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CN116964219A - 用于分析抗原结合分子的方法和组合物 - Google Patents

用于分析抗原结合分子的方法和组合物 Download PDF

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CN116964219A
CN116964219A CN202180078190.7A CN202180078190A CN116964219A CN 116964219 A CN116964219 A CN 116964219A CN 202180078190 A CN202180078190 A CN 202180078190A CN 116964219 A CN116964219 A CN 116964219A
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cells
barcode
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W·J·麦克唐纳
M·J·T·斯图宾顿
G·麦克德莫特
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10X Genomics Inc
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Abstract

本文提供了用于测量来自单细胞的分泌型抗体或其他分析物的方法和系统。本文所公开的方法包括使用与分泌型抗体结合的捕获剂和报告剂，以及分区(例如，液滴或孔)中的珠粒，以在单细胞基础上测量分泌型抗体，其中该捕获剂和/或该报告剂可以是分析物特异性的并且/或者加条形码的。本文进一步描述了包括使用水凝胶包封的细胞(例如，细胞珠粒)测量来自单细胞的分泌型分析物和/或细胞分析物的方法。

Description

用于分析抗原结合分子的方法和组合物
技术领域
本公开在一些方面涉及用于分析抗原结合分子的方法和组合物，该抗原结合分子包括分泌型抗原受体，例如分泌型抗体。
背景技术
用于发现抗体的方法通常依赖于通量较低的永生化(例如，通过将产生第一抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤)、引起抗体分泌的培养方法，以及对小(通常为三个或更少)抗原组的检测。杂交瘤可以在培养物中生长，每种培养物均从一个活杂交瘤细胞开始培养，所产生的培养物中的每一种均由遗传上相同的杂交瘤组成，这些遗传上相同的杂交瘤在每种培养物中产生一种抗体(单克隆)，而不是不同抗体的混合物(多克隆)。与检测试剂(诸如荧光团)偶联的抗原诱饵可以用于检测克隆扩增细胞中的抗体-抗原相互作用。然而，对抗体分泌(例如，来自原代细胞的抗体分泌)进行单细胞分析仍然充满挑战。需要有效地分析分泌型抗体和抗体分泌细胞的方法，特别是在抗体分泌细胞的异质群体中进行高通量筛选的方法。本公开解决了这些和其他需求。
发明内容
本公开提供了用于对单细胞分析物进行检测和测量的方法和系统，其包括可以与来自单细胞(例如，抗体产生细胞)的分泌型分析物(例如，抗体)偶联的加核苷酸条形码的多肽。本文所述的方法和系统可以包括执行下一代测序，以测量和分析可以从单细胞分泌并且/或者存在于单细胞中的分析物分子(例如，抗体、细胞因子、mRNA等)。与其他细胞分析方法相比，本文所公开的方法和系统可以增加能够从单细胞测量的不同分子或分析物的数量。此外，本发明所公开的方法和系统可以允许同时测量多种细胞分子(例如，分泌型分子和/或细胞内分子)，诸如分泌型分析物(例如，抗体)、mRNA、细胞表面蛋白、抗原受体序列和抗原结合特异性等。
在一些实施方案中，本文提供了用于分析来自单细胞(例如，来自受试者的异质细胞群体中的原代细胞)的分泌型分析物的方法和组合物，该分泌型分析物诸如抗原结合分子，例如抗体，该分析例如使用捕获剂和/或细胞珠粒来将该分泌型分析物与分泌它的细胞相关联。在一些实施方案中，来自细胞(例如，浆细胞)的分泌型抗体可以束缚至该细胞的表面(例如，经由细胞表面双特异性抗体捕获剂)并且/或者束缚至包封该细胞的基质(例如，细胞珠粒)，然后使用基于核酸的加条形码的抗原来筛选多种抗原特异性。这种方法能够与抗原/表位的大阵列相容，并且直接将抗体的重链和/或轻链与这些抗原/表位配对，使得具有感兴趣的抗原/表位特异性的抗体能够被快速克隆并转化为适于进一步治疗性开发和检测的形式。
在一些方面，本文提供了用于分析来自多个细胞中的单细胞的分泌型分析物的方法和组合物，其中该分泌型分析物包括抗原结合分子，诸如分泌型抗原受体，例如分泌型抗体。在一些方面，对该单细胞的分析还包括分析一种或多种其他分析物，包括蛋白质分析物(例如，一种或多种细胞表面蛋白分析物(诸如受体和/或配体)，以及/或者一种或多种其他分泌型分析物(诸如细胞因子))、核酸分析物(例如，基因组DNA和/或RNA(诸如mRNA))、碳水化合物分析物，以及/或者脂质分析物。
本文在一个方面提供了一种用于单细胞分析的方法，包括：(a)将细胞(例如，抗体分泌细胞)与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，其中该标记细胞包括与该细胞的表面偶联的复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如，分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，和(iii)报告剂；(b)将该标记细胞分隔在分区中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列(例如，其可以是或包括共同的分区特异性条形码序列)；以及(c)在该分区中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)或其互补序列。
在任一项前述实施方案中，细胞(例如，抗体分泌细胞)可以属于B细胞谱系，例如浆细胞。
在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞表面分子偶联。
在任一项前述实施方案中，所述细胞表面分子可以是细胞表面蛋白。
在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以被配置为与细胞表面蛋白和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。
在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以是第一抗体结合剂。
在任一项前述实施方案中，报告剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
在任一项前述实施方案中，所述报告剂可以是第二抗体结合剂。
在任一项前述实施方案中，所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。
在任一项前述实施方案中，所述标记细胞还可以包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告剂可以被配置为与该细胞的第二细胞表面蛋白偶联。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。
在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子。多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子可以包含来自第二报告核酸分子的序列(例如，第二报告序列)，以及来自第二条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。
在任一项前述实施方案中，所述标记细胞还可以包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物可以包含核酸分析物序列。
在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第三条形码核酸分子。多个第三条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。
在任一项前述实施方案中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子可以包含被配置为与该核酸分析物序列偶联的第三序列。
在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列，以及来自第三条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。
在任一项前述实施方案中，所述分区可以包括其中包含多个条形码核酸分子的支持物。
在任一项前述实施方案中，所述支持物可以是珠粒。
在任一项前述实施方案中，所述珠粒可以是凝胶珠粒。
在任一项前述实施方案中，所述多个条形码核酸分子能够可释放地附接到该支持物。
在任一项前述实施方案中，该分区可以来自多个分区。
在任一项前述实施方案中，该分区可以是液滴或微孔。
在另一个方面，本文提供了一种单细胞分析方法，包括：(a)将细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞珠粒，其中该细胞珠粒在基质中包含细胞，例如抗体分泌细胞，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，其中该标记细胞珠粒在该细胞珠粒之中或之上包含复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)报告剂；(b)将该标记细胞珠粒分隔在分区中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列(例如，其可以是或包括共同的分区特异性条形码序列)；以及(c)在该分区中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)或其互补序列。
在任一项前述实施方案中，细胞(例如，抗体分泌细胞)可以属于B细胞谱系，例如浆细胞。
在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞珠粒的基质偶联。
在任一项前述实施方案中，所述基质可以是可降解的聚合物基质。
在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以被配置为与基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。
