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CN117384308A - 一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途 - Google Patents

一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途 Download PDF

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CN117384308A
CN117384308A CN202311332245.XA CN202311332245A CN117384308A CN 117384308 A CN117384308 A CN 117384308A CN 202311332245 A CN202311332245 A CN 202311332245A CN 117384308 A CN117384308 A CN 117384308A
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polysaccharide
galactose
radix tetrastigme
fermentation
thdp2
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CN202311332245.XA
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程俊文
贺亮
魏海龙
胡传久
程诗明
黄旭波
王衍彬
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Zhejiang Academy of Forestry
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Zhejiang Academy of Forestry
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Abstract

本发明公开了一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途。该三叶青多糖由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3‑O‑甲基‑半乳糖组成，其摩尔比为8.5‑11.0:1.5‑3:0.8‑1.5：1.0。该三叶青多糖是从桑黄发酵三叶青中提取分离纯化得到。该三叶青多糖具有显著的抗肿瘤活性和调节肠道菌群结构功效，可以直接作为抗肿瘤和/或调节肠道菌群结构功能品，也可用于制备抗肿瘤和/或调节肠道菌群结构功能产品。

Description

一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途
技术领域
本发明属于天然产物和多糖技术领域，具体涉及一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属植物，别名：金线吊葫芦，学名：三叶崖爬藤，是浙江、福建等地区传统习用青草药，以地下块根和果实的药用效果最好。现代药理研究表明三叶青具有抗炎、镇痛及解热、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等作用。三叶青因其具有解热、抗增生、抗炎等多种保健功效，常被用作膳食补充剂。
三叶青中含有多糖、黄酮、多酚等活性成分和淀粉、蛋白质等营养成分，传统的提取、分离其活性成分工艺中，淀粉、蛋白质、刺激性成分等成分会一道提取出，增加了分离中的处理步骤，导致最终产品中的活性成分含量偏低、活性偏低。
现有三叶青多糖是采用传统的提取、分离方法得到的。中国专利ZL201711200506.7公开了一种三叶青多糖的制备方法及其应用，以三叶青藤叶为原料，按照如下步骤依次实施：(1)热水浸提；抽滤收集滤液；真空浓缩；浓缩液加入乙醇；收集沉淀，即三叶青粗多糖。(2)将粗多糖溶于水，加入Sevag试剂；搅拌后离心除蛋白层和有机层，重复此步操作多次至不出现蛋白为止；(3)将除蛋白后的多糖溶于去离子水中，通过DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析得到三叶青多糖单一组分。所得到三叶青多糖，可显著降低机体血糖血脂，改善机体内抗氧化酶酶活力水平，并对胰岛具有一定修复作用，具有很好的药用价值和市场价值。如能基于三叶青开发更多具有应用价值、安全环保的活性物质比如活性多糖，将具有积极的意义。
发明内容
本发明发现三叶青块根中90％以上是粘性高分子，分子量高的淀粉，导致三叶青中活性多糖难以释放。然而淀粉是桑黄真菌发酵的丰富碳源，可以在食品加工过程中充分利用。
基于上述发现，本发明提供了一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途。本发明通过研究发现，基于桑黄菌发酵后获得新的三叶青多糖具有极佳的体外抗肿瘤功效和调节肠道菌群结构功效，可用于食品、保健品、药品和日化用品等诸多领域。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明还提供了所述三叶青多糖的制备方法，该方法具有操作简单、易于控制的优点，适于工业化大规模生产。
本发明还提供了所述基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖的用途，其具有显著的抗肿瘤活性和调节肠道菌群结构功效，可以直接作为抗肿瘤和/或调节肠道菌群结构功能品，也可用于制备抗肿瘤和/或调节肠道菌群结构功能产品。
本发明桑黄菌发酵的作用主要有两个方面：一方面通过接入桑黄菌发酵产生的生物酶将三叶青中的淀粉类非活性物质酶解，便于活性多糖的释放和提取；另一方面获得本发明特定结构的活性三叶青多糖。
一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖，由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖组成，其中半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖的摩尔比为8.5-11.0:1.5-3:0.8-1.5：1.0。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述半乳糖为α-半乳糖和β-半乳糖，进一步优选为α-D-半乳糖和β-D-半乳糖。
所述甘露糖为α-甘露糖，进一步优选为α-D-甘露糖。
所述岩藻糖为α-岩藻糖，进一步优选为α-L-岩藻糖。
