CN117187126A

CN117187126A - 一种大肠杆菌噬菌体jnuw3的分离以及抗jnuw3噬菌体大肠杆菌的开发

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Publication number: CN117187126A
Application number: CN202311130419.4A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 张显; 张恒维; 胡杨露; 杨套伟; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-09-04
Filing date: 2023-09-04
Publication date: 2023-12-08

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌噬菌体JNUW3的分离以及抗JNUW3噬菌体大肠杆菌的开发，属于微生物技术领域。本发明筛选分离出来自污染发酵罐的噬菌体JNUW3，该噬菌体能够抑制多种大肠杆菌。本发明成功地筛选出一株具有噬菌体抗性的底盘细胞JNK4，与现有技术中的大肠杆菌相比，可以抵抗噬菌体JNUW3的感染；并且也可以抵御T7噬菌体，具有一定的广谱抗噬菌体特性。从根本上解决了发酵产物在生产中易受到噬菌体侵染导致发酵失败的难题，提高了发酵生产企业的经济效益。

Description

一种大肠杆菌噬菌体JNUW3的分离以及抗JNUW3噬菌体大肠杆菌的开发

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌噬菌体JNUW3的分离以及抗JNUW3噬菌体大肠杆菌的开发，属于微生物技术领域。

背景技术

噬菌体为病毒的多样性、起源和进化提供了一个特殊的视角，不仅是因为它们极其丰富生物圈中有超过1031个噬菌体颗粒，而且还有它们遥远的起源，可能是30亿多年前。此外，病毒生态学家计算出，在全球范围内，每秒约有1023例噬菌体感染，这表明种群不仅庞大而古老，而且具有高度的动态化。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，只有单一核酸，无完整细胞结构。利用微生物细胞中的核糖体、蛋白质等合成自身生长和增殖所需各种因子、氨基酸和能量，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。噬菌体的寄生具有高度专一性，这一特性是由宿主细胞的表面构造和噬菌体的构造所决定。烈性噬菌体的感染过程一般分为吸附、注入、复制、装配和释放5个阶段。

现代发酵工业趋向大容积发酵罐及连续发酵工艺，对噬菌体的生长、繁殖和传播提供了有利条件，微生物发酵生产过程中，一旦感染噬菌体，发酵过程很快停止，菌体也会迅速消失。造成严重的经济损失。而且，一旦发生噬菌体感染，若不及时采取有效措施，往往会造成发酵生产的连续失败。给企业带来巨大的损失。

大肠杆菌感染噬菌体后，过去通常采用甲醛熏蒸、管道灭菌或菌种轮换等措施来保证生产的持续性，但这些应对策略不仅耗时长、要求严格、成本高，而且效果差，无法从根本上解决噬菌体感染的问题。因此，选育高效的抗噬菌体工业大肠杆菌底盘细胞，对解决发酵工业噬菌体感染具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一株具有噬菌体抗性的大肠杆菌(Escherichia coli)JNK4，已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231188。本发明通过自然进化以大肠杆菌BL21为出发菌株筛选出一株可以抵御大肠杆菌噬菌体JNUW3，以应用于工业生产。

本发明还提供了上述抵抗大肠杆菌噬菌体的大肠杆菌(Escherichia coli)JNK4的进化方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将分离好的JNUW3噬菌体与接种于5mL LB液体培养基中，加入100uL相应的宿主大肠杆菌菌液并混匀，培养箱37℃条件下过夜培养。

(2)将培养物在LB平板上进行划线，于培养箱中37℃倒置培养12 16h。挑取单菌落与LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养。

重复上述步骤(1)和(2)5次，获得可以在可以抵御JNUW3噬菌体的大肠杆菌K4。

本发明提供了一株噬菌体JNUW3，已于2022年10月26日保藏于XX保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221670。