在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以是第一抗体结合剂。
在任一项前述实施方案中，报告剂可以被配置为与该抗体或其抗原结合片段偶联。
在任一项前述实施方案中，所述报告剂可以是第二抗体结合剂。
在任一项前述实施方案中，所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。
在任一项前述实施方案中，所述细胞或所述标记细胞珠粒还可以包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告剂可以被配置为与该细胞的细胞表面蛋白偶联。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。
在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子。多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。
在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子可以包含来自第二报告核酸分子的序列(例如，第二报告序列)，以及来自第二条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。
在任一项前述实施方案中，所述细胞还可以包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物可以包含核酸分析物序列。
在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第三条形码核酸分子。多个第三条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。
在任一项前述实施方案中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子可以包含被配置为与该核酸分析物序列偶联的第三序列。
在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列，以及来自第三条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。
在任一项前述实施方案中，所述分区可以包括其中包含多个条形码核酸分子的支持物。
在任一项前述实施方案中，所述支持物可以是珠粒。
在任一项前述实施方案中，所述珠粒可以是凝胶珠粒。
在任一项前述实施方案中，所述多个条形码核酸分子能够可释放地附接到该支持物。
在任一项前述实施方案中，该分区可以来自多个分区。
在任一项前述实施方案中，该分区可以是液滴或微孔。
在任一项前述实施方案中，这些方法还可以包括步骤(d)，其中对所产生的加条形码的核酸分子进行测序。如果对所产生的加条形码的核酸分子进行测序，则细胞(例如抗体分泌细胞)可以被分析为分泌能够结合报告剂的抗体，例如经由检测到报告序列。如果该方法进一步(d)对所产生的加条形码的核酸分子进行测序，则可以在对所产生的加条形码的核酸分子进行测序之前将其扩增。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。
图1示出了用于分隔单独生物颗粒的示例性微流体通道结构。
图2示出了用于将珠粒受控分隔到离散液滴中的示例性微流体通道结构。
图3示出了一种示例性的携带条形码的珠粒。
图4示出了另一种示例性的携带条形码的珠粒。
图5示出了示例性的微阵列示意图。
图6示出了用于加工核酸分子的示例性工作流程。
图7示出了本文所公开的示例性方法。
图8示出了使用捕获剂(例如，细胞表面捕获剂，诸如双特异性抗体)的示例性方法。
图9示出了本文所公开的示例性方法。
图10A示出了使用细胞珠粒的示例性方法。显示分泌型抗体离开细胞表面并缀合至细胞珠粒基质。
图10B示出了具有缀合至基质的分泌型抗体分子的示例性细胞珠粒。
图11示出了将加条形码的分析物转化为测序文库的示例性说明。
图12示出了同时测量分泌型分析物(例如，分泌型抗体或其抗原结合片段)、mRNA、细胞表面蛋白和抗原结合特异性的示例性说明。
图13示出了标记剂的示例性示意图。
图14示出了另一种示例性的携带条形码的珠粒。
图15A至图15D示出了用于加工核酸分子的示例性工作流程。
图16示出了示例性计算机系统，该计算机系统被编程为或以其他方式被配置为实现本文所提供的方法。
具体实施方式
除非另外指明，否则本文所述技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这在本领域从业人员的技能范围内。此类常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接，以及使用标签来检测杂交。适宜技术的具体说明可以参考本文的实施例。然而，当然也可以使用其他等效的常规程序。此类常规技术和描述可以在以下标准实验室手册中找到：诸如，Green等人编辑，(1999),Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)；Weiner,Gabriel,Stephens编辑，(2007),Genetic Variation:A Laboratory Manual；Dieffenbach,Dveksler编辑，(2003),PCR Primer:A Laboratory Manual；Bowtell和Sambrook(2003)，DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual；Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006)，CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(均由Cold Spring HarborLaboratory Press出版)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)，W.H.Freeman,New YorkN.Y.；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000)，Lehninger,Principles of Biochemistry第3版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；以及Berg等人，(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有这些文献均全文以引用方式并入本文中用于所有目的。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均全文以引用方式并入本文中用于所有目的，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
本文提供了用于分析抗原结合分子的方法和组合物，该抗原结合分子包括分泌型抗原受体，例如分泌型抗体。尽管分泌型抗体在全文中作为示例性分析物进行论述，但是应当理解，本公开还涵盖其他抗原结合分子。在一些实施方案中，本文提供了对免疫细胞(例如，B谱系细胞)进行图谱分析，以及分析物检测和测量的方法和系统，其利用加核苷酸条形码的多肽(例如报告剂，例如抗体结合剂，例如抗原)来筛选这些细胞的多种抗原特异性，例如分泌型抗体的抗原特异性。本文所述的方法和系统可以包括执行下一代测序，以测量和分析可以从单细胞分泌并且/或者存在于单细胞中的分析物分子(例如，抗体)。与其他细胞分析方法相比，本文所公开的方法和系统可以增加能够从单细胞测量的不同分子或分析物的数量。此外，本发明所公开的方法和系统可以允许同时测量多种细胞分子(例如，分泌型分子和/或细胞内分子)，诸如分泌型分析物(例如，抗体)、mRNA、细胞表面蛋白和抗原结合特异性等。
B细胞产生的生物分子对其目标(即抗体)具有极强(例如，亚皮摩尔)的结合能力。由B细胞产生的抗体被束缚至B细胞表面(例如，如在初始B细胞或记忆B细胞的情况下，以BCR形式)，或者由B细胞分泌(例如，如在浆细胞或其他抗体分泌效应细胞的情况下)。在一些方面，这种相互作用通过抗体重链恒定区的哪个外显子存在于转录的RNA中来确定，因为BCR包含分泌型抗体中不存在的跨膜结构域。分泌型抗体(例如，由浆细胞分泌)包括在血清中可检测的抗体，其通常包括高度亲和力成熟的、反映浆细胞的成熟发育状态的抗体。
对于被束缚至细胞表面的BCR(例如，如在记忆B细胞的情况下)，可以检测BCR-抗原相互作用，并且将其用于富集抗原结合B细胞(例如，使用流式细胞术或磁富集)，因为抗原紧密结合到细胞表面结合的BCR。然而，在分泌型抗体的情况下，这种相互作用被破坏，因而难以稳定地测量，并且分泌型抗体可能快速地从分泌细胞中漂出并与其他细胞所分泌的抗体混合。在本文所公开的一些实施方案中，分泌型抗体被捕获，例如，在分泌该抗体的细胞的表面上、在含有该细胞的液滴(例如含有珠粒，诸如凝胶珠粒、磁性珠粒或顺磁性珠粒)中，以及/或者在包围(例如，包封)该细胞的基质中，用于随后对该细胞及其分泌的抗体分子进行单细胞分析。在一些实施方案中，本文所公开的方法用于筛选受试者中的异质细胞群体(诸如浆细胞)中的单细胞。
在本文的一些实施方案中，该方法包括将细胞(诸如B细胞谱系(例如，浆细胞)的分离细胞)与包含报告核酸分子的报告剂接触。在一些实施方案中，报告核酸分子包含对应于或识别报告剂的报告序列。例如，报告序列可以是寡核苷酸DNA条形码序列，从而产生标记细胞。报告剂可以是一种或多种用报告剂加条形码的第二抗体结合剂(例如，抗原)，其中报告条形码序列(例如，报告序列)是可以在下游扩增的独特寡核苷酸。在一些实施方案中，标记细胞包括与该细胞的表面偶联的复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)报告剂。
在本文的一些实施方案中，该方法还可以包括富集抗原特异性细胞(例如，浆细胞)，方式为：针对抗原进行二次富集，例如，靶向荧光团或该抗原的另一部分(作为富集的靶标)，然后将其用于产生单细胞悬液以供分隔；或者以选择性方式仅围绕与感兴趣抗原结合的细胞形成细胞珠粒。
在本文的一些实施方案中，标记细胞(或在标记细胞周围形成的细胞珠粒)分隔在分区(例如液滴，诸如乳液液滴)中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列。如针对图4(例如，段落322)所述，多个分区条形码序列可以是该分区的共同的分区特异性序列(410)。还可参见图3在例如段落319处参考元件310的描述。如段落340中所述，使用共同的分区特异性条形码序列可以用于将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列或其互补序列。