所述3-O-甲基-半乳糖为α-3-O-甲基-半乳糖，进一步优选为α-3-O-甲基-D-半乳糖。
所述多糖的结构单元优选主链结构为(1→2)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖(α-D-Manp)残基；在主链上有一个(1→2)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位上被β-D-半乳糖(β-D-Galp)端基取代，主链上连续的两个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被一条由(1→6)连接的α-3-O-甲基-D-半乳糖(α-3-O-Me-Galp)残基和β-D-半乳糖端基组成的第一支链取代、以及一个α-L-岩藻糖(α-L-Fucp)端基取代。
进一步优选，所述主链结构为(1→2)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基依次连接。
本发明三叶青多糖主链上的三个支链有多种不同的变化组合，β-D-半乳糖端基可取代主链上任意一个(1→2)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位，第一支链和一个α-L-岩藻糖(α-L-Fucp)端基在连续的两个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上可按任意顺序排列，例如可具有如图5a所示的结构单元，图5a所示的结构单元仅作为两个端基以及第一支链一种排列顺序的示例，并不用于限制两个端基以及第一支链的排列顺序。
图5a中，Galp为吡喃型半乳糖，Manp为吡喃型甘露糖，Fucp为吡喃型岩藻糖。图5a所示结构为一个重复单元，具体重复单元的数量依据三叶青多糖的分子量来确定。
可选地，所述基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖的重均分子量优选为10KDa-15KDa，进一步优选12KDa-13KDa，最优选12.3KDa-12.8KDa。
所述基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖可采用水溶性多糖的制备方法从桑黄发酵三叶青中提取分离纯化得到，优选由桑黄菌发酵三叶青-热水浸提分离纯化得到。包括：通过桑黄菌发酵三叶青-水提醇沉、Sevage试剂去蛋白得到桑黄菌发酵三叶青粗多糖，经阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，冷冻干燥得到基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖。具体技术方案如下：
一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖的制备方法，包括步骤：
(1)发酵三叶青粗多糖的制备：采用桑黄菌发酵三叶青块茎，发酵产物经水提取、醇沉、去除蛋白质和冻干上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(编号为F-THDP)；
(2)纯化：将步骤(1)中得到的经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(F-THDP)的水溶液，经二乙氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)离子交换剂填充的柱层析，收集经0.15mol/L-0.3mol/LNaCl水溶液洗脱的洗脱液再经凝胶过滤层析，收集含多糖的洗脱液，经透析、冻干得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖(编号为F-THDP2)。
为了达到更好的发明效果，优选：
本发明桑黄菌选用桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，可采用市售产品。
步骤(1)中，包括：将三叶青块茎切薄片，灭菌，冷却后接种桑黄菌，发酵培养，发酵产物用水在90℃-100℃下提取得到水提液，浓缩，得到浓缩液，浓缩液经醇沉所得沉淀用Sevage试剂去除蛋白质，冻干上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖。
所述发酵培养的条件采用桑黄菌适宜的培养条件即可，优选发酵培养的条件为：温度24℃-28℃，湿度50％-65％，培养时间为18天-25天。
所述发酵产物用水提取的步骤，水作为提取溶剂，用量没有严格的限制，可选用占发酵产物重量2倍量-6倍量的水。发酵产物用水在90℃-100℃下提取的时间以至少2小时为宜。
所述醇沉步骤采用本领域常用的醇沉试剂，优选地采用乙醇或乙醇水溶液进行醇沉。所述乙醇水溶液选用体积百分浓度大于等于90％的乙醇水溶液。
所述Sevage试剂采用本领域常用的Sevage试剂，优选地采用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比优选为4:1。
步骤(2)中，所述经DEAE纤维素离子交换剂填充的柱层析的条件优选为：以NaCl水溶液的浓度从0-0.7mol/L梯度递增溶液进行洗脱。
所述经DEAE纤维素离子交换剂可选用市售产品，例如DEAE纤维素-52离子交换剂等。
所述凝胶过滤层析选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱过滤层析，可选用市售产品，例如Sephacryl S系列(SephacrylS-100)等。
所述凝胶过滤层析的条件优选为：用0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。
所述磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，例如可参照《中国药典》。
所述透析选用孔径为5000Da-8000Da的透析袋，以去除小分子。
本发明基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2具有良好的抗肿瘤活性。例如：F-THDP2在0.6mg/mL浓度时，对MCF-7、A549和HeLa三种肿瘤细胞的抑制率在51.63％-57.51％，比未发酵三叶青多糖THDP2对上述三种肿瘤细胞的抑制率有显著增强。