所述噬菌体JNUW3以大肠杆菌W3110为宿主分离得到，其为长尾噬菌体，所述噬菌体基因组全长为43624bp，G+C含量为51.00％，共有58个ORF。

本发明还提供了上述大肠杆菌噬菌体JNUW3的分离和纯化方法，包括以下步骤：

(1)采集自某公司由于噬菌体侵染导致发酵失败的发酵罐中样品，将样品简单前处理后，6000rpm离心10min后取上清液过滤除菌，滤液与同体积的LB液体培养基及1mL处于对数期的大肠杆菌菌液均匀混合，于培养箱中37℃过夜培养，富集噬菌体；

(2)将样本富集液5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液；

(3)取滤液100μL与其宿主大肠杆菌菌液500μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合；

(4)将上述混合液加入5mL冷却至50℃的LB半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的LB平板上，待琼脂凝固后于培养箱中37℃倒置培养12 16h，观察噬菌斑生长情况；

(5)在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，于1mL LB液中振荡解吸附后过0.22μm的微孔滤膜除菌得噬菌体滤液，将其接种于5mL LB液体培养基中，加入100μL相应的宿主大肠杆菌菌液并混匀，培养箱37℃条件下过夜培养，5000rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态，重复操作3 5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

本发明提供了一种组合物，所述组合物中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明提供了一种杀菌剂，所述杀菌剂中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明提供了一种杀菌药物，所述杀菌药物的主要成分中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明提供了一种消毒剂，所述消毒剂中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明提供了一种清洁剂，所述清洁剂中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明提供了一种饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物中含有大肠杆菌噬菌体JNUW3。

本发明还提供了上大肠杆菌噬菌体JNUW3在制备杀菌药物或制备防治大肠杆菌引起的传染病药物中的应用。

本发明还提供了采用大肠杆菌噬菌体JNUW3制备杀菌剂、杀菌药物、消毒剂、清洁剂、饲料添加剂组合物中的应用。

本发明提供了一种具有噬菌体抗性的基因工程菌，所述基因工程菌是以所述大肠杆菌K4为底盘细胞，进行发酵产物的制备。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵产物包括但不限于酶、有机酸、氨基酸、多糖、色素。

本发明还提供了上述大肠杆菌JNK4或上述基因工程菌在制备发酵产物且抵抗噬菌体侵染中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述噬菌体为噬菌体JNUW3、T4噬菌体、λ噬菌体，所述噬菌体JNUW3已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 20221670。

本发明还提供了上述大肠杆菌JNK4或上述基因工程菌在制备能够生产发酵产物且抵抗噬菌体侵染的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明筛选分离出来自污染发酵罐的噬菌体JNUW3，该噬菌体能够抑制多种大肠杆菌，分别为：E.coli O78:H11(ATCC 35401)、E.coli BL21、E.coli W3110、E.coliMG1655、E.coli JM109。

(2)本发明成功地筛选出一株具有噬菌体抗性的底盘细胞JNK4，与现有技术中的大肠杆菌相比，可以抵抗噬菌体JNUW3的感染；并且也可以抵御T7噬菌体，具有一定的广谱抗噬菌体特性，从根本上解决了发酵产物在生产中易受到噬菌体侵染导致发酵失败的难题，提高了发酵生产企业的经济效益。

生物材料保藏

一株大肠杆菌(Escherichia coli)JNK4，分类学命名为Escherichia coli JNK4，已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231188，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

一株大肠杆菌噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3，分类学命名为Colibacteriophage JNUW3，已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221670，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：大肠杆菌噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3透射电镜(TEM)照片。

图2：大肠杆菌噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3透射电镜(TEM)照片。

图3：大肠杆菌(Escherichia coli)JNK4对噬菌体的抗性；其中，平板上的4为噬菌体JNUW3。

图4：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21对噬菌体的抗性；其中，平板上的4为噬菌体JNUW3。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、肠沙门氏菌亚种Salmonella enterica subsp.enterica、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母Blastobotrys adeninivorans由实验室保藏。

下述实施例中所涉及的T4噬菌体、λ噬菌体购自：中国典型培养物保藏中心CCTCC。

下述实施例中涉及的培养基如下：

(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

(2)LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

(3)LB半固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂5g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

