60 (m, 6H), 2.05-1.98 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.67 (d, J = 5.0 Hz, 3H).

MS (C₂₀H₂₄N₄O₄): 385.23 [M+H]⁺.

实施例18：化合物T4的合成

起始原料T4-X的合成参照T1-X的合成方法。

将182 mg (0.35 mmol)中间体T4-X和1.9 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-15:1）得78 mg化合物T4，收率：55.7 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.53 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.56 (brs, 2H),6.15 (s, 1H), 4.76 (m, 1H), 3.80-3.66 (m, 4H), 3.70-3.55 (m, 6H), 2.10-1.99(m, 2H), 1.86-1.78 (m, 2H), 1.72 (s, 6H).

MS (C₂₁H₂₆N₄O₄): 399.25 [M+H]⁺.

实施例19：化合物T5的合成

起始原料T5-X的合成参照T1-X的合成方法。

将245 mg (0.50 mmol)中间体T5-X和2.5 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-15:1）得85 mg化合物T5，收率：45.9 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.98 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.50 (s, 2H),6.29 (s, 1H), 4.62 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 4.72 (m,1H), 3.84-3.71 (m, 4H), 3.66-3.48 (m, 6H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.90-1.80 (m,2H).

MS (C₂₀H₂₄N₄O₃): 369.15 [M+H]⁺.

实施例20：化合物T6的合成

起始原料T6-X的合成参照T1-X的合成方法。

将220 mg (0.45 mmol)中间体T6-X和2.2 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-15:1）得80 mg化合物T6，收率：48.2 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.92 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.53 (s, 2H),6.25 (s, 1H), 4.64 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 3.24 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 4.75 (m,1H), 3.88-3.70 (m, 4H), 3.69-3.52 (m, 6H), 2.11-2.00 (m, 2H), 1.88-1.80 (m,2H).

MS (C₂₀H₂₄N₄O₃): 369.21 [M+H]⁺.

实施例21：化合物T7的合成

起始原料T7-X的合成参照T1-X的合成方法。

将115 mg (0.24 mmol)中间体T7-X和1.2 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1）得34 mg化合物T7，收率：39.2 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.58 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.82-6.76 (m,2H), 6.21 (s, 1H), 6.11 (s, 2H), 3.61-3.60 (m, 4H), 3.30-3.25 (m, 4H), 3.08-2.98 (m, 1H), 1.79-1.52 (m, 8H).

MS (C₂₀H₂₄N₄O₃): 369.22 [M+H]⁺.

实施例22：化合物T8的合成

起始原料T8-X的合成参照T1-X的合成方法。

将79 mg (0.13 mmol)中间体T8-X和1.6 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h。真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 ml）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 ml）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 100:1-80:1-50:1-20:1-8:1）得34 mg化合物T8，收率：68.7 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 9.72 (brs, 1H), 8.53 (brs, 1H), 7.53 (s,1H), 6.96 (s, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.08 (s, 2H), 4.67 (m, 1H), 3.71-3.61 (m,4H), 3.39-3.18 (m, 7H), 2.44-2.36 (m, 1H), 1.95-1.81 (m, 3H).

MS (C₁₉H₂₃N₅O₃): 370.27 [M+H]⁺.

实施例23：化合物T9的合成

起始原料T9-X的合成参照T1-X的合成方法。

将120 mg (0.20 mmol)中间体T9-X和2.4 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h。真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 ml饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 ml）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-8:1）得55 mg化合物T9，收率：73.3 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 9.69 (brs, 1H), 8.55 (brs, 1H), 7.55 (s,1H), 6.88 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.11 (s, 2H), 4.61 (m, 1H), 3.80-3.65 (m,4H), 3.45-3.21 (m, 7H), 2.52-2.33 (m, 1H), 2.00-1.80 (m, 3H).

MS (C₁₉H₂₃N₅O₃): 370.25 [M+H]⁺.