本发明基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2作用在小鼠体内，与未发酵三叶青多糖THDP2、空白对照组作用在小鼠体内相比，能够显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌等肠道有益菌的数量、降低大肠杆菌数等肠道致病菌的数量，从而调节肠道菌群结构，增强肠道微生物蠕动。本发明基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2具有调节肠道菌群结构活性(促进肠道益生菌增殖例如促进肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖、抑制肠道易致病菌增殖例如抑制肠道大肠杆菌的增殖)、增强肠道微生物蠕动活性。
因此，本发明基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2可以直接作为抗肿瘤功能品，也可用于制备抗肿瘤的功能产品。本发明基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2还可以直接作为增强肠道微生物蠕动功能品例如调节肠道菌群结构功能品，也可用于制备增强肠道微生物蠕动功能产品例如调节肠道菌群结构功能品。所述功能产品包括食品、保健品、药品或日化用品等。例如，所述基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖F-THDP2可用于制备抗肿瘤的食品、抗肿瘤的保健品、抗肿瘤的药品、增强肠道微生物蠕动的食品、增强肠道微生物蠕动的保健品、增强肠道微生物蠕动的药品等。
本发明所用的原料、试剂、耗材、仪器等均可采用市售产品。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明根据三叶青营养成分和有效成分特点，针对目前三叶青产品中淀粉类非活性成分含量高等缺陷，通过接入桑黄菌发酵产生的生物酶将三叶青中的淀粉类非活性物质酶解，制备的三叶青发酵后多糖在抗肿瘤、增强肠道微生物蠕动方面具有良好的生物活性，使三叶青资源得到充分利用。该制备工艺方法能够有效地将三叶青中的营养成分和有效成分进行生物降解和利用、有助于提高最终产品中活性多糖的活性。本发明方法原料来源天然、质量可控，对环境无污染，适于工业化生产。
本发明桑黄发酵的三叶青多糖F-THDP2的高级结构与原先未发酵前的三叶青多糖完全不同，其生物活性也高低不一样。经桑黄菌发酵后，新产生的三叶青多糖药用价值更高。本发明桑黄发酵的三叶青多糖F-THDP2有良好生物活性，例如良好的抗肿瘤活性、良好的增强肠道微生物蠕动活性，具有广泛的实际应用价值。本发明桑黄发酵的三叶青多糖F-THDP2的获得方法操作方便，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，可工业化推广生产。
本发明研究了桑树桑黄发酵的三叶青多糖F-THDP2结构和活性的变化。与未发酵的三叶青多糖THDP2相比，桑树桑黄发酵的三叶青多糖F-THDP2的主要单糖组成和分子量发生了显著变化。F-THDP2分子量为12.3KDa-12.8KDa。此外，F-THDP2与THDP2的糖苷链存在显著差异，在F-THDP2中建立了1,2-linkedα-D-Galp和1,6-linkedα-D-Manp主干，这与THDP2中1,4-linkedα-D-Glcp和1,4-linkedβ-D-Galp主干明显不同。此外，F-THDP2在水溶液中表现出比THDP2更灵活的链构象。引人注目的是，与原始多糖相比，F-THDP2通过Fas/fasl介导的Caspase-3信号通路对HeLa细胞表现出更好的抑制作用。这些结构和生物活性的变化表明，桑黄菌的发酵修饰是一种很有前景的新方法，可以有效地将三叶青中淀粉和其他多糖转化为具有高生物活性的生物大分子，在工业中具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖F-THDP水溶液经DEAE纤维素-52离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm，记作A490)曲线，Tube numbers为管数。
图2为实施例1中经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-100)纯化后的含多糖F-THDP2洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube numbers为管数。
图3为多糖乙酰化产物的GC-MS图谱；A为标准品对照图谱，B为发酵前三叶青多糖THDP2样品图谱；C为发酵后三叶青多糖F-THDP2样品图谱；其中，纵坐标RelativeAbundance为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)，Rham为鼠李糖，Rib为核糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖，Xyl为木糖，Man为甘露糖，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖。
图4a为F-THDP2的1H-NMR图谱，图4b为F-THDP2的13C-NMR图谱，图4c为F-THDP2的HSQC图谱，图4d为F-THDP2的COSY图谱，图4e为F-THDP2的TCOSY图谱，图4f为F-THDP2的1H-13C HMBC图谱，图4g为F-THDP2的NOESY图谱。
图5a为F-THDP2的结构式；图5b为THDP2的结构式。
图6a为THDP2的1H-NMR图谱，图6b为THDP2的13C-NMR图谱，图6c为THDP2的HSQC图谱，图6d为THDP2的COSY图谱，图6e为THDP2的TCOSY图谱，图6f为THDP2的1H-13C HMBC图谱，图6g为THDP2的NOESY图谱。
图7a为THDP2的激光光散射图；图7b为F-THDP2的激光光散射图；图7c为F-THDP2的分子量Mw与粘度[η]对数图；其中，纵坐标Relative Scale为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)；
图8a为THDP2的二维原子力显微镜(AFM)图谱；图8b为图8a形貌中直线高度测量值曲线图；图8c为图8a形貌中直线能谱曲线图；图8d为F-THDP2的二维原子力显微镜图谱；图8e为图8d形貌中直线高度测量值曲线图；图8f为图8d形貌中直线能谱曲线图。
图9为对比例1中未经桑黄菌发酵的三叶青粗多糖THDP水溶液经DEAE纤维素-52离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm，记作A490)曲线，Tubenumbers为管数。