实施例1：噬菌体JNUW3分离、纯化、鉴定和保藏

具体步骤如下：

1、噬菌体的分离纯化

(1)将采集自某公司由于噬菌体侵染导致发酵失败的发酵罐中样品分装于无菌离心管中，离心5min。

(2)用一次性注射器吸取离心后的上清液，再用高压灭菌过的0.22μm除菌滤头过滤上清，得到噬菌体滤液；用灭过菌的超纯水稀释滤液，稀释至10^-6；每次稀释前都要用涡旋仪涡旋10s以上；噬菌体稀释液于4℃冰箱保存备用。

(3)大肠杆菌噬菌体JNUW3的分离、纯化、鉴定和保藏

先准备好高压灭菌的LB培养液和无菌10mL离心管等必需材料，培养大肠杆菌BL21，放入摇床；摇床设置为37℃，180r/min，过夜培养增菌。

取滤液100μL与其宿主大肠杆菌菌液500μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合；将上述混合液加入5mL冷却至50℃的LB半固体琼脂培养基，混匀后立即铺于已凝固的LB平板上，待琼脂凝固后于培养箱中37℃倒置培养12 16h。

(4)观察噬菌斑生长情况；

根据JNUW3的噬菌斑形态特征和透射电镜鉴定结果(图1～图2)，JNUW3噬菌体为长尾双链DNA温和噬菌体；已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221670。

实施例2：噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3全基因组测序

采用Ⅰllumina MiSeq测序平台进行对大肠杆菌噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3全基因组测序，结果如表1所示。

表1：噬菌体JNUW3基因组基因

结果显示：噬菌体JNUW3的全基因组为双链DNA，长度为43624bp，GC含量为51.00％。共鉴定出58个编码序列。然而，超过一半的CDSs被预测为具有未知功能的假想蛋白质或噬菌体蛋白质。

实施例3：噬菌体JNUW3宿主谱的确定

研究的测试菌株包括：

11株不同编号的大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌O55:H7、大肠杆菌O111:K58:H21、大肠杆菌O103:H8、大肠杆菌O78:K80、大肠杆菌O78:H11、大肠杆菌O128:H7、大肠杆菌O114:H2、大肠杆菌O145:H2、大肠杆菌O26:H11、大肠杆菌O111:H8等常见致病性大肠杆菌；以及金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、肠沙门氏菌亚种Salmonella enterica subsp.enterica、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母Blastobotrys adeninivorans等。通过潜在宿主平板上的斑点试验来确定是否是该菌的宿主。

具体方法为：

(1)噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3悬浮液的制备；

1)准备培养基：选择液体LB培养基。

2)增殖宿主细菌：将大肠杆菌E.coli W3110接种至LB培养基中，在37摄氏度条件下培养8h进行增殖。

3)添加噬菌体：将噬菌体溶液加入到上述含有大肠杆菌E.coli W3110的培养基中，以感染宿主细菌。

4)孵育培养：将步骤3)添加了噬菌体的体系置于37摄氏度孵育6h，得到培养液。

5)混合和离心：孵育后，将培养液取出，通过混合和离心操作进行细菌和噬菌体的分离。

6)过滤澄清：通过滤器或离心操作去除残留的宿主细菌和细胞碎片，使悬液更纯净。

7)调整浓度：根据需要，可以使用离心操作或适量的溶液来调整噬菌体悬液的浓度。

(2)将1μL步骤(1)得到的噬菌体悬浮液(1×10¹⁰PFU·mL^-1)滴在覆盖潜在宿主菌的平板上，待其晾干后，倒置放入培养箱中，培养条件为：37℃，4h。

所述覆盖潜在宿主菌的平板分别为：分别添加了11株不同编号的大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌O55:H7、大肠杆菌O111:K58:H21、大肠杆菌O103:H8、大肠杆菌O78:K80、大肠杆菌O78:H11、大肠杆菌O128:H7、大肠杆菌O114:H2、大肠杆菌O145:H2、大肠杆菌O26:H11、大肠杆菌O111:H8等常见致病性大肠杆菌；以及金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、肠沙门氏菌亚种Salmonella enterica subsp.enterica、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的LB+1.8％琼脂粉培养基；

