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CN117396516A - 抗cea抗体和使用方法 - Google Patents

抗cea抗体和使用方法 Download PDF

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CN117396516A
CN117396516A CN202280036537.6A CN202280036537A CN117396516A CN 117396516 A CN117396516 A CN 117396516A CN 202280036537 A CN202280036537 A CN 202280036537A CN 117396516 A CN117396516 A CN 117396516A
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Abstract

本披露提供了结合人CEA的抗体及其抗原结合片段、包含所述抗体的药物组合物，以及抗CEA抗体或该组合物用于治疗疾病诸如癌症的用途。

Description

抗CEA抗体和使用方法
技术领域
本文披露了结合人CEA的抗体或其抗原结合片段以及用于治疗癌症的方法。
背景技术
癌胚抗原(CEA，也称为CEACAM5或CD66e)是一种糖蛋白，其分子量为约70-100kDa，具体取决于所存在的糖基化的量。Gold等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志],121,439(1965)首先报道了与人腺癌中的癌症特异性抗原相关的CEA的存在。CEA通常在多种腺上皮组织(诸如胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道)中表达，在这些腺上皮组织中它似乎位于细胞的顶端表面(Hammarstrom,S.Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研讨会]9,67-81(1999))。例如，发现它存在于结肠的柱状上皮细胞和杯状细胞中(Fraengsmyr等人,Tumor Biol.[肿瘤生物学]20:277-292(1999))。在由这些组织类型产生的肿瘤中，CEA表达从顶端膜到细胞表面增加，并且一旦从细胞表面除去，就会进入血流(Hammarstrom,S.Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研讨会]9,67-81；(1999)，还参见Fraengsmyr等人,Tumor Biol.[肿瘤生物学]20:277-292(1999))。在许多类型的癌症中观察到CEA过表达，这些癌症包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌。因此，在癌症的预后和治疗中，CEA已经用作诊断性肿瘤标志物以确定癌症患者血液中的CEA水平升高(Chevinsky,A.H.(1991)Semin.Surg.Oncol.[外科肿瘤学研讨会]7,162-166；Shively,J.E.等人,(1985)Crit.Rev.Oncol.Hematol.[肿瘤学/血液学评论]2,355-399)。
CEA已被认为是用于靶向治疗的有用的肿瘤相关抗原(Kuroki M等人,(2002)Anticancer Res[抗癌研究]22:4255-64)。一种方法是产生展示抗CEAscFv的逆转录病毒构建体，并将一氧化氮合酶(iNOS)基因递送至表达CEA的癌细胞。(Kuroki M.等人,(2000)Anticancer Res.[抗癌研究]20(6A):4067-71)。另一种方法是将放射性同位素与抗CEA抗体连接，并证明放射特异性针对表达CEA的肿瘤(Wilkinson等人,PNAS USA[美国国家科学院院刊]98,10256-60(2001)；Goldenberg等人,Am.J.Gastroenterol.[美国胃肠病学杂志],86:1392-1403(1991)；Olafsen T.等人,Protein Engineering,Design&Selection[蛋白质工程设计与选择],17,21-27,(2004)；Meyer等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]15:4484-4492(2009)；Sharkey等人,J.Nucl.Med.[核医学杂志]46:620-633(2005))。放射性同位素方法已扩展到抗CEA抗体药物缀合物(ADC)。例如，Shinmi等人报道了一种与单甲基奥瑞他汀E(MMAE)缀合的抗CEA抗体(Shinmi等人,Cancer Med.[癌症医学]6(4):798-808(2017))。
然而，抗CEA抗体的问题之一是交叉反应性。CEA与其他CEACAM家族成员高度同源，例如，人CEA与CEACAM6显示出84％同源性，与CECAM8显示出77％同源性，与CEACAM1显示出73％同一性。本披露提供了对CEA特异的抗CEA抗体。
发明内容
本披露涉及抗CEA抗体及其抗原结合片段。本披露涵盖以下实施例。
一种抗CEA抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:52的氨基酸596至674处特异性结合人CEA的抗体或其结合片段。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不结合其他CEACAM家族成员。
如权利要求1所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1(轻链互补决定区1)、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；或
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2、(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:48至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:31的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(VL)。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或是低岩藻糖基化的。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是IgG1。
该抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体缀合到毒素。
一种包含该抗CEA抗体或抗原结合片段的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的该抗体或抗原结合片段。
该方法，其中该癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
该方法，其中该抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
该方法，其中该治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
该方法，其中该治疗剂是抗PD1或抗PDL1抗体。
一种分离的核酸，其编码该抗CEA抗体或抗原结合片段。
一种载体，其包含该核酸。
一种宿主细胞，其包含该核酸或载体。
一种用于生产抗CEA抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养宿主细胞以及从培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
在一个实施例中，该抗CEA抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，该一个或多个互补决定区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:40。
在另一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含一个或多个互补决定区(HCDR)的重链可变区，该一个或多个互补决定区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43；和/或(b)包含一个或多个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，该一个或多个互补决定区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:44SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:40。
在另一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个互补决定区(HCDR)的重链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR3，和/或(b)包含三个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，该抗CEA抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个互补决定区(HCDR)的重链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR3；和/或(b)包含三个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，该抗CEA抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3。
在另一个实施例中，抗CEA抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3。
在又一个实施例中，该抗CEA抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2和(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3。
在一个实施例中，本披露的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:48中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:49的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:49中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本披露的抗CEA抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:48的氨基酸序列或在SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:48的氨基酸序列中包含一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列，和/或(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQID NO:49的氨基酸序列或在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:49的氨基酸序列中包含一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代的氨基酸序列。在另一个实施例中，这些氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本披露的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在更特定的实施例中，本披露的抗体包含野生型人IgG1(也称为人IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc结构域。在另一个实施例中，本披露的抗体包含具有S228P和/或R409K取代(根据EU编号系统)的人IgG4的Fc结构域。
在一个实施例中，本披露的抗CEA抗体以1×10-6M至1×10-10M的结合亲和力(KD)结合CEA。在另一个实施例中，本披露的抗体以约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M或约1×10-10M的结合亲和力(KD)结合CEA。
在另一个实施例中，本披露的抗人CEA抗体显示对食蟹猴CEA的跨物种结合活性。
在一个实施例中，本披露的抗体具有强的Fc介导的效应子功能。抗体介导对表达CEA的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本披露涉及分离的核酸，这些分离的核酸包含编码抗CEA抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施例中，分离的核酸包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:50的VH核苷酸序列或与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:50具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本披露的抗体或抗原结合片段的VH区。替代性地或另外地，分离的核酸包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:34、或SEQ IDNO:51的VL核苷酸序列或与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:34、或SEQ ID NO:51具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本披露的抗体或抗原结合片段的VL区。
在另一方面，本披露涉及包含抗CEA抗体或其抗原结合片段和任选地药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又一方面，本披露涉及治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗CEA抗体或其抗原结合片段或抗CEA抗体药物组合物。在另一个实施例中，待由该抗体或抗原结合片段治疗的疾病是癌症。
本披露涉及抗CEA抗体或其抗原结合片段或抗CEA抗体药物组合物用于治疗疾病诸如癌症的用途。
附图说明
图1示出了脱落CEA(sCEA)、嵌合CEA(CHIM)、CEACAM6和CEA变体(CEA-v)的示意图。在CEA中，标记了N结构域、A1、B1、A2、B2、A3、B3和GPI接头(GPI)；在CEACAM6中，标记了结构域N'、A'和B'。
图2A-B描绘了抗CEA结构域B3抗体VH(图2A)和VL(图2B)区的系统发生树。使用DNASTAR的MegalignTM软件对候选抗CEA抗体的VH和VL序列进行比对。序列同源性在系统发生树中显示。
图3A示出了通过表面等离子共振(SPR)对嵌合构建体(CHIM)上的纯化的鼠抗CEA抗体BGA13的亲和力测定。图3B描绘了通过抗原ELISA分析的BGA13的结合概况。
图4A-B示出了可溶性CEA(sCEA)对CEA抗体与MKN45细胞的结合的影响。图4A示出了在可溶性CEA(sCEA)存在或不存在下结构域B3抗体的结合概况；图4B是图4A的抗体结合概况，示出为直方图。
图5A-B示出了产生用于人源化BGA13抗体轻链CDR(LCDR)区(图5A)和重链CDR(HCDR)区(图5B)的亲和力成熟的抗体文库的随机化位点。
图6示出了四轮选择后BGA13轻链CDR区的氨基酸改变。
图7示出了通过流式细胞术测定的亲和力成熟的人源化BGA13变体与LOVO细胞的结合。
图8是通过流式细胞术测定的优化的人源化BGA113变体与MKN45细胞的结合。
图9A和图9B表明通过流式细胞术(图9A)和抗原ELISA(图9B)所发现，抗体BGA113K与各种CEACAM家族成员没有脱靶结合。
图10示出了在各种浓度的可溶性CEA存在下，可溶性CEA对BGA113K与CEA表达细胞MKN45细胞结合的影响。
图11表明抗体BGA113在体外通过ADCC杀伤细胞。
图12描绘了当用BGA113抗体治疗时鼠癌症模型的肿瘤体积减小。
定义
除非在本文件的其他地方特别定义，否则本文所用的所有其他技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则如“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该”在内的词语的单数形式包括它们相应的复数指代。
除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
如本文所用的术语“抗癌剂”是指可用于治疗细胞增殖性障碍(如癌症)的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向性抗癌剂、和免疫治疗剂。
术语“癌胚抗原”或“CEA”是指大约70-100kDa的糖蛋白。CEA也称为CEACAM5或CD66e。人CEA的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)也可在登录号P06731或NM_004363.2中找到。
如本文所用的术语“施用(administration/administering)”和“治疗(treating/treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还意指通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞进行的例如细胞的体外和离体处理。本文中的术语“受试者”包括任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。在一方面，治疗任何疾病或障碍是指改善该疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在又另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或两者上调节疾病或障碍。在又另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发作或发展或进展。
在本披露的上下文中，术语“受试者”是哺乳动物，例如，灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人(例如，患有本文所述的障碍或处于患上本文所述的障碍的风险中的患者)。
如本文所用的术语“亲和力”是指抗体与抗原之间相互作用的强度。在抗原内，抗体的可变区通过非共价力与抗原在许多位点相互作用。通常，相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL或Vκ)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个框架区(FR)构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