图10为对比例1中经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-100)纯化后的含多糖THDP2洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube numbers为管数。
具体实施方式
以下结合具体实施例以及附图与对本发明作进一步详细描述，但并不用于限制本发明技术方案的可实施范围。
桑黄菌采用桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)。
实施例1
(1)发酵三叶青粗多糖的制备：取采用真空冷冻干燥法干燥得到的三叶青块茎500g，切成3mm±2mm的薄片，121℃灭菌25min，冷却至室温后接种桑黄菌；在密封的三角烧瓶中，湿度保持在58％±2％，在26℃下发酵培养20天，所得的发酵产物用发酵产物重量3倍量蒸馏水在95℃±5℃下提取2.5h，水提液浓缩得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇至浓缩液终浓度为80％(v/v)进行醇沉，所得沉淀采用Sevage试剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)去除蛋白质，冻干此上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(编号为F-THDP)。
(2)纯化：将步骤(1)中得到的经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(F-THDP)进行分离纯化。将样品粗多糖水溶液(15mg/mL)10mL注入到DEAE纤维素-52离子交换剂填充的柱(6.5cm×40cm)中，以NaCl水溶液的梯度递增(0-0.7mol/L)溶液进行洗脱，流速为2.5mL/min；每管取6mL依次收集洗脱液，用苯酚-硫酸法测定各管洗脱液在490nm的吸光度，结果见图1，收集的0.05mol/L-0.1mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作F-THDP1，收集的0.15mol/L-0.3mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作F-THDP2，收集的0.35mol/L-0.5mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作F-THDP3。对图1中含多糖F-THDP1的洗脱液、含多糖F-THDP2的洗脱液和含多糖F-THDP3的洗脱液分别进行透析(孔径为5000Da-8000Da的透析袋)，各透析液分别通过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-100)柱(1.2cm×90cm)层析，上样量5mL，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)和0.15mol/LNaCl水溶液(磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)以流速0.5mL/min洗脱；每管收集3mL洗脱液，用苯酚-硫酸法测定各管洗脱液在490nm的吸光度，收集层析后富含多糖F-THDP2的洗脱液，结果见图2；收集层析后富含多糖F-THDP1的洗脱液，收集层析后富含多糖F-THDP3的洗脱液。富含多糖F-THDP2的洗脱液经透析(孔径为5000Da-8000Da的透析袋)后，将透析液冻干得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖组分F-THDP2。富含多糖F-THDP1的洗脱液经透析(孔径为5000Da-8000Da的透析袋)后，将透析液冻干得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖组分F-THDP1。富含多糖F-THDP3的洗脱液经透析(孔径为5000Da-8000Da的透析袋)后，将透析液冻干得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖组分F-THDP3。
对比例1
(1)三叶青粗多糖的制备：取采用真空冷冻干燥法干燥得到的三叶青块茎500g，用蒸馏水在95℃±5℃下提取2.5h，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇至浓缩液终浓度为80％(v/v)进行醇沉，所得沉淀采用Sevage试剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)去除蛋白质，冻干上清液得到三叶青发酵前粗多糖(编号为THDP)。
(2)纯化：将步骤(1)中得到的三叶青粗多糖(THDP)按实施例1中的纯化步骤进行分离纯化，其中，收集的0.05mol/L-0.1mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作THDP1，收集的0.15mol/L-0.3mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作THDP2，收集的0.35mol/L-0.5mol/LNaCl水溶液的洗脱液中的多糖记作THDP3。最终得到发酵前三叶青多糖组分THDP2。
实施例2
(1)发酵三叶青粗多糖的制备：取采用真空冷冻干燥法干燥得到的三叶青块茎500g，切成3mm±2mm的薄片，120℃灭菌30min，冷却至24℃后接种桑黄菌；在密封的三角烧瓶中，湿度保持在55％±5％，在24℃下发酵培养25天，所得的发酵产物用发酵产物重量6倍量蒸馏水在95℃±5℃下提取4h，水提液浓缩得到浓缩液，在浓缩液中加入体积百分浓度90％的乙醇水溶液至浓缩液终浓度为80％(v/v)进行醇沉，所得沉淀采用Sevage试剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)去除蛋白质，冻干此上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(编号为F-THDP)。
(2)纯化：将三叶青粗多糖(F-THDP)水溶液(20mg/mL)10mL注入到DEAE纤维素-52离子交换剂填充的柱(6.5cm×40cm)中，其中Sephacryl S-100柱(1.2cm×90cm)层析时用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)和0.15mol/LNaCl水溶液(磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)以流速0.5mL/min洗脱，其余操作同实施例1，得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖组分F-THDP2。
