CN117098529A - 初期突发释放受控的贮库组合物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明关于贮库组合物，其包括在微球中的疏水性氨基酸，该贮库组合物能够控制包括生物可降解聚合物及活性成分的调配物中的初期突发释放过量的活性成分、具有优异的悬浮能力、且能够均匀地及连续地获得该活性成分的效应，即使当普通的使用者使用该组合物作为注射用调配物时。

Description

初期突发释放受控的贮库组合物及其方法

技术领域

本发明关于贮库组合物，特别地藉由包括在微球中的疏水性氨基酸，该贮库组合物控制初期突发释放且通过良好的再悬浮性质提供使用者高便利性。

本发明关于患者客制化药物释放控制(长效注射技术)改良型医药产品的技术开发以进入生物产业技术开发-客制化诊断治疗产品业务的中东及ASEAN市场(任务号码：20014981)，该开发系由韩国工业技术评估研究所(Korea Evaluation Institute ofIndustrial Technology)的支持与贸易、工业及能源部(the Ministry of Trade,Industry and Energy)的资助下进行。

背景技术

贮库为容许持久性药效的注射调配物之一，且为主要在期望长期投予激素及类似物时使用的调配物。贮库调配物为持续释放型调配物，其具有对患者的注射次数可减至最少的优点，但是其在注射之后于整个释放期内不容易达成恒定的药物持续缓释。特别地，当输注开始时过量释放贮库中的药物的初期突发释放较高时，可能发生由过量的药物释放所引起的副作用且药效的持续效应在一段特定的时间内可能变差，且非常重要的是控制贮库的初期突发释放。

GLP-1促效剂(诸如利拉鲁肽(liraglutide)和希马鲁肽(semaglutide))为用于治疗糖尿病及肥胖症的药物，最先经开发以降低糖尿病患者的血糖，且确认此类药物有效减轻肥胖患者的体重。在肠内分泌的肠促胰液素(incretin hormone)激素的类似物增加餐后分泌的胰岛素量及增加胃肠内容物排泄的时间，容许食物自胃缓慢地落入小肠中。另外，作用于中枢神经系统以抑制食欲的各种作用可助于降低血糖及减轻体重。

然而，当身体暴露于过量的利拉鲁肽时，可能会出现副作用，诸如恶心、腹泻、心率加快、低血糖症或头痛，且包括利拉鲁肽作为活性成分的贮库的初期突发释放的控制为更重要的问题之一。

同时，日本专利第5681626号揭示包括磷脂组分及其中结合包括固醇的脂质组分及聚乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物的微球的持续释放型制剂可控制释放速率。然而，在脂质的情况下，其未显出足以抑制初期突发释放的效应且由于其强的疏水性本质而具有差的微球性质的缺点。另外，因为形成微球的聚乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物的修饰导致批准药物使用的难度，因此以该组合物应用于贮库有实际使用上的限制。

另外，在贮库的情况下，考虑到药物的储存安全性，可将微球以冷冻干燥状态储存且悬浮于注射用水中。在此情况下，当微球的悬浮性差时，有可能投予少于一个剂量的配方药物且因此难以看出足够的药物效应。另外，低的悬浮能力可导致团块形成及微球沉积，可由于注射期间堵塞注射针的现象而难以注射，且微球的悬浮能力亦为非常重要的因素之一。

就此而论，因为习知的持续释放型微球在提供具有充分受控的初期突发释放的贮库上的限制，因此对开发具有适当的再悬浮及初期突发释放控制性质的贮库组合物仍有需求。

[相关技术文件]

[专利文献]

1.专利文献1：日本专利第5681626号

发明内容

本发明旨在解决上述问题，且本发明的目的为提供具有优异的再悬浮性及抑制过量的药物初期突发释放的贮库组合物、及至被彼的制备方法。

本发明的发明人尝试开发能够控制过量的药物初期突发释放的贮库组合物，且因此发现在微球的油层及水相层中包括作为释放控制物质的疏水性氨基酸可抑制药物的初期突发释放。另外，确认包括疏水性氨基酸的微球具有作为贮库的均匀的性质、优异的悬浮能力及优异的制备特征，且完成本发明。

本发明提供包括微球的贮库组合物，该微球包括油层(O层)，该油层包括生物可降解聚合物及疏水性氨基酸。

微球可进一步包括在水相层中的疏水性氨基酸。

微球可具有至少0.1g/ml的总体密度(BD)及介于-8mV与-30mV之间的ζ电位。

疏水性氨基酸可选自由缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、异白氨酸和白氨酸所组成的群组。

微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的疏水性氨基酸。

微球可为藉由包括以整体水相溶液为基准计，0.05％(w/v)至25％(w)的疏水性氨基酸所制备的微球。

生物可降解聚合物可为包括乳酸交酯及乙交酯作为单体的聚合物。

生物可降解聚合物可具有0.35dL/g至0.65dL/g的固有黏度。

另外，本发明亦提供制备贮库组合物的方法，其包括制备包括疏水性氨基酸及生物可降解聚合物的油相(O)溶液或将油相(O)溶液与包括水溶性溶剂的第一水相(水相1：W1)溶液混合以制备W1/O乳液；且将油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)中以制备O/W2乳液或W1/O/W2乳液。