在一些实施例中，抗CEA抗体包含至少一个抗原结合位点，至少一个可变区。在一些实施例中，抗CEA抗体包含来自本文所述CEA抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，抗CEA抗体是分离的或重组的。
本文中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”意指基本上同质的抗体的群体，即，除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，该群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，特别地其互补决定区(CDR)，它们通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示获得自基本上同质的抗体群体的抗体的特征并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法获得单克隆抗体(mAb)。参见，例如Kohler等人,Nature[自然]1975 256:495-497；美国专利号4,376,110；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物学现代方法]1992；Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL[抗体：实验室手册],Cold spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]1988；以及Colligan等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY[当代免疫学方案]1993。本文披露的抗体可以是任何免疫球蛋白类别(包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA)，及其任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。产生单克隆抗体的杂交瘤可以在体外或在体内培养。高效价的单克隆抗体可以在体内产生中获得，其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射到小鼠中，例如原始引发的Balb/c小鼠，以产生含有高浓度所需抗体的腹水。可以使用本领域技术人员熟知的柱层析方法从这样的腹水，或从培养上清液中纯化同种型IgM或IgG的单克隆抗体。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以定义为主要负责效应子功能的恒定区。典型地，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链典型地分类为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常在一级序列中是相同的。
典型地，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常由框架区对齐，使得能够结合特异性表位。一般而言，从N-末端到C-末端，轻链和重链可变结构域两者都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。CDR和框架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(参见，例如Johnson等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997))、ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学者],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991)；和Rees等人,在Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Prediction[蛋白质结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],牛津,141-172(1996)中。例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号为约27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(编号根据Kabat)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
术语“高变区”意指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(例如轻链可变结构域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。参见Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
除非另外说明，否则“抗原结合片段”意指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，单链Fv(ScFv))；纳米抗体以及从抗体片段形成的抗体。
如本文所用，抗体“特异性结合”靶蛋白，是指与其他蛋白相比，抗体表现出优先结合靶蛋白，但这种特异性不需要绝对的结合特异性。在描述抗原(例如蛋白质)与抗体或抗原结合抗体片段之间的相互作用的上下文中使用的抗体“特异性结合”或“选择性结合”是指决定抗原在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中(例如在生物样品、血液、血清、血浆或组织样品中)的存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原特异性结合是背景水平的至少两倍，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原特异性结合。在一方面，在指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原的特异性结合是背景结合水平的至少十(10)倍，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原特异性结合。
本文中的术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。
术语“人源化”或“人源化抗体”意指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。典型地，人源化抗体将包含基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。当有必要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加到抗体克隆名称中。人源化形式的啮齿动物抗体会通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，但是可包括某些氨基酸取代以增加亲和力，增加人源化抗体的稳定性，除去翻译后修饰或出于其他原因。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或亚序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比，其与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高确定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列也可以指与所有其他评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或亚序列。相应的人种系序列可以仅是框架区，仅互补决定区，框架和互补决定区，可变区段(如上定义)，或包含可变区的序列或亚序列的其他组合。可以使用本文所述的方法确定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或突变形式的人种系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-l)。平衡解离常数可以使用本领域任何已知的方法测量。本披露的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
本文中的术语“癌症”或“肿瘤”具有如本领域理解的最广泛的含义，并且是指哺乳动物中典型地以不受调控的细胞生长为特征的生理病症。在本披露的上下文中，癌症不限于某个类型或位置。
在本披露的上下文中，当提及氨基酸序列时，术语“保守取代”意指用新氨基酸取代原始氨基酸，该新氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能性质，例如其与CEA的结合亲和力。具体地，氨基酸的常见保守取代是本领域熟知的。
如本文所用的术语“杵臼(knob-into-hole)”技术是指氨基酸在体外或体内通过在它们相互作用的界面上将空间突起(杵)引入一个多肽并将穴袋或空腔(臼)引入另一个多肽从而引导将两条多肽配对在一起。例如，杵臼已经被引入了抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面、或VH/VL界面(参见例如US2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人,1997,Protein Science[蛋白质科学]6:781-788)。在一些实施例中，杵臼确保了抗体制备期间两个不同重链正确配对在一起。例如，在其Fc区中具有杵臼氨基酸的抗体还可包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者进一步包含与相似或不同轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。杵臼技术还可在VH或VL区中使用，以确保正确配对。
如本文在“杵臼”技术的上下文中所用的术语“杵”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入突起(杵)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有臼突变。
如本文在“杵臼”的上下文中所用的术语“臼”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入穴袋或空腔(臼)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有杵突变。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)披露获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中短字长W鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同字长比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值。这些初始邻域字命中作为开始搜索以找到包含它们的较长HSP的值。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，BLAST程序默认使用字长3，期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可使用以下的算法来确定：E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17,(1988)，其已并入ALIGN程序(2.0版本)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，可以使用以下确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453(1970)的算法，其已并入GCG软件包中的GAP程序中，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，并且长度权重为1、2、3、4、5或6。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成的，天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。典型地，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，启动子或增强子序列如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要在物理上邻接或紧邻它们增强其转录的编码序列。
在一些方面，本披露提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的抗CEA抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本文披露的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的合适组合物是可注射或输注溶液的形式。一种合适的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施例中，该抗体通过静脉内输注或注射来施用。在某些实施例中，该抗体通过肌内或皮下注射来施用。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响该疾病、障碍或症状的治疗的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体，疾病，障碍，和/或疾病或障碍的症状，疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中所述的治疗病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂。这种施用也涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所需剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以顺序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，短语“与…组合”意指将抗CEA抗体在施用另外的治疗剂的同时、就在该施用前或就在该施用后施用于受试者。在某些实施例中，将抗CEA抗体作为与另外的治疗剂的共同配制品来施用。
术语“毒素”或“有效负荷”或“细胞毒性剂”在本文中用作抑制或减少细胞中的分子表达、细胞功能、诱导细胞凋亡和/或引起细胞破坏的分子。该术语包括放射性同位素、化疗剂和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒性剂的实例包括但不限于奥瑞他汀类(auristatins)(例如，奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素类(auromycins)、美登素类(maytansinoids)、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、康普瑞汀(combrestatin)、倍癌霉素类(duocarmycins)、多拉司他汀类(dolastatins)、多柔比星、道诺霉素、紫杉醇、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、莫迪素(modeccin)A链、α-八叠球菌素(alpha-sarcin)、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、卡利奇霉素(calicheamicin)以及放射性同位素诸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和Lu177。
具体实施方式
本披露提供了抗CEA抗体及其抗原结合片段。此外，本披露提供了具有所需的药代动力学特征和其他期望的属性的抗体，并且因此可用于降低癌症的可能性或治疗癌症。本披露进一步提供了包含抗体的药物组合物以及制备和使用此类药物组合物用于预防和治疗癌症和相关障碍的方法。
抗CEA抗体
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或其抗原结合片段。本披露的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:14、31或48的氨基酸序列(表1)的VH结构域。本披露还提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的HCDR。在一方面，本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含(或替代性地，由其组成)具有表1中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个HCDR。
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:15、32或49的氨基酸序列(表1)的VL结构域。本披露还提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列的LCDR。具体地，本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含(或替代性地，由其组成)具有表1中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个LCDR。
本披露的其他抗体或其抗原结合片段包括已被改变，但在CDR区中与表1中披露的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸改变，其中当与表1中描述的序列中描绘的CDR区相比时，在CDR区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
本披露的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已被改变，但与表1中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的那些。在一些方面，其包括氨基酸序列的改变，其中当与表1中描述的序列中描绘的可变区相比时，在可变区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸，同时保持基本上相同的治疗活性。
本披露还提供了编码特异性结合CEA的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化此类核酸序列以在哺乳动物细胞中表达。
表1.