实施例3
(1)发酵三叶青粗多糖的制备：取采用真空冷冻干燥法干燥得到的三叶青块茎500g，切成3mm±2mm的薄片，125℃灭菌20min，冷却至25℃后接种桑黄菌；在密封的三角烧瓶中，湿度保持在60％±5％，在28℃下发酵培养18天，所得的发酵产物用发酵产物重量2倍量蒸馏水在95℃±5℃下提取2h，水提液浓缩得到浓缩液，在浓缩液中加入体积百分浓度95％的乙醇水溶液至浓缩液终浓度为80％(v/v)进行醇沉，所得沉淀采用Sevage试剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)去除蛋白质，冻干此上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖(编号为F-THDP)。
(2)纯化：将三叶青粗多糖(F-THDP)水溶液(25mg/mL)10mL注入到DEAE纤维素-52离子交换剂填充的柱(6.5cm×40cm)中，其余操作同实施例1，得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖组分F-THDP2。
关于三叶青发酵前后多糖结构鉴定和性能分析：
一、单糖组成
取多糖3mg，放入薄壁长试管中，加入2.0mol/L三氟乙酸4.0mL，封管，110℃水解2h。水解后，试管中溶液在低于40℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，“加入甲醇蒸干”的步骤重复操作4-5次，以完全除去三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。
将各种单糖标准品和完全酸水解的样品分别溶于3mL蒸馏水中，加入30mg硼氢化钠，密塞，于室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的硼氢化钠，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复“加入少量甲醇，减压浓缩蒸干”步骤4-5次。再加入醋酐(乙酸酐)4mL，100℃反应1h，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，得到乙酰化后的产物。将各乙酰化后的产物分别用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入等量的蒸馏水充分混匀，待静置后，除去上层水溶液，如此重复3-4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥、过滤，用氯仿定容至10mL，即得乙酰化产物，待GC-MS分析。
GC-MS条件：采用DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温(初始柱温为120℃，以10℃/min升温至240℃，保持6.5min)，接口温度250℃，离子源温度250℃，进样量2.0μL，以氦气做载气，流速1.0mL/min。
发酵后多糖F-THDP2水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱如图3C，发酵前多糖THDP2水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱如图3B，对应单糖标准品谱图(图3A)显示：
实施例1中多糖F-THDP2的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖组成，其中D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖的摩尔比为12.6:2.3:1.0，F-THDP2中不含葡萄糖，而半乳糖的含量急剧增加，半乳糖是F-THDP2的主要单糖，半乳糖的摩尔百分比为79.25％。
实施例2中多糖F-THDP2的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖组成，其中D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖的摩尔比为11.8:2.6:1.0，F-THDP2中不含葡萄糖，而半乳糖的含量急剧增加，半乳糖是F-THDP2的主要单糖，半乳糖的摩尔百分比为76.62％。
实施例3中多糖F-THDP2的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖组成，其中D-半乳糖、D-甘露糖和L-岩藻糖的摩尔比为12.0:2.0:1.0，F-THDP2中不含葡萄糖，而半乳糖的含量急剧增加，半乳糖是F-THDP2的主要单糖，半乳糖的摩尔百分比为80.0％。
对比例1中多糖THDP2的单糖组成为由D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖组成，其中D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖的摩尔比为9.5:4.1:1.1，表明THDP2中不含岩藻糖，葡萄糖是THDP2主要的单糖，葡萄糖的摩尔百分比为64.63％。
上述结果表明三叶青中的葡萄糖在发酵过程中被代谢并主要转化为半乳糖。此外，与THDP2相比，F-THDP2含有一个新的单糖：岩藻糖，表明F-THDP2是在发酵过程生物合成产生的新多糖，而不是原始三叶青多糖的降解产物。二、理化性质组分及分子量检测
将实施例1中经桑黄菌发酵后的三叶青多糖F-THDP2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.76％。其激光光散射图(图7b)显示，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰，具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品F-THDP2的RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明F-THDP2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝1.23×104Da。
实施例2中经桑黄菌发酵后的三叶青多糖F-THDP2用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.13％；其RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明F-THDP2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝1.26×104Da。
