CN117286082B - 野油菜黄单胞菌及发酵产低粘度黄原胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野油菜黄单胞菌及发酵产低粘度黄原胶的方法，涉及微生物发酵技术领域，其中，所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris F417，并于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，发酵产低粘度黄原胶的方法是将含有该野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻并进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。采用本发明方法，提高了黄原胶得率和胶品质，可以用于黄原胶放大化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种野油菜黄单胞菌及发酵产低粘度黄原胶的方法。
背景技术
黄原胶是一种具有三级结构的杂多糖。一级结构是由两个葡萄糖、两个甘露糖和一个葡萄糖醛酸组成的重复五糖单元。黄原胶的主链由β-1，4-糖苷键相连的葡萄糖构成，在主链C-3处每隔一个葡萄糖上有一个三糖侧链，侧链末端的甘露糖含有丙酮酸残基，与主链相连的甘露糖在C-6位置被乙酰基修饰。黄原胶由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，例如悬浮性、乳化性、增稠性、假塑性、热稳定性等，可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、凝胶剂、浸润剂、膜成型剂等广泛应用于各个领域，是性能最为优越的生物胶之一。黄原胶具有长链高分子的一般性能，但它比一般高分子含有较多的官能团，在特定条件下会显示独特性能。黄原胶溶液的溶解性、热稳定性和流变性能很大程度上受到乙酰基和丙酮酸残基的影响，一般情况下，去除丙酮酸基团能够使黄原胶在溶液中获得更有序的螺旋构象，而去除乙酰基能获得更无序的构象。
目前，黄原胶的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产黄原胶的主流方法，如何对发酵培养基和发酵菌种进行优化，以提高黄原胶的产率和品质是需要解决的技术问题。
发明内容
为提高黄原胶的产率和品质，本发明提供了一种野油菜黄单胞菌及发酵产低粘度黄原胶的方法。
本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种野油菜黄单胞菌，所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestrisF417，并于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
第二方面，本发明提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，将含有第一方面所述野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻并进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。
在本发明的一较佳实施方式中，菌种活化的方法包括：将含有第一方面所述野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2~12次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
在本发明的一较佳实施方式中，液体种子培养方法包括：将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的液体种子。
在本发明的一较佳实施方式中，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法具体包括：将生长至对数期的液体种子以5~15%的接种量接种至装有50~100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30~37℃，150~250r/min摇床恒温培养72~120 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶。
在本发明的一较佳实施方式中，液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
在本发明的一较佳实施方式中，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法提供了一株保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，能够利用廉价易得、可再生的原料高效生产低粘度黄原胶，该发酵产低粘度黄原胶的方法不仅可以降低制造成本，减少环境污染，生产得到的低粘黄原胶，还将黄原胶的应用领域进一步扩大；
本发明方法提供了一种高产高品质的黄原胶生产技术，该方法的创新性也意味着其在黄原胶领域的潜在应用和市场价值，可以用于放大化生产。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举本发明实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1-6的产胶率条形图。
图2是本发明实施例1-6的产胶黏度图，其中黄原胶溶液浓度为1.0 g/L时的黏度值为实施例1的产胶黏度，黄原胶溶液浓度为2.0 g/L时的黏度值为实施例2的产胶黏度，黄原胶溶液浓度为3.0 g/L时的黏度值为实施例3的产胶黏度，黄原胶溶液浓度为4.0 g/L时的黏度值为实施例4的产胶黏度，黄原胶溶液浓度为5.0 g/L时的黏度值为实施例5的产胶黏度，黄原胶溶液浓度为6.0 g/L时的黏度值为实施例6的产胶黏度。
图3是本发明实施例1-6的剪切性能图，其中黄原胶溶液浓度为1.0 g/L时的剪切性能值为实施例1的剪切性能，黄原胶溶液浓度为2.0 g/L时的剪切性能值为实施例2的剪切性能，黄原胶溶液浓度为3.0 g/L时的剪切性能值为实施例3的剪切性能，黄原胶溶液浓度为4.0 g/L时的剪切性能值为实施例4的剪切性能，黄原胶溶液浓度为5.0 g/L时的剪切性能值为实施例5的剪切性能，黄原胶溶液浓度为6.0 g/L时的剪切性能值为实施例6的剪切性能。
图4是本发明实施例1-6的透明度图，其中黄原胶溶液浓度为1.0 g/L时的透明度为实施例1的透明度，黄原胶溶液浓度为2.0 g/L时的透明度为实施例2的透明度，黄原胶溶液浓度为3.0 g/L时的透明度为实施例3的透明度，黄原胶溶液浓度为4.0 g/L时的透明度为实施例4的透明度，黄原胶溶液浓度为5.0 g/L时的透明度为实施例5的透明度，黄原胶溶液浓度为6.0 g/L时的透明度为实施例6的透明度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，采用液体发酵工艺，工艺流程为：菌株活化→斜面培养→菌种富集→发酵培养→产量测定→粘度测定→透明度测定。
实验菌种为实验室前期保藏菌株野油菜黄单胞菌作为出发菌株，该菌株为Xanthomonas campestrisF417，并于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，分类学名称为Xanthomonas campestris，保藏编号为GDMCC NO：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株在平板培养基上呈圆润光滑的浅黄色菌落，细胞为细杆状，革兰氏阴性菌，为植物致病菌。
本发明使用了液体种子培养基和发酵培养基。
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
下面提供六个实施例和六个对比例，以说明本发明方法能提高黄原胶的产率和品质。
实施例1
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以5%的接种量接种至装有50 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，150 r/min摇床恒温培养72 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为1.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为1.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
实施例2
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代4次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以5%的接种量接种至装有50 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，150 r/min摇床恒温培养72 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为2.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为2.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