本披露提供了结合人CEA的表位的抗体及其抗原结合片段。在某些方面，抗体和抗原结合片段可以结合CEA的相同表位。
本披露还提供了结合与表1中描述的抗CEA抗体相同的表位的抗体及其抗原结合片段。因此，其他抗体及其抗原结合片段可以基于它们在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制本披露的抗体及其抗原结合片段结合CEA的能力证明测试抗体可与该抗体或其抗原结合片段竞争结合CEA。不受任何一种理论的束缚，这样的抗体可以结合CEA上的与其竞争的抗体或其抗原结合片段相同或相关(例如，在结构上相似或在空间上邻近)的表位。在某些方面，结合CEA上的与本披露的抗体或其抗原结合片段相同的表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。这种人或人源化单克隆抗体可以如本文所述制备和分离。
接头
还应理解，抗体的多肽链的结构域和/或区可被各种长度的接头区分开。在一些实施例中，抗原结合结构域通过接头区与彼此CL、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分开。例如，VL1-CL-(接头)VH2-CH1这种接头区可以包含随机分类的氨基酸，或一组受限的氨基酸。此类接头区可以是柔性的或刚性的(参见US 2009/0155275)。
在不同的实施例中，接头可用于将化合物缀合在毒素与抗体之间，在一些实施例中，接头在细胞内条件下可裂解，使得接头的裂解在细胞内环境中从抗体释放毒素。在其他实施例中，接头单元是不可裂解的，毒素例如通过抗体降解而释放。接头可以是但不限于可裂解的接头、不可裂解的接头、亲水性接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。
二聚化特异性氨基酸
在一个实施例中，抗体包含至少一个二聚化特异性氨基酸改变。二聚化特异性氨基酸改变导致“突起到孔中”相互作用，并增加正确抗体的组装。二聚化特异性氨基酸可以在CH1结构域或CL结构域或其组合内。用于将CH1结构域与其他CH1结构域(CH1-CH1)和CL结构域与其他CL结构域(CL-CL)配对的二聚化特异性氨基酸至少可以在WO 2014082179、WO2015181805家族和WO 2017059551的披露内容中找到。二聚化特异性氨基酸也可以在Fc结构域内，并且可以与CH1或CL结构域内的二聚化特异性氨基酸组合。在一个实施例中，本披露提供了包含至少一个二聚化特异性氨基酸对的抗体。
对Fc区框架的进一步改变
在其他方面，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。此方法描述于例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一个或多个不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法描述于例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
另一方面，改变一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的公开WO 94/29351中。在特定的方面，本披露的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被IgG1亚类和κ同种型的一个或多个同种异型氨基酸残基替代。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，如Jefferis等人,MAbs.[单克隆抗体]1:332-338(2009)所述。
在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。此方法描述于例如Presta的公开WO 00/42072中。此外，已经绘制了在人IgG1上与FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276:6591-6604,2001)。
在另一方面，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏或具有降低的糖基化)。例如，可以改变糖基化以增加抗体对“抗原”的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化途径的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化途径的细胞已经在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta的公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180,1999)。
在另一方面，如果所需的ADCC降低，许多先前的报道显示人抗体亚类IgG4仅具有适度的ADCC并且几乎没有CDC效应子功能(Moore G L等人,2010MAbs[单克隆抗体],2:181-189)。然而，发现天然IgG4在应激条件下(如在酸性缓冲剂中或在升高的温度下)较不稳定(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Dall'Acqua,W.等人,1998Biochemistry[生物化学],37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。降低的ADCC可以通过将抗体可操作地连接至用降低FcγR结合或C1q结合活性的改变的组合工程化的IgG4 Fc，从而降低或消除ADCC和CDC效应子功能来实现。考虑到抗体作为生物药物的物理化学性质，IgG4的较不期望的固有特性之一是其两条重链在溶液中动态分离以形成半抗体，这导致通过称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Vander Neut Kolfschoten M等人,2007Science[科学],317:1554-157)。228位(EU编号系统)丝氨酸突变为脯氨酸表现出对IgG4重链分离的抑制作用(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。据报道，铰链区和γFc区中的一些氨基酸残基对抗体与Fcγ受体的相互作用具有影响(Chappel S M等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报],88:9036-9040；Mukherjee,J.等人,1995FASEB J[美国实验生物学学会联合会杂志],9:115-119；Armour,K.L.等人,1999Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志],29:2613-2624；Clynes,R.A.等人,2000Nature Medicine[自然医学],6:443-446；Arnold J.N.,2007Annu Rev immunol[免疫学年鉴],25:21-50)。此外，在人群中一些罕见的IgG4同种型也可引起不同的物理化学特性(Brusco,A.等人,1998EurJ Immunogenet[欧洲免疫遗传学杂志],25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。为了产生具有低ADCC和CDC但具有良好稳定性的抗体，可以修饰人IgG4的铰链区和Fc区并引入许多改变。这些经修饰的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO:83-88，Li等人的美国专利号8,735,553中找到。
抗体产生
抗体及其抗原结合片段可通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本披露还提供了编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码包含本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:50组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:17、34或51组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本披露的多核苷酸可以编码抗CEA抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗CEA抗体的重链和轻链的可变区的多肽。
本披露还提供了用于产生抗CEA抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于表达载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有可操作地连接至编码抗CEA抗体链或抗原结合片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些方面，除了在诱导条件的控制下，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子外，其他调节元件也可以是有效表达抗CEA抗体或抗原结合片段所需要或期望的。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见，例如，Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；以及Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
用于携带并表达抗CEA抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本披露多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达抗CEA抗体。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的抗CEA抗体。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常死亡或正常或异常永生化动物或人细胞。例如，已经开发了几种能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK 293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽一般在例如Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,NY,N.Y.[从基因到克隆，纽约VCH出版社，纽约市],1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学综述]89:49-68,1986)和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
检测和诊断方法
本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于检测CEA的方法。在一方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中CEA的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在其他方面，此类组织包括相对于其他组织以更高水平表达CEA的正常和/或癌性组织。
在一方面，本披露提供了检测生物样品中CEA的存在的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与抗原结合的条件下，使生物样品与抗CEA抗体接触，并检测抗体与抗原之间是否形成复合物。生物样品可以包括但不限于尿液、组织、痰或血液样品。
还包括诊断与CEA表达相关的障碍的方法。在某些方面，该方法包括使测试细胞与抗CEA抗体接触；通过检测抗CEA抗体与CEA多肽的结合来测定测试细胞表达的CEA的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞相同组织来源的正常细胞或非CEA表达细胞)中的CEA表达水平进行比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中较高水平的CEA表达表明存在与CEA表达相关的障碍。
治疗方法
本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于治疗CEA相关障碍或疾病的方法。在一方面，CEA相关障碍或疾病是癌症。