实施例3中经桑黄菌发酵后的三叶青多糖F-THDP2用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.37％；其RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明F-THDP2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝1.28×104Da。
将对比例1发酵前(未发酵)三叶青多糖组分THDP2用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.71％。其激光光散射图(图7a)显示，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品THDP2的RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明THDP2是分子量分布均一的多糖，其分子量Mw＝3.58×104Da。
THDP2和F-THDP2的分子量分别为3.58×104g/mol和1.23×104g/mol-1.28×104g/mol，表明三叶青发酵后多糖F-THDP2的分子量显著低于三叶青未发酵多糖THDP2。
三、甲基化分析
取2mg多糖样品溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repidmethod for permethylation ofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。
F-THDP2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表1可知：三叶青发酵后多糖F-THDP2含有6种残基，分别为2-Galp-1→(26.72mol％)、6-Galp-1→(6.43mol％)、2,6-Galp-1→(21.15mol％)、2,6-manp-1→(13.35mol％)、T-Fucp(6.32mol％)和T-Galp(26.03mol％)。
THDP2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表2)。由表2可知：三叶青未发酵多糖THDP2的糖苷键连接方式主要由T-Manp(7.11mol％)、T-Glcp(21.44mol％)、4-Galp-1→(28.49mol％)、4,6-Glcp-1→(28.67mol％)和4-Glcp-1→(14.29mol％)构成。三叶青发酵前后多糖的糖苷键连接方式发生显著变化。
表1 F-THDP2甲基化分析
甲基化单糖残基 连接方式 摩尔比 主要碎片离子(m/z)
2,3,4,6-Me4-Fucp 1-linked Fucp 6.32 59,71,89,101,117,129,144,161
2,3,4,6-Me4-Galp 1-linked Galp 26.03 87,99,102,117,129,205
3,4,6-Me3-Galp 1,2-linked Galp 26.72 59,71,129,145,161,189
2,3,4-Me3-Galp 1,6-linked Galp 6.43 71,87,99,117,129,189,233
3,4-Me2-Galp 1,2,6-linked Galp 21.15 87,99,129,189
3,4-Me2-Manp 1,2,6-linked Manp 13.35 87,99,129,189
表2 THDP2甲基化分析
甲基化单糖残基 连接方式 摩尔比 主要碎片离子(m/z)
2,3-Me2-Glcp 1,4,6-linked Glcp 28.67 43,85,102,117,127,159,201,261
2,3,6-Me3-Glcp 1,4-linked Glcp 14.29 43,45,71,87,102,113,117,129,233
2,3,4,6-Me4-Manp 1-linked Manp 7.11 43,59,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,4,6-Me4-Glcp 1-linked Glcp 21.44 43,45,59,71,87,101,117,129,145,205
2,3,6-Me3-Galp 1,4-linked Galp 28.49 43,59,71,87,99,102,117,129,159,233
四、核磁共振
分别取60mg多糖溶于0.5mL氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。
根据F-THDP2的1H-NMR(见图4a)、13C-NMR(见图4b)结合HSQC谱(见图4c)等，检测到6个峰较为显著可用于分析。三叶青发酵后多糖F-THDP2主链由→2)-α-D-Galp-(1→和→2,6)-α-D-Manp-(1→主链组成，支链由端基β-D-Galp、→6)-α-3-O-Me-D-Galp-(1→和端基α-L-Fucp残基组成。
根据THDP2的1H-NMR(见图6a)、13C-NMR(见图6b)结合HSQC谱(见图6c)等，三叶青未发酵多糖THDP2主链由→4)-α-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Galp-(1→组成，支链由α-D-Manp和α-D-Glcp组成。
表3 F-THDP2糖残基的化学位移全归属
表4 THDP2糖残基的化学位移全归属
综上，证实了F-THDP2由重量百分含量99％以上的多糖组成；单糖组成是由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖和3-O-甲基-D-半乳糖组成，其中D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖和3-O-甲基-D-半乳糖的摩尔比为8.5-11.0:1.5-3:0.8-1.5：1.0。激光光散射法证明它是单一组分且重均分子量为12.3KDa-12.8KDa。核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→2)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基；在主链上有一个(1→2)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位上被β-D-半乳糖端基取代，主链上连续的两个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被一条由(1→6)连接的α-3-O-甲基-D-半乳糖残基和β-D-半乳糖端基组成的第一支链取代、以及一个α-L-岩藻糖端基取代。具体结构单元可以是图5a所示的一种结构单元，也可以是三个支链按其它排列顺序排列的结构单元。