在一些实施方案中，捕获剂被配置为与细胞表面分子偶联。在一些实施方案中，细胞表面分子是细胞表面蛋白，例如细胞表面受体，诸如CD19、CD20、CD45或CD22。在一些实施方案中，捕获剂被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。例如，捕获剂可以包含一种或多种免疫球蛋白(例如，抗体)分子(例如，IgA、IgE、IgG或IgM分子)或者其任何片段(例如，表位结合片段)或衍生物，以及任何合适的组合。在一些实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞表面蛋白和分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。在一些实例中，捕获剂是第一抗体结合剂。例如，捕获剂可以是多特异性抗体，例如能够结合到细胞表面分子并且能够结合到分泌型抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体。
在一些实施方案中，捕获剂可以被束缚至脂质，使得生物分子能够插入细胞膜中，在那里，它随后可以将分泌型抗体束缚至细胞表面。在一些实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞表面蛋白和分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。例如，捕获剂可以被束缚至脂质，并且包含能够结合到分泌型抗体或其抗原结合片段的抗体。
在一些实施方案中，该方法还包括富集抗原特异性细胞(例如，浆细胞)，方式为：针对抗原进行二次富集，例如以选择性方式围绕分泌与感兴趣抗原结合的抗体的细胞形成细胞珠粒。例如，如果抗原具有缀合的辣根过氧化物酶或类似结构域，则可以通过添加过氧化氢来形成水凝胶基质，从而仅围绕与感兴趣抗原结合的浆细胞形成细胞珠粒。
在一些实施方案中，报告剂可以包括核酸分子，并且被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。在一些实例中，报告剂是第二抗体结合剂，例如，与荧光团或富集靶标缀合的抗原或表位(例如，图8或图10中所示的812)。在一些实例中，所述报告核酸分子还包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列，例如，从而将该条形码核酸分子与报告核酸分子杂交，任选地随后进行连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中，包含对照物诸如寡核苷酸、加寡核苷酸条形码的四聚荧光团、荧光团(例如，藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC))或捕获剂可以用于过滤没有真正结合抗原或表位的抗原结合细胞，或者如果细胞结合到不相关抗原诸如血红蛋白、肌红蛋白或不相关抗原，则将细胞去除。可以用于过滤其分泌型抗体没有真正结合报告剂的抗体结合剂(例如，抗原或表位)的抗原结合细胞的对照抗原的实例可以是脱靶抗原，或者受试者(例如，人类受试者或者从其分离抗体分泌细胞的受试者)预期将不针对其产生抗体应答或预期将不具有对其有特异性的抗体的抗原。此类非靶抗原的实例可以是在受试者(例如，人类受试者)中大量表达的内源性抗原(例如，人血清白蛋白(HSA))。对照抗原可以与生物素、链霉亲和素或与链霉亲和素缀合的生物素偶联。对照抗原可以进一步被可检测地标记，或者可以是可检测标签，例如，可以任选地作为报告剂的一部分被包括在内的可检测标签。在一些实施方案中，捕获感兴趣的单细胞悬液和/或细胞珠粒-凝胶珠粒(例如，包括一个或多个标记细胞)并加以分析，例如，使用10×GenomicsChromiumTM系统的免疫图谱分析解决方案，并使用加条形码和/或V(D)J扩增。这为每个所捕获的B细胞产生了针对每种抗原的抗原特异性计数的向量，使得能够使用本领域技术人员可预见的计数变换和插补方法来鉴定该细胞的抗原特异性。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括用于分析分泌型抗体或其抗原结合片段，以及用于分析感兴趣的细胞表面分子(例如，蛋白质)的多组学方法。在一些实施方案中，标记细胞还包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。在一些实施方案中，第二报告剂被配置为与细胞的第二细胞表面蛋白偶联，并且所述第二报告核酸分子包含对应于第二报告剂的第二报告序列。第二报告序列可以不同于第一报告序列，以便在检测过程和分析过程期间区分这两种报告剂。
在一些实施方案中，该分区还包含多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子。在一些实施方案中，第二报告核酸分子包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列，例如，从而将第二条形码核酸分子与第二报告核酸分子杂交，任选地随后进行连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中，该方法还包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子包含来自第二报告核酸分子的序列和来自第二条形码核酸分子的序列，或者它们的互补序列。第二加条形码的核酸分子可以包含第二报告核酸分子的第二报告序列和第二条形码核酸分子的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列，如参考图3和图15(1522、1512)例如在段落360至362处的说明所描述的。如稍后在“VII.检测和分析”的“A.产生加条形码的分子”和“B.多路使用方法”中所论述的，例如段落319和340，多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以是或包括与多个条形码核酸分子中的这一个条形码核酸分子的分区或细胞条形码相同的分区或细胞条形码，以便将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括用于鉴定分泌型抗体或其抗原结合片段，以及用于分析感兴趣的细胞表面分子(例如，蛋白质)和/或感兴趣的核酸分子(例如，RNA)的多组学方法。在一些实施方案中，标记细胞包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物包含核酸分析物序列(例如，分别为该细胞所分泌的抗体的重链可变区和轻链可变区的VDJ序列或VJ序列)。在一些实施方案中，该分区还包含多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子。在一些实例中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子包含被配置为与核酸分析物序列偶联的第三序列，例如，从而将该第三条形码核酸分子与核酸分析物序列杂交，任选地随后进行连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中，该方法还包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子包含来自核酸分析物的序列和来自第三条形码核酸分子的序列，或者它们的互补序列。第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列和第三条形码核酸分子的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列，如本文参考图3的说明所描述的。如稍后在“VII.检测和分析”的“A.产生加条形码的分子”和“B.多路使用方法”中所论述的，例如段落319和340，多个第三条形码核酸分子中的这一个第三条形码核酸分子可以包括与多个条形码核酸分子中的这一个条形码核酸分子的分区或细胞条形码相同的分区或细胞条形码，以便将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，分区包括支持物，该支持物包含多个条形码核酸分子或与多个条形码核酸分子偶联。在一些实例中，支持物是珠粒。在一些实例中，珠粒是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)，该聚合物基质包括一种或多种包含不同官能团的聚合物。在一些实施方案中，多个条形码核酸分子可释放地附接到支持物，并且/或者随机地分布在支持物基质之中或之上。在一些实施方案中，分区来自多个分区。在一些实施方案中，分区是液滴或微孔。
在一些替代性实施方案中，该方法包括将细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞珠粒，其中该细胞珠粒包含基质(例如，水凝胶/聚合物基质)中的细胞。在一些实例中，基质是胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。细胞珠粒可以例如通过将细胞固定在固定介质中或通过细胞的交联元件(诸如细胞膜或细胞骨架)来产生。
在本文的一些实施方案中，该方法还可以包括富集抗原特异性细胞(例如，浆细胞)和/或含有抗原特异性细胞的细胞珠粒，方式为：针对抗原进行富集，例如，靶向荧光团或该抗原的另一部分(作为富集的靶标)，然后将其用于产生单细胞或细胞珠粒的悬液以供分隔；或者以选择性方式仅围绕具有分泌与感兴趣抗原结合的抗体的细胞的细胞珠粒来形成细胞珠粒。
在一些实施方案中，报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，其中标记细胞珠粒在该细胞珠粒之中或之上包含复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)报告剂。在一些实施方案中，该方法还包括将标记细胞珠粒分隔在分区中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列，例如，每个分区所独有的条形码。如针对图4(例如，段落322)所述，多个分区条形码序列可以是该分区的共同的分区特异性序列(410)。还可参见图3在例如段落319处参考元件310的描述。如段落340中所述，使用共同的分区特异性条形码序列可以将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，该方法还包括：在分区内，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列或其互补序列。在一些实施方案中，包封在细胞珠粒内的细胞属于B细胞谱系，例如浆细胞。