第二水相(W2)溶液可进一步包括疏水性氨基酸。

疏水性氨基酸可以100重量份生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的量包括在油相溶液中。

疏水性氨基酸含量可为以整体第二水相溶液为基准计的0.05％(w/v)至25.0％(w)。

该方法进一步包括在干燥及/或过滤上文所制备的O/W2乳液或W1/O/W2乳液之后离心以回收微球的步骤。

包括疏水性氨基酸的本发明的贮库组合物的微球可在贮库注射开始时控制在微球中所包括的活性成分的过量释放、可具有优异的悬浮能力、且可均匀地及连续地获得活性成分的效应，即使当以注射投予使用者时。

附图说明

[图1A至1G]显示根据本发明的具体例所制备的PLGA微球的SEM照片。特定言之，图1A至1E显示使用利拉鲁肽作为API的情况下，其中图1A显示不包括疏水性氨基酸的微球；图1B显示包括在第一水相层中的疏水性氨基酸的微球；图1C显示包括在第二水相层中的疏水性氨基酸的微球；图1D显示包括在油层中的疏水性氨基酸的微球，及图1E显示包括在油层及第二水相中的疏水性氨基酸的微球。另外，图1F至1G显示使用希马鲁肽作为API的情况，其中图1F显示不包括疏水性氨基酸的微球；及图1G显示包括在油层及第二水相层中的疏水性氨基酸的微球。

[图2A至2E]显示依照本发明的具体例所制备的PLGA微球的SEM照片，其中图2A显示包括缬氨酸的微球；图2B显示包括甲硫氨酸的微球；图2C显示包括苯基丙氨酸的微球；图2D显示包括色氨酸的微球；及图2E显示包括白氨酸的微球。

[图3A和3B]显示根据本发明的具体例所制造的PLGA微球的SEM照片，其中图3A显示不包括疏水性氨基酸的微球；及图3B显示不包括亲水性氨基酸且以白氨酸涂布的微球。

[图4A和4B]显示根据本发明的具体例所制备的PLGA微球的SEM照片，其中图4A显示包括胆固醇的微球；及图4B显示包括二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)(其为阳离子脂质)的微球。

[图5A至5C]显示根据本发明的具体例所制备的PLGA微球的SEM照片，该微球包括在油层中的白氨酸。

[图6A至6D]显示根据本发明的具体例所制造的PLGA微球的SEM照片，该微球包括在油层及第二水相层中的白氨酸。

[图7]为显示根据本发明的具体例所制备的微球的DSC分析结果的图形。

[图8]为显示根据本发明的具体例所制备的微球的长期释放特征的图形。

[图9]为显示鉴定根据本发明的具体例所制备的微球的活体内药物释放行为的结果的图形。

具体实施方式

本发明将于下文详细说明。

然而，应理解本发明可采取各种修饰及替代形式，且下文提出的特定实例及说明仅意欲帮助理解本发明，并不意欲限制本发明至特定揭示的形式。应理解本发明的范畴包括落在本发明的精神及范畴内的所有修饰物、等效物及替代物。

本发明提供包括微球的贮库组合物，该微球包括油层(O层)，该油层包括生物可降解聚合物及疏水性氨基酸。

本发明的贮库组合物相当于作为能够在一段长时间内释放药物的调配物的持续释放型制剂，且更特定言之，可为持续释放型注射制剂。持续释放型制剂应在一段时间内以预期的水平缓慢地释放其中的药物。出于此目的，有必要在贮库注射开始时控制其中内部药物过量释放的初期突发释放，且在注射之前制成良好的悬浮液。本发明已生产具有优异的悬浮能力，同时通过混合疏水性氨基酸来控制初期突发释放的微球，以完成贮库组合物。

本发明的微球可呈包括单一水相层(W层)及单一油层(O层)的O/W的形式。另外，本发明的微球可呈包括水相层(W层)、油层(O层)及水相层(W层)的W/O/W的形式。

为了方便说明二或更多个水相层或水相溶液，在此可提及的存在于微球的油层内部的水相层或形成该水相层的水相溶液分别为第一水相(W1层)或第一水相溶液，及在微球的油相外部所形成的水相层或形成该水相层的水相溶液分别为第二水相(W2)层或第二水相。在此情况下，在微球的O/W型中的水相层(W层)或水相溶液应理解为对应于微球的W1/O/W2型中的第二水相(W2层)或第二水相溶液的构型。因此，O/W乳液在本文亦可称为O/W2乳液，且在以下的说明中，述及的第二水相层(W2层)或第二水相溶液应理解为对应于微球的O/W型的水相层或水相溶液的说明。

微球可由单一乳化方法制备，其中将包括生物可降解聚合物及疏水性氨基酸的油相溶液添加至水相溶液中且乳化以形成O/W乳液。微球亦可由双乳化方法制备，其中将W/O乳液添加至水相溶液中且再乳化以制成W/O/W乳液。

特定言之，本发明的微球系由以下方法制备，包括：将疏水性氨基酸及生物可降解聚合物溶解在脂溶性溶剂中以制备油相(O)溶液；或藉由将以活性成分溶解在水溶性溶剂中所制备的第一水相(水相1：W1)溶液与以疏水性氨基酸及生物可降解聚合物溶解在脂溶性溶剂中所制备的油相(O)溶液混合，以制备W1/O乳液；且将油相溶液或W1/O乳液添加至包括水相溶剂的第二水相(水相2：W2)中。