在一方面，本披露提供了治疗癌症的方法。在某些方面，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗CEA抗体或抗原结合片段。癌症可包括但不限于胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文披露的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本披露的抗体或抗原结合片段可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。关于这点要考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所研究的障碍的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗体的量、障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％-99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为预防或治疗疾病，本披露的抗体或抗原结合片段的合适的剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的应答、以及主治医生的判断。抗体适当地以一次或经一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至100mg/kg的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直到出现疾病症状的期望抑制。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。施用初始较高负载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。但是，其他给药方案可以是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测此疗法的进展。
组合疗法
在一方面，本披露的抗CEA抗体可与其他治疗剂组合使用。可以与本披露的抗CEA抗体一起使用的其他治疗剂包括：但不限于化疗剂(例如，紫杉醇或紫杉醇药剂；(例如)、多西他赛；卡铂；托泊替康；顺铂；伊立替康、多柔比星、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂、培美曲塞二钠、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨、氟达拉滨、长春新碱、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、多激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如阿仑单抗)、泼尼松龙、达贝泊汀α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠)、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、CD-19靶向剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、mTOR抑制剂(例如坦罗莫司、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如BI672)。
在另一方面，抗CEA抗体可与抗PD1抗体组合使用。抗PD1抗体可包括但不限于替雷利珠单抗、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)或纳武利尤单抗(Nivolumab)。替雷利珠单抗披露于US 8,735,553中。由默克公司(Merck)披露于US 8,354,509和US 8,900,587中的帕博利珠单抗(以前称为MK-3475)是人源化lgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受体并抑制PD1受体配体PD-L1和PD-L2的结合。帕博利珠单抗已被批准用于转移性黑色素瘤和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的适应症，并且正在进行用于治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和难治性霍奇金淋巴瘤(cHL)的临床研究。纳武利尤单抗(如由百时美施贵宝公司(Bristol-MeyersSquibb)所披露的)是全人lgG4-K单克隆抗体。纳武利尤单抗(克隆5C4)披露于美国专利号US 8,008,449和WO 2006/121168中。纳武利尤单抗被批准用于治疗黑色素瘤、肺癌、肾癌、和霍奇金淋巴瘤。
药物组合物和配制品
还提供了包含抗CEA抗体或其抗原结合片段或包含编码抗CEA抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸的组合物，包括药物配制品。在某些实施例中，组合物包含一种或多种抗CEA抗体或抗原结合片段，或包含编码一种或多种抗CEA抗体或抗原结合片段的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物还可包含合适的载剂，如本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
通过将具有所需纯度的这种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备本文所述的抗CEA抗体或抗原结合片段的药物配制品(Remington'sPharmaceutical Sciences 16th edition[雷明顿药物科学第16版],Osol,A.编(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利号US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体配制品包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，后者的配制品包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌性可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
实例
实例1：抗CEA单克隆抗体的产生
用于免疫和结合测定的CEA重组蛋白
为了发现在含有结构域B3(SEQ ID NO:52的氨基酸596-674，参见Beauchemin等人,Mol.Cell Bio.[分子细胞生物学],1987,7(9):3321-3330)的膜周围区域与人和猕猴CEA发生交叉反应但不与其他人CEACAM成员脱靶结合的针对CEA的新抗体，设计并表达了几种重组蛋白用于抗体筛选(参见表2)。
将全长人CEA(SEQ ID NO:52)、猕猴CEA(SEQ ID NO:53)和全长人CEACAM6(SEQ IDNO:54)的cDNA编码区根据GenBank序列排序。对于人CEA(登录号：NM_004363.2)，该基因可获自Sinobio，目录号HG11077-UT。对于猕猴CEA(登录号：NM_001047125)，该基因可获自Genscript，目录号OMb23865D。对于人CEACAM6(登录号：NM_002483.4)，该基因可获自Sinobio，目录号HG10823-UT。CEA融合蛋白的示意图如图1所示。据报道，人CEA的剪接变体与全长CEA在肿瘤上同时表达(Peng等人,PloS one[公共科学图书馆：综合],7,e36412-e36412(2012))，并且因此制备了变体(CEA-v)。为了产生此构建体，将由huCEA(SEQ ID NO:55)的氨基酸(AA)1-687组成的细胞外结构域(ECD)的编码区、猴CEA(SEQ ID NO:56)的氨基酸(AA)1-690的区域和CEACAM6(SEQ ID NO:57)的氨基酸(AA)1-320的区域进行PCR扩增。将CEA氨基酸(AA)1-78(SEQ ID NO:58)和CEA的氨基酸398-687(SEQ ID NO:59)的区域进行PCR扩增，然后通过重叠PCR缀合以制备CEA变体(CEA-v)(SEQ ID NO:60)。替代性地，将CEACAM6氨基酸(AA)1-273(SEQ ID NO:61)的区域和含有CEA氨基酸(AA)596-687的结构域B3(SEQ ID NO:62)的膜周围区域进行PCR扩增，然后通过重叠PCR缀合以制备嵌合构建体(CHIM)(SEQ ID NO:63)。然后将所有构建体克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))中，其C末端分别与6xHis标签融合，从而产生五个重组融合蛋白表达质粒CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM。为了产生重组融合蛋白，将CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM质粒瞬时转染到基于HEK293的哺乳动物细胞表达系统(内部产生)中，并在装备有旋转振荡器的CO2培养箱中培养5-7天。收集含有重组蛋白的上清液并离心澄清。使用Ni-NTA琼脂糖(目录号R90115，英杰公司)纯化重组蛋白。将所有重组蛋白用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，并以小等分试样保存在-80℃冰箱中。
在细胞系中稳定表达
为了建立表达全长人CEA的稳定细胞系(登录号：NM_004363.2)，将表达CEA的cDNA克隆到逆转录病毒载体pFB-Neo(目录号217561，美国的安捷伦公司(Agilent,USA))中。根据先前的方案(Zhang等人,Blood.[血液]2005 106(5):1544-51)产生双嗜性逆转录病毒载体。将含有人CEA的病毒载体转导到L929(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA))和CT26细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)中，以产生人CEA表达细胞系。通过在含有10％ FBS和G418的完全RPMI1640培养基中培养来选择高表达细胞系，然后通过FACS结合测定来验证。
免疫、杂交瘤融合和克隆
用500μl含有或不含水溶性佐剂(目录号KX0210041，中国北京的康碧泉公司(KangBiQuan,Beijing,China))的1×107个L929/huCEA细胞腹膜内(i.p.)免疫八至十二周龄Balb/c小鼠(中国北京的华阜康生物科技有限公司(HFK BIOSCIENCE CO.,LTD,Beijing,China))。两周后重复该过程以促进抗体产生。第三次免疫后两周，通过ELISA和FACS评估小鼠血清的可溶性CEA(sCEA)结合。使用标准技术(Colligan JE等人,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY[免疫学实验手册],1993)分离脾细胞并与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)融合。
通过ELISA和FACS评估抗体的CEA结合活性
为了筛选结合人CEA但不结合CEACAM6或sCEA的抗体，筛选并反筛选结合CHIM但不结合sCEA、CEACAM6和CEA-v的抗体，以及结合CHIM、sCEA和CEA-v但不结合CEACAM6的抗体。杂交瘤克隆的上清液最初通过(Methods in Molecular Biology[分子生物学方法](2007)378:33-52)中所述的ELISA(略作修改)进行筛选。简而言之，将sCEA、CHIM、CEACAM6或CEA-v分别以3μg/ml的低浓度包被在96孔板中。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，美国的细胞传导技术公司(Cell Signaling Technology,USA))和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司(eBioscience,USA))进行显色，并使用酶标仪(SpectraMaxParadigmTM，美国的分子设备公司(Molecular Devices,USA))测量450nm波长处的吸光度信号。使用L929/huCEA和/或MKN45细胞(ATCC)通过FACS进一步验证ELISA阳性克隆。MKN45细胞来源于人胃癌。将表达CEA的细胞(105个细胞/孔)与ELISA阳性杂交瘤上清液一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，中国的碧云天生物技术公司(Beyotime Biotechnology,China))结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。
