CN116987137B - 一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用，所述加帽化合物是符合下式所示结构的化合物、其立体异构体、药学上可接受的盐、或其溶剂合物。由于具备3至6元环烷基或3至6元杂环基，因此本发明所述加帽化合物可以提高mRNA的稳定性，不容易被脱帽酶水解，最终可以提高mRNA的翻译效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用。
背景技术
mRNA需解决的主要技术问题之一在于如何提高mRNA稳定性和翻译效率，而位于蛋白编码序列两侧的5’UTR和3’UTR直接影响mRNA的翻译效率和稳定性并决定mRNA疫苗或药物的效果，一般通过添加5’帽子结构（Cap）和多聚腺苷酸Poly(A)尾巴结构以增强mRNA疫苗或药物的稳定性，使其能在不同条件下较长时间保持全部生物活性。
目前市场的5’帽子结构普遍存在有加帽效率低，以及mRNA翻译效率低等缺点，本申请开发了一种环状修饰的5’帽子结构，不但能够提高加帽效率、细胞水平mRNA翻译效率，同时提高了mRNA小鼠体内翻译效率。
发明内容
为解决现有加帽类似物加帽效率低，以及mRNA翻译效率低的问题，本申请提供一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用。
本发明提供一种加帽化合物，是符合式（I）所示结构的化合物，或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物，
，
（I）
其中，表示单键或无；
表示单键或双键；
R1、R2分别独立地为H、OH、卤素、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、烷硫基或烷氧基与4’上的碳形成桥环；其中烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、烷硫基未被取代，或被一个或多个R5取代，R5为烷基、烷氧基、取代或未取代的乙酰胺基中的任意一种；
R3为OH、卤素、烷氧基或烷氧基与4’上的碳形成桥环；其中烷氧基未被取代，或被一个或多个R6取代，R6为烷基、烷氧基中的任意一种；
R4为OH、烷基、烷氧基；其中烷基、烷氧基未被取代或被一个或多个R7取代，R7为烷基、烷氧基中的任意一种；
Ra、Rb和Rc分别独立地为3至6元环烷基、3至6元杂环基、CH2、CH或O，其中Ra和X1不同时为O， Rb和X4不同时为O， Rc和X5不同时为O；且Ra、Rb和Rc中至少一个为3至6元环烷基或3至6元杂环基；
X1、X2、X3、X4和X5分别独立地选自O、S、CH2、CH、NH或没有；
Y1a、Y2a、Y3a和Y4a分别独立地为OH、SH或BH3；
Y1b、Y2b、Y3b和Y4b分别独立地为O或S；
m为0、1、2或3；
B1和B2分别独立地为天然的、或修饰的核苷碱基。
所述药学上可接受的盐，可以是钠盐、钾盐、铵盐、有机胺盐等本领域技术人员熟知的盐。
以上结构通式的加帽类似物可以提高mRNA的稳定性，不容易被脱帽酶水解，最终可以提高mRNA的翻译效果。
可选的实施方案中，Ra、Rb和R c有一个、两个或三个为3至6元环烷基或3至6元杂环基。
优选的实施方案中，Ra、Rb和Rc中任意一个或两个为3至6元环烷基或3至6元杂环基。
进一步的，Ra、Rb和Rc中的任意一个或两个为三元或四元环烷基，其结构选自：或；且与之相邻的X1、X4或X5为没有。
作为优选，本发明所述的加帽化合物，其结构如式（II）所示化合物，或其立体异构体、药学上可接受的盐、或其溶剂合物，
，
（II）
其中，Ra选自或。其在加帽效率和mRNA翻译效率上有优异的表现。
进一步优选：R3为H、OH、C1-6烷氧基或LNA，其中C1-6烷氧基未被取代，或被一个或多个R6取代，R6为C1-6烷基或C1-6烷氧基。
再进一步优选，R3为H、OH或C1-4烷氧基，R4为H、OH或C1-4烷氧基。
另外，R1和R2分别独立地为H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或LNA；其中C1-6烷基、C1-6烷氧基未被取代或被一个或多个R5取代，R5为C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的乙酰胺基中的任意一种。
作为以上优选的化合物、其立体异构体、药学上可接受的盐、或其溶剂合物，：R1、R2分别独立地为OH或C1-4烷氧基；其中C1-4烷氧基未被取代或被一个或两个R5取代，R5为C1-4烷基、C1-4烷氧基。
结构上再进一步优选，本发明所述的加帽化合物，为结构如式（III）所示化合物，或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物，
（III）。
进一步优选，R3选自H、OH、-O-甲基、-O-乙基、-O-丙基、-O-异丙基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、LNA。
进一步优选，R4为羟基、甲氧基。