本发明的脂溶性溶剂常于所属技术领域中使用，且可使用任何医药上可接受的载剂或溶剂。一个实例可为但不限于二氯甲烷。

在本发明中的水溶性溶剂常于所属技术领域中使用，且可使用任何医药上可接受的载剂或溶剂。实例包括但不限于聚乙烯醇(PVA)或乙酸钠。第二水相溶液可进一步包括在乳液制备期间用于调节溶液的渗透压的渗透压调节剂，诸如氯化钠。

本发明的微球可进一步包括在水相层中的疏水性氨基酸。水相层可为第二水相层。特定言之，微球可藉由将油相溶液或W1/O乳液添加至以疏水性氨基酸溶解在水相溶剂中所制备的水相溶液中来制备。

在本发明中，当微球的油层及水相层两者皆包括疏水性氨基酸时，除了抑制微球内部的活性成分过量释放的初期突发释放抑制效应以外，亦显著地改进贮库组合物的悬浮能力，且因此组合物可有效地用作为可注射剂。

本发明的微球可具有0.1g/ml或更大的总体密度(BD)值。

总体密度(BD)系指当粉末或颗粒材料填充至特定容器中时，以包括颗粒间空隙的体积为基准的密度。当贮库组合物中的微球的总体密度小于0.1g/ml时，使微球太轻而不能用作为可注射剂。特别地，由于微球的庞大本质，使再悬浮期间于注射用水中有分散性差的问题。本发明的微球具有0.1g/ml或更大的总体密度、具有优异的再悬浮性能及具有作为可注射剂的优异的性质。

本发明的微球可具有-8mV或更小的ζ电位值。

ζ电位系以粒子之间的吸引力及排斥力的大小为单位表示，且本发明的微球可具有-8mV或更小的ζ电位。当ζ电位值大于-8mV时，使关注的微球在注射用水中可具有降低的分散性且快速沉积。

微球较佳地具有-8mV至-40mV或-10mV至-30mV的ζ电位值。当满足上述范围时，微球具有优异的分散性，使得微球可很好地悬浮于注射用水中，且在此情况下，可形成均匀的贮库悬浮液，由此提供特别作为注射制剂的优异的特征。

本发明的微球进一步包括活性成分。亦即，因为本发明的贮库组合物适合投予体内而在一段特定的时间内释放活性成分至体内，所以可将活性成分包括在贮库组合物的内部。可将活性成分包括在微球中，且接受微球的保护及在体内续留一段特定的时间。

可将活性成分包括在本发明的微球的第一水相层(W1层)或油层(O层)中。在单一乳液的情况下，活性成分通常可包括在油层中，及在双乳液的情况下，活性成分通常可包括在第一水相层中。

以释放为目的而于本发明使用的活性成分较佳地可为治疗特定疾病或症状的药物，更佳为生物医药或肽药物。特定的药物可为利拉鲁肽或希马鲁肽。

利拉鲁肽或希马鲁肽可用于治疗肥胖症或糖尿病，因为GLP-1促效剂涉及类升糖素肽-1(GLP-1)(其为扮演降低血糖的角色的激素)的作用。当身体暴露于过量的利拉鲁肽或希马鲁肽时，可能出现症状，诸如呕吐、恶心、低血糖症、头痛及类似者。

因此，当包括利拉鲁肽或希马鲁肽作为贮库组合物的活性成分时，非常重要的是活性成分不自贮库过量释放。另外，因为利拉鲁肽或希马鲁肽为肽药物且难以维持或储存，所以有一种将贮库组合物干燥且以粉末形式储存以解决该问题的方法。在此情况下，应将粉末悬浮于注射用水中以用于注射，且当粉末有差的悬浮能力时，无法形成均匀的制剂。因此，药效的均匀性降低，发生微球的团聚及沉积，或可产生漂浮的微球，且因此可能难以确保受控的释放效应。因此，在包括利拉鲁肽或希马鲁肽作为活性成分的情况下，非常重要的是抑制初期突发释放及成就(implement)悬浮能力优异的制剂。

为了提供具有此初期突发释放控制能力的贮库组合物，因此微球的油层(O层)含有生物可降解聚合物及疏水性氨基酸。

在氨基酸之中，疏水性氨基酸不具有极性部分且选自由缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、异白氨酸和白氨酸所组成的群组。其较佳地可为白氨酸。当疏水性氨基酸包括在本发明的微球的油层中时，有可能藉由以疏水性氨基酸减少微球表面的小孔且藉由部分抑制存在于第一水相层或油层中的一些活性成分自油相层出来而控制初期突发释放，因为存在于O层的疏水性氨基酸与水不亲近。

当疏水性氨基酸只包括在第一水相层中时，使过量的活性成分的初期突发释放未受到有效的控制，及当疏水性氨基酸只包括在第二水相层中时，有以下问题：由于使用过量的原料(疏水性氨基酸)而使溶解时间增加及由于原料成本增加而使制造程序和程序成本增加。另一方面，当疏水性氨基酸包括在油层中或在油层及第二水相层两者中时，具有可获得有效的初期突发释放控制效应的优点，即使只含有低含量的疏水性氨基酸，且可显著地改进贮库的悬浮能力。