实施例24：化合物T10的合成

起始原料T10-X的合成参照T1-X的合成方法。

将170 mg (0.34 mmol)中间体T10-X和1.7mL三氟乙酸加入到4mL反应管中，于45℃油浴中搅拌反应3 h。真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-10:1）得48mg化合物T10，收率：37.1 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 8.50 (br, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.16 (s, 1H),6.33 (s, 1H), 4.75-4.72 (m, 1H), 4.42-4.35 (m, 4H), 3.83-3.76 (m, 2H), 3.73-3.56 (m, 4H), 3.26-3.10 (m, 4H), 2.14-1.97 (m, 2H), 1.90-1.79 (m, 2H).

MS (C₂₀H₂₄N₄O₄): 385.05 [M+H]⁺.

实施例25：化合物T11的合成

起始原料T11-X的合成参照T1-X的合成方法。

将77 mg (0.16 mmol)中间体T11-X和1.5 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。向所得残留物中加入15 mL饱和NaHCO₃溶液，用二氯甲烷（15 mL）萃取三次。合并有机相，用饱和氯化钠（15 mL）洗一次，无水硫酸钠干燥。减压浓缩，所得残留物经柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=100:1-80:1-50:1-20:1-10:1）得38 mg化合物T11，收率：65.5 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.87-7.86 (m, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.21-7.18(m, 1H), 7.05-7.04 (m, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.93-6.79 (m, 1H), 6.65-6.64 (m,1H), 6.19 (s, 1H), 6.10 (s, 2H), 3.80 (br, 4H), 3.41-3.39 (m, 4H).

MS (C₁₉H₁₈N₄O₄): 367.23 [M+H]⁺.

实施例26：化合物T1三氟乙酸盐的制备

将250 mg (0.51 mmol) 中间体T1-X和2.5 mL三氟乙酸加入到4 mL反应管中，所得反应混合物于45℃油浴中搅拌反应3 h，真空旋蒸除去溶剂。所得残留物用甲醇(2.5 mL)洗两次，过滤并于室温下真空干燥得112 mg化合物T1三氟乙酸盐，收率：45.3 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 7.44 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.32 (brs, 2H),6.08 (s, 1H), 6.03 (s, 2H), 4.71 (m, 1H), 3.82-3.70 (m, 4H), 3.66-3.55 (m,6H), 2.08-1.99 (m, 2H), 1.88-1.80 (m, 2H).

MS (C₂₁H₂₃F₃N₄O₆): 371.14 [M+H-TFA]⁺.

实施例27：化合物T1盐酸盐的制备

将120 mg 化合物T1和2.4 mL甲醇加入到4 mL反应管中，所得混合物于冰水浴中搅拌冷却。向其中加入0.054 mL浓盐酸。所得混合物于冰浴中搅拌1 h后过滤，滤饼用冰甲醇淋洗，真空干燥后得103 mg化合物T1盐酸盐，收率：78.0 %。NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 8.78 (brs, 3H), 7.48 (s, 1H), 6.91 (s, 1H),6.11 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 3.84-3.71 (m, 4H), 3.70-3.57 (m,6H), 2.10-2.01 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 2H).

MS (C₁₉H₂₃ClN₄O₄): 371.19 [M+H-HCl]⁺.

实施例28：化合物T1硫酸盐的制备

将200 mg 化合物T1和4.0 mL甲醇加入到4 mL反应管中，所得混合物于冰水浴中搅拌冷却。向其中加入0.058 ml浓硫酸。所得混合物于冰浴中搅拌1 h后过滤，滤饼用冰甲醇淋洗，真空干燥后得213 mg化合物T1硫酸盐，收率：84.2 %。¹H NMR 解析如下：

¹H NMR：(300 MHz，DMSO-d₆) δ 8.89 (brs, 2H), 7.46 (s, 1H), 6.90 (s, 1H),6.13 (s, 1H), 6.06 (s, 2H), 4.75 (m, 1H), 3.83-3.69 (m, 4H), 3.68-3.55 (m,6H), 2.10-1.99 (m, 2H), 1.86-1.78 (m, 2H).