进一步优选，R1和R2分别独立地选自H、OH、F、Cl、-亚甲基-乙酸胺基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-O-甲基、-O-乙基、-O-正丙基、-O-异丙基、-亚甲基-O-甲基、-亚乙基-O-甲基、-亚甲基-O-乙基、-亚乙基-O-乙基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、-亚甲基-乙酰氨基、-乙基-乙酰氨基、-正丙基-乙酰氨基、-异丙基-乙酰氨基、-正丁基-乙酰氨基、-异丁基-乙酰氨基。
进一步优选，B1和B2分别独立地为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
另外还可以，Ra、Rb和Rc中的任意一个或两个为三元或四元环烷基，其结构选自：或，且与之相邻的X1、X2或X5为O。
作为优选，本发明所述的加帽化合物、为结构如式（IV）所示化合物，或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物，
（IV）。
R1、R2分别独立地为OH或C1-4烷氧基；其中C1-4烷氧基未被取代或被一个或多个R5取代，R5为C1-4烷基、C1-4烷氧基；
R3为C1-6烷氧基，其中C1-6烷氧基未被取代或被一个或多个R6取代，R6为C1-6烷基或C1-6烷氧基；
R4为H、OH或C1-4烷氧基。
进一步优选，R3选自H、OH、-O-甲基、-O-乙基、-O-正丙基、-O-异丙基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、LNA。
进一步优选，R4为羟基、甲氧基。
进一步优选，R1和R2分别独立地选自H、OH、F、Cl、-亚甲基-乙酸胺基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、-O-甲基、-O-乙基、-O-正丙基、-O-异丙基、-亚甲基-O-甲基、-亚乙基-O-甲基、-亚甲基-O-乙基、-亚乙基-O-乙基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、-亚甲基-乙酰氨基、-乙基-乙酰氨基、-正丙基-乙酰氨基、-异丙基-乙酰氨基、-正丁基-乙酰氨基、-异丁基-乙酰氨基。
进一步优选，B1和B2分别独立地为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
本发明所述的加帽化合物，具体可选自以下任一项所示化合物，或其立体异构体、或药学上可接受的盐、溶剂合物，
-化合物1，
-化合物2，
-化合物3，
-化合物4，
-化合物5，
-化合物6，
-化合物7，
-化合物8，
-化合物9，
-化合物10，
-化合物11，
-化合物12，
-化合物13，
-化合物14，
-化合物15，
-化合物16，
-化合物17，
-化合物18，
-化合物19，
-化合物20，
-化合物21，
-化合物22，
-化合物23，
-化合物24，
-化合物25，
-化合物26，
-化合物27，
-化合物28，
-化合物29，
-化合物30，
-化合物31，
-化合物32，
-化合物33，
-化合物34，
-化合物35，
-化合物36，
-化合物37，
-化合物38，
-化合物39，
-化合物40。
或者，以下化合物也可以作为所述加帽化合物，用于mRNA加帽。
-化合物41，
-化合物42。
本发明所述的加帽化合物，由于具备三元环至六元环烷基或杂环基，因此可以提高mRNA的稳定性，不容易被脱帽酶水解，最终可以提高mRNA的翻译效果。
所述的加帽化合物在制备体外共转录RNA加帽试剂中的应用，所述加帽类似物结构片段存在于mRNA中发挥作用，并用于制备药物组合物。
本发明还包括一种复合体，其包含本发明所述加帽化合物，其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸；以及B1与所述DNA模板位置+1处的核苷碱基互补，并且B2与所述DNA模板上转录模板位置+2处的核苷碱基互补。
本发明还包括RNA分子，具有本发明所述的加帽化合物。
本发明还包括药物组合物，包含前述的RNA分子，以及药学上可接受的载体。
附图说明
图1：化合物1、2、31、32的mRNA小鼠体内翻译效率图。
图2：对比例1的mRNA小鼠体内翻译效率图。
具体实施方式
具体官能团和化学术语的定义见下：
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至6个(例如1、2、3、4、5和6个)碳原子的烷基，更优选为含有1至4个碳原子的烷基。
术语“C1-6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基团。C1-6烷基的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。
术语“C1-4烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或支链饱和烃基团。C1-4烷基的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基等。
术语“C1-6烷氧基”是指-O-R基团，其中R如上文的“C1-6烷基”所定义。
术语“C1-4烷氧基”是指-O-R基团，其中R如上文的“C1-4烷基”所定义。
“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
术语“环烷基”包括具有指定碳数的任何稳定的单环或双环，其中任何碳可以是饱和或不饱和的。例如，3至6元环烷基意在包括具有3、4、5或6个碳原子的单环或双环。3至6元环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基。