在一些实施方案中，捕获剂被配置为与细胞珠粒的基质偶联。在一些实例中，细胞珠粒可以是由结合在一起的核酸分子形成的大分子。在一些实施方案中，细胞珠粒的基质是可降解的聚合物基质，例如通过聚合或交联形成的基质，该基质无规排列，诸如在无规共聚物中，以及/或者具有有序结构，诸如在嵌段共聚物中。在一些实施方案中，捕获剂被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。在一些实施方案中，所述捕获剂被配置为与基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。在一些实施方案中，所述捕获剂是第一抗体结合剂。
在一些实施方案中，报告剂包括核酸分子，并且被配置为与抗体或其抗原结合片段偶联。在一些实施方案中，所述报告剂包括第二抗体结合剂，例如，与荧光团或富集靶标缀合的抗原。在一些实施方案中，所述报告核酸分子(例如，识别报告剂的报告条形码序列)还包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，包含段落89中所公开的对照物(诸如加寡核苷酸条形码的四聚荧光团)可以用于过滤没有真正结合抗原的抗原结合细胞，或者如果细胞结合到不相关抗原诸如血红蛋白、肌红蛋白或不相关抗原，则将细胞去除，或防止细胞珠粒形成。在一些实施方案中，捕获感兴趣的细胞珠粒并加以分析，例如，使用10×Genomics ChromiumTM系统的免疫图谱分析解决方案，并使用加条形码和/或V(D)J扩增。这为每个所捕获的B细胞产生了针对每种抗原的抗原特异性计数的向量，使得能够使用本领域技术人员可预见的计数变换和插补方法来鉴定该细胞的抗原特异性。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括用于分析分泌型抗体或其抗原结合片段，以及用于分析细胞表面分子(例如，蛋白质)的多组学方法。在一些实施方案中，所述细胞或所述标记细胞珠粒还包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。在一些实施方案中，所述第二报告剂被配置为与该细胞的细胞表面蛋白(例如CD表面标志物，诸如CD45)偶联。在一些实施方案中，所述第二报告核酸分子包含对应于第二报告剂的第二报告序列。
在一些实施方案中，该分区还包含多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子，例如，细胞或分区特异性条形码，诸如附接到珠粒(例如，凝胶珠粒)的条形码。在一些实施方案中，所述第二报告核酸分子包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。在一些实施方案中，该方法还包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子包含来自第二报告核酸分子的序列和来自第二条形码核酸分子的序列，或者它们的互补序列。第二加条形码的核酸分子可以包含第二报告核酸分子的第二报告序列和第二条形码核酸分子的细胞或分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列，如参考图3和图15(1522、1512)例如在段落360至362处的说明所描述的。如稍后在“VII.检测和分析”的“A.产生加条形码的分子”和“B.多路使用方法”中所论述的，例如段落319和341，多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以是或可以包括与多个条形码核酸分子中的这一个条形码核酸分子的分区或细胞条形码相同的分区或细胞条形码，以便将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括用于分析分泌型抗体或其抗原结合片段，以及用于分析细胞表面分子(例如，蛋白质)和/或核酸分子(例如，RNA)的多组学方法。在一些实施方案中，所述细胞(例如，包含在细胞珠粒中的细胞)还包含多种核酸分析物(例如，分别包含该细胞所分泌的抗体的重链可变区和轻链可变区的VDJ序列或VJ序列的mRNA转录物)，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物包含核酸分析物序列。在一些实施方案中，该分区还包含多个第三条形码核酸分子。在一些实施方案中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子包含被配置为与该核酸分析物序列偶联的第三序列。在一些实施方案中，该方法还包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子包含来自核酸分析物的序列和来自第三条形码核酸分子的序列，或者它们的互补序列。第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列和第三条形码核酸分子的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列，如本文参考图3的说明所描述的。如稍后在“VII.检测和分析”的“A.产生加条形码的分子”和“B.多路使用方法”中所论述的，例如段落319和340，多个第三条形码核酸分子中的这一个第三条形码核酸分子可以包括与多个条形码核酸分子中的这一个条形码核酸分子的分区或细胞条形码相同的分区或细胞条形码，以便将一种或多种分析物与分隔在该分区中的标记细胞相关联。
在一些实施方案中，分区包括其中包含多个条形码核酸分子的支持物。在一些实例中，支持物是珠粒。在一些实例中，珠粒是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)，该聚合物基质包括一种或多种包含不同官能团的聚合物。在一些实施方案中，多个条形码核酸分子可释放地附接到支持物，并且随机地分布在支持物基质之中或之上。在一些实施方案中，分区来自多个分区。在一些实施方案中，分区是液滴或微孔。
在一些实施方案中，所捕获的感兴趣的细胞珠粒或单细胞悬液的分析程序包括以下方法中的全部或一些：1)鉴定具有合理的抗原结合计数数目的细胞，2)作为过滤步骤，鉴定还具有额外的多组学计数(诸如细胞RNA或表面蛋白)的细胞，3)通过减去在空液滴中检测到的每种抗原的中值或均值背景来变换抗原结合计数分布，4)从进一步分析中排除结合感兴趣抗原和对照抗原或仅结合对照抗原的细胞，5)使用任何数量的方法(例如，中心对数比、主成分分析(PCA)、广义PCA(GLMPCA)、更复杂的机器学习模型或神经网络)来变换抗原计数向量，以及6)选择具有抗原指纹图谱的抗体用于治疗评价。在一些实施方案中，通过使用与给定的感兴趣细胞条形码/细胞以及重链恒定区和轻链恒定区杂交的引物，用cDNA文库来选择性地扩增感兴趣的浆细胞或分泌型抗体。这些重链和轻链可以分别扩增，重叠延伸PCR可以将它们组合成单个连续分子。
II.细胞和分析物
在一些实施方案中，本文所公开的细胞可以包括天然抗原受体(例如，抗体)分泌细胞或衍生物(例如，融合细胞、转化细胞或无限增殖化细胞)，经工程化或修饰以分泌抗原受体(例如，抗体)或其抗原结合片段的细胞。本文所公开的抗原受体可以包括天然存在的和经工程化的抗体(包括其片段、融合体和变体)、天然存在的和经工程化的B细胞受体(BCR)(包括其片段、融合体和变体)、天然存在的和经工程化的T细胞受体(TCR)(包括其片段、融合体和变体，诸如可溶性TCR)，以及嵌合抗原受体(CAR)(包括其片段、融合体和变体)。此外，本文所公开的抗原受体可以是可溶的，或者是细胞外囊泡(诸如外来体或来自细胞的微囊泡)的一部分。
适应性免疫应答的关键方面是快速产生高亲和力抗体(Abs)，诸如浆细胞。这种抗体产生特点是抗体分泌细胞的功能，该抗体分泌细胞在初始(或记忆)B细胞遇到抗原、活化、增殖和分化时产生。由浆细胞分泌的抗体是在血清中可检测的一组抗体，通常由高亲和力成熟(反映浆细胞的成熟发育状态)的抗体组成。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞可以包括任何类型的抗体分泌细胞，包括但不限于B细胞，诸如抗原特异性记忆B细胞、免疫或接种疫苗后分离的浆细胞，或者在充分条件下与感兴趣抗原、抗CD40L共孵育以将抗原特异性记忆B细胞转化为抗原特异性浆细胞的记忆B细胞。
在本文的一些实施方案中，在分析之前，分离感兴趣的细胞群体，例如B细胞。例如，分离的细胞群体可以是：使用流式细胞术分离或用结合到表面的抗原进行磁富集的抗原特异性记忆B细胞；免疫或接种疫苗后分离并且通过流式细胞术、磁富集、浮力激活细胞分选术(BACS)或另一种方法捕获的浆细胞；或者与感兴趣抗原、抗CD40L和适当的培养基共孵育(从而将抗原特异性记忆B细胞转化为抗原特异性浆细胞)的记忆B细胞。
在一些实施方案中，本文所公开的样品包含一种或多种细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、浆细胞和/或树突细胞)，并且使用本文所公开的方法和系统来分析。样品可以是细胞系或细胞培养样品。样品可以包含一种或多种微生物。样品可以源自另一种样品。样品可以是组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，诸如血液、尿液、唾液、血浆、血清、粘膜排出物、痰、粪便和泪液。样品可以用各种方式分离。例如，细胞样品可以从生物样品(诸如体液，诸如血浆)中分离，或者可以从来自受试者的特定组织或器官中分离。在一些实施方案中，如本文所述，使用流式细胞术(例如，FACS)、用结合到表面的抗原进行磁富集(MACS)、BACS或另一种方法来分离感兴趣的B细胞群体。
在一些实施方案中，本文所公开的分析物可以包括特异性结合抗原决定簇的任何分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物(例如片段)，并且通常是指完整抗体中能够结合与该完整抗体相同(尽管不必结合到相同的程度)的表位/抗原的一部分(例如，分别包含轻链和重链的每个结构域)。尽管多种类型的抗原结合分子是可能的，但是抗原结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的抗原结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，抗原结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，本文所公开的抗体可以包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。在一些实施方案中，分析物是分泌型抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，分泌型抗体可以由B细胞产生，并且可以由B细胞(例如浆细胞，其中抗体在血清中是可检测的)分泌。
