CN117230203B - 检测myod1基因突变的引物探针组及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测MYOD1基因突变的引物探针组及其试剂盒，属于基因检测技术领域。本发明以MYOD1基因上的L122R突变位点作为检测对象，利用特异引物对突变靶序列进行精准扩增放大，经过合适的探针设计，克服了现有技术中MYOD1基因突变检测灵敏度较低、准确性较差、检测时间较久的问题，本发明通过荧光信号收集直接对突变进行定性检测和判读，仅需一步PCR扩增，最低可检测到肿瘤组织中低至1％丰度的突变，2h即可出结果，并且准确性较高、步骤简单、判读直观方便，可用于横纹肌肉瘤的预后评估、辅助诊断和鉴别诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及检测MYOD1基因突变的引物探针组及其试剂盒。
背景技术
MYOD1基因，位于人染色体11p15.1，由3个外显子组成，编码一种由320个氨基酸组成的核蛋白，属于bHLH转录因子家族和肌源性因子亚家族成员。它通过诱导细胞周期停滞来调节肌肉细胞分化。此外，还可以通过转录调控参与肌肉再生。其编码的原肌球蛋白调节蛋白（MyoD1）是分子量为45kDa的磷酸化蛋白，是细胞骨架中与原肌球蛋白结合的蛋白质。
横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma）是儿童最常见的软组织肿瘤，是一种具有胚胎性骨骼肌细胞表型和生物学特征的原始恶性肿瘤，通常表达MyoD1蛋白。MYOD1 p.L122R 突变（NM_002478，NP_002469）首先在部分临床侵袭性横纹肌肉瘤中发现。MYOD1基因突变转录产物一方面可以竞争性结合正常蛋白的结合位点导致成肌细胞无法分化并保持其增殖状态，另外一方面还可以与MYC反应基因结合并激活致癌转录程序，促进肿瘤发生。MYOD1突变最常发生在梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤中，偶尔也会发生在胚胎型横纹肌肉瘤中，约占所有FOXO1融合阴性横纹肌肉瘤的3%。MYOD1 L122R突变患者的预后极差，长期存活率低于30%，是患者的独立预后因素，其存在与否与患者的临床分级无关。检测MYOD1基因突变状态对于患者的危险度分级和治疗策略选择具有重要意义。
由于MYOD1基因L122R突变在横纹肌肉瘤诊疗中的重要作用，目前突变检测已成为危险度评估和治疗方案选择的重要内容之一。临床上基因突变检测的金标准是Sanger测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的发展，已经得到广大医务人员的认可，但该技术检测灵敏度较不高（突变含量检测下限约25%），受基线干扰容易出现假阳性，且检测周期较长（24~48小时）。
发明内容
本发明的目的在于提供检测MYOD1基因突变的引物探针组及其试剂盒，以解决现有技术中MYOD1基因突变检测灵敏度较低、准确性较差、检测时间较久的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测MYOD1基因突变的引物探针组，包括MYOD1基因扩增引物对和/或MYOD1基因突变位点探针组；
所述MYOD1基因扩增引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MYOD1基因突变位点探针组包括突变型探针和/或野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述突变型探针的5'端标记有报告基团；
和/或，所述野生型探针的5'端标记有报告基团；
和/或，所述突变型探针的3'端标记有淬灭基团；
和/或，所述野生型探针的3'端标记有淬灭基团。
优选的，所述报告基团选自FAM、VIC、ROX、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3中的一种或几种；
所述野生型探针的报告基团与所述突变型探针的报告基团不同。
优选的，所述淬灭基团选自NFQ-MGB、BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA中的一种或几种。
优选的，所述突变型探针和/或野生型探针进行了锁核酸修饰。
优选的，由探针序列5’端起算，所述突变型探针的第4个碱基进行了锁核酸修饰；
所述野生型探针的第4个碱基进行了锁核酸修饰。
本发明还提供了上述引物探针组在制备检测MYOD1基因L122R突变的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述引物探针组。
优选的，所述MYOD1基因扩增引物对的浓度为1～50μmol/L；
所述MYOD1基因突变位点探针组的浓度为1～50μmol/L。