根据平板上有无噬菌斑判断是否为待测噬菌体的宿主。

对于测试的大肠杆菌流行菌株，噬菌体JNUW3对于E.coli O78:H11(ATCC 35401)、E.coli BL21具有裂解活性，但对于非大肠杆菌菌株均未表现出裂解活性。

实施例4：大肠杆菌JNK4的筛选、分离

具体步骤如下：

(1)将分离好的JNUW3噬菌体接种于5mL LB液体培养基中，加入100μL相应的宿主大肠杆菌BL21菌液并混匀，培养箱37℃条件下过夜培养，培养时间为：12h；得到培养物。

(2)将步骤(1)得到的培养物在LB平板上进行划线，于培养箱中37℃倒置培养1216h。挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养。重复上述步骤，直到获得可以在可以抵御JNUW3噬菌体的大肠杆菌JNK4；已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231188。

实施例5：大肠杆菌JNK4菌株对于不同噬菌体的抵御性实验

通过双层板点板实验验证JNK4菌株对于不同噬菌体的抵御性实验，通过不同噬菌体侵染JNK4菌株验证JNK4的广谱抗噬菌体能力。

具体步骤如下：

(1)噬菌体悬浮液的制备

噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3(图3～图4中的4，即为该噬菌体)、T4噬菌体悬浮液、λ噬菌体悬浮液、T1噬菌体悬浮液、T7噬菌体悬浮液及课题组同期筛选的噬菌体(分别命名为5、6、JNUWH)悬浮液的制备。

1)准备培养基：选择液体LB培养基。

(2)JNK4菌株对于不同噬菌体的抵御

通过潜在宿主平板上的斑点试验来确定是否是该菌的宿主。

分别将10μL浓度均为1×10¹⁰PFU·mL^-1的噬菌体悬浮液(JNUW3噬菌体(图3～图4中的4，即为该噬菌体)悬浮液、T4噬菌体悬浮液、λ噬菌体悬浮液、T1噬菌体、T7噬菌体悬浮液及课题组同期筛选的噬菌体(分别命名为5、6、JNUWH)悬浮液)滴在覆盖潜在宿主菌的平板上，待其晾干后，倒置放入培养箱中过夜培养。

所述覆盖潜在宿主菌的平板为，添加了菌浓为：OD600为0.6～0.8的大肠杆菌JNK4菌株的LB+1.8％琼脂粉培养基。

根据平板上有无噬菌斑判断是否为待测噬菌体的宿主。

验证结果发现(图3～图4，其中，平板上的4为噬菌体JNUW3)，JNK4大肠杆菌菌株可以抵御JNUW3、以及T7噬菌体，具有一定的广谱抗噬菌体特性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株具有噬菌体抗性的大肠杆菌(Escherichia coli)JNK4，已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231188。

2.一株大肠杆菌噬菌体(Colibacteriophage)JNUW3，已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221670。

3.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求2所述的大肠杆菌噬菌体JNUW3；所述产品包括组合物、杀菌剂、杀菌药物、消毒剂、清洁剂、饲料添加剂；所述组合物中主要的活性成分为大肠杆菌噬菌体JNUW3。

4.一种具有噬菌体抗性的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以权利要求1所述的大肠杆菌JNK4为底盘细胞，进行发酵产物的制备。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵产物包括但不限于酶、有机酸、氨基酸、多糖、色素。

6.权利要求1所述的大肠杆菌JNK4或权利要求4或5所述的基因工程菌在制备发酵产物中的应用，或在制备能够生产发酵产物的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述噬菌体为噬菌体JNUW3、T4噬菌体、λ噬菌体，所述噬菌体JNUW3已于2022年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221670。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵产物包括但不限于酶、有机酸、氨基酸、多糖、色素。

9.权利要求2所述的大肠杆菌噬菌体JNUW3在制备杀菌药物或制备防治大肠杆菌引起的传染病药物中的应用。

10.权利要求2所述的大肠杆菌噬菌体JNUW3在制备杀菌剂、消毒剂、清洁剂、饲料添加剂中的应用。