MS (C₁₉H₂₄N₄O₈S): 371.25 [M+H-H₂SO₄]⁺.

实施例29：确定化合物对细胞糖代谢的影响

化合物对细胞ATP水平的影响。

实验条件：

SK-N-SH (Human Neuroblastoma Cell Line)，是一种人源神经瘤细胞系。在6空板中植入SK-N-SH细胞，密度为6×10⁴。在5% O₂条件下培12小时。加入10 mM各种药物。48小时后，收取细胞。用Promega ATP检测试剂盒测细胞ATP水平。实验重复6-10次。实验结果如图1所示。未加药组(对照)的ATP水平定义为1，特拉唑嗪处理组为阳性对照。T1至T11为实验组。

实验结果：T1-T9具有提高细胞ATP活性；而T10和T11没有提高ATP活性。

实施例30：确定化合物对Pgk1蛋白的亲和力

实验条件：

纯化的Pgk1蛋白（浓度1 mg/mL），加入Biacore T200芯片，测试确定蛋白偶联后，加入不同浓度的药物。获得的曲线可计算出亲和力及Rmax等参数。

实验结果如表1所示。

表1

实验结果：表1列出了各种药物与Pgk1的亲和力。其中，特拉唑嗪的亲和力最高，达到1.4 mM。T1-T9与Pgk1蛋白皆有亲和力，但远低于特拉唑嗪。T10及T11未检测到与Pgk1蛋白的亲和力（KD值大于1000 mM）。Rmax（RU）是指在检测到亲和力时，小分子药物结合到靶蛋白的数量。我们已发表的研究表明，特拉唑嗪通过干扰ATP，促进ATP从Pgk1蛋白上解离，使ATP对Pgk1酶反应的抑制作用被解除。Rmax数值越高暗示干扰ATP解离的潜力越大。ADP是Pgk1的底物，KD值为337.4。在测定特拉唑嗪亲和力时，加入饱和的ADP，可降低特拉唑嗪的KD值从1.4 mM至2.9 mM，表明特拉唑嗪结合在Pgk1蛋白上的位点与ADP/ATP是重叠的。T6的KD值在加入ADP后也被显著降低。说明T6与Pgk1的结合可以被ADP干扰，说明T6在Pgk1蛋白上的结合位点与特拉唑嗪类似。这一结果揭示，多个异喹啉类衍生物与Pgk1具有亲和力，但亲和力弱于特拉唑嗪。

实施例31：确定化合物对线粒体呼吸的影响

实验条件：

使用Seahorse XFe分析仪（XFe-24，Seahorse Bioscience，Billerica，MA，UAS）检测细胞线粒体压力，测量氧消耗率（OCR）。将SH-SKN细胞系接种在Seahorse XFe分析仪配套的24孔细胞板中。24小时后，分别给予DMSO（0.01 %）或者各种药物处理(10 mM)。药物处理12小时后进行细胞线粒体压力检测。对于线粒体压力测试，分出97.2mL的Seahorse基础培养基（Seahorse Bioscience，Billerica，MA，UAS）水浴加热至37 ℃后加入1 mL母液，该母液由下列溶液混合而成（1 mL浓度为200 mM的L-谷氨酰胺溶液（sigma）、1 mL为100 mM的丙酮酸溶液（sigma）和800 mL浓度为2.5 M的葡萄糖溶液，用1M NaOH溶液调节pH值为7.4）。检测前取出探针板，向探针板中加入1 mL XF Carlibrant溶液（Seahorse Bioscience），放置于无CO₂的37 ℃恒温培养箱中孵育过夜。药物处理后，取出细胞，用37 ℃预热的seahorse基础培养基洗细胞两次，保证每孔剩余500 mL的seahorse基础培养基，将细胞放入无CO₂的37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。在此期间，将探针板从培养箱中取出，向探针板中加入oligomycin、FCCP和Rotenone/antimycin A，之后将探针板放入Seahorse XFe分析仪中进行校准。药物皆使用10 mM。实验重复3-5次。