在一些实施方案中，分析物是包含免疫球蛋白分子的分泌型抗体，例如，具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变区，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变区，之后是恒定轻链(CL)结构域，也称为轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以被分配到称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的五种类型之一，其中一些类型可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以被分配到称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型之一。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
在一些实施方案中，由本文所公开的细胞产生的分析物是靶向任何合适的抗原或表位的抗体。例如，抗原可以包括但不限于与病原体相关联的任何抗原，包括病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原、蠕虫抗原、寄生虫抗原、外寄生虫抗原、原生动物抗原，或来自任何其他感染原的抗原。抗原还可以包括与特定疾病或病症相关联的任何抗原，无论是来自病原性来源还是细胞来源，包括但不限于：癌症抗原、与自身免疫疾病相关联的抗原(例如，糖尿病抗原)、变态反应抗原(变应原)、携带一种或多种突变氨基酸的哺乳动物细胞分子、出生前或刚出生时由哺乳动物细胞正常表达的蛋白质、通过插入流行病学因子(例如病毒)而被诱导表达的蛋白质、通过基因易位而被诱导表达的蛋白质，以及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋白质。这些抗原可以是天然抗原或已经以某种方式(例如，改变序列或产生融合蛋白)修饰的基因工程化抗原。应当理解，在一些实施方案中(即，当抗原由酵母载体从重组核酸分子表达时)，抗原可以是蛋白质或其免疫原性结构域的任何表位、融合蛋白或嵌合蛋白，而不是完整的细胞或微生物。抗原可以是与感染性疾病、癌症或自身免疫疾病相关联的任何一种抗原。抗原可以是天然生物来源的抗原或基因工程化的抗原。与感染性疾病有关的抗原包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原，或者它们的免疫原性部分。与癌症有关的抗原包括但不限于肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。与自身免疫疾病有关的抗原包括但不限于本领域已知的刺激自身抗体产生的任何抗原，例如自体抗原。
在一些实施方案中，由本文所公开的细胞产生的分析物是靶向独特型的另一种抗体(诸如抗体药物)的抗独特型(抗ID)抗体。独特型可以被定义为抗体补体决定区(CDR)内存在的独特位的特定组合。单个独特位是抗体Fv区内的特定区域，其结合到不同抗体的互补位(抗原表位结合位点)。在一些实施方案中，独特位是抗体的抗原决定簇。在一些实施方案中，由本文所公开的细胞产生的分析物是抗原阻断性抗ID抗体，如此命名是因为靶向抗体的互补位和独特位彼此重叠。因此，抗体药物的靶抗原与该抗ID抗体彼此竞争。所以，这种形式的抗ID抗体仅检测游离的抗体药物。在一些实施方案中，由本文所公开的细胞产生的分析物是非阻断性的，在这种情况下，抗体药物的互补位和独特位不重叠。因此，抗ID抗体和抗原可以同时结合到抗体药物，而不影响彼此的结合能力。在一些实施方案中，非阻断性抗ID抗体结合所有形式的可用抗体药物(游离的或结合抗原的)。在一些实施方案中，由本文所公开的细胞产生的分析物是复合特异性抗ID，其不能结合到抗体药物，除非该药物已经结合到其抗原。因此，这种类型的抗ID抗体只能检测结合的抗体药物。
在一些实施方案中，分析物(例如，分泌型抗体)被束缚至细胞(例如，B细胞或浆细胞，经由本文所述的捕获剂或基质)的表面，并且被筛选与多个靶标偶联的能力。在一些实施方案中，筛选分析物的多种抗原特异性，例如使用与抗体结合剂偶联的报告剂来筛选，如本文所述。
在骨髓和脾脏中成熟后，免疫活性B细胞保留在外周组织中，直到它们遇到抗原并被活化。B细胞活化需要两种不同的信号，导致B细胞分化为记忆B细胞或浆细胞。第一活化信号在抗原结合到B细胞受体(BCR)时出现。抗原在结合到BCR后，通过受体介导的内吞作用被内化，在消化后与B细胞表面上的MHC II分子复合。第二活化信号经由胸腺依赖性或胸腺非依赖性机制发生。大多数B细胞对抗原的应答需要B细胞与T辅助细胞的相互作用(胸腺依赖性活化)。抗原II类MHC复合物在B细胞上呈递使其能够充当T细胞的抗原呈递细胞(APC)。T辅助细胞上的T细胞受体(TCR)结合到B细胞表面上的抗原复合II类MHC分子，从而引起T细胞活化。活化的T细胞随后向B细胞提供第二活化信号，其可以通过多种蛋白质进行。替代性地，有几种类型的抗原可以直接提供第二B细胞活化信号(胸腺非依赖性活化)。这些抗原包含以下物质的组分：一些细菌细胞壁组分(例如，脂多糖)或含有高度重复分子的抗原(例如，细菌鞭毛蛋白)。B细胞在活化后增殖并形成生发中心，在此分化为记忆B细胞或浆细胞。在分化为浆细胞后，额外的信号启动浆细胞抗体类别转换并调节抗体分泌。浆细胞的主要功能是分泌B细胞克隆特异性抗体。每个浆细胞分泌的抗体都含有克隆独特的抗原结合区以及与之连接的恒定免疫球蛋白(Ig)同种型限定区。
BCR的抗原结合部分由膜结合抗体组成，该膜结合抗体像大多数抗体(例如，免疫球蛋白)一样，具有随机确定的独特抗原结合位点。BCR的抗原结合部分包括一种同种型(例如，IgD、IgM、IgA、IgG或IgE)的膜结合免疫球蛋白分子。当B细胞由于第一次遇到同源抗原而活化时，该细胞增殖并分化产生抗体分泌血浆B细胞和记忆B细胞的群体。各种免疫球蛋白同种型在它们的生物学特征、结构、靶标特异性和分布方面各不相同。存在多种分子机制来产生初始多样性，包括多个位点处的基因重组。
BCR由编码抗体重链和轻链的两个基因IgH和IgK(或IgL)组成。免疫球蛋白是通过基因节段之间的重组、这些节段的连接区处的序列多样化以及整个基因中的点突变而形成的。每个重链基因包含以下三个不同基因节段的多个拷贝：可变“V”基因节段、多样性“D”基因节段，和连接“J”基因节段。每个轻链基因包含蛋白质可变区的以下两个不同基因节段的多个拷贝：可变“V”基因节段和连接“J”基因节段。重组可以产生具有V、D和J节段各一个的分子。此外，在这两个连接区中的每一者处，可以缺失几个碱基并添加其他碱基(称为N核苷酸和P核苷酸)，从而产生更多的多样性。B细胞活化后，通过体细胞超突变发生亲和力成熟过程。在该过程中，活化B细胞的子代细胞在整个基因中累积明显的体细胞突变，且在CDR区中具有较高的突变浓度，从而导致产生对抗原具有较高亲和力的抗体。除体细胞超突变之外，活化B细胞还经历了同种型转换过程。具有相同可变区段的抗体取决于恒定区段可以具有不同的形式(同种型)。尽管所有的初始B细胞只表达IgM(或IgD)，但是活化B细胞却主要表达IgG，但也表达IgM、IgA和IgE。这种从IgM(和/或IgD)到IgG、IgA或IgE的表达转换是通过重组事件发生的，导致一个细胞专门产生特定的同种型。在基因排列过程期间出现的独特核苷酸序列可以类似地称为克隆型。
在一些实施方案中，本文所公开的方法、组合物和系统用于分析各种BCR序列和来自免疫细胞的分泌型抗体，例如各种克隆型。在一些实施方案中，本文所公开的方法、组合物和系统用于分析抗体或其任何片段(例如，包括VDJ或VJ区的可变区、恒定区、跨膜区，它们的片段、它们的组合，以及它们的片段的组合)的序列。在一些实施方案中，本文所公开的方法、组合物和系统用于分析B细胞受体重链、B细胞受体轻链或它们的任何片段(例如，包括VDJ或VJ区的可变区、恒定区、跨膜区、它们的片段、它们的组合，以及它们的片段的组合)的序列。在用于附接条形码序列和/或扩增反应的各种操作中有用的引物序列可以包括靶向抗体或BCR蛋白的基因或基因区域的基因特异性序列。
一般来讲，本文所述的方法和系统可以包括刺激细胞(例如免疫细胞，即B细胞或浆细胞)以诱导一种或多种分析物(例如，分泌型抗体)从该细胞中分泌。刺激细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、浆细胞或树突细胞)以诱导一种或多种分析物(例如，分泌型抗体)分泌可以包括使该细胞经受(例如，接触)特定分子(例如，刺激分子或共刺激分子)。可以用于诱导细胞分泌分析物的特定分子可以包括抗原，诸如模式识别受体(PRR)配体(例如，Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体、细胞溶质dsDNA传感器(CDS)配体等)、脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA(例如，聚肌胞苷酸(poly I:C)或聚腺尿苷酸(poly(A:U))、CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，或者它们的任何组合。本文所述的方法可以包括以足以诱导一种或多种分泌型分子(例如，抗体)分泌的浓度向细胞提供多个一种或多种不同的刺激分子。浆细胞活性的调节剂是已知的，包括例如，CD23/FcεRII、CD25/IL-2Rα、FCRLB/FCRY、IFN-γR1/CD119、IFN-γR2、IL-2Rβ、IL-5Rα/CD125、IL-27Rα/WSX-1/TCCR、IL-4Rα、IL-6Rα、NTB-A/SLAMF6、SIT1和SWAP70，，它们中的任何一种或多种可以被靶向、调节以及/或者用于诱导浆细胞分泌抗体。
分别参见图7和图9中的操作700或900，将免疫细胞(例如，B细胞或浆细胞)或其他感兴趣的细胞类型与合适浓度的一种或多种刺激分子一起孵育，以诱导抗体或其他分析物分泌。本文可以使用足以诱导细胞(例如，B细胞或浆细胞)分泌抗体的任何合适浓度的刺激分子。
III.分析物捕获