对来自杂交瘤的在FACS筛选中表现出阳性信号并且与CHIM而不是CEACAM6和sCEA结合的条件培养基进行功能测定，以评估sCEA的存在对CEA抗体与CEA表达细胞的结合的影响(参见下面的实例)。对具有所需结合特异性和功能活性的抗体进一步亚克隆和表征。
杂交瘤亚克隆和对无血清或低血清培养基的适应
主要通过ELISA、FACS和功能测定进行初步筛选后，通过有限稀释亚克隆阳性杂交瘤克隆。通过功能测定而验证的靠前抗体亚克隆在含3％ FBS的CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02，美国的海克隆公司(Hyclone,USA))中适应生长。
单克隆抗体的表达和纯化
将杂交瘤细胞在CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02，海克隆公司)中培养，并在37℃下、在CO2培养箱中孵育5至7天。通过离心收集条件培养基并在纯化前通过0.22μm膜过滤。依照制造商的指导中的方案应用含有鼠抗体的上清液并结合到蛋白A柱(目录号17127901，通用生命科学公司(GE Life Sciences))。该程序通常产生纯度高于90％的抗体。将蛋白A亲和纯化的抗体用PBS透析或使用HiLoad 16/60SuperdexTM200柱(目录号17531801，通用生命科学公司)进一步纯化以去除聚集物。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。将最终的抗体制剂以等分试样储存在-80℃冰箱中。
表2：氨基酸和核酸序列
实例2.CEA抗体的克隆和序列分析
根据制造商的方案，使用Ultrapure RNA试剂盒(目录号74104，德国的凯杰公司(QIAGEN,Germany))收获鼠杂交瘤细胞以制备总RNA。使用来自英杰公司的cDNA合成试剂盒(目录号18080-051)合成第一条链cDNA，并使用PCR试剂盒(目录号CW0686，中国北京的康为世纪公司(CWBio,Beijing,China))进行鼠单克隆抗体的VH和VL基因的PCR扩增。基于先前报道的序列(Brocks等人,Mol Med.[分子医学]2001 7(7):461-9)合成用于重链可变区(VH)和κ轻链可变区(VL)的抗体cDNA克隆的寡核苷酸引物。然后将PCR产物亚克隆到pEASY-Blunt克隆载体(目录号CB101-02，中国的全式金公司(TransGen,China))中，并测序。从DNA测序结果确定VH和VL区的氨基酸序列。
单克隆抗体通过比较序列同源性来分析，并基于序列相似性分组(图2)。根据IMGT(Lefranc等人,1999Nucleic Acids Research[核酸研究]27:209-212)系统通过序列注释来定义互补决定区(CDR)。代表性克隆BGA13的氨基酸序列在表3中列出。
表3：氨基酸序列
实例3.纯化的鼠抗CEA抗体的结合概况测定
通过使用BIAcoreTM T-200(通用生命科学公司)的SPR测定，表征了具有CEA特异性结合(如通过ELISA和FACS显示的)以及没有sCEA干扰的CEA抗体的结合动力学(图3A)。简言之，将抗鼠IgG抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100530，通用生命科学公司)上。使纯化的鼠抗体流过芯片表面并被抗鼠IgG抗体捕获。然后使纯化的CHIM、CEA-v、CEA或猴CEA重组蛋白的连续稀释液(6.0nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA13的结合亲和力概况在下表4中示出。
通过抗原ELISA检查BGA13的结合概况，观察到纯化的BGA13与huCEA和猴CEA的结合，这表明BGA13对可溶性huCEA和猴CEA是弱结合剂，或者可溶性CEA在固定时具有不同的构象(图3B)。对于该实验，将sCEA、CHIM、猴CEA、CEA-v和BSA以10μg/ml的高浓度在4℃下包被在96孔板中过夜。BGA13或对照抗体ab4451(目录号ab4451，美国的艾博抗公司(abcam,USA))以2μg/ml的浓度孵育1小时。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，美国的细胞传导技术公司)和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司)进行显色，并使用酶标仪(SpectraMax Paradigm，美国的分子设备公司)测量450nm波长处的吸光度信号。
表4：通过SPR比较BGA13结合亲和力
实例4.重组可溶性CEA对BGA13与CEA表达细胞的结合的影响
通过流式细胞术评估可溶性CEA的存在对各种CEA抗体与CEA表达细胞的特异性结合的影响。简言之，在20μg/ml额外的重组可溶性CEA蛋白的存在下，将表达人CEA的细胞(105个细胞/孔)与2μg/ml纯化的CEA鼠单克隆抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，中国的碧云天生物技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司)定量细胞荧光。如图4A和图4B所示，BGA13与CEA表达细胞的结合不受可溶性CEA存在的影响。
实例5.鼠抗人CEA抗体的人源化
mAb人源化和工程化
对于BGA13的人源化，通过在IMGT和NCBI的人免疫球蛋白基因数据库中进行序列比较，搜索人种系IgG基因中与BGA13可变区的cDNA序列具有高度同源性的序列。选择以高频率存在于人抗体库(Glanville等人，2009PNAS[美国国家科学院院刊]106:20216-20221)中并且与BGA13高度同源的人IGVH和IGVL基因作为人源化的模板。在人源化之前，将BGA13重链和轻链可变结构域分别与命名为人IgG1wt的野生型人IgG1恒定区(SEQ ID NO:87)和人κ恒定(CL)区(SEQ ID NO:88)融合。
表5：氨基酸序列
通过CDR移植进行人源化(Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第248卷:Antibody Engineering,Methods and Protocols[抗体工程、方法和方案],HumanaPress[胡马纳出版社])并将BGA13抗体以人IgG1形式工程化。在第一轮人源化中，框架区中从鼠到人氨基酸残基的突变由模拟的3D结构指导，并且在人源化抗体BGA13的第一版本BGA131中保留了对于维持CDR的规范结构具有结构重要性的鼠框架残基(重链和轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO:89和90中示出)。
表6：氨基酸序列
具体地，将BGA13 VL的CDR移植到保留了2个鼠框架残基(N66和V68)的人种系可变基因IGVK1-27的框架中(轻链可变结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:92中示出)。将BGA13VH的CDR移植到保留了5个鼠框架(L39、I53、Y55、N66、S68)残基的人种系可变基因IGVH1-46的框架中(重链可变结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:91中示出)。
表7：氨基酸序列
使用内部开发的表达载体将BGA13-1构建为人全长抗体形式，这些表达载体含有野生型人IgG1的恒定区，具有容易适应的亚克隆位点。通过将上述两种构建体共转染到293G细胞中并使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现BGA13-1抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
使用BGA131，进行额外数量的单个或多个氨基酸改变，将VH和VL框架区中的人残基转化为相应的鼠种系残基，其分别包括VH中的V68A、R72A和V79A以及VL中的V43S。这产生BGA132(VH中的V68A、R72A)、BGA133(VH中的V79A)、BGA134(VH中的V68A、R72A、V79A)、BGA135(VL中的V43S)、BGA136(VH中的V68A、R72A和VL中的V43S)、BGA137(VH中的V79A、VL中的V43S)和BGA138(VH中的V68A、R72A、V79A和VL中的V43S)。所有含有修饰的抗体都具有与BGA131相似的结合活性，并且没有一种改变消除结合。
为了去除翻译后修饰(PTM)位点，通过基于BGA131序列在CDR和框架区中引入突变来进行进一步工程化，这些突变包括VH区中的N52T、N54Q、N59S、N102G、N104Q和S61A氨基酸改变。这产生BGA131A(N52T(VH))、BGA131B(N54Q(VH))、BGA131C(N59S(VH))、BGA131D(N102G(VH))、BGA131E(N104Q(VH))和BGA131F(N54Q、N59S、S61A(VH))，并且所有抗体都具有与BGA131相似的结合特异性，没有一种改变消除结合。在保持特异性的同时，还考虑了氨基酸组成和表达水平。使用在特定位置含有突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，中国北京的全式金公司)进行所有人源化突变。通过序列分析验证所需的突变。与BGA13-1相比，BGA13-1F具有显著降低的结合亲和力，没有糖基化位点，但具有高表达水平(表8)。
表8：氨基酸序列
实例6.亲和力成熟文库的产生
通过标准分子生物学技术使用噬菌粒载体pCANTAB 5E(通用电气医疗集团(GEHealthcare))构建噬菌粒，该噬菌粒被设计成在M13噬菌体的表面上展示BGA13-1F Fab片段作为与基因-3次要外壳蛋白片段的N末端的融合体。在基因-3序列之前有一个琥珀终止密码子，以允许直接从噬菌粒克隆表达Fab片段。使用噬菌粒作为模板来构建含有108个独特成员的噬菌体展示文库。
构建两个文库(H-AM、L-AM)，分别随机化重链和轻链中的CDR位置。所有三个CDR在每个文库中随机化，但每个CDR在每个克隆中具有最多一个突变，HCDR3除外，其可具有两个同时突变。每个位置用编码任何氨基酸的NNK密码子(IUPAC编码)或琥珀终止密码子随机化。组合的重链和轻链文库设计具有5.0×106个独特全长克隆的潜在多样性，没有终止密码子或半胱氨酸密码子，并且预期分布分别为约0.02％、1.1％、17％和82％的克隆分别具有0、1、2和3个突变。由于HCDR3区域中的引物设计，预期一小部分重链克隆具有4个突变。作为第一步，使用pCANTAB 5E(作为模板)和含有随机化CDR3位置的引物扩增DNA片段(参见图5A和图5B)。然后将PCR产物凝胶纯化并与含有随机化CDR2位置的引物组装。用针对随机CDR1位置的引物重复该过程。然后通过重叠PCR将所得的重链或轻链的PCR产物与其相应的CH片段或CL片段组装。通过重叠PCR将片段进一步与没有突变的轻链或重链组装。然后将所得片段凝胶纯化，并在NcoI/NotI消化后与pCANTAB 5E连接。通过电穿孔将纯化的连接物转化到TG1细菌中。来自每个文库的48个克隆的测序证实了每个位置的随机化(数据未示出)，尽管由于取样深度有限，并非在每个位置都观察到所有的氨基酸突变。约52％和55％的轻链和重链文库具有全长随机克隆，足以覆盖设计的所有潜在多样性，即使在寡核苷酸合成和文库构建中存在适度的掺入偏差，也会产生108个独立克隆。
实例7.亲和力成熟的人源化BGA13变体的产生
文库选择和筛选
使用标准方案通过噬菌体展示进行亲和力成熟的人源化BGA13 Fab的产生(Silacci等人,(2005)Proteomics[蛋白质组学],5,2340-50；Zhao等人,(2014)PLoS One[公共科学图书馆：综合],9,e111339)。对于第一轮和第二轮选择，在免疫管(目录号470319，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))中对固定化的CHIM进行竞争选择。简言之，免疫管用1ml CHIM(5μg/ml的PBS溶液)在4℃下包被过夜。在各种浓度的BGA13-1F IgG(第1轮，1μg/ml；第2轮，5μg/ml)存在下，将所有亲和力成熟文库与包被的免疫管一起孵育1小时。对于第三轮和第四轮选择，使用L929/huCEA细胞(第3轮)或LOVO细胞(ATCC CCL-229)(第4轮)进行细胞淘选，其中HEK293细胞作为耗竭细胞。在四轮选择之后，挑选单个克隆并使用标准方案制备含有噬菌体的上清液。对ELISA阳性克隆测序，并分析突变位点。