术语“3至6元杂环基”，是指包含3-6个环原子的饱和或不饱和的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。
术语“环烷基”包括具有指定碳数的任何稳定的单环或双环，其中任何碳可以是饱和或不饱和的。例如，3至6元环烷基意在包括具有3、4、5或6个碳原子的单环或双环。碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基。
术语“3至6元杂环基”，是指包含3-6个环原子的饱和或不饱和的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。
“LNA”、“lockednucleicacidunit”、“锁核苷”或“锁核酸”可以互换使用，包括但不限于核苷酸单体的2'O和4'C之间的亚甲基桥，或是指糖类似物、核苷、核苷酸单体或核酸，其各自含有所述桥，例如、等。
“取代的”指基团中的一个或更多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。
本申请中的“碱基”和“核苷碱基”可以互换使用，既可以是天然核苷碱基，也可以是修饰核苷碱基。天然核苷碱基包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)以及它们的衍生物中的任意一种。
“修饰的碱基”和“修饰的核苷碱基”可以互换使用，是指天然核苷碱基的一个或两个以上氢被取代而得到的物质，例如包括但不限于N6-甲基腺嘌呤等，在本实施例中，修饰基团选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2'-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶,N1-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、异鸟嘌呤。
“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺/反)、阻转异构体等。
实施例1：以中间体A和B为原料合成化合物1的铵盐合成路径
将中间体A（15.0mmol）和中间体B(12.0mmol)悬浮在DMF（90.0mL）中，冰浴下将ZnCl2(120.0mmol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应24小时后，用0.25MEDTA-2Na(144.0mmol)溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的碳酸氢铵水溶液洗脱液线性梯度洗脱。收集纯度大于98%的组分经纳滤除盐后浓缩得到化合物1的铵盐，反应路线流程，如下方程式：
其中，化合物A通过以下步骤得到
取中间体A1（0.86mol）溶解在DMF（5.0L）中，DMSO（5.1mol）和EDCI（2.6mol）加入到反应液后再将吡啶（0.86mol）和三氟乙酸（0.86mol）滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液，有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩，柱层析得到中间体A2。
氮气氛围下，将四乙基亚甲基二磷酸脂（0.78mol）冰浴下滴加到NaH（60%，1.03mol）的THF（1.0L）悬浊液中，随后0℃搅拌0.5小时。将中间体A2（0.52mol）的THF溶液（2.0L）缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯（480.0mL)萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠洗涤两次，每次300.0mL，有机相减压浓缩后经柱层析纯化得到中间体A3。
氮气氛围下，将三甲基碘化亚砜（1.06mol）冰浴下加到NaH（60%，1.88mol）的DMSO（1.2L）混悬液中，随后0℃搅拌1小时。将中间体A3（0.47mol）的DMSO溶液（2.0L）缓慢滴加到反应液中。室温搅拌6小时。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯（450.0mL)萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠洗涤两次，每次300.0mL，有机相减压浓缩后用柱层析纯化得到中间体A4。
取中间体A4（0.21mol）溶解在1.5L乙腈中，将三乙基溴硅烷（2.1mol）加入到反应液中，随后室温搅拌过夜后浓缩得到中间体A5的粗品，无需纯化直接用于下一步反应。
将中间体A5粗品溶解在THF（1.5L）中，室温下加入TBAF（0.6mol）。室温搅拌3小时。减压浓缩得到中间体A6的粗品，无需纯化直接用于下一步反应。
取中间体A6的粗品溶解在甲醇（300.0mL）中，将浓氨水（1.3L）加入到反应液中，室温搅拌过夜。反应结束后减压浓缩，反相色谱纯化得到中间体A7。