实验结果如表2所示。

表2

表2列出了药物对细胞基础呼吸的影响，以对照组（DMSO处理）为1。有统计学差异的用星号标出。该结果显示，特拉唑嗪及T1-T9皆具有提高线粒体呼吸的活性。T10及T11没有激活线粒体的活性。该实验结果与图1的结果是一致的。皆说明新合成的异喹啉类衍生物（T1-T9）具有激活Pgk1，增加线粒体呼吸的活性。

实施例32：确定化合物是否通过Pgk1产生药效

实验条件：

为了进一步确定新合成的异喹啉类衍生物通过靶向Pgk1产生激活线粒体的活性，本发明构建了在SK-N-SH细胞中稳定敲低Pgk1细胞系。人源Pgk1的target序列：GAGCTAAAGTTGCAGACAA。将敲低序列5’端加入BamHI酶切位点，3’端加入XbaI酶切位点，中间接入loop环，合成top链5’- gatccGAGCTAAAGTTGCAGACAATTCAAGAGATTGTCTGCAACTTTAGCTCt-3’，bottom链：5’-ctagaGAGCTAAAGTTGCAGACAATCTCTTGAATTGTCTGCAACTTTAGCTCg-3’。将两条DNA oligo经过5’端磷酸化后插入plenti-u6载体中。将所得到的Lenti-shPgk1载体，与pCAG-dR8.9和pCMV-VSV-G按摩尔比1:1:1的比例分别转染到HEK293T细胞中，72小时后收取上清。将所得的上清经过超速离心得到病毒沉淀，用1/100体积的PBS重悬病毒沉淀，静置24小时后，感染到经过polybrene处理的SH-SKN细胞中。感染48小时后将所得到的经病毒感染的细胞通过有限稀释法接种到96孔板中获得单克隆细胞系。将所得到的单克隆细胞系继续扩增培养。最后利用western blot进一步鉴定Pgk1的敲低效率。结果见图2，其中，A为免疫印迹实验，B为线粒体呼吸生理学实验（seahorse assay）。图2中A显示，在稳定表达shPgk1的细胞系中，Pgk1蛋白被显著敲低。该蛋白质免疫印迹结果中，GAPDH是蛋白上样量的对照，确保上样量相同。图2中B为利用该细胞系，比较T6对线粒体呼吸的影响。Seahorse的实验条件、给药时间等与实施例31相同。结果显示，T6（10 mM）对正常细胞（对照）的基础呼吸率及最大呼吸率皆具有激活作用；但在shPgk1敲低的细胞中，活性消失。说明T6激活线粒体代谢依赖于Pgk1。其它化合物也具有类似结果。

实施例33：体外生化实验中，确定化合物的量效关系

实验条件：

人源Pgk1 cDNA克隆到含有His标签的pEASYTM-E2载体（TransGen Biotech）中。用0.5 mM IPTG在BL21（DE3）化学感受态细胞（TransGen Biotech）中诱导蛋白质表达。在提取缓冲液（20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 5% glycerol,protease inhibitor cocktail, pH 7.9）中裂解细胞后，用镍珠（AdarBiotech）纯化上清液。使用洗脱缓冲液（20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 80 mM imidazole,protease inhibitor cocktail, pH 7.9）洗脱His标记的Pgk1。Pgk1活性可通过监测NADH的产生速率来测量，因为NADH应该随着反应的进行而积累。将纯化的Pgk1-His蛋白（2 μg/mL）加入在反应缓冲液中（20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.1 mM MgSO₄, 10 mMNaHPO₄, pH 8.6）中加入底物（1.6 mM GAP, 1 mM b-NAD, 1 mM ADP, 20 ng/mL GAPDH）。在该反应体系中分别加入不同浓度的特拉唑嗪（阳性对照）、T6，在室温下反应10分钟后，用酶标仪（Molecular Devices, SpectraMax i3x）设定检测339 nm吸收波长，该波长可检测NADH水平。