五、多糖链高级构象
利用SEC-MALLS-Vis激光光散射仪系统，THDP2和F-THDP2的分子量分别为3.58×104g/mol和1.23×104g/mol，表明三叶青发酵后多糖F-THDP2的分子量低于三叶青未发酵多糖THDP2。
通过Mark-Houwink-Sakurada方程计算表明，发酵前多糖THDP2的α值为0.32，发酵后F-THDP2的α值为0.76，表明发酵前多糖THDP2在溶液中为紧密型链结构，发酵后多糖F-THDP2在溶液中由紧密型链结构向自由延伸链构象转变。
分别将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2、实施例3中F-THDP2水溶液涂抹在云母片上测试，获得多糖的二维原子力形貌，结果表明，THDP2的多糖链相互缠绕形成聚集体，形成高度为1.18nm±0.09nm的紧密线圈(实施例1如图8a)。相反，从F-THDP2上可以观察到许多伸展的分子链(实施例1如图8d)，其链高为0.51nm±0.07nm，F-THDP2表现出更加扩展的柔性构象。六、发酵前后三叶青多糖的生物活性对比
1.体外抗肿瘤(MTT法)
取对数生长期的A549细胞、HeLa细胞和MCF-7细胞，贴壁细胞用0.25％(质量百分比)胰蛋白酶消化，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1-10×104个/mL的细胞悬液，经过准确的细胞计数后按500个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔加100μL，置于37℃5％(体积百分比)CO2饱和湿度培养箱中培养24h，再加入完全培养基将样品稀释成不同浓度的样品溶液10μL，空白对照组为加入等体积的RPMll640完全培养基，每组设5个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37℃5％CO2及饱和湿度条件下培养24h、48h。培养结束后，每孔加入用按5mg/mL新鲜配制的四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液50μL，温育4小时，使MTT还原，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200μL，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪于570nm处测定光密度值(OD)，设置对照组，按公式计算细胞的抑制率。抑制率(％)＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。
表5发酵前后三叶青多糖的抗肿瘤活性对比
糖组分 浓度(mg/mL) 对HeLa细胞抑制率(％)
实施例1中F-THDP2 0.6 57.51**##
实施例2中F-THDP2 0.6 56.34**##
实施例3中F-THDP2 0.6 56.03**##
实施例1中F-THDP1 0.6 13.72
实施例1中F-THDP3 0.6 18.54
THDP2 0.6 41.67
空白对照组 0 2.31
注：F-THDP2分别与F-THDP1、F-THDP3、空白对照组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。F-THDP2与对比例1THDP2对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
表6发酵前后三叶青多糖的抗肿瘤活性对比
糖组分 浓度(mg/mL) 对A549细胞抑制率(％)
实施例1中F-THDP2 0.6 52.85**##
实施例2中F-THDP2 0.6 52.21**##
实施例3中F-THDP2 0.6 51.75**##
实施例1中F-THDP1 0.6 15.23
实施例1中F-THDP3 0.6 12.66
THDP2 0.6 40.12
空白对照组 0 1.98
注：F-THDP2分别与F-THDP1、F-THDP3、空白对照组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。F-THDP2与对比例1THDP2对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
表7发酵前后三叶青多糖的抗肿瘤活性对比
注：F-THDP2分别与F-THDP1、F-THDP3、空白对照组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。F-THDP2与对比例1THDP2对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
比较发酵后三叶青粗多糖经DEAE纤维素-52分离得到的3个组分F-THDP2、F-THDP1、F-THDP3的体外抗肿瘤能力，由表5-7可以看出，与空白对照组相比，F-THDP1、F-THDP3对3种细胞A549细胞、HeLa细胞和MCF-7细胞抑制率无显著差异，表明F-THDP1和F-THDP3组分不具有抑制肿瘤细胞的能力；与THDP2相比，在相同浓度下，F-THDP2对3种细胞系的抗癌活性均显著优于THDP2(P<0.01)，说明三叶青发酵后多糖F-THDP2的抗癌活性明显增强。
2.对肠道微生物的作用
将100只健康小鼠随机分组，每组10只，给药组小鼠每天灌胃给药1次，多糖水溶液浓度0.1mg/mL，剂量为每次50mg多糖/kg小鼠体重，连续给药14d后处死，收集组织。空白组小鼠以与给药组给药量等体积的生理盐水进行灌胃，每天1次，连续14d后处死，收集组织。将小鼠盲肠内容物置于含4.5mL无菌生理盐水的离心管中，在微型振荡器中摇匀，此为10-1倍稀释液，将10-1倍稀释液离心，取上清液0.5mL，加入含4.5mL无菌生理盐水的离心管中，在微型振荡器中摇匀得到10-2倍稀释液，依照上述步骤直至稀释至10-7倍。将10-7倍稀释液进行细菌培养，乳酸杆菌采用LBS琼脂培养基在37℃厌氧培养48h，大肠杆菌采用EMB琼脂培养基在37℃有氧培养24h，双歧杆菌采用BS琼脂培养基在37℃厌氧培养48h，每种细菌培养试验设3个重复。细菌培养试验结束，对细菌进行平板菌落计数，统计乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌所含的细菌数。