实施例3
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代6次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以10%的接种量接种至装有75 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，33.5℃，200 r/min摇床恒温培养96 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为3.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为3.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
实施例4
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代8次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以10%的接种量接种至装有75 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，33.5℃，200r/min摇床恒温培养96h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为4.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为4.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
实施例5
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代10次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以15%的接种量接种至装有100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃，250r/min摇床恒温培养120h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为5.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为5.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
实施例6
本实施例提供了一种发酵产低粘度黄原胶的方法，具体如下：
1）菌种活化
将含有保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代12次，使保藏菌株野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
2）液体种子培养
将活化完成的保藏菌株野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417的液体种子。
3）黄原胶的提取
将生长至对数期的液体种子以15%的接种量接种至装有100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃，250r/min摇床恒温培养120h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
4）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为6.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
5）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
6）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为6.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例1
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以5%的接种量接种至装有50 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150 r/min摇床恒温培养72 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为1.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为1.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例2
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以5%的接种量接种至装有50 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150 r/min摇床恒温培养72 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为2.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为2.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例3
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以10%的接种量接种至装有75 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，33.5℃，200 r/min摇床恒温培养96 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为3.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为3.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例4
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以10%的接种量接种至装有75 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，33.5℃，200 r/min摇床恒温培养96 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为4.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为4.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例5
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以15%的接种量接种至装有100 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，37℃，250 r/min摇床恒温培养120 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为5.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为5.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
对比例6
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶的方法，具体如下：
1）培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
液体发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
2）培养野油菜黄单胞菌生产黄原胶
对比例中采用的野油菜黄单胞菌，不是保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，而是中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258。首先接种到液体种子培养基，然后在28℃、180 r/min的摇床上培养24 h。将生长至对数期的液体种子以15%的接种量接种至装有100 mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，37℃，250 r/min摇床恒温培养120 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶，称重，按下面公式计算黄原胶的产胶率。
3）黏度测定
将发酵所得黄原胶研磨成粉末，分别配置质量浓度为6.0 g/L的黄原胶溶液，600r/min磁力搅拌至完全溶解，记录溶解时间，25℃稳定1 h。打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值；设定转速为60 r/min，测定温度为25℃，测定黏度值，粘度单位为mPa·s。