分泌型分析物(例如，抗体)可能快速地从分泌细胞中漂出并与其他细胞所分泌的分析物(例如，抗体)混合，使得对分析物分泌的单细胞分析具有挑战性。在本文所公开的一些实施方案中，分泌型分析物(例如，抗体)被捕获，例如，在分泌该分析物的细胞的表面上、在含有该细胞的液滴(例如含有珠粒，诸如磁性珠粒或顺磁性珠粒)中，以及/或者在包围(例如，包封)该细胞的基质中，用于随后对该细胞及其分泌的分析物(例如，抗体)进行单细胞分析。在一些实施方案中，本文所公开的方法用于筛选受试者中的异质细胞群体(诸如浆细胞)中的单细胞。
A.在细胞表面上捕获分析物
在某些实施方案中，用于加工来自细胞(例如，B细胞或浆细胞)的分泌型分析物(例如，抗体)的方法可以包括将该分泌型分析物偶联至捕获剂。细胞(例如，B细胞或浆细胞)可以在捕获剂与细胞表面偶联的充分条件下与捕获剂一起孵育，以形成与细胞表面的复合偶联。
一般来讲，如本文所公开的，捕获剂可以包含一个或多个部分。在一些情况下，捕获剂包含至少一个、至少两个、至少三个或者至少四个或更多个部分。每个部分可以包含一种多肽。特定部分的多肽可以能够偶联一个或多个分子。例如，特定部分的多肽可以与位于细胞表面上的分子偶联，该分子诸如细胞表面蛋白或受体(例如CD表面标志物，诸如CD45)。捕获剂的另一部分的多肽能够结合可以从细胞(例如，T细胞、B细胞、树突细胞等)分泌的分子。
捕获剂的一个或多个部分可以直接或间接地彼此连接、缀合或融合。例如，捕获剂的第一部分可以直接或间接地连接、缀合或融合至捕获剂的第二部分。在一些情况下，第一部分以化学方式(例如，共价或非共价地)结合或连接至第二部分。在一些情况下，第一部分和第二部分经由接头(例如，氨基酸接头)连接。在一些情况下，第一部分和第二部分经由一个或多个结构域或多肽链连接。如本文所述的捕获剂可以包含一种或多种免疫球蛋白(或抗体)分子(例如，IgA、IgE、IgG或IgM分子)或者其任何片段(例如，抗原结合片段)或衍生物，以及任何合适的组合。
例如，捕获剂可以是双特异性抗体，例如图8中的804。双特异性抗体可以包含第一部分和第二部分，其中第一部分包含能够结合细胞表面分子(例如，CD受体)的第一多肽，第二部分包含能够结合细胞的一种或多种分子(例如，从细胞分泌的一种或多种抗体)的第二多肽。在一些情况下，捕获剂的第一部分的第一多肽可以包含第一免疫球蛋白分子(例如，IgA、IgE、IgG或IgM)，或者其片段或衍生物(例如，Fab、F(ab’)2、双特异性Fab2、scFv、双体等)，结合剂的第二部分的第二多肽可以包含第二免疫球蛋白分子(例如，IgA、IgE、IgG或IgM)，或者其片段或衍生物(例如，Fab、F(ab’)2、双特异性Fab2、scFv、双体等)。
捕获剂的第一多肽(例如，第一免疫球蛋白分子)可以能够结合细胞表面上的分子，第二多肽(例如，第二免疫球蛋白分子)可以能够结合从细胞分泌的一种或多种分子。捕获剂的分别包含一种或多种多肽的一个或多个部分可以彼此缔合，例如结合、连接或偶联。例如，捕获剂的包含第一多肽的第一部分可以经由接头连接到捕获剂的包含第二多肽的第二部分。接头可以是柔性接头，从而允许第一多肽和第二多肽与它们各自的结合配偶体有效结合。接头可以是氨基酸接头，诸如富含甘氨酸的接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的接头。
在一些实施方案中，图8中所示的捕获剂804可以包含多肽，诸如捕获抗体或双特异性分子，例如与生物素标记的F(ab’)2抗IgG Fc(用于结合到分泌型IgG抗体)缀合的抗CD45-链霉亲和素(用于结合到细胞表面上的CD45)。捕获剂804可以是双特异性抗体(或另一种抗体构建体，诸如三特异性抗体)，其包含能够结合从细胞802(例如免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、B细胞谱系中的细胞或树突细胞)分泌的分子808(例如，抗体、细胞因子、激素或生长因子)的第一部分，以及能够结合细胞表面分子诸如细胞表面受体806(例如，CD45)的第二部分。细胞(例如，B细胞或浆细胞)可以在合理且充分的条件下与溶液中的捕获剂一起孵育一定量的时间，以允许捕获剂与细胞表面偶联。在某些实施方案中，捕获剂804是包含第一部分和第二部分的双特异性抗体。
在一些实施方案中，第一部分包含对一种或多种分子(诸如对一种或多种不同类型的抗体)具有结合亲和力的抗体或其抗原结合片段，即，第一部分可以结合来到其附近的一种或多种分子(例如，一种或多种抗体)。可以选择第一部分，使其与来自一种或多种细胞(例如免疫细胞，即B细胞或浆细胞)的感兴趣的特定分泌型分析物(例如，抗体)结合。在其他实施方案中，第一部分包含多种抗体或其片段(例如，抗原结合片段)，其中每种抗体或其片段可以对特定分析物(诸如抗体)具有选择性。例如，第一部分可以包含两种抗体或其片段(例如，抗原结合片段)，其中每种抗体或其片段对不同的分析物具有结合亲和力。第一部分可以包含一种抗体、两种抗体、三种抗体、四种抗体、五种抗体、六种抗体、七种抗体或八种抗体，或者它们的片段，其中每种抗体或其片段对不同的分析物具有结合亲和力。在其他情况下，一种或多种抗体和/或抗体片段(例如，抗原结合片段)对相同的分析物(例如，相同的抗体)具有结合亲和力。
另外，在某些实施方案中，第二部分包含抗体或其抗原结合片段。第二部分可以被配置为使得其靶向、结合或以其他方式缔合一种或多种细胞表面蛋白，诸如受体酪氨酸激酶(RTK)、G蛋白偶联受体(GPCR)、分化簇(CD)蛋白(诸如CD45等)等，或者它们的任何组合。在一些实施方案中，第二部分被配置为偶联(例如，共价或非共价地结合)至细胞表面，并且允许第一部分偶联(例如，共价或非共价地)至如本文所述的一种或多种分泌型分析物(例如，抗体)。捕获剂(或者多肽或其部分)能够以多种方式与细胞表面偶联。例如，多肽的第二部分可以使用任何合适的方法附接到细胞表面，诸如通过半胱氨酸残基或通过具有反应功能性的非天然氨基酸附接。在一些情况下，第二部分经由其碳水化合物基团(即，糖基化位点)，例如在抗体的恒定区(即，Fc)上，或者经由脂质-脂质相互作用或脂质-蛋白质相互作用附接到表面。在一些实例中，捕获剂也可以是脂质缀合的806，使得该捕获剂能够插入细胞802(例如，免疫细胞)的细胞膜中，如图8所示。此外，在一些实施方案中，第二部分包含两种抗体或其表位结合片段，其中每种抗体或其表位结合片段分别对不同的细胞表面分子具有结合亲和力。在其他实施方案中，第二部分包含三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种抗体或其表位结合片段，其中每种抗体或其表位结合片段选择性地靶向特定细胞表面分子(例如，相同或不同的细胞表面分子)。
在一些实施方案中，捕获剂的第一部分(例如，包含多肽的那些)可以偶联、连接或缀合至(例如，化学偶联、连接或缀合至)第二部分。替代性地，捕获剂的第一部分可以融合(例如，重组融合)至第二部分。因此，在一些实施方案中，捕获剂是包含第一部分和第二部分的融合蛋白。融合多肽可以通过重组DNA技术产生，例如，融合基因(一个或多个基因编码第一部分，另外一个或多个基因编码第二部分)的翻译产生融合多肽。在某些实施方案中，一个或多个接头(例如氨基酸接头，诸如多肽接头)将第一部分连接至第二部分，以例如确保第一部分和第二部分的正确折叠并且/或者确保有效地结合至细胞表面和/或分析物。此外，多肽接头可以允许发生重要的结构域相互作用、增强稳定性，并且减小空间位阻。在其他实施方案中，第一部分和第二部分在翻译后连接或缀合。例如，捕获剂的第一部分的多肽可以使用任何合适的生物缀合策略缀合至第二部分，包括但不限于活化酯(例如，NHS酯)、环加成反应、施陶丁格连接、点击化学等。在还有其他实施方案中，第一部分和第二部分可以经由第一部分与第二部分之间的N或C末端键合而端对端连接，从而提供柔性桥结构以便进行正确折叠和减小空间位阻。
如图8中所示，分析物(例如，分泌型抗体)与捕获剂804和报告剂810(包含分析物特异性抗原814)以及包含条形码序列(即，报告条形码序列)816的核酸分子结合或偶联，形成复合物818。
B.在基质上捕获分析物
在另一个方面，本公开提供了加工来自细胞(例如，B细胞或浆细胞)的分泌型分子(例如，分泌型抗体)的方法，这些方法包括：(a)产生细胞珠粒，其中该细胞珠粒包含被聚合物基质包封的细胞，其中该聚合物基质包含多种捕获剂；以及(b)将从该细胞分泌的分子与多种捕获剂中的第一捕获剂偶联，以形成复合物。
本公开提供了包括使用能够形成基质(诸如聚合物基质和/或交联基质)的大分子(例如，聚合物)的方法。在一些情况下，聚合物前体聚合形成聚合物凝胶基质。在一些实施方案中，聚合物凝胶可以是水凝胶，从而形成水凝胶基质。用于形成水凝胶基质的聚合物分子可以包含多种捕获剂。多种捕获剂可以偶联或连接到(例如，共价或非共价地结合或连接到)聚合物的主链。参见例如美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，其全文以引用方式并入本文，旨在提供示例性的细胞珠粒官能化策略。多种捕获剂中的第一捕获剂可以包含能够结合特定分子(例如分泌型分子，诸如抗体)的多肽。包含能够结合特定分子的多肽的捕获剂可以是抗体或者其抗原结合片段或衍生物。捕获剂可以能够结合的特定分子可以是细胞(例如免疫细胞，即B细胞或浆细胞)的分析物(例如抗体)。分析物可以是在刺激后(例如，用一种或多种刺激分子或者一种或多种APC刺激后)能够由细胞分泌的分子。
多个细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、浆细胞和/或树突细胞)可以被共同分隔(例如，包封到液滴中)，使得分区(例如，液滴或孔)可以包含多个细胞中的一个细胞。该分区还可以包含能够在该分区内部形成聚合物基质或交联基质(诸如水凝胶基质)的组分，从而引起细胞珠粒的形成。凝胶基质(例如，水凝胶基质)以及因此细胞珠粒可以使用可逆凝胶(例如，水凝胶)形成。凝胶基质可以是水凝胶基质，并且形成该水凝胶基质的聚合物分子的主链可以包含多种捕获剂，这些捕获剂包含能够结合特定分子(例如，抗体)的多肽。
本文所公开的方法可以包括对形成细胞珠粒的细胞(例如，B细胞或浆细胞)进行刺激，使得该细胞分泌一种或多种分析物。由细胞分泌的分析物可以偶联(例如，共价或非共价地结合或连接)到多种捕获剂中的第一捕获剂，所述多种捕获剂附接(例如，偶联或连接)到形成细胞珠粒水凝胶基质的聚合物分子的主链上，例如图10A。在一些实施方案中，聚合物基质是水凝胶基质。在一些实施方案中，聚合物基质包括胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。在一些实施方案中，多种第一捕获剂与聚合物基质的聚合物主链偶联。在一些实施方案中，珠粒可以包含聚合物前体(例如单体、低聚物、线型聚合物)、寡核苷酸、引物与其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键包括碳-碳键或硫醚键。在一些情况下，珠粒可以包含acrydite部分或点击化学部分，在某些方面，前述部分可以用于附接一种或多种作用剂，诸如捕获剂。参见例如美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，其全文以引用方式并入本文，旨在提供示例性的细胞珠粒官能化策略。