CDR中的突变频率分析
在四轮选择之后，每个CDR中的突变频率相对较高，范围从HCDR3中的17％到LCDR2中的95％。关于重链，在H-AM文库中鉴定的约一半克隆与亲本克隆相同。其他克隆在HCDR2中的Q54N处含有一个回复突变。
在分析轻链时，突变更加多样化。两个位点分别在LCDR1的几乎所有克隆中都发生了突变。轻链残基29和31分别在47.09％和35.29％的克隆中从Ile突变为Gln和从Gly突变为Gln。位置29不仅具有高频率的Gln突变，而且具有突变为酪氨酸的克隆子集。位置31不仅具有高频率的Gln突变，而且有约12.5％的机会突变为Leu。由于文库设计限制，没有发现位置29和31的突变彼此结合。然而，这两个位点中的每一个中的突变通常与其他CDR中的突变组合。关于LCDR2，只有A51在至少64.71％的克隆中发生突变，但没有任何明显的模式，其包括大的疏水和极性残基，诸如Tyr、Phe、Thr和Asn。关于LCDR3，两个位点在至少50％的克隆中发生了突变。轻链残基90和92分别在11.76％和47.06％的克隆中从His突变为Leu和从Tyr突变为Leu。图6示出了四轮选择后轻链CDR区的序列差异。
所选择的人源化BGA13变体的表达
进行了突变的组合。将来自所选噬菌体克隆的轻链可变区亚克隆到人κ轻链表达哺乳动物表达载体中。将轻链表达载体与表达BGA13-1F重链的哺乳动物表达载体以1:1的比例共转染到293G细胞中。通过蛋白A亲和色谱法(目录号17543802，通用生命科学公司)从培养上清液中纯化CEA抗体形式。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
亲和力成熟的人源化BGA13变体的表征
通过使用BIAcoreTMT-200(通用生命科学公司)的SPR测定(表9)和流式细胞术(图7)进行BGA13-1F和其他亲和力成熟克隆的亲和力比较。对于该实验，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100839，通用生命科学公司)上。抗CEA抗体流过芯片表面并被抗人Fab抗体捕获。然后使CHIM的连续稀释液(1.37nM至333nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。对于流式细胞术，将表达CEA的细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的亲和力成熟抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司(BioLegend,USA))结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司)定量细胞荧光。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA131F-ph-L(SEQ ID NO:95)和BGA131F-ph-M(SEQID NO:96)显示出对huCEA表面蛋白的亲和力提高(表10)。
表9：通过SPR比较结合亲和力
表10：氨基酸序列
实例8.亲和力成熟的人源化BGA13变体的进一步工程化
通过在基于BGA131F-ph-M模板的CDR中引入突变进行了进一步的工程化，该模板包括VH中的W33Y、Q54N和S59N以及VL中的T51Y。这产生BGA1132A(W33Y(VH))、BGA1132B(Q54N(VH))、BGA 1132C(S59N(VH))、BGA 1131A(T51Y(VL))，它们都具有改进的与BGA-1131F的结合活性，其中改进最大的抗体最终产生具有(W33Y(VH)、T51Y(VL))改变的BGA113抗体(表11)，序列在表12中示出。
表11：通过SPR比较与CHIM的结合亲和力
样品ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
BGA1311F-ph-M 1.97E+04 2.48E-04 1.26E-08 97.2
1132A 1.99E+04 2.82E-04 1.42E-08 129.1
1132B 1.98E+04 3.80E-04 1.92E-08 71.1
1132C 1.84E+04 3.94E-04 2.15E-08 59.4
1131A 3.21E+04 4.63E-04 1.44E-08 92.9
113 3.15E+04 4.75E-04 1.51E-08 112.4
表12：BGA113的氨基酸和核酸序列
实例9.BGA113的优化
为了进一步改善生物化学/生物物理学性质，通过在CDR和框架区中引入取代来优化BGA113(表13)。选择大的疏水残基并将其改变为极性残基，K13和Q53除外，它们是基于观察到的人VH种系之间的差异而选择的。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(Tm)、表面疏水性和等电点(pI)，同时保持功能活性。如实例6所述，通过克隆到载体pCANTAB-5E中以Fab形式表达变体。然后通过ELISA和SPR分析筛选含有Fab的上清液的CEA结合。选择没有显著亲和力降低的变体并鉴定出可耐受取代的残基。证明轻链中的L92E，重链中的K13E、Q54E、Y57D/E和Y57K对亲和力的影响极小。因此，表达和纯化具有单个鉴定出的突变或组合的IgG形式的BGA113变体，如实例8中所述。进行SPR研究和FACS分析并总结在表14中。证实了特异性和表位没有由于引入的氨基酸取代而发生改变(数据未示出)。总之，结果表明这些单一或组合突变(重链中的K13E、Q54E、Y57D和Y57K，轻链中的L92E)对亲和力的影响极小，L92E除外，它略微降低了与CEA的结合亲和力。总之，Y57K改变优化了BGA113抗体的表达、CEA结合和亲和力，从而产生BGA113K(表1)。
表13：用于取代的残基的总结
残基 AA取代
H：K13 E
H：Y32 H、N、Q、D、E、K
H：Y33 H、N、Q、D、E、K
H：Q53 A、D、G、N、S、T、Y、R、H
H：Y57 H、N、Q、D、E、K
H：Y100 H、N、Q、D、E、K
H：Y105 H、N、Q、D、E、K
L：V15 T、P、L
L：Y30 H、N、Q、D、E、K
L：Y32 H、N、Q、D、E、K
L：Y49 H、N、Q、D、E、K
L：P80 S、T、A
L：L92 H、N、Q、D、E、K
表14：通过SPR对BGA113变体的亲和力测量的总结
实例10.抗CEA抗体BGA113K的结合概况
BGA113K和先前披露的CEA抗体(在U.S.2012/0251529中命名为抗体2F1)以人IgG1形式产生并使用BIAcoreTM T-200(通用生命科学公司)通过SPR测定表征它们的结合动力学。
为了获得该数据，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100839，通用生命科学公司)上。BGA113K抗体流过芯片表面并被抗人Fab抗体捕获。然后使可溶性huCEA或cynoCEA(目录号：CE5-C52H5，北京百普赛斯生物科技股份有限公司(Acrobiosystem))的连续稀释液(1.37nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA113K和2F1对照抗体表现出不同的结合亲和力。BGA113K对人CEA具有非常高的亲和力，对cynoCEA也具有相当的亲和力，如下表15所示。
对于流式细胞术，将表达CEA的MKN45细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的亲和力成熟抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司)定量细胞荧光。如图8所示，BGA-113K以剂量反应方式与活细胞上的天然CEA特异性结合，EC50为2.92μg/ml。
表15：通过SPR比较抗CEA抗体的结合亲和力
实例11.脱靶特异性的评估
通过ELISA和流式细胞术评估BGA113K的脱靶特异性。对于流式细胞术，将CEACAM3(SEQ ID NO:65)、CEACAM7(SEQ ID NO:66)或CEACAM8(SEQ ID NO:67)瞬时转染到HEK293细胞(105个细胞/孔)中，然后与2μg/ml纯化的BGA113K一起孵育，随后与Alexa Fluor-647标记的抗huIgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司)定量细胞荧光。对于抗原ELISA、CEACAM1(SEQ ID NO:64)(目录号10822-H08H，中国的义翘神州公司(Sino Biological,China))、CHIM(SEQ ID NO:63)、CEA(SEQ ID NO:55)或CEACAM6(SEQ ID NO:57)以10μg/ml的浓度在4℃下包被在96孔板中过夜。使用HRP-连接的抗人Fc(Fc特异性)IgG抗体(目录号A0170，美国的西格玛公司(Sigma,USA))和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司)进行显色，并使用酶标仪(SpectraMax Paradigm，美国的分子设备公司)测量450nm波长处的吸光度信号。如图9A至图9B所示，没有观察到与其他CEACAM家族成员的交叉反应性，因此BGA113K仅表现出对CEA的特异性(图9A-B中的CEACAM5)。
实例12.可溶性huCEA对BGA113K与CEA表达细胞的结合的影响
为了确定可溶性CEA(sCEA)是否对BGA113K的特异性结合有任何影响，将不同浓度(0、0.5、1、2μg/ml)的重组可溶性CEA与(0.01-100μg/ml)BGA113K预混合并孵育5分钟。然后将混合物与2×105个CEA表达细胞诸如MKN45细胞在4℃下孵育30分钟。将细胞用第二抗体抗huFc-APC(目录号409320，美国的百进生化技术公司)染色并通过流式细胞术分析。在2μg/ml重组sCEA存在下，BGA113K与CEA表达细胞的结合不受影响。该结果针对MKN45细胞显示(图10)，并表明BGA113K对CEA的膜结合形式的特异性。
实例13.BGA113诱导对CEA+肿瘤细胞的有效ADCC作用
为了确定野生型IgG1形式的BGA113是否可以诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，将表达CD16(V158)的NK92MI细胞(NK92MI/CD16V)用作效应细胞，并与表达CEA的小鼠结肠癌细胞(CT26-ATCC CRL-2638)共培养。在指定浓度(0.00005-5μg/ml)的BGA113存在下，以1:1的E:T比率进行共培养5小时，并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放确定细胞毒性。使用CytoToxTM96非放射性细胞毒性测定试剂盒(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))测量上清液中LDH的量，并根据制造商的说明计算特异性裂解的量。如图11所示，BGA113可在体外诱导ADCC，EC50为约6.7ng/ml。
实例14.BGA113的体内抗肿瘤功效
为了确定BGA113针对CEA+肿瘤细胞的体内功效，将NK92MI/CD16V细胞(5×106)与CT26/CEA细胞(106)混合并皮下注射到NCG小鼠中。在肿瘤注射当天开始，每周两次给予BGA113(0.12、0.62或3.1mg/kg)或媒介物对照(每组7只小鼠)。与媒介物相比，3.1mg/kg剂量的BGA113表现出少量的肿瘤抑制，尽管与媒介物对照的差异在统计学上不显著(P>0.05)(图12)。
参考文献
Abdul-Wahid,A.,M.Cydzik,N.W.Fischer,A.Prodeus,J.E.Shively,A.Martel,S.Alminawi,Z.Ghorab,N.L.Berinstein&J.Gariépy(2018)Serum-derivedcarcinoembryonic antigen(CEA)activates fibroblasts to induce a local re-modeling of the extracellular matrix that favors the engraftment of CEA-expressing tumor cells.International Journal of Cancer,143,1963-1977.