将中间体A7（0.1mol），三苯基膦（0.2mol），2,2’二硫二吡啶（0.2mol），咪唑（0.8mol）和三乙胺（0.1mol）溶解在DMF(380.0mL)中，氮气氛围下搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠（0.4mol）丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A8。
取中间体A8(90.0mmol)溶解DMF(370.0mL)中，加入磷酸三丁胺（0.27mol）和氯化锌（0.72mol）后室温搅拌5小时。反应结束后用水稀释，装载到DEAESephadex上，用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱，浓缩得到中间体A9。
取中间体A9（70.0mmol）溶解在纯化水（560.0mL）中。反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯（0.4mol），过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后装载到DEAESephadex上，用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱，浓缩得到中间体A10。
取中间体A10（53.0mmol），三苯基膦（106.0mmol），2,2’二硫二吡啶（106.0mmol），咪唑（4.2mol）和三乙胺（53.0mmol）溶解在DMF(350.0mL)中，氮气氛围下搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠（0.16mol）丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体A。
其中，化合物B通过以下步骤得到
称取2’OMe-rA亚磷酰胺单体（0.23mol）和N2-异丁酰基-2’,3’乙酰基鸟苷（0.23mol）溶解在DCM（2.0L）中。氮气氛围下加入四氮唑（0.5mol）。室温搅拌2小时。反应结束后，将叔丁基过氧化氢水溶液（0.69mol,70%）滴加到反应液中，室温继续反应1小时。向反应液滴加三氯乙酸（0.69mol）的DCM（0.4L）溶液，室温反应2小时。将反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液，10%碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相减压浓缩后用柱层析纯化得到中间体B1。
取中间体B1（0.18mol）和双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（0.25mol）溶解在DCM（1.7L）。氮气氛围下加入四氮唑（0.39mol）。室温搅拌2小时。反应结束后，将叔丁基过氧化氢水溶液（0.51mol,70%）滴加到反应液中，室温继续反应1小时。将反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液，10%碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相减压浓缩后溶解在甲醇（0.5L）和氨水（1.0L）中，室温搅拌过夜。浓缩除去溶剂后用水稀释，装载到DEAESephadex上，用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱，浓缩得到中间体B。反应路线流程：
实施例2：以中间体B和C为原料合成化合物2的铵盐合成路径
以中间体B和C为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物2的铵盐。反应路线：
其中，化合物C通过以下步骤得到：参考实施例1中中间体A2-A的合成方法得到中间体C2-C。反应路线：
实施例3：以中间体B和D为原料合成化合物5的铵盐合成路径
以中间体B和D为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物5的铵盐。反应路线：
其中，化合物D通过以下步骤得到：
取化合物D1（0.18mol）和咪唑（0.36mol）溶解在DMF（3.5L）。冰浴下将叔丁基二苯基氯硅烷（0.2mol）加入到反应液中。室温搅拌5小时。将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取两次，每次500.0mL。有机相用饱和氯化钠洗涤后干燥，减压浓缩得到中间体D2，无需纯化直接用于下一步反应。
冰盐浴下将醋酸酐（0.45mol）和吡啶（0.8mol）缓慢加到CrO3（0.45mol）的二氯甲烷（900.0mL）悬浮液中。室温搅拌15分钟后将中间体D2（0.15mol）加入到反应液中。室温搅拌1小时后将反应液倒入到冰的乙酸乙酯中，抽滤，滤液减压浓缩后经柱层析纯化得到中间体D3。
将甲基三苯基溴化膦（0.15mol）冰浴下滴加到NaH（60%，0.12mol）的THF（500.0mL）悬浊液中，0℃搅拌0.5小时。将中间体D3（0.12mol）的THF溶液（300.0mL）缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应，乙酸乙酯萃取后浓缩，柱层析纯化得到中间体D4。