实验结果见图3，其中，A为特拉唑嗪对细胞中Pgk1酶活性的影响，B为化合物T6对细胞中Pgk1酶活性的影响。

如图3中A所示，作为阳性对照，检测了特拉唑嗪100 mM、20 mM、1 mM、0.1 mM及0.01 mM对Pgk1酶活性的影响。结果显示，高浓度（100 mM）特拉唑嗪可抑制Pgk1酶活性，而低浓度（1 mM）激活Pgk1效果最佳。图3中B比较了不同浓度T6对Pgk1的影响，发现各种浓度都不能抑制Pgk1。激活Pgk1的最佳浓度是0.1 mM。这一结果说明，T6没有抑制Pgk1风险。可能在患者身上不会产生降低脑组织ATP的作用，该药效降低了唑嗪类药物的风险。T1-9皆有类似结果。

实施例34：培养细胞中，确定化合物的量效关系

实验条件：

在六空板中植入SK-N-SH细胞，密度为6×10⁴。在5% O₂条件下培12小时，加入药物。48小时后，收取细胞。用Promega ATP检测试剂盒测细胞ATP水平。实验重复5-7次。

实验结果见图4。

如图4所示，阳性对照特拉唑嗪（TZ）和T6的使用剂量皆为5、10和50 mM。TZ的最佳剂量为10 mM；T6的最佳剂量为50 mM。但50 mM的TZ和T6有抑制细胞生长的趋势，T6的生物学有效浓度应接近10 mM。

实施例35：在小鼠体内，确定化合物对血糖的影响

实验条件：

正常饲养条件3至4月龄的野生型小鼠（C57BL/6）腹腔注射不同药物，0.1 mg/Kg，注射生理盐水为对照组。给药后，禁食6小时。取小鼠尾部血液，测血糖值。每组实验9只小鼠。

实验结果见图5。

如图5所示，特拉唑嗪（TZ）组未表现出降血糖作用。而T1-9具有显著降血糖作用。说明这类新型异喹啉类衍生物具有更高的激活糖代谢活性。

实施例36：在糖尿病模型小鼠，确定化合物的降血糖作用

实验条件：

基因敲除的db/db小鼠，是经典的高血糖和肥胖模型。在正常饲养条件下，3月龄以上的小鼠已产生高血糖和肥胖。只提供小鼠饮用水（禁食）6小时后，取小鼠尾部血液，测血糖值。然后腹腔注射不同药物，包括生理盐水（control）、利拉鲁肽（liraglutide） 0.6 mg/Kg、低浓度T6（T6 low, 0.1 mg/Kg）及高浓度T6（T6 high, 0.5 mg/Kg）；4小时后，取小鼠尾部血液，测血糖值。每组实验6只小鼠。每只小鼠获得给药前血糖值（V_before）及给药后血糖值（V_after）。药物对血糖的影响（%）进行下列计算：

（V_before-V_after）×100/V_before。

实验结果见图6。

如图6所示，利拉鲁肽作为阳性对照，表现出最佳降血糖药效。T6的低浓度（0.1mg/Kg）、高浓度（0.5 mg/Kg）也具有显著的降血糖药效。该结果进一步确定了腹腔注射新型异喹啉类衍生物作为给药途径时，具有降血糖药效。

腹腔注射新型异喹啉类衍生物具有降血糖药效只能持续不超过6个小时。为了确定T6长效降血糖作用，我们将T6加入饮用水中，持续喂给小鼠一周时间。图7为饮用水给药途径对小鼠血糖的长期影响。

实施例37：在糖尿病模型小鼠，确定化合物的长期降血糖及减肥作用

实验条件：

正常饲养的基因敲除的db/db小鼠，在饮用水中加入二甲双胍（二甲双胍，350 mg/Kg）、特拉唑嗪（0.3 mg/Kg）或T6（1.5 mg/Kg）。处理7天后，测小鼠血液中糖化血红蛋白及胰岛素含量变化及体重变化。