表8对微生物菌群的影响单位：lg CFU/g(101CFU/g)
糖组分 乳酸杆菌 双歧杆菌 大肠杆菌
实施例1中F-THDP2 11.03±0.14**## 9.87±0.17**## 4.56±0.14**##
实施例2中F-THDP2 11.09±0.15**## 9.74±0.15**## 4.62±0.11**##
实施例3中F-THDP2 11.27±0.13**## 9.92±0.14**## 4.67±0.13**##
实施例1中F-THDP1 7.53±0.12 7.09±0.14 6.25±0.12
实施例1中F-THDP3 7.41±0.13 7.02±0.12 6.27±0.14
THDP2 7.98±0.14 6.87±0.11 6.31±0.11
空白组 7.13±0.15 6.34±0.12 6.36±0.14
注：F-THDP2分别与F-THDP1、F-THDP3、空白组对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。F-THDP2与对比例1THDP2对比，#表示P<0.05，##表示p<0.01。
比较发酵后三叶青粗多糖经DEAE纤维素-52分离得到的3个组分F-THDP2、F-THDP1、F-THDP3对小鼠肠道微生物菌群的影响作用，由表8可以看出，与空白组相比，F-THDP1和F-THDP3对乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌无显著差异，表明F-THDP1和F-THDP3组分不具有调节肠道菌种的作用；与THDP2相比，F-THDP2显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌的数量(p<0.01)、显著降低大肠杆菌数量(p<0.01)。乳酸杆菌与双歧杆菌为常见的益生菌，其大量增殖可以遏制病原微生物增殖，对保证肠道健康具有重要意义，表明F-THDP2可以调节肠道菌群结构。
本发明中基于桑黄菌发酵后的三叶青多糖由重量百分含量99％以上的多糖组成；该多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖组成，其中半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖的摩尔比为8.5-11.0:1.5-3:0.8-1.5：1.0。本发明基于桑黄菌发酵后的三叶青多糖的重均分子量为10KDa-15KDa。该组成的多糖具有较强的生物活性，例如增强抗肿瘤活性和增强肠道微生物蠕动活性。本发明制备方法中参数的变化并不影响该多糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现该多糖的制备。在此不再赘述。

Claims (10)

1.一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖，其特征在于，由重量百分含量99％以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖组成，其中半乳糖、甘露糖、岩藻糖和3-O-甲基-半乳糖的摩尔比为8.5-11.0:1.5-3:0.8-1.5：1.0。
2.根据权利要求1所述的三叶青多糖，其特征在于，所述半乳糖为α-半乳糖和β-半乳糖，所述甘露糖为α-甘露糖，所述岩藻糖为α-岩藻糖，所述3-O-甲基-半乳糖为α-3-O-甲基-半乳糖。
3.根据权利要求1或2所述的三叶青多糖，其特征在于，所述半乳糖为α-D-半乳糖和β-D-半乳糖，所述甘露糖为α-D-甘露糖，所述岩藻糖为α-L-岩藻糖，所述3-O-甲基-半乳糖为α-3-O-甲基-D-半乳糖。
4.根据权利要求3所述的三叶青多糖，其特征在于，所述多糖的结构单元中主链结构为(1→2)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基；在主链上有一个(1→2)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位上被β-D-半乳糖端基取代，主链上连续的两个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被一条由(1→6)连接的α-3-O-甲基-D-半乳糖残基和β-D-半乳糖端基组成的第一支链取代、以及一个α-L-岩藻糖端基取代。
5.根据权利要求4所述的三叶青多糖，其特征在于，所述β-D-半乳糖端基取代主链上任意一个(1→2)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位，第一支链和一个α-L-岩藻糖端基在连续的两个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上按任意顺序排列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的三叶青多糖，其特征在于，所述三叶青多糖的重均分子量为10KDa-15KDa。
7.根据权利要求1-6任一项所述的三叶青多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)发酵三叶青粗多糖的制备：采用桑黄菌发酵三叶青块茎，发酵产物经水提取、醇沉、去除蛋白质和冻干上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖；
(2)纯化：将步骤(1)中得到的经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖的水溶液，经DEAE纤维素离子交换剂填充的柱层析，收集经0.15mol/L-0.3mol/LNaCl水溶液洗脱的洗脱液再经凝胶过滤层析，收集含多糖的洗脱液，经透析、冻干得到经桑黄菌发酵后的三叶青多糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：将三叶青块茎切薄片，灭菌，冷却后接种桑黄菌，发酵培养，发酵产物用水在90℃-100℃下提取得到水提液，浓缩，得到浓缩液，浓缩液经醇沉所得沉淀用Sevage试剂去除蛋白质，冻干上清液得到经桑黄菌发酵后的三叶青粗多糖。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：温度24℃-28℃，湿度50％-65％，培养时间为18天-25天。
10.根据权利要求1-6任一项所述的三叶青多糖在制备抗肿瘤和/或增强肠道微生物蠕动的功能产品中的应用，所述功能产品包括食品、保健品、药品或日化用品。
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