在一些情况下，利用化学缀合方法将分子(例如，捕获剂)附接到细胞珠粒水凝胶基质。在一些情况下，捕获剂(诸如抗体)可以包含化学修饰(例如点击化学前体，诸如烯烃/炔烃)，其被配置为与细胞珠粒的聚合物基质或聚合物前体中存在的化学修饰(例如点击化学前体，诸如叠氮化物/炔烃)反应。在某些实施方案中，包含分泌型抗体的捕获剂与聚合物基质的聚合物主链偶联，如图10A和图10B所示。
本文公开了包含细胞珠粒的组合物，该细胞珠粒包含聚合或交联的聚合物网络，该聚合物网络包含细胞或从该细胞产生的裂解细胞，其中该聚合或交联的聚合物网络是带电的。参见例如美国专利公开2018/0216162(现为美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，以及美国专利公开2019/0233878，这些专利公开全文以引用方式并入本文，旨在提供用于细胞分析的示例性组合物。细胞珠粒可以包含来自细胞的组分(例如，分泌型抗体或其抗原结合片段)。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可以是蛋白质。聚合物网络可以带正电。聚合物网络可以包含壳聚糖。聚合物网络可以包含PEI。聚合物网络可以带负电。聚合物网络可以包含藻酸盐。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多12小时、最多24小时、最多48小时或最多72小时。
本文还公开了包含细胞珠粒的组合物，该细胞珠粒包含聚合或交联的聚合物网络，该聚合物网络包含细胞或从该细胞产生的裂解细胞和带电物质。细胞珠粒可以包含来自细胞的组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、miRNA)。组分可以是蛋白质。带电物质可以带正电。带电物质可以包括三甲基铵。带电物质可以是(2-氨乙基)三甲基铵。带电物质可以是(3-丙烯酰胺丙基)三甲基铵。带电物质可以带负电。带电物质可以包括磷酸盐。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多12小时、最多24小时、最多48小时或最多72小时。
C.细胞珠粒
细胞珠粒可以通过如本文所述的方法产生，例如通过分子前体(例如，聚合物前体或凝胶前体)在包含细胞或来自细胞的成分的分区中聚合。细胞珠粒可以包含来自细胞的一种或多种不同类型的组分，包括例如DNA(例如，gDNA、染色质等)、RNA(例如，mRNA、miRNA)、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段，以及/或者代谢物。组分可以包含在细胞珠粒中以及/或者附接到细胞珠粒(例如，经由捕获剂)。细胞珠粒可以通过以下方式来产生：将细胞包封在聚合物基质或凝胶基质中，然后使细胞在该凝胶基质或聚合物基质中裂解；当细胞被包封在聚合物基质或凝胶基质中时，使该细胞裂解；或者使该细胞裂解，以便其成分被包封在聚合物基质或凝胶基质中。聚合物基质或凝胶基质可以包含一种或多种被配置为与来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段等)相互作用的带电物质。
用于产生细胞珠粒的分区可以包含一种或多种用于进行一种或多种反应的试剂。这些物质可以包括例如：用于核酸扩增或延伸反应的试剂(例如，引物、聚合酶、核苷酸、辅助因子(例如，离子辅助因子)、缓冲剂等)，包括本文所述的那些；用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅助因子、底物、缓冲剂等)；用于核酸修饰反应(诸如聚合、连接或消化)的试剂；以及/或者用于模板制备的试剂。
试剂可以包括用于最小化由点击化学反应导致的核酸损伤的试剂。例如，可以将自由基清除剂添加到分区中，从而降低由点击化学反应期间产生的自由基引起的核酸损伤的风险。在一些情况下，自由基清除剂包括二甲基亚砜(DMSO)。可以将DMSO以足以防止核酸损伤的浓度添加到用于产生细胞珠粒的分区中。在一些实施方案中，将DMSO以至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％或更高的量添加到分区中。
分区内的一种或多种试剂可以附接到前体(例如，聚合物前体或凝胶前体)。试剂可以共价附接到前体。试剂可以可逆或不可逆地附接到前体。试剂可以经由acrydite部分附接到前体。
在一些情况下，寡核苷酸可以附接到前体。附接到前体的寡核苷酸可以用于例如捕获RNA和/或进行逆转录反应。寡核苷酸可以包含poly-T序列或poly-U序列(例如，可以是poly-T引物)。在一些实施方案中，poly-T序列用于与poly-A序列(例如，来自细胞mRNA)杂交。在一些实施方案中，poly-U序列用于与poly-A序列(例如，来自细胞mRNA)杂交。
在一些情况下，寡核苷酸(诸如poly-T序列)可以经由不可逆的点击化学反应来附接到前体(例如，聚合物)。在一些实施方案中，这种寡核苷酸的点击化学附接可以在聚合物交联期间进行，从而形成凝胶基质。例如，连同用叠氮化物和炔烃点击化学基团修饰的聚合物一起引入乳液液滴中的炔丙基化poly-T寡核苷酸是经由CuAAC点击化学附接的，导致与叠氮化物修饰的聚合物的一些叠氮化物修饰的接头位点产生1,2,3-三唑键。其他位点与炔烃修饰的聚合物形成交联，从而产生包含共价附接的poly-T试剂的凝胶基质，该试剂能够捕获聚腺苷酸化的RNA转录物。
用于产生细胞珠粒的分区可以包含一种或多种颗粒(例如，磁性颗粒)。分区内的一种或多种试剂可以附接到颗粒。试剂可以共价附接到颗粒。试剂可以可逆或不可逆地附接到颗粒。试剂可以经由acrydite部分附接到颗粒。在一些情况下，寡核苷酸可以附接到颗粒。附接到颗粒的寡核苷酸可以用于例如捕获RNA和进行逆转录反应。在一些实施方案中，颗粒(任选地为磁性颗粒)包含附接到其上的寡核苷酸，这些寡核苷酸包含能够与poly-A序列(例如，来自细胞mRNA)杂交的poly-T序列。
分区内的细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)可以如本文所述裂解，从而将成分从细胞释放到该分区中。成分可以包括多种类型的细胞组分，包括蛋白质、代谢物和/或核酸分子(例如，DNA、RNA(例如，信使RNA)等)。替代性地，或除此之外，分区内的细胞可以被透化。透化可以允许将某些试剂、物质、成分等转移进入和/或离开发生或未发生完全细胞裂解的细胞。在一些实施方案中，细胞在细胞珠粒聚合或胶凝之前裂解或透化。在其他实施方案中，细胞在细胞珠粒聚合或胶凝的同时裂解或透化。在一些实施方案中，细胞在细胞珠粒聚合或胶凝之后裂解或透化。在还有其他实施方案中，细胞在处于细胞珠粒中时既不裂解也不透化。
试剂可以包含在分区内，包括附接到前体、颗粒等的试剂，并且可以用于对细胞或者来自或源自细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)的成分进行一种或多种反应。反应可以是例如扩增反应、逆转录反应或脱氨基反应。在一些实施方案中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝之前进行。在一些实施方案中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝的同时进行。在一些实施方案中，所述一种或多种反应在细胞珠粒聚合或胶凝之后进行。在一些情况下，寡核苷酸(例如，引物)用于对来自细胞的信使RNA进行逆转录反应，从而产生互补DNA(cDNA)。逆转录可以包括向cDNA中添加额外的核苷酸，例如多核苷酸，诸如polyC。在一些情况下，可以进行模板转换以进一步延伸cDNA。模板转换可以将一个或多个附加序列补加到cDNA上。如本文所述，在一些情况下，可以使用附加序列来促进核酸延伸/扩增以及/或者加条形码。cDNA可以附接到前体和/或颗粒。在一些情况下，在细胞珠粒产生之前，使用寡核苷酸从细胞中捕获信使RNA(例如，经由杂交)。
在一些实施方案中，分区经受足以产生包含一种或多种试剂的细胞珠粒的条件。例如，包含附接到试剂(例如，引物、核酸分子等)的聚合物前体的分区液滴可以被聚合或胶凝，使得试剂附接到聚合物基质或凝胶基质(即，附接到细胞珠粒)。在一些情况下，试剂经由不稳定键(例如，化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键)可释放地附接到凝胶前体。试剂可以共价附接到细胞珠粒。试剂可以可逆或不可逆地附接到细胞珠粒。试剂可以附接到凝胶珠粒的表面。试剂可以附接到细胞珠粒的内部。在一些情况下，mRNA附接到细胞珠粒。例如，附接到来自细胞的mRNA的聚合物前体可以聚合或胶凝产生细胞珠粒，使得该mRNA附接到细胞珠粒。在一些情况下，cDNA附接到细胞珠粒。例如，附接到源自细胞的cDNA的聚合物前体可以聚合产生细胞珠粒，使得该cDNA附接到细胞珠粒。在一些情况下，一种或多种寡核苷酸附接到细胞珠粒。例如，附接到寡核苷酸的聚合物前体可以聚合或胶凝产生细胞珠粒，使得该寡核苷酸附接到细胞珠粒。
将大分子成分(例如，核酸分子、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段等)附接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒可以用于制备供进一步加工的物质。例如，附接到细胞珠粒或颗粒的核酸分子可以在保持附接到细胞珠粒或颗粒的同时进行加工。加工后，核酸可以从细胞珠粒和/或颗粒中释放(例如，释放到分区中)以供分析。在一些情况下，可能有用的是将一种类型的细胞组分或其衍生物(例如，mRNA、cDNA、分泌型抗体或其抗原结合片段)附接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒，同时包封但不附接另一种类型的细胞组分(例如，基因组DNA)。这在例如促进多种类型的组分的单独加工方面可能是有用的。例如，在细胞珠粒形成后，细胞珠粒可以被转移到水性溶液中，然后经受如本文所述的额外加工。例如，可以对细胞珠粒进行批量逆转录，以从捕获的mRNA产生cDNA(例如，与附接到细胞珠粒基质或颗粒(诸如磁性颗粒)的寡核苷酸杂交)。
D.细胞珠粒产生方法