本发明还提供了上述引物探针组或试剂盒在制备横纹肌肉瘤辅助诊断试剂或预后试剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的检测MYOD1基因突变的引物探针组以MYOD1基因上的L122R突变位点作为检测对象，利用特异引物对突变靶序列进行精准扩增放大，经过合适的探针设计，通过荧光信号收集直接对突变进行定性检测和判读，仅需一步PCR扩增，实现了灵敏度较高（最低可检测到肿瘤组织中低至1％丰度的突变）、准确性较高、步骤简单、检测时间更短（2 h即可出结果）、判读直观方便的效果，更好的呈现MYOD1基因突变检测的预后评估价值。
本发明提供的试剂盒由于含有检测MYOD1基因突变位点的野生型探针，可用于检测MYOD1的mRNA表达。由于MYOD1的mRNA表达只存在于大部分横纹肌肉瘤中，不存在于组织形态学特征相似的其它肉瘤中，本发明能够实现特异性检测的试剂盒亦可实现辅助横纹肌肉瘤的分子诊断，具有一定的辅助诊断和鉴别诊断价值。
附图说明
图1为MYOD1突变检测试剂盒对不同浓度的检测结果图；
图2为MYOD1突变检测试剂盒对不同浓度检测的线性关系图；
图3为MYOD1突变检测试剂盒对不同突变丰度的检测结果图；
图4为MYOD1突变检测试剂盒对不同突变丰度检测的线性关系图；
图5为野生型探针的检测结果图；
图6为突变型探针的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 引物与探针设计
设计并合成用于检测MYOD1野生型和突变型的特异性引物和探针，核苷酸序列如下所示：
上游引物MYOD1-Fwd-Primer：5’ – GCAAGGCCGCCACCAT – 3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物MYOD1-Rev-Primer：5’–TTGGATTGCTCGACGTGCA–3’，如SEQ ID NO.2所示；
突变型探针MYOD1-mut-Probe：5’–FAM–GCC(+g)GAGCAAA–NFQ–MGB–3’，如SEQ IDNO.3所示；
野生型探针MYOD1-wt-Probe：5’–VIC–GCC(+t)GAGCAAAG–NFQ–MGB–3’，如SEQ IDNO.4所示；
上述探针中，序列括号内+代表锁核酸修饰；
配置检测人MYOD1基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂包括MYOD1野生型反应液和突变型反应液；反应液中分别含有所上述用于检测MYOD1野生型和突变型的特异性引物和探针；MYOD1野生型和突变型反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针，上述MYOD1野生型反应液还可用作对样本核酸质量进行质控的内参引物和探针。
实施例2 检测方案
检测样本为石蜡包埋肿瘤组织样本，通过核酸提取试剂纯化组织样本中的DNA/RNA，RNA逆转录为cDNA，再配置如下反应体系进行检测：
表1 反应体系（20 μL体系为例）：
注：其中2×探针法qPCR反应缓冲液含有Taq酶、Mg2+、PCR缓冲液、dNTPs和水。
扩增程序设置如下：
表2 扩增步骤
检测人MYOD1基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，其中，阴性对照为纯水，阳性对照为突变质粒和野生型质粒混合物（突变型占比5%）。
突变质粒包含的MYOD1基因片段的核苷酸序列如下所示：
5’–CTGAAACCCGAAGAGCACTCGCACTTCCCCGCGGCGGTGCACCCGGCCCCGGGCGCACGTGAGGACGAGCATGTGCGCGCGCCCAGCGGGCACCACCAGGCGGGCCGCTGCCTACTGTGGGCCTGCAAGGCGTGCAAGCGCAAGACCACCAACGCCGACCGCCGCAAGGCCGCCACCATGCGCGAGCGGCGCCGCCGGAGCAAAGTAAATGAGGCCTTTGAGACACTCAAGCGCTGCACGTCGAGCAATCCAAACCAGCGGTTGCCCAAGGTGGAGATCCTGCGCAACGCCATCCGCTATATCGAGGGCCTGCAGGCTCTGCTGCGCG–3’，如SEQ ID NO.5所示；
对MYOD1突变检测试剂盒性能进行验证：
使用插入突变型MYOD1基因片段质粒做标准品，分别以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、和10-7ng/μL溶液做模板测试试剂盒的检测性能，结果显示试剂盒在此范围内扩增曲线良好，如图1所示。