微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的疏水性氨基酸。当疏水性氨基酸系以1.5重量份或更多的量混合时，由于微球表面的不均匀性而有贮库药物的均匀性降低的问题。

更特定言之，微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物为基准计，大于0.07至1.1重量份或0.3至1.1重量份的疏水性氨基酸。在此情况下，微球对活性成分具有优异的初期突发释放抑制效应。

在此态样中，本发明的微球可包括在油层中以100重量份生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份；大于0.07至1.1重量份；或0.3至1.1重量份的疏水性氨基酸。当疏水性氨基酸系以100重量份聚合物为基准计，1.5重量份或更多的量包括在油层中时，有微球表面变得不均匀且使贮库药物的均匀性降低的问题。另外，在其中疏水性氨基酸只包括在仅油层中的情况下，当疏水性氨基酸的含量为0.07重量份或更少时，由于亲水性氨基酸而使初期突发释放控制效应很小。

另外，本发明的微球可为那些经制备而包括相对于包括水溶性溶剂及疏水性氨基酸的整体水相溶液，0.05％(w/v)至25％(w)的疏水性氨基酸的微球。在水相层中，当疏水性氨基酸的含量为0.005％(w/v)或更少时，微球的总体密度变得太低，不适合用作为可注射剂。

生物可降解聚合物具有在活体内降解且形成本发明的微球的性质，且当聚合物在活体内逐渐降解时，包括在其中的药物可逐渐释放。亦即，其适合于药物释放期间保护内部的药物且控制药物在一段长时间内释放。

经各国家的药物安全部特定批准用于可注射制剂的生物可降解聚合物可用于本发明中而没有限制。

生物可降解聚合物可具有0.35至0.65dL/g，较佳为0.50至0.55dL/g的固有黏度。当固有黏度小于0.35dL/g时，其可能显出比所欲时间段更快的药物释放，及当固有黏度大于0.65dL/g时，其显出比所欲时间段更慢的药物释放，所以其可能难以达成充分的药物效应。在一个较佳的具体例中，使用0.53dL/g的黏度聚合物以维持一段长时间内的药物释放性质，作为最适化维持药物持久性的贮库组合物，使其具有生物可利用性。固有黏度可根据由制造商所提供测量聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(PLGA)的黏度的方法来测量。

特定言之，生物可降解聚合物可为包括乳酸交酯及乙交酯作为单体的聚合物。当包括乳酸交酯及乙交酯作为单体，所有上述聚合物皆包括在本发明中，无关于聚合形式。亦意味着包括其中聚合物的末端经修饰的支链聚合物。此等聚合物的实例可选自但不限于由聚乳酸交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)和葡萄糖-PLGA所组成的群组。在此态样中，可将本发明的微球称为PLGA微球。

生物可降解聚合物可具有以下如凝胶过滤层析术分析所测定的各个分子量的分子量分布：500至4,000的分子量范围为3％或更大，5,000至16,000的分子量范围为10％或更大及少于30％，及16,000至40,000的分子量范围为20％或更大及少于50％，及40,000或更大的分子量范围为20％或更大。

本发明的贮库组合物可进一步包括医药上可接受的载剂或赋形剂等。然而，本发明的贮库组合物较佳地可不包括稳定剂、pH修饰剂及氧化剂。

另外，本发明亦提供制备贮库组合物的方法，其包括制备包括疏水性氨基酸及生物可降解聚合物的油相(O)溶液，或将油相(O)溶液与包括水溶性溶剂的第一水相(水相1：W1)溶液混合以制备W1/O乳液；且将油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)中以制备O/W2乳液或W1/O/W2乳液。

该方法亦可能进一步包括在干燥及/或过滤之后离心所制备的乳液以回收微球的步骤。

第一水相(水相1：W1)溶液可藉由将活性成分溶解在水溶性溶剂中来制备。在本发明中的水溶性溶剂常于所属技术领域中使用，且可使用任何医药上可接受的载剂或溶剂。实例包括但不限于聚乙烯醇(PVA)或乙酸钠。

活性成分系指自本发明的贮库组合物释放为目的所包括的药物，且不受类型的限制及可用于本发明中。特定言之，其可为水溶性药物且可为生物医药或肽药物。一个实例可为利拉鲁肽或希马鲁肽。

油相(O)溶液可藉由将生物可降解聚合物及疏水性氨基酸混合且溶解在脂溶性溶剂中来制备。亦可将活性成分混合且溶解在油相溶液中。特别地，在以单一乳化方法生产微球的情况下，在添加其中混合活性成分的油相溶液至水相溶液中的同时，可生产乳液。

可使用本发明的技术领域中常使用的溶剂作为包括活性成分的油相溶液中的溶剂。

本发明的脂溶性溶剂常于所属技术领域中使用，且可使用任何医药上可接受的载剂或溶剂。一个实例可为但不限于二氯甲烷。

疏水性氨基酸可以100重量份生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的量包括在油相溶液中。当疏水性氨基酸系以1.5重量份或更多的量包括油相溶液中时，有微球表面变得不均匀且使贮库药物的均匀性降低的问题。另外，当疏水性氨基酸只包括在仅油溶液中时，当含量少于0.07重量份时，藉由亲水性氨基酸的初期突发释放控制效应不显著。