4）剪切性能测定
按黏度测定方法测定黄原胶溶液在转速6 r/min和60 r/min时的黏度值，按照下方公式计算剪切性能值。
η1——转速6 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
η2——转速60 r/min时的黏度值，单位为mPa·s
5）透明度测定
将发酵产物黄原胶溶于去离子水中配置成浓度为6.0 g/L的溶液，8000 rpm 离心10 min 以除去气泡。利用紫外可见分光光度计在 620 nm下测定黄原胶溶液的吸光度值并记录数据。
将采用了本发明方法的实施例1-6与对比例1-6进行对比，对比参数包括产胶率、粘度和透明度，见表1所示。
表1 性能对比
通过表1，以及图1可知，本发明方法采用保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417进行发酵生产黄原胶，采用天然可再生的原料进行发酵而成，成本低廉，绿色环保，降低了生产成本，在实施例4中保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417在本发酵培养基下的发酵产胶率最高可达到4.485%，相比于对比例4中利用中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258在相同发酵培养基和相同发酵条件下的产胶率（3.181%）提升了40.99%，使得黄原胶的产胶率得到有效的提升和保障。实施例1-6和对比例1-6在相同液体发酵培养基下对菌种进行发酵培养，培养基组分和发酵条件均一一对应相同，由于使用的菌种不同，实施例1使用的菌种为保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417，对比例1使用的菌种为中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258，因此两者之间的产胶率也不同，实施例1-6的产胶率分别为4.357%、4.299%、4.354%、4.485%、4.416%和4.375%，对比例1-6的产胶率分别为3.153%、3.186%、3.242%、3.181%、3.254%和3.225%，说明在相同发酵培养基和相同发酵条件下实施例相比于对比例的产胶率分别提升了38.18%、34.93%、34.30%、40.99%、35.71%和35.66%，黄原胶的产胶率提升明显，所用菌种野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417具有显著优势。
黄原胶分子由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单元”结构聚合体，由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，是性能最为优越的生物胶之一。通过表1，以及图2可知，本发明方法采用保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417进行发酵生产的黄原胶，具有高浓度低黏度的特性，在浓度为6.0 g/L下的黏度值仅为143.60 mPa·s， 中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258发酵生产的黄原胶在6.0 g/L下的黏度值为3625.2 mPa·s，两者相比而言保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417生产的黄原胶黏度显著降低，说明本发明方法采用较为简单的发酵工艺和生产条件，可以制备出低黏度的黄原胶，使得黄原胶的应用范围更加广泛，使得黄原胶的质量得到有效的提升和保障。
剪切性能值反映了黄原胶溶液抵抗剪切滑动的能力，通过表1，以及图3可知，保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417发酵所得黄原胶水溶液随着胶浓度的提高，剪切性能值逐渐增加，实施例1-6的剪切性能值分别为0.81、1.34、1.36、1.35、1.47和1.67；对比例1-6的剪切性能值分别为2.37、3.86、4.57、7.70、6.25和6.49，黄原胶溶液在受到剪切作用时，粘度会有所下降，且剪切速度越高，粘度下降越快，当剪切力消除时，溶液立即恢复原有的粘度。黄原胶能在水中形成高强度的全天然生物胶，具有优良的触变性和流变性，剪切力和粘度之间的关系是呈正相关的，胶粘度越高，所呈现的剪切性能越大，由于对比例1-6采用中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258发酵生产黄原胶，粘度值均高于实施例1-6采用野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417生产的黄原胶的粘度值，因此对比例1-6的剪切性能值也高于实施例1-6，存在正相关性，粘度越高，剪切性能值越大，粘度越低，剪切性能值越小，我们的目的是生产低粘度的黄原胶。
通过表1，以及图4可知，本发明方法采用保藏菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisF417进行发酵生产的黄原胶，实施例1-6黄原胶的透明度分别为0.091、0.116、0.158、0.222、0.321和0.377，对比例1-6黄原胶的透明度分别为0.168、0.225、0.343、0.390、0.562和0.667，在相同黄原胶浓度下的水溶液的OD620值均小于中国工业微生物菌种保藏中心的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCICC10258发酵生产的黄原胶，具有高透明度的特性。
综上所述，本发明方法采用天然可再生的原料进行发酵而成，成本低廉，绿色环保，降低了生产成本；采用较为简单的发酵工艺和生产条件，可以制备出低黏度的黄原胶，使得黄原胶的应用范围更加广泛；本方法在研发过程中通过采用合适的发酵菌株，使得黄原胶的产胶率和质量都得到有效的提升和保障。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris），其特征在于，所述野油菜黄单胞菌为野油菜黄单胞菌 F417，并于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一种发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，将含有权利要求1所述野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻并进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。
3.根据权利要求2所述发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，菌种活化的方法包括：将含有权利要求1所述野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2~12次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性。
4.根据权利要求3所述发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，液体种子培养方法包括：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，测定接种0 h的液体种子培养基在600 nm波长处的吸光值，当菌体浓度OD600值为0.8时，得到野油菜黄单胞菌的液体种子。
5.根据权利要求4所述发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法具体包括：将生长至对数期的液体种子以5~15%的接种量接种至装有50~100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30~37℃，150~250r/min摇床恒温培养72~120 h ，采用乙醇沉淀法，取10 mL发酵液称重后用生理盐水稀释3倍，3000 r/min离心15 min，留取上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，搅拌10 min，4℃、8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到黄原胶。
6.根据权利要求5所述发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，液体种子培养基按重量百分比包括葡萄糖2%、大豆蛋白0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且pH值为7.0。
7.根据权利要求6所述发酵产低粘度黄原胶的方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
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