以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、和10-7ng/μL浓度突变质粒标准品扩增曲线Ct值做标准曲线，结果显示检测体系在10-2~10-7ng/μL浓度区间内具有良好的线性关系，如图2所示。
使用插入突变型和野生型MYOD1基因片段质粒做标准品，以突变型质粒含量50%、10%、5%、2%、1%、0.1%、0.01%和0%溶液做模板，测试试剂盒的检测性能，结果显示本试剂盒最低可检测到1%的突变，如图3所示。
使用突变比例100%、50%、20%、5%、2%和1%溶液扩增结果Ct值做标准定量曲线，结果显示本试剂盒在1% - 100%突变丰度内具有良好的线性关系，如图4所示。
采用上述检测方案，利用本发明提供的试剂盒对62例横纹肌肉瘤样本进行了检测，其中11例为突变型，同时以Sanger测序法为对照。
Sanger测序法：
选择肿瘤含量大于50%的62例肿瘤样本组织石蜡切片（3μm，5-10张/例），采用石蜡样本DNA提取试剂盒进行核酸提取，使用MYOD1基因上游引物5’-CTGAAACCCGAAGAGCACTCGC-3’（如SEQ ID NO.6所示）和下游引物5’-GGATCTCCACCTTGGGCAACC-3’（如SEQ ID NO.7所示）进行核酸扩增，对PCR产物进行Sanger测序，与野生型MYOD1基因序列对比，分析是否发生L122R突变。
检测结果如下表3所示，样本检测结果示例如图5和图6所示，其中图5为野生型探针的检测结果，图6为突变型探针的检测结果。
表3 检测统计结果
结果显示，与金标准Sanger测序相比，本方法灵敏性可达100%{11/(11+0)×100%）}，特异性可达100%{51/(0+51)×100%}，准确性可达100%{(11+51)/(11+0+0+51)×100%}，实现了显著更优的效果。
由于MyoD1蛋白仅在胚胎性横纹肌细胞中表达，正常肌细胞不表达，是横纹肌肉瘤的特异性标志物，几乎不表达于其他类型的肿瘤中。采用含24例神经母细胞瘤，3例NTRK重排梭形细胞肿瘤，2例肾透明细胞肉瘤，1例CIC重排肉瘤和1例胰腺实性假乳头状瘤的其他肿瘤作为对照样本，横纹肌肉瘤作为检测样本，利用本发明提供的试剂盒进行检测，结果如下表4所示：
表4 MYOD1表达检测
由结果可知，本发明提供的检测方案特异性强，本发明试剂盒还可用于横纹肌肉瘤MYOD1基因的表达检测，从而辅助横纹肌肉瘤的诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.检测MYOD1基因突变的引物探针组，其特征在于，包括MYOD1基因扩增引物对和MYOD1基因突变位点探针组；
所述MYOD1基因扩增引物对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MYOD1基因突变位点探针组包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述突变型探针和野生型探针进行了锁核酸修饰；
由探针序列5’端起算，所述突变型探针的第4个碱基进行了锁核酸修饰；
所述野生型探针的第4个碱基进行了锁核酸修饰。
2.根据权利要求1所述的检测MYOD1基因突变的引物探针组，其特征在于，所述突变型探针的5'端标记有报告基团；
所述野生型探针的5'端标记有报告基团；
所述突变型探针的3'端标记有淬灭基团；
所述野生型探针的3'端标记有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的检测MYOD1基因突变的引物探针组，其特征在于，所述野生型探针的报告基团与所述突变型探针的报告基团分别选自FAM、VIC、ROX、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3中的一种；
所述野生型探针的报告基团与所述突变型探针的报告基团不同。
4.根据权利要求2所述的检测MYOD1基因突变的引物探针组，其特征在于，所述野生型探针的淬灭基团与所述突变型探针的淬灭基团分别选自NFQ-MGB、BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA中的一种。
5.权利要求1~4任一项所述的引物探针组在制备检测MYOD1基因L122R突变的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~4任一项所述的引物探针组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述MYOD1基因扩增引物对的浓度为1～50μmol/L；
所述MYOD1基因突变位点探针组的浓度为1～50μmol/L。
8.权利要求1~4任一项所述的引物探针组在制备横纹肌肉瘤辅助诊断试剂中的应用。
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