O/W乳液可藉由将油相混合在水相中且以均质机搅拌来制备。可使用的搅拌速率及时间系取决于乳液形成条件及样本量而定。

第二水相(W2)溶液可藉由包括水溶性溶剂来制备。

在本发明中的水溶性溶剂常于所属技术领域中使用，且可使用任何医药上可接受的载剂或溶剂。实例包括但不限于聚乙烯醇(PVA)或乙酸钠。第二水相溶液可进一步包括在乳液制备期间用于调节溶液的渗透压的渗透压调节剂，诸如氯化钠。

另外，水溶性溶剂可进一步包括聚乙烯醇、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯啶酮、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、聚氧乙烯、氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物及其混合物。

另外，所包括的疏水性氨基酸含量可为以整体第二水相溶液为基准计，0.05％(w/v)至25.0％(w)。当第二水相溶液含有0.005％(w/v)或更少的疏水性氨基酸时，微球的总体密度变得太低，不适合用作为可注射剂。

本发明亦提供包括微球的贮库组合物，其系以上述方法制备。在此情况下，有可能获得具有优异的悬浮能力，同时对微球中的活性成分具有优异的初期突发释放抑制效应的贮库组合物。

本发明将于下文以制备例及实验例的方式详细说明。以下的实施例及实验例仅例证本发明且不限制本发明的范畴。

制备例：准备试验及制备微球

制备例1-1：制备微球

制备第一水相(水相1：W1)溶液：将作为API的252mg的利拉鲁肽(PolypeptideLaboratories)或希马鲁肽溶解在1.2mL的1wt％的乙酸钠(Daejung Chemicals&MetalsCo.Ltd.)溶液中。

制备油相(O)溶液：将1350mg的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(聚D,L-乳酸-共-乙交酯；Resomer select 5545DLG 5Glu,Evonik；固有黏度0.53dl/g)溶解在5mL的二氯甲烷(Dichloromethane，Honeywell)中。制备W1/O乳液：将W1与O溶液混合且以均质机在9000rpm下搅拌2分钟。

接下来，制备第二水相(水相2：W2)溶液：将0.5g的氯化钠(NaCl；DaejungChemicals&Metals Co.Ltd)溶解在100mL的1wt％的聚乙烯醇(PVA；Gohsenol EG-40P，Nippon Gohsei)溶液中。制备W1/O/W2乳液：以均质机在9000rpm下搅拌，同时将W1/O乳液以5ml/min的速率注入W2相溶液中。将所制备的W1/O/W2乳液在水中于室温下经3小时干燥，通过具有75um网孔大小的筛网过滤且接着离心以回收微球。将所回收的微球再分散于蒸馏水中且接着离心三次以清洗微球表面。在清洗之后，将微球冻干，最后获得包括封装于其中的药物的微球。

将此方法所制备的微球用作为以下实验中的本发明的微球的对照物。

制备例1-2：制备包括疏水性氨基酸的微球

制备用于长效调配物中的初期突发释放控制的包括疏水性氨基酸的微球，以确认其释放控制效应。使用缬氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸或白氨酸作为疏水性氨基酸。

特定的制备方法系与制备例1的方法相同，除了将疏水性氨基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液、油相(O)溶液及/或第二水相(水相2：W2)中以外。

当疏水性氨基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液或油相(O)溶液中时，将其与主要组分(利拉鲁肽或希马鲁肽)以1：1的莫耳比混合，及当疏水性氨基酸混合在第二水相(水相2：W2)中时，将其与氯化钠(NaCl)以相同的浓度混合。特定的制备调配物系根据各实验而改变。

[测试方法]

1.利拉鲁肽或希马鲁肽含量的评估

将20mg的微球放入20mL量瓶中，以10mL的乙腈溶解在，以1wt％的乙酸钠溶液调整至刻度线，以0.45针筒过滤器过滤且以高性能液相层析术定量利拉鲁肽或希马鲁肽的量。在此时，使用Aegispak C18-L管柱，在1.0mL/min的流速下，在215nm下使用0.05M磷酸二氢钾与乙腈以53：47混合的溶剂作为移动相测量分析条件。

2.释放测试

将20mg经冻干的微球在DISTEK Dissolution system 2500中，在120rpm及37℃下使用包括0.05％的聚山梨醇酯80的100mL的磷酸盐缓冲液(1×PBS)接受释放测试。取出2mL的样本且离心以分离上清液及微球，且以高性能液相层析术定量存在于上清液中的利拉鲁肽或希马鲁肽的量。在此时，使用Aegispak C18-L管柱，在1.0mL/min的流速及215nm下使用0.05M磷酸二氢钾与乙腈以53：47混合的溶剂作为移动相测量分析条件。

自微球初期突发释放的药物确认在上述方法中经1小时溶析的利拉鲁肽的量，且长期释放确认经35天溶析的利拉鲁肽的量。

3.SEM测量

将约10mg的微球固定在铝台上且在0.1托的真空及高电压(10kV)下以铂涂布3分钟，接着安装在SEM粉末上且使用影像分析程序观察微球表面。

4.粒径测量

微球的大小系使用来自Malvern的Mastersizer测量。将约30mg的微球悬浮在5ml的蒸馏水中，且将悬浮液加进分散装置中且接着在2800rpm及超音波50％的条件下分散1分钟以测量大小。