取中间体D4（0.1mol）溶解在无水THF（420.0mL）中，控温-5~0℃，氮气氛围下滴加到硼烷二甲硫醚溶液(0.2mol，10M)中，滴加完毕后保温搅拌6小时。随后将氢氧化钠水溶液(0.7mol，350.0mL)和过氧化氢(80.0mL，30％水溶液)依次滴加到反应液中。恢复室温搅拌2小时。加入乙酸乙酯(200.0mLx2)萃取。有机相依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩有机相，柱层析纯化得中间体D5。
将中间体D5（85.0mmol）的THF（200.0mL）溶液冰浴下滴加到NaH（60%，95.0mmol）的THF（170.0mL）悬浊液中，0℃搅拌0.5小时。将碘甲烷（100.0mmol）滴加到反应液中。室温搅拌3小时。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应，乙酸乙酯萃取后浓缩，柱层析纯化得到中间体D6。
取中间体D6（70.0mmol）溶解在无水THF（300.0mL）中，将TBAF的THF溶液（1M,0.3mol）加入后室温搅拌6小时。反应液用水洗涤，水相再用乙酸乙酯萃取一次。合并有机相，干燥后浓缩。柱层析纯化后得到中间体D7。
取中间体D7（60.0mmol）溶解在DMF（130.0mL）中，DMSO（0.36mol）和EDCI（0.18mol）加入到反应液后再将吡啶（60.0mmol）和三氟乙酸（60.0mmol）滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液，有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩，柱层析得到中间体D8。
将四乙基亚甲基二磷酸脂（80.0mmol）冰浴下滴加到NaH（60%，53.0mmol）的THF（50.0mL）悬浊液中，随后0℃搅拌0.5小时。将中间体D8（53.0mmol）的THF溶液（70.0mL）缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应，乙酸乙酯萃取后浓缩，柱层析得到中间体D9。
取中间体D9（44.0mmol）溶解在醋酸（80.0mL）中，室温下加入醋酸酐（132.0mmol）后降温至10℃以下，将浓硫酸（6.6mmol）滴加到反应液中。室温搅拌过夜。反应液用DCM（150.0mL）稀释后，依次用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩有机相得中间体D10，无需纯化直接用于下一步反应。
称取化合物D10（40.0mmol）和化合物D11（40.0mmol）悬浮在DCE（300.0mL）中，将BSA（0.1mol）加入到反应液中。反应升温至70℃搅拌1小时后，降温至0℃，将TMSOTf（0.12mol）滴加到反应液中。滴加完毕后升温至70℃搅拌3小时。降温至室温后，反应液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，有机相减压浓缩后经柱层析纯化得到中间体D12。
参考中间体C4的合成方法得到中间体D13。
参考中间体C5的合成方法得到中间体D14。
参考中间体C7的合成方法得到中间体D15。
参考中间体C8的合成方法得到中间体D16。
参考中间体C9的合成方法得到中间体D17。
参考中间体C10的合成方法得到中间体D18。
参考中间体C的合成方法得到中间体D。
实施例4：以中间体B和E为原料合成化合物9的铵盐合成路径
以中间体B和E为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物9的铵盐。反应路线流程，如下所示：
其中，化合物E通过以下步骤得到：参考实施例2中中间体C2-C的合成方法得到中间体E2-E。反应路线：
实施例5：以中间体B和F为原料合成化合物10的铵盐合成路径
以中间体B和F为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物10的铵盐。反应路线：
其中，化合物F通过以下步骤得到：
取中间体D5（0.33mol），三苯基膦（0.66mol）和DIAD（0.66mol）溶解在THF（1.5L）中。将DPPA（0.66mol）滴加到反应液中。室温搅拌过夜。减压浓缩除去溶剂。经柱层析纯化得到中间体F1。
参考实施例3中中间体D7的合成方法得到中间体F2。
参考实施例3中中间体D8的合成方法得到中间体F3。
参考实施例3中中间体D9的合成方法得到中间体F4。
参考实施例3中中间体D10的合成方法得到中间体F5。
参考实施例3中中间体D12的合成方法得到中间体F6。
参考实施例3中中间体D13的合成方法得到中间体F7。
参考实施例3中中间体D15的合成方法得到中间体F8。
取中间体F8（125.0mmol）溶解在THF（1.0L）中。将水（100.0mL）和三苯基膦（187.5mmol）加入后升温至50℃搅拌过夜。浓缩除去溶剂。粗品经柱层析纯化后得到中间体F9。
取中间体F9（108.0mmol）溶解在DCM（940.0mL）中，加入TEA（143.0mmol）后，冰浴下将苯甲酰氯（130.0mmol）滴加到反应液中。恢复室温后搅拌2小时。反应液依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩有机相，柱层析纯化得中间体F10。
参考实施例3中中间体D14的合成方法得到中间体F11。
参考实施例3中中间体D16的合成方法得到中间体F12。