Abdul-Wahid,A.,E.H.B.Huang,M.Cydzik,E.Bolewska-Pedyczak&J.Gariépy(2014)The carcinoembryonic antigen IgV-like N domain plays a critical role inthe implantation of metastatic tumor cells.Molecular Oncology,8,337-350.
Augugliaro,R.,S.Parolini,R.Castriconi,E.Marcenaro,C.Cantoni,M.Nanni,L.Moretta,A.Moretta&C.Bottino(2003)Selective cross-talk among naturalcytotoxicity receptors in human natural killer cells.Eur J Immunol,33,1235-41.
Bacac,M.,C.Klein&P.Umana(2016)CEA TCB:A novel head-to-tail 2:1T cellbispecific antibody for treatment of CEA-positive solidtumors.Oncoimmunology,5,e1203498.
Barrow,A.D.,C.J.Martin&M.Colonna(2019)The Natural CytotoxicityReceptors in Health and Disease.Front Immunol,10,909.
Beauchemin,N.2017.CEA Gene Family.In Encyclopedia of Cancer,ed.M.Schwab,870-874.Berlin,Heidelberg:Springer Berlin Heidelberg.
Beck,A.,T.Wurch,C.Bailly&N.Corvaia(2010)Strategies and challenges forthe next generation of therapeutic antibodies.Nat Rev Immunol,10,345-52.
Biron,C.A.,K.B.Nguyen,G.C.Pien,L.P.Cousens&T.P.Salazar-Mather(1999)Natural killer cells in antiviral defense:function and regulation by innatecytokines.Annu Rev Immunol,17,189-220.
Brocks,B.,P.Garin-Chesa,E.Behrle,J.E.Park,W.J.Rettig,K.Pfizenmaier&D.Moosmayer(2001)Species-crossreactive scFv against the tumor stroma marker"fibroblast activation protein"selected by phage display from an immunizedFAP-/-knock-out mouse.Molecular medicine(Cambridge,Mass.),7,461-469.
Chau,I.,M.J.Allen,D.Cunningham,A.R.Norman,G.Brown,H.E.Ford,N.Tebbutt,D.Tait,M.Hill,P.J.Ross&J.Oates(2004)The value of routine serum carcino-embryonic antigen measurement and computed tomography in the surveillance ofpatients after adjuvant chemotherapy for colorectal cancer.J Clin Oncol,22,1420-9.
de St Groth,S.F.&D.Scheidegger(1980)Production of monoclonalantibodies:strategy and tactics.J Immunol Methods,35,1-21.
Dotan,E.,A.Starodub,J.Berlin,C.H.Lieu,M.J.Guarino,J.Marshall,J.R.Hecht,S.J.Cohen,W.A.Messersmith,P.P.Maliakal,W.A.Wegener,R.M.Sharkey&D.M.Goldenberg(2015)A new anti-CEA-SN-38 antibody-drug conjugate(ADC),IMMU-130,is active in controlling metastatic colorectal cancer(mCRC)in patients(pts)refractory or relapsing after irinotecan-containing chemotherapies:Initial results of a phase I/II study.Journal of Clinical Oncology,33,2505-2505.
Durbin,H.,S.Young,L.M.Stewart,F.Wrba,A.J.Rowan,D.Snary&W.F.Bodmer(1994)An epitope on carcinoembryonic antigen defined by the clinicallyrelevant antibody PR1A3.Proc Natl Acad Sci U S A,91,4313-7.
Engler,F.A.,J.R.Polli,T.Li,B.An,M.Otteneder,J.Qu&J.P.Balthasar(2018)"Catch-and-Release"Anti-Carcinoembryonic Antigen Monoclonal Antibody Leads toGreater Plasma and Tumor Exposure in a Mouse Model of Colorectal Cancer.JPharmacol Exp Ther,366,205-219.
Fischer,E.,K.Chaitanya,T.Wuest,A.Wadle,A.M.Scott,M.van den Broek,R.Schibli,S.Bauer&C.Renner(2012)Radioimmunotherapy of fibroblast activationprotein positive tumors by rapidly internalizing antibodies.Clin Cancer Res,18,6208-18.
Flamini,E.,L.Mercatali,O.Nanni,D.Calistri,R.Nunziatini,W.Zoli,P.Rosetti,N.Gardini,A.Lattuneddu,G.M.Verdecchia&D.Amadori(2006)Free DNAandcarcinoembryonic antigen serum levels:an important combination for diagnosisof colorectal cancer.Clin Cancer Res,12,6985-8.
Gangopadhyay,A.,D.A.Lazure&P.Thomas(1997)Carcinoembryonic antigeninduces signal transduction in Kupffer cells.Cancer Letters,118,1-6.
Gauthier,L.,A.Morel,N.Anceriz,B.Rossi,A.Blanchard-Alvarez,G.Grondin,S.Trichard,C.Cesari,M.Sapet,F.Bosco,H.Rispaud-Blanc,F.Guillot,S.Cornen,A.Roussel,B.Amigues,G.Habif,F.Caraguel,S.Arrufat,R.Remark,F.Romagne,Y.Morel,E.Narni-Mancinelli&E.Vivier(2019)Multifunctional Natural Killer Cell EngagersTargeting NKp46 Trigger Protective Tumor Immunity.Cell,177,1701-1713 e16.
Gold,P.&S.O.Freedman(1965)Demonstration of tumor-specific antigens inhuman colonic carcinomata by immunological tolerance and absorptiontechniques.J Exp Med,121,439-62.
Goldenberg,D.M.(1992)Cancer imaging with CEA antibodies:historicaland current perspectives.Int J Biol Markers,7,183-8.
S.(1999)The carcinoembryonic antigen(CEA)family:structures,suggested functions and expression in normal and malignanttissues.Seminars in Cancer Biology,9,67-81.
Hezareh,M.,A.J.Hessell,R.C.Jensen,J.G.van de Winkel&P.W.Parren(2001)Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizingantibody against human immunodeficiency virus type 1.J Virol,75,12161-8.
Hohenberger,P.,P.M.Schlag,T.Gerneth&C.Herfarth(1994)Pre-andpostoperative carcinoembryonic antigen determinations in hepatic resectionfor colorectal metastases.Predictive value and implications for adjuvanttreatment based on multivariate analysis.Ann Surg,219,135-43.
Hudspeth,K.,B.Silva-Santos&D.Mavilio(2013)Natural cytotoxicityreceptors:broader expression patterns and functions in innate and adaptiveimmune cells.Front Immunol,4,69.
Hurwitz,E.,I.Stancovski,M.Sela&Y.Yarden(1995)Suppression andpromotion of tumor growth by monoclonal antibodies to ErbB-2 differentiallycorrelate with cellular uptake.Proc Natl Acad Sci U S A,92,3353-7.
Igawa,T.,H.Tsunoda,Y.Kikuchi,M.Yoshida,M.Tanaka,A.Koga,Y.Sekimori,T.Orita,Y.Aso,K.Hattori&M.Tsuchiya(2010)VH/VL interface engineering topromote selective expression and inhibit conformational isomerization ofthrombopoietin receptor agonist single-chain diabody.Protein Eng Des Sel,23,667-77.
Koch,J.,A.Steinle,C.Watzl&O.Mandelboim(2013)Activating naturalcytotoxicity receptors of natural killer cells in cancer and infection.TrendsImmunol,34,182-91.
Kuespert,K.,S.Pils&C.R.Hauck(2006)CEACAMs:their role in physiologyand pathophysiology.Current Opinion in Cell Biology,18,565-571.
Kruse,P.H.,J.Matta,S.Ugolini&E.Vivier(2014)Natural cytotoxicityreceptors and their ligands.Immunol Cell Biol,92,221-9.
Lanier,L.L.(2015)NKG2D Receptor and Its Ligands in HostDefense.Cancer Immunol Res,3,575-82.
Lee,J.H.&S.-W.Lee(2017)The Roles of Carcinoembryonic Antigen in LiverMetastasis and Therapeutic Approaches.Gastroenterology Research and Practice,2017,11.
Lee,K.-A.,E.-A.Bae,Y.C.Song,E.-K.Kim,Y.-S.Lee,T.-G.Kim&C.-Y.Kang(2015)A multimeric carcinoembryonic antigen signal inhibits the activation ofhuman T cells by a SHP-independent mechanism:Apotential mechanism for tumor-mediated suppression of T-cell immunity.International Journal of Cancer,136,2579-2587.
Lefranc,M.P.,V.Giudicelli,C.Ginestoux,J.Bodmer,W.Muller,R.Bontrop,M.Lemaitre,A.Malik,V.Barbie&D.Chaume(1999)IMGT,the internationalImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res,27,209-12.
Liersch,T.,J.Meller,M.Bittrich,B.Kulle,H.Becker&D.M.Goldenberg(2007)Update of carcinoembryonic antigen radioimmunotherapy with(131)I-labetuzumabafter salvage resection of colorectal liver metastases:comparison of outcometo a contemporaneous control group.Ann Surg Oncol,14,2577-90.