5.悬浮密度测量

当本发明的微球再悬浮于注射溶剂中时，确认很好地分散的悬浮密度。悬浮密度系使用来自Mettler Toledo的D5测量。将534mg的微球悬浮在2ml的溶剂部分中且注入仪器的小室(cell)中以测量密度。

悬浮密度的参考值系以未经处理的微球的1.01g/cm³的悬浮密度为基准测定。

6.ζ电位测量

在50mg的微球分散于3ml的纯水之后，使用来自Malvern的Nano-ZS仪器测量ζ电位。

7.总体密度测量

将1ml的微球填充至微量离心管(Eppendorf tube)且测量经填充的微球的质量。

8.DSC测量

DSC测量系使用微差扫描热量仪执行。将5至10mg的各微球放入铝中且以5℃/min自25℃至250℃测量。

试验例1：确认藉由混合疏水性氨基酸的初期突发释放控制效应

进行以下实验以测定在微球中的疏水性氨基酸是否能控制过量的药物释放。根据与制备例1的微球制备方法相同的方法，生产包括疏水性氨基酸的微球：将作为疏水性氨基酸的白氨酸在制备微球的各阶段混合在第一水相(水相1：W1)溶液、油相(O)溶液及/或第二水相(水相2：W2)的各者中且制备乳液。特定的制备条件系与制备例1的微球制备条件相同，除了将疏水性氨基酸混合在各溶液中以外。

当疏水性氨基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液或油相(O)溶液中时，将其与主要组分(利拉鲁肽或希马鲁肽)以1：1的莫耳比混合，及当疏水性氨基酸混合在第二水相(水相2：W2)中时，将其与氯化钠(NaCl)以相同的浓度混合。微球的特定的制备调配物系如表1中所示。

表1

为了确认根据表1的不包括疏水性氨基酸的微球(比较例1)、其中白氨酸混合在第一水相溶液中的微球(实施例1-1)、其中白氨酸混合在第二水相溶液中的微球(实施例1-2)、藉由将白氨酸混合在油相溶液中所制备的微球(实施例1-3)及藉由将白氨酸同时与油相溶液及第二水相溶液混合所获得的微球(实施例1-4)的初期突发释放抑制效应，以根据测试方法1和2的条件确定利拉鲁肽(API)的含量及释放速率，且依照测试方法3和4的条件使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球的平均粒径(D[4,3])。将结果显示于以下表2及图1A至1E中。

再者，为了确认藉以投予希马鲁肽的不包括疏水性氨基酸的微球(比较例S-1)及其中白氨酸同时混合在油相溶液及第二水相溶液中的微球(实施例S-1)的初期突发释放抑制效应，以根据测试方法1和2的条件确认希马鲁肽(API)的含量及释放速率，且根据测试方法3和4的条件使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球的平均粒径(D[4,3])。将结果显示于以下表2及图1F至1G。

表2

如表2及图1A至1G中所示，可确认许多小孔存在于比较例1和比较例S-1的微球表面上且因此API的初期突发释放亦较大。另外，即使在第一水相层中包括白氨酸的微球的情况下(实施例1-1)，亦未获得覆盖小孔的效应且因此无法获得初期突发释放抑制效应。

然而，当白氨酸包括在油层(O)及/或第二水相层(W2)中时，可看出微球的小孔被覆盖且在表面上几乎观察不到小孔。特定言之，在其中白氨酸只包括在油层中的情况下(实施例1-3)，微球本身的性质有些差，但是在其中白氨酸包括在油层及第二水相层两者中的情况下(比较例1至4和S-1)，确认亦具有良好的性质，同时具有API的初期突发释放控制效应。

试验例2：确认取决于疏水性氨基酸类型的初期突发释放控制效应

为了确认除了白氨酸以外的疏水性氨基酸是否可同样地抑制微球的初期突发释放，在微球制备步骤中分别混合缬氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和白氨酸所制备的微球中确认API利拉鲁肽的释放。

在与比较例1的微球制备相同的方式制备微球的同时，将疏水性氨基酸在制备微球的阶段期间分别与油相(O)溶液及第二水相(水相2：W2)混合，以制备包括亲水性氨基酸的微球。特定的制备条件系与比较例1的微球制备条件相同，除了将疏水性氨基酸混合在各溶液中以外。

在油相(O)溶液中，将各疏水性氨基酸以相对于主要组分(利拉鲁肽)的1：1的莫耳比混合，及在第二水相(水相2：W2)中，将各疏水性氨基酸与氯化钠以相同的浓度混合。微球的特定的制备调配物系如以下表3中所示。

表3

为了确认根据表3的不包括疏水性氨基酸的微球(比较例1)、包括缬氨酸的微球(实施例2-1)、包括甲硫氨酸的微球(实施例2-2)、包括苯基丙氨酸的微球(实施例2-3)、包括色氨酸的微球(实施例2-4)及包括白氨酸的微球(实施例2-5)中的初期突发释放抑制效应，以根据测试方法1和2的条件确定利拉鲁肽(API)的含量及释放速率，根据测试方法3和4使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球的平均粒径(D[4,3])，且将结果显示于以下表4及图2A至2E中。