参考实施例3中中间体D17的合成方法得到中间体F13。
参考实施例3中中间体D18的合成方法得到中间体F14。
参考实施例3中中间体D的合成方法得到中间体F。
实施例6：以中间体A和G为原料合成化合物14的铵盐合成路径
以中间体A和G为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物14的铵盐。反应路线：
其中，化合物G通过以下步骤得到：
取中间体B1（0.18mol）和双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（0.25mol）溶解在DCM（1.7L）。氮气氛围下加入四氮唑（0.39mol）。室温搅拌2小时。反应结束后，将DDTT（0.51mol）加到反应液中，室温继续反应1小时。将反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液，10%碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相减压浓缩后溶解在甲醇（0.5L）和氨水（1.0L）中，室温搅拌过夜。浓缩除去溶剂后用水稀释，装载到DEAESephadex上，用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱，浓缩得到中间体G。反应路线：
实施例7：以中间体H和I为原料合成化合物21的铵盐合成路径
以中间体H和I为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物11的铵盐。反应路线：
其中，化合物H通过以下步骤得到：分别参考实施例5中中间体F14和F的合成方法分别得到中间体Y1~Y。反应路线：
化合物I通过以下步骤得到：
取中间体B1（0.3mol）溶解在DMF（1.2L）中，DMSO（1.8mol）和EDCI（0.9mol）加入到反应液后再将吡啶（0.3mol）和三氟乙酸（0.3mol）滴加到反应液中。室温反应5小时后用乙酸乙酯稀释反应液，有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后浓缩，柱层析得到中间体I1。
将四乙基亚甲基二磷酸脂（0.24mol）冰浴下滴加到NaH（60%，0.16mol）的THF（500.0mL）悬浊液中，随后0℃搅拌0.5小时。将中间体I1（0.16mol）的THF溶液（400.0mL）缓慢滴加到反应液中。室温搅拌过夜。冰浴下将饱和氯化铵水溶液滴加到反应液中淬灭反应，乙酸乙酯萃取后浓缩，柱层析得到中间体I2。
参考实施例5中中间体F7的合成方法得到中间体I3。
参考实施例5中中间体F11的合成方法得到中间体I4。
参考实施例6中中间体G的合成方法得到中间体I。
反应路线：
实施例8：以中间体H和J为原料合成化合物22的铵盐合成路径
以中间体H和J为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物22的铵盐。反应路线：
其中，化合物J通过以下步骤得到：
取中间体A5（0.21mol）和DMT-2'OMe-A(Bz)（0.25mol）溶解在DMF（1.5L）中，将DCC（0.5mol）加到反应液中室温过夜。反应结束后加水（4.5L）淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次，每次500.0mL。合并有机相后减压浓缩，经柱层析纯化得到中间体J1。
取中间体J1（0.11mol）溶解在80%的醋酸水溶液（1.6L）中，室温搅拌过夜，反应完全，减压浓缩除去溶剂后用柱层析纯化得到中间体J2。
参考实施例1中中间体B的合成方法得到中间体J。
实施例9：以中间体B和K为原料合成化合物31的铵盐合成路径
以中间体B和K为原料，参考实施例1中化合物1的化合物31的铵盐。反应路线：
其中，化合物K通过以下步骤得到：
取中间体A2（0.19mol）溶解在乙腈（1.1L）中，将磷酸二氢钠水溶液（0.2M，38.2mmol）和双氧水（30wt.%,0.21mol）加入到反应液中。降温至0℃，将亚氯酸钠溶液（0.75M,0.29mol）滴加到反应液中。滴加完毕后恢复至室温搅拌1小时。将亚硫酸钠水溶液加入到反应液中淬灭反应。将反应液浓缩得到中间体K1的粗品。
取中间体K1的粗品溶解在DMF（1.0L）中。降温至0℃，分别将NaHCO3（1.35mol）和碘甲烷（0.34mol）加入到反应液中，室温搅拌过夜。将反应液用水稀释后，乙酸乙酯萃取2次，每次500.0mL。合并有机相后减压浓缩，经柱层析纯化得到中间体K2。
将中间体K2（0.1mol）溶解在无水THF（610.0mL）中，降温至0℃，氮气氛围下钛酸四异丙酯（0.1mol）和乙基溴化镁（2.0MinTHF，0.5mol）。恢复至室温搅拌6小时。将饱和氯化铵水溶液加入到反应液中，分液，水相抽滤后用乙酸乙酯萃取。合并有机相后减压浓缩。粗品经柱层析纯化得到中间体K3。
参考实施例4中中间体E6的合成方法得到中间体K4。
参考实施例4中中间体E7的合成方法得到中间体K5。
取中间体A3（0.55mol）溶解在磷酸三甲酯（200.0ml）中，降温至-0℃后将三氯氧磷（0.1mol）滴加到反应液中。-0℃下搅拌3小时后，将TEAB溶液滴加到反应液中进行淬灭。经反相制备色谱纯化得到中间体K5。
参考实施例4中中间体E8的合成方法得到中间体K7。