实验结果见图7，其中，A为糖化血红蛋白含量，B为胰岛素含量，C为小鼠体重变化。

如图7所示，与对照组比较，只有T6处理组的糖化血红蛋白（HbA1c）含量出现降低。各处理组的胰岛素含量皆没有变化。T6处理组的小鼠体重呈显著下降状态，对体重的影响不同于特拉唑嗪及二甲双胍处理组。上述结果说明，口服给药途径长期处理，T6降血糖的药效好于特拉唑嗪及二甲双胍、并具有减低体重作用。

实施例38：在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中，确定化合物对多巴胺神经元的影响

实验条件：

取3月龄雄性小鼠，正常饲养。采用急性MPTP造模方式（见Sonsalla PK, HeikkilaRE. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergicneurotoxicity in mice.Eur J Pharmacol1986;129(3): 339-45.）。腹腔注射，共给药4次。每次给药剂量是20 mg/kg体重，每次间隔2小时。MPTP溶解在生理盐水中，对照组给与等剂量的生理盐水。T2溶于DMSO中，并用生理盐水稀释至所需浓度，故给药处理时给与等剂量的DMSO和生理盐水。MPTP模型建立当天给予T2（处理组）或DMSO（对照组）治疗，随后各组小鼠每天给予药物处理。使用转棒（E103，UGO BASILE）测试小鼠行为。首先，在每分钟15转（15 rpm）固定速度下，对小鼠进行连续两天的预训练，直到它们能够在杆上停留60秒以上。在MPTP注射后的第7天，在加速模式（2-45 rpm）下在旋转杆上测试小鼠。记录小鼠持续在转棒上的时间。该行为由摄像机监控。实验结束后，处死小鼠、取纹状体脑组织，进行免疫印记（Western Blot）实验。多巴胺神经元特异表达的蛋白是酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase，TH）。用TH抗体进行免疫印记实验，可确定多巴胺神经元是否损伤。特拉唑嗪（TZ，0.1 mg/Kg）设为阳性对照，T2尝试了三个剂量：0.1 mg/Kg、0.3 mg/Kg、及1 mg/Kg。

实验结果见图8，其中，A为各药物对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的运动能力的影响，B为特拉唑嗪对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠体内酪氨酸羟化酶含量的影响，C为0.1mg/Kg剂量的化合物T2对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠体内酪氨酸羟化酶含量的影响。

如图8中A所示，特拉唑嗪（TZ）处理，可改善MPTP损伤状态下小鼠运动能力。T2的三个剂量皆有保护作用。图8中B比较了对照组、MPTP处理组及特拉唑嗪处理组的酪氨酸羟化酶蛋白含量。每组随机取4只小鼠的纹状体蛋白。进行免疫印记实验。右侧为统计结果。该结果显示，特拉唑嗪具有保护多巴胺神经元的作用。该组实验为阳性对照。图8中C为多巴胺神经元，与图8中B的方法类似。该结果显示，T2具有保护多巴胺神经元的作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种异喹啉类衍生物，其特征在于，所述异喹啉类衍生物的结构通式如下：

所述异喹啉类衍生物的结构具体如下：

。

2.一种权利要求1所述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐，包括盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、三氟乙酸盐、醋酸盐、磷酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁二酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐。

3.一种异喹啉类衍生物制剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述异喹啉类衍生物和/或权利要求2所述异喹啉类衍生物药学上可接受的盐。

4.一种权利要求1所述异喹啉类衍生物在制备磷酸甘油激酶激活剂中的应用。

5.一种权利要求1所述异喹啉类衍生物在制备治疗或预防神经退行性疾病的药物中的应用。

6.一种权利要求1所述异喹啉类衍生物在制备治疗或预防代谢性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述代谢性疾病为糖尿病或肥胖。

7.一种权利要求1所述异喹啉类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下合成路线或它们的组合：

合成路线A：

；

合成路线B：

；

合成路线C：

；