表4

如表4及图2A至2E中所示，与比较例1的微球的表面及API释放量相比(图1A)，包括缬氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸或白氨酸的所有微球(实施例2-1至2-5)的小孔减少，表明API(利拉鲁肽)的初期突发释放亦受到抑制。这意指当制备微球时，使得疏水性氨基酸包括在油相及W2相中，可使疏水性氨基酸起作用以抑制微球释放。

试验例3：确认微球的涂布的初期突发释放抑制效应的差异

与其中疏水性氨基酸包括在微球中的情况相比，确认即使当微球在制备之后以疏水性氨基酸涂布时是否亦能抑制初期突发释放。

特定言之，制备调配物系如表5中所示，且微球系根据制备例1所述的条件及方法制备(比较例2)。将上文所制备的比较例2的微球再悬浮于白氨酸溶液中且接着冻干(比较例3)。制备白氨酸溶液：将每1g的微球混合0.5g的白氨酸，维持悬浮液10分钟且接着执行冻干。

表5

因此，为了确认以上所制备的比较例2和比较例3的微球的初期突发释放抑制效应，以根据测试方法1和2的条件测定利拉鲁肽(API)的含量及释放速率，且根据测试方法3和4使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球表面的平均粒径(D[4，3])，且将结果显示于以下表6及图3A和3B中。

表6

分类	批号	含量(％)	释放(1h)(％)	D[4，3](μm)
					比较例2	100	92.82	20.17	31.90
比较例3	100L	90.14	24.73	29.44

如以上表6及图3A和3B中所示，当微球经疏水性氨基酸简单地涂布时(比较例3)，可看出即使与未经涂布的微球(比较例2)相比时，亦无法获得释放抑制效应，反而使释放量增加。因此，可看出在本发明包括疏水性氨基酸的微球中所获得的释放抑制效应为藉由乳液制备步骤中控制微球的小孔及表面可获得的疏水性氨基酸的独特效应。

试验例4：确认根据其他的疏水性材料类型的初期突发释放控制效应

为了确认是否可在本发明的疏水性氨基酸的微球中获得初期突发释放抑制效应，即使在使用其他材料的情况下，以藉由使用胆固醇(其为疏水性材料之一)及DOTAP(其为阳离子脂质)来确认是否可抑制微球的初期突发释放。

在与比较例1的微球制备相同的方式制备微球的同时，将胆固醇或DOTAP在制备微粒的阶段期间混合在油相(O)中，以制备包括胆固醇或DOTAP的微球。

在油相(O)溶液中，将胆固醇或DOTAP以相对于主要组分(利拉鲁肽)的1：1的莫耳比混合。微球的特定的制备调配物显示于以下表7中。

表7

为了确认根据表7的不包括疏水性氨基酸的微球(比较例1)、包括胆固醇的微球(比较例4-1)及包括DOTAP的微球(比较例4-2)中的利拉鲁肽(API)的释放，以根据测试方法1和2的条件确认利拉鲁肽(API)的含量及释放速率，依照测试方法3和4的条件使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球表面的平均粒径(D[4,3])，且将结果显示于以下表8及图4A和4B中。

表8

如表8及图4A和4B中所示，当与比较例1的微球的表面及API释放量(图1A)相比时，可看出包括胆固醇或DOTAP的微球的比较例4-1和4-2未抑制API(利拉鲁肽)的初期突发释放，或发生API含量降低的现象。另外，即使当以SEM确认表面时，亦可确认微球中有大量小孔或无法产生光滑的表面。因此，以上结果显示本发明的微球的初期突发释放抑制效应为疏水性氨基酸在PLGA微球中的特定效应。

试验例5：藉由疏水性氨基酸的含量确认释放控制抑制效应

为了测定对本发明的微球中的微球内部的药物的释放抑制效应受否受到疏水性氨基酸含量的影响，以疏水性氨基酸的含量来测定微球中的API的释放及微球本质。

在根据比较例1所述的微球制备方法制备微球的同时，使用白氨酸作为疏水性氨基酸，且油相及/或第二水相的制备差别只在于白氨酸的混合。另外，制备不包括疏水性氨基酸的微球(比较例5)且使用其作为对照物。用于各实验组的制备微球的配方及释放控制组分的特定含量及混合步骤系如以下表9中所示。释放控制组分系以相对于形成微球的生物可降解聚合物(PLGA)量的％(w/w)释放控制组分表示。

表9

为了确认根据表9的不包括疏水性氨基酸的微球(比较例5)、在油层中包括白氨酸的微球(实施例3-1、3-2和3-2)及在油层及W2层中包括白氨酸的微球(实施例4-1、4-2、4-3和4-4)中的利拉鲁肽(API)的释放，以根据测试方法1和2的条件确定利拉鲁肽(API)的含量及释放速率，根据测试方法3和4的条件使用SEM照片观察微球表面，且测量各微球表面的平均粒径(D[4,3])，且将结果显示于以下表表10、图5A至5C及图6A至6D中。