参考实施例4中中间体E9的合成方法得到中间体K8。
参考实施例4中中间体E10的合成方法得到中间体K9。
参考实施例4中中间体E的合成方法得到中间体K。
实施例10：以中间体B和L为原料合成化合物32的铵盐合成路径
以中间体B和L为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物32的铵盐。反应路线：
其中，化合物L通过以下步骤得到：参考实施例9中中间体K1-K的合成方法得到中间体L1-L。
实施例11：以中间体K和M为原料合成化合物37的铵盐合成路径
以中间体K和M为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物37的铵盐。反应路线：
其中，化合物M通过以下步骤得到：参考实施例1中中间体B的合成方法得到中间体M。
实施例12：以中间体A和M为原料合成化合物38的铵盐合成路径
以中间体A和M为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物38的铵盐。反应路线：
对比例1：以中间体H和B为原料合成化合物43的铵盐合成路径
以中间体H和B为原料，参考实施例1中化合物1的合成方法得到化合物43的铵盐。反应路线：
生物活性检测部分：
利用实施例的帽类似物进行mRNA的IVT反应。首先计算好体系所需物料体积，然后进行加样（IVT反应体系如表1）。在体系中加入无菌无酶水，随后依次加入10×buffer、NTPs、帽类似物，混匀后轻轻离心，随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7RNA聚合酶、线性化DNA模板，充分混匀后轻轻离心，于37摄氏度下孵育。2小时后加入DNaseI1U，37摄氏度继续孵育30分钟以去除DNA模板，然后使用磁珠纯化方法进行RNA纯化。纯化的mRNA用无菌无酶水进行溶解，随后利用NanodropOne进行定量检测。
表1 IVT反应体系
| IVT反应体系 | 用量 |
| T7RNA聚合酶 | 50U |
| 10Xbuffer | 2μl |
| 100mMATP | 1μl |
| 100mMGTP | 1μl |
| 100mMCTP | 1μl |
| 100mMN1-Me-pUTP | 1μl |
| 100mM帽类似物 | 1μl |
| 无机焦磷酸酶 | 0.05U |
| 核酸酶抑制剂 | 20U |
| 无菌无酶水 | 补足至20μl |
| DNA模板 | 1μg |
液相色谱质谱法（LC-MS）被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率；首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针，通常的标记为biotin标记，将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNaseHreactionbuffer室温孵育30分钟，边孵育边缓慢混匀，随后加入20ulRNaseH(5U/μL)孵育37度3h，每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗，清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80摄氏度的75%甲醇，混合物在加热板上加热到80摄氏度，保持3分钟，然后放置磁力架上吸取上清，使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1%MeOH中，即可用于LC-MS分析，确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别，利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。
具体结果见表2。
表2 mRNA产量以及加帽效率
| 实施例 | 化合物编号 | 20ul体系产量（μg） | 加帽率（%） |
| 实施例1 | 化合物1 | 114 | 99.1 |
| 实施例2 | 化合物2 | 117 | 98.4 |
| 实施例3 | 化合物5 | 110 | 96.3 |
| 实施例4 | 化合物9 | 98 | 94.5 |
| 实施例5 | 化合物10 | 103 | 96.3 |
| 实施例6 | 化合物14 | 102 | 98.0 |
| 实施例7 | 化合物21 | 99 | 97.1 |
| 实施例8 | 化合物22 | 115 | 96.0 |
| 实施例9 | 化合物31 | 112 | 98.5 |
| 实施例10 | 化合物32 | 116 | 98.9 |
| 对比例1 | 化合物43 | 105 | 96.1 |
由实验结果可知，跟对比例1相比，使用本申请的帽类似物进行mRNA的IVT反应，其mRNA体外转录产量和加帽效率都有了显著的提高。