Liu,L.,W.Zeng,M.A.Wortinger,S.B.Yan,P.Cornwell,V.L.Peek,J.R.Stephens,J.W.Tetreault,J.Xia,J.R.Manro,K.M.Credille,D.W.Ballard,P.Brown-Augsburger,V.Wacheck,C.K.Chow,L.Huang,Y.Wang,I.Denning,J.Davies,Y.Tang,P.Vaillancourt&J.Lu(2014)LY2875358,a neutralizing and internalizing anti-MET bivalentantibody,inhibits HGF-dependent and HGF-independent MET activation and tumorgrowth.Clin Cancer Res,20,6059-70.
Matsuoka,Y.,Y.Matsuo,K.Sugano,H.Ohkura,M.Kuroki&M.Kuroki(1990)Characterization of Carcinoembryonic Antigen-related Antigens in Normal AdultFeces.Japanese Journal of Cancer Research,81,514-519.
Mechetner,E.(2007)Development and characterization of mousehybridomas.Methods Mol Biol,378,1-13.
Moertel,C.G.,T.R.Fleming,J.S.Macdonald,D.G.Haller,J.A.Laurie&C.Tangen(1993)An evaluation of the carcinoembryonic antigen(CEA)test for monitoringpatients with resected colon cancer.Jama,270,943-7.
Nap,M.,M.L.Hammarstrom,O.Bormer,S.Hammarstrom,C.Wagener,S.Handt,M.Schreyer,J.P.Mach,F.Buchegger,S.von Kleist&et al.,(1992)Specificity andaffinity of monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigen.CancerRes,52,2329-39.
Nap,M.,K.Mollgard,P.Burtin&G.J.Fleuren(1988)Immunohistochemistry ofcarcino-embryonic antigen in the embryo,fetus and adult.Tumour Biol,9,145-53.
Oberst,M.D.,S.Fuhrmann,K.Mulgrew,M.Amann,L.Cheng,P.Lutterbuese,L.Richman,S.Coats,P.A.Baeuerle&S.A.Hammond(2014)CEA/CD3 bispecific antibodyMEDI-565/AMG 211 activation of T cells and subsequent killing of human tumorsis independent of mutations commonly found in colorectaladenocarcinomas.MAbs,6,1571-84.
Pegram,H.J.,D.M.Andrews,M.J.Smyth,P.K.Darcy&M.H.Kershaw(2011)Activating and inhibitory receptors of natural killer cells.Immunol CellBiol,89,216-24.
Peng,L.,M.D.Oberst,J.Huang,P.Brohawn,C.Morehouse,K.Lekstrom,P.A.Baeuerle,H.Wu,Y.Yao,S.R.Coats,W.Dall'Acqua,M.Damschroder&S.A.Hammond(2012)The CEA/CD3-bispecific antibody MEDI-565(MT111)binds a nonlinearepitope in the full-length but not a short splice variant of CEA.PloS one,7,e36412-e36412.
Poul,M.A.,B.Becerril,U.B.Nielsen,P.Morisson&J.D.Marks(2000)Selectionof tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries.J MolBiol,301,1149-61.
Primrose,J.N.,R.Perera,A.Gray,P.Rose,A.Fuller,A.Corkhill,S.George&D.Mant(2014)Effect of 3 to 5 years of scheduled CEA and CT follow-up todetect recurrence of colorectal cancer:the FACS randomized clinicaltrial.Jama,311,263-70.
Richman,P.I.&W.F.Bodmer(1987)Monoclonal antibodies to humancolorectal epithelium:markers for differentiation and tumourcharacterization.Int J Cancer,39,317-28.
Ridgway,J.B.,L.G.Presta&P.Carter(1996)'Knobs-into-holes'engineeringof antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng,9,617-21.
Saito,G.,S.Sadahiro,K.Okada,A.Tanaka,T.Suzuki&A.Kamijo(2016)Relationbetween Carcinoembryonic Antigen Levels in Colon Cancer Tissue and SerumCarcinoembryonic Antigen Levels at Initial Surgery and Recurrence.Oncology,91,85-9.
Sakurai,Y.,S.Hirohashi,T.Ohishi,Y.Shimosato,S.Kodaira&O.Abe(1989)Conformational epitopes specific to carcinoembryonic antigen defined bymonoclonal antibodies raised against colon cancer xenografts.J Surg Oncol,42,39-46.
Sheahan,K.,M.J.O'Brien,B.Burke,P.A.Dervan,J.C.O'Keane,L.S.Gottlieb&N.Zamcheck(1990)Differential reactivities of carcinoembryonic antigen(CEA)andCEA-related monoclonal and polyclonal antibodies in common epithelialmalignancies.Am J Clin Pathol,94,157-64.
Shinmi,D.,R.Nakano,K.Mitamura,M.Suzuki-Imaizumi,J.Iwano,Y.Isoda,J.Enokizono,Y.Shiraishi,E.Arakawa,K.Tomizuka&K.Masuda(2017)Novelanticarcinoembryonic antigen antibody-drug conjugate has antitumor activityin the existence of soluble antigen.Cancer Med,6,798-808.
Silacci,M.,S.Brack,G.Schirru,J.Marlind,A.Ettorre,A.Merlo,F.Viti&D.Neri(2005)Design,construction,and characterization of a large synthetichuman antibody phage display library.Proteomics,5,2340-50.
Stern,N.,G.Markel,T.I.Arnon,R.Gruda,H.Wong,S.D.Gray-Owen&O.Mandelboim(2005)Carcinoembryonic Antigen(CEA)Inhibits NK Killing via Interaction withCEA-Related Cell Adhesion Molecule 1.The Journal of Immunology,174,6692-6701.
Stewart,L.M.,S.Young,G.Watson,S.J.Mather,P.A.Bates,H.A.Band,R.W.Wilkinson,E.L.Ross&D.Snary(1999)Humanisation and characterisation ofPR1A3,a monoclonal antibody specific for cell-bound carcinoembryonicantigen.Cancer Immunol Immunother,47,299-306.
Takahashi,T.,S.Minami,Y.Tsuchiya,K.Tajima,N.Sakai,K.Suga,S.I.Hisanaga,N.Ohbayashi,M.Fukuda&H.Kawahara(2019)Cytoplasmic control of Rabfamily small GTPases through BAG6.EMBO Rep,20.
Thompson,J.A.,F.Grunert&W.Zimmermann(1991)Carcinoembryonic antigengene family:Molecular biology and clinical perspectives.Journal of ClinicalLaboratory Analysis,5,344-366.
Wong,J.Y.,D.Z.Chu,L.E.Williams,D.M.Yamauchi,D.N.Ikle,C.S.Kwok,A.Liu,S.Wilczynski,D.Colcher,P.J.Yazaki,J.E.Shively,A.M.Wu&A.A.Raubitschek(2004)Pilot trial evaluating an 123I-labeled 80-kilodalton engineeredanticarcinoembryonic antigen antibody fragment(cT84.66 minibody)in patientswith colorectal cancer.Clin Cancer Res,10,5014-21.
Wu,J.,Y.Song,A.B.Bakker,S.Bauer,T.Spies,L.L.Lanier&J.H.Phillips(1999)An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10.Science,285,730-2.
Wu,T.T.&E.A.Kabat(1970)An analysis of the sequences of the variableregions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and theirimplications for antibody complementarity.J Exp Med,132,211-50.
Zhang,T.,B.A.Lemoi&C.L.Sentman(2005)Chimeric NK-receptor-bearing Tcells mediate antitumor immunotherapy.Blood,106,1544-1551.
Zhang,T.,X.Song,L.Xu,J.Ma,Y.Zhang,W.Gong,Y.Zhang,X.Zhou,Z.Wang,Y.Wang,Y.Shi,H.Bai,N.Liu,X.Yang,X.Cui,Y.Cao,Q.Liu,J.Song,Y.Li,Z.Tang,M.Guo,L.Wang&K.Li(2018)The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has aprofound impact on its biological functions.Cancer Immunol Immunother,67,1079-1090.
Zhao,L.,L.Qu,J.Zhou,Z.Sun,H.Zou,Y.Y.Chen,J.D.Marks&Y.Zhou(2014)Highthroughput identification of monoclonal antibodies to membrane bound andsecreted proteins using yeast and phage display.PLoS One,9,e111339.

Claims (22)

1.一种抗CEA抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:52的氨基酸596至674处特异性结合人CEA的抗体或其结合片段。
2.如权利要求1所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不与其他CEACAM家族成员结合。
3.如权利要求1所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1(轻链互补决定区1)、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；或
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2、(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3。
4.如权利要求3所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:48至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
6.如权利要求1所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:31的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(VL)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
9.如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或是低岩藻糖基化的。
10.如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
11.如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是IgG1。
12.如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段，其中该抗体缀合到毒素。
13.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或其抗原结合片段，进一步包含药学上可接受的载剂。
14.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。
15.如权利要求14所述的方法，其中该癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
16.如权利要求14所述的方法，其中该抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
17.如权利要求16所述的方法，其中该治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
18.如权利要求16所述的方法，其中该治疗剂是抗PD1或抗PDL1抗体。
19.一种分离的核酸，其编码如权利要求1至7中任一项所述的抗CEA抗体或抗原结合片段。
20.一种载体，其包含如权利要求19所述的核酸。
21.一种宿主细胞，其包含如权利要求19所述的核酸或如权利要求20所述的载体。
22.一种用于生产抗CEA抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养如权利要求21所述的宿主细胞以及从培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
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