表10

另外，各微球的物理化学性质(总体密度(BD)、悬浮密度、ζ电位)系根据测试方法5至8测量且显示于表11中。

表11

如以上表10和11中所示，可确认白氨酸(其为实施例3-1至3-3和实施例4-1至4-4的疏水性氨基酸)对包括在O层或O及W2层中的微球中的API具有初期突发释放抑制效应。特别在实施例3-2的微球的情况下，可确认其为具有优异的API释放抑制作用及均匀的表面和微球形状的制剂。再者，在此情况下，注射分散性为良好的，ζ电位为适当的，且当微球悬浮于注射用水中时，分散性为优异的，且发现组合物具有适合作为注射用调配物的特征。

然而，确认当白氨酸包括在仅O层中及与聚合物相比的白氨酸含量为0.07％(w/w)时，释放控制效应略微降低。

另外，即使在其中白氨酸包括在O层中的情况下，当白氨酸的含量系相对于整体W2水相溶液为0.05％(w/v)或更少时，粒子的总体密度值(总体密度，BD，g/ml)太低，且发现粒子显出难以用作为注射用调配物的性质。

然而，在实施例4-1和4-2的微球的情况下，可看出在O层及W2层两者中包括白氨酸容许更好的API的初期突发释放控制且提供具有非常均匀的微球形状的调配物。特别地可看出悬浮密度为适当的，注射分散性为良好的，且ζ电位值为显著优异的。这意指微球在注射用水中的分散性为优异的，且本发明的微球具有作为注射制剂的显著优异的性质。

再者，如图7中所示，比较例5、比较例4-2和实施例4-1的微球的DSC分析确认没有改变聚合物及药物的热行为及晶形，即使当白氨酸包括在微球中时。

如图8中所示，比较例5、实施例3-2和实施例4-2的微球的长期释放行为经确认为35天，且因此确认药物系以零级方式连续释放4周，同时本发明包括白氨酸的微球的初期溶析控制1天内维持在5％或更少及经4天在15％或更少。这显示本发明在油层或油层及W2层中包括白氨酸的PLGA微球具有抑制初期突发释放及维持持续释放的非常优异的效应，且具有用作为贮库的性质。

试验例6：测定活体内初期突发释放抑制及持续释放效应

执行该实验以确认微球的活体内药物释放行为。

将根据表1的实施例1-4和比较例1所制备的微球(28mg/kg，利拉鲁肽)经皮下投予具有300g平均体重的5只8周龄SD大鼠(雄性)，且在0、1、2、4、8、10、12、24、48、96、168、336、504、672、1008小时收集血液。

随后，在SD大鼠的血浆样本中，在各时间点的血液中的利拉鲁肽浓度系使用酵素连结免疫吸附检定法(ELISA)测量。在此时，GLP-1(活性)ELISA(IBL，德国)系作为套组使用。

利拉鲁肽浓度随时间的变化显示于图9中。在图9中的结果说明在实验中所使用的5只小鼠的平均值。

如图9中所示，与比较例1的微球(其为一般的微球形式)相比，可看出包括疏水性氨基酸的微球(实施例1至4)具有降低4.4倍的生理活性物质的最大血液浓度(Cmax)，且直到第42天仍具有卓越的持续释放效应。

工业利用性

包括疏水性氨基酸的本发明的贮库组合物的微球可在贮库注射开始时控制在微球中所包括的活性成分的过量释放、可具有优异的悬浮能力、且可均匀地及连续地获得活性成分的效应，即使当以注射投予使用者时。

Claims (13)

1.一种包含微球的贮库组合物，该微球包含油层(O层)，该油层包含生物可降解聚合物及疏水性氨基酸。

2.如权利要求1的贮库组合物，其中该微球进一步包含在水相层中的疏水性氨基酸。

3.如权利要求1或2的贮库组合物，其中该微球具有0.1g/ml或更大的总体密度(BD)及介于-8mV与-30mV之间的ζ电位。

4.如权利要求1或2的贮库组合物，其中该疏水性氨基酸系选自由缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、异白氨酸和白氨酸所组成的群组。

5.如权利要求1的贮库组合物，其中该微球包含在油相溶液中以100重量份的该生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的疏水性氨基酸含量。

6.如权利要求2的贮库组合物，其中该微球包含以整体水相溶液为基准计，0.05％(w/v)至25％(w)的疏水性氨基酸含量。

7.如权利要求1或2的贮库组合物，其中该生物可降解聚合物为包含乳酸交酯及乙交酯作为单体的聚合物。

8.如权利要求7的贮库组合物，其中该生物可降解聚合物具有0.35至0.65dL/g的固有黏度(25℃)。

9.一种制备贮库组合物的方法，其包含：

制备包含疏水性氨基酸及生物可降解聚合物的油相(O)溶液，或将包含水溶性溶剂的第一水相(水相1：W1)溶液与油相(O)溶液混合以制备W1/O乳液；且

将该油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)溶液中以形成O/W2乳液或W1/O/W2乳液。

10.如权利要求9的方法，其中该第二水相(水相2：W2)溶液进一步包含疏水性氨基酸。

11.如权利要求9的方法，其中该疏水性氨基酸系以100重量份的该生物可降解聚合物为基准计，少于1.5重量份的量包含在油相溶液中。

12.如权利要求10的方法，其中该疏水性氨基酸含量为以整体第二水相溶液为基准计的0.05％至25.0％(w/v)。

13.如权利要求9或10的方法，进一步包含在干燥及/或过滤上文所制备的该O/W2乳液或该W1/O/W2乳液之后离心以回收微球的步骤。