测试方法：采用eGFP编码序列为DNA模板，利用实施例及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录。随后将获得的不同的mRNA产物进行293T细胞的转染。293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板（24孔板）。转染时细胞密度一般60-80%为佳，每孔转染2μgmRNA，转染试剂选用LipofectamineMessengerMAXTransfectionReagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37摄氏度，CO2孵育箱中，转染4-6小时后，更换为新鲜的完全培养基。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育24h以后，荧光显微镜观察其中GFP的荧光强度，并且根据荧光强度计算实施例相对于对比例1的荧光强度比例。
表3 mRNA翻译效率
| 实施例 | 化合物编号 | 荧光相对强度（相对于对比例1） |
| 实施例1 | 化合物1 | 2.26 |
| 实施例2 | 化合物2 | 2.58 |
| 实施例3 | 化合物5 | 1.98 |
| 实施例4 | 化合物9 | 2.12 |
| 实施例5 | 化合物10 | 2.16 |
| 实施例6 | 化合物14 | 1.44 |
| 实施例7 | 化合物21 | 1.37 |
| 实施例8 | 化合物22 | 1.24 |
| 实施例9 | 化合物31 | 1.84 |
| 实施例10 | 化合物32 | 1.94 |
| 对比例1 | 化合物43 | 1.0 |
由实验结果可知，以本申请的帽类似物为起始进行体外转录，在转染细胞孵育24h后，其mRNA的翻译效率分别高于对比例1。以上结果表明本申请的帽类似物在细胞水平翻译效率更高。
实验步骤：
小鼠尾部使用酒精棉球轻轻擦拭，使用胰岛素注射器尾静脉注射1ug的LNP-mRNA药物。小鼠尾静脉给药后24h后，使用10%水合氯醛腹腔注射（根据小鼠体重麻醉，50-60μl/20g），待小鼠麻醉后，接着腹腔注射配制好的发光底物150μl（发光底物浓度15mg/ml，货号2109GR001，品牌biofroxx）。小鼠发光底物注射后5min，将小鼠置于小动物活体成像仪中，选择对应的luciferase通道进行小鼠活体成像的拍摄；保存图片即可。其它时间点均按照此步骤进行重复即可，曝光参数需保持一致进行对比。mRNA小鼠体内翻译效率效果参见图1所示。
由图1可知，尾静脉给药后，化合物1，2，31，32与对比例1均集中在肝脏部位。给药24小时后，化合物1，2，31，32的修饰的mRNA在小鼠体内蛋白表达量比对比例1更高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (11)
1.一种加帽化合物，其为式（I）所示结构的化合物，或药学上可接受的盐，
，（I）；
其中，表示单键；
表示单键；
R1为OH、甲氧基或F；
R2为OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基，其中C1-4烷基未被取代，或被一个或多个R5取代，R5为C1-4烷氧基或乙酰胺基中的任意一种；
R3为甲氧基；
R4为OH；
Ra、Rb和Rc中任意一个为三元环烷基；
Ra为三元环烷基或CH2；
Rb为或CH2；其中Rb为时，X4为没有；Rb为CH2时，X4为O；
Rc为或CH2；其中Rc为时，X5为没有；Rc为CH2时，X5为O；
X1为没有或O；
X2和X3为O；
Y1a、Y2a、Y3a和Y4a为OH；
Y1b、Y2b和Y4b为O；
Y3b为O或S；
m为1；
B1和B2分别独立地为天然的、或修饰的核苷碱基。
2.根据权利要求1所述的加帽化合物，其特征在于：
Ra、Rb和Rc中的任意一个为三元环烷基，其结构为；且与之相邻的X1、X4或X5为没有。
3.根据权利要求2所述的加帽化合物，其特征在于，其为结构如式（II）所示化合物或药学上可接受的盐，
，（II）；
Ra选自。
4.根据权利要求3所述的加帽化合物，其特征在于，其为结构如式（III）所示化合物或药学上可接受的盐，
，（III）。
5.根据权利要求1所述的加帽化合物，其特征在于：Ra选自，且与之相邻的X1为O。
6.根据权利要求5所述的加帽化合物，其特征在于：其为结构如式（IV）所示化合物或药学上可接受的盐，
，（IV）；
R1为OH；
R2为OH或C1-4烷氧基；
R3为甲氧基；
R4为OH。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的加帽化合物，其特征在于，选自如下任一项所示化合物或药学上可接受的盐，
-化合物1，
-化合物2，
-化合物5，
-化合物9，
-化合物10，
-化合物14，
-化合物21，
-化合物22，
-化合物31，
-化合物32。
8.权利要求1-7任一项所述的加帽化合物在制备体外共转录RNA加帽试剂中的应用。
9.一种复合体，其包含权利要求1-7任一项所述加帽化合物和DNA模板，其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区，所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸；以及B1与所述DNA模板位置+1处的核苷碱基互补，并且B2与所述DNA模板上转录模板位置+2处的核苷碱基互补。
10.一种RNA分子，其特征在于，包含权利要求1-7任一项所述的加帽化合物。
11.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求10所述的RNA分子，以及药学上可接受的载体。
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