本公开的方法可以包括产生一种或多种包含一种或多种本文所公开的聚合物的细胞珠粒。参见例如美国专利公开2018/0216162(现为美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，以及美国专利公开2019/0233878，这些专利公开全文以引用方式并入本文，旨在提供示例性的细胞珠粒产生系统和方法。例如，将细胞和聚合物前体或凝胶前体与不可混溶的流体(例如，油)混合，从而产生多个水性液滴，包括含有细胞的液滴。如本文所述，液滴可以含有带电物质。液滴可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝以产生含有细胞的细胞珠粒的条件。胶凝可以包括本文所述的任何胶凝机制和胶凝聚合物，包括如本文别处所述的利用点击化学反应的那些。在一些情况下，细胞珠粒经受足以裂解细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)，从而将细胞组分释放到细胞珠粒中的处理条件。在其他实施方案中，在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝产生细胞珠粒之前，细胞在液滴中裂解。在还有其他实施方案中，在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前或之后，细胞被透化。可以将细胞珠粒收集在水相中，以产生多个细胞珠粒。可以储存细胞珠粒供进一步加工。在一些情况下，带电物质可以在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后附接到细胞珠粒。例如，聚合物前体或凝胶前体可以包含一个或多个官能团，该官能团在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后促进带电物质的附接。在其他实施方案中，聚合物前体或凝胶前体包含含有带电物质的官能团，这些官能团在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝期间结合到细胞珠粒中。
在一个方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先，可以产生包含来自多个细胞的细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)、聚合物前体或凝胶前体和带电物质的分区。接下来，该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物和带电物质的聚合物网络或凝胶网络的条件，从而产生细胞珠粒。该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处有所描述。在一些实施方案中，将细胞裂解，以使细胞组分释放到细胞珠粒中。细胞可以在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前裂解、在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时裂解，或者在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。在其他实施方案中，细胞珠粒中的细胞不被裂解，而是被透化以允许接近细胞核内的组分。
在另一个方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先，可以产生包含从细胞分离的细胞核、聚合物前体或凝胶前体和带电物质的分区。接下来，该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应以产生包含细胞核和带电物质的聚合物网络或凝胶网络的条件，从而产生细胞珠粒。该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处有所描述。例如，铜催化剂可以用于催化点击化学反应，从而产生水凝胶。在一些实施方案中，将细胞核裂解，以使细胞核组分释放到细胞珠粒中。细胞核可以在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前裂解、在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时裂解，或者在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。在其他实施方案中，细胞珠粒中的细胞核不被裂解，而是被透化以允许接近细胞核内的细胞核组分。
带电物质可以是带正电的物质。带正电的物质可以是包含正电荷的试剂。带正电的物质可以包括三甲基铵。带正电的物质可以是(3-丙烯酰胺丙基)-三甲基铵。带电物质可以是带负电的物质。带负电的物质可以包括磷酸盐。带电物质可以附接到聚合物网络或凝胶网络。在聚合期间，带电物质可以结合到聚合物网络或凝胶网络中。细胞珠粒可以包含一种或多种化学交联剂。化学交联剂可以是二硫键。带电物质可以附接到一种或多种化学交联剂。细胞衍生物可以是来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质等)。一种产生细胞珠粒的方法可以包括将分区(例如，液滴)内的细胞裂解，以从该细胞释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电的组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电的组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电物质相互作用。来自细胞的组分可以非共价地附接到带电物质。
在一些实施方案中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)经由离子相互作用与细胞珠粒的带正电的物质(例如，细胞珠粒聚合物的带正电的官能团)(例如，((3-丙烯酰胺丙基)-三甲基铵)相互作用。在其他实施方案中，来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)经由离子相互作用与细胞珠粒的带负电的物质(例如，细胞珠粒聚合物的带负电的官能团)(例如，磷酸盐)相互作用。在还有其他实施方案中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒的带正电的物质(例如，细胞珠粒聚合物的带正电的官能团)(例如，(3-丙烯酰胺丙基)-三甲基铵)相互作用，并且来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒的带负电的物质(例如，细胞珠粒聚合物的带负电的官能团)(例如，磷酸盐)相互作用。因此，例如由于与细胞珠粒的带电物质的静电相互作用，来自细胞的一种或多种组分可以能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多12小时、最多24小时、最多48小时或最多72小时。
在一个方面，本公开提供了用于产生包含带电的聚合物网络或凝胶网络的细胞珠粒(例如，包含带电物质的细胞珠粒)的方法。首先，可以产生包含来自多个细胞的细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)和聚合物前体或凝胶前体的分区。接下来，该分区可以经受足以使所述带电的聚合物前体或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物的带电聚合物网络或凝胶网络的条件，从而提供包含带电物质的细胞珠粒。该反应可以使得聚合物前体或凝胶前体上的净电荷改变，从而产生带电的聚合物网络或凝胶网络。该反应可以使得聚合物网络或凝胶网络上的净电荷改变，从而产生带电的聚合物网络或凝胶网络。
聚合物前体或凝胶前体可以带正电。聚合物前体或凝胶前体可以包括壳聚糖。聚合物前体或凝胶前体可以包括聚乙烯亚胺(PEI)。聚合物前体或凝胶前体可以带负电。聚合物前体或凝胶前体可以包括藻酸盐。细胞衍生物可以是来自细胞的组分(例如，DNA、RNA、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段等)。一种产生细胞珠粒的方法可以包括将分区(例如，液滴)内的细胞裂解，以从该细胞释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA)或RNA(例如，mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电的组分，例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电的组分，例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电的聚合物网络或凝胶网络相互作用。来自细胞的组分可以非共价地附接到包含带电物质的细胞珠粒的聚合物网络或凝胶网络。在一些实施方案中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)经由离子相互作用与细胞珠粒的带正电的物质(例如，带正电的聚合物网络或凝胶网络)相互作用。在其他实施方案中，来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)经由离子相互作用与细胞珠粒的带负电的物质(例如，带负电的聚合物网络或凝胶网络)相互作用。
在还有其他实施方案中，来自或源自细胞的带负电的组分(例如，DNA)与细胞珠粒的带正电的物质(例如，带正电的聚合物网络或凝胶网络)相互作用，并且来自或源自细胞的带正电的组分(例如，蛋白质)与细胞珠粒的带负电的物质(例如，带负电的聚合物网络或凝胶网络)相互作用。因此，例如由于与细胞珠粒的带电物质的静电相互作用，来自细胞的一种或多种组分可以能够保留在细胞珠粒内。例如，由于与带电的聚合物网络或凝胶网络的相互作用，来自细胞的组分可以能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分可以能够在细胞珠粒内保留最多1小时、最多2小时、最多3小时、最多4小时、最多5小时、最多6小时、最多12小时、最多24小时、最多48小时或最多72小时。
在一个方面，本公开提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先，可以产生包含来自多个细胞的细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)和聚合物前体或凝胶前体的分区。接下来，该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物的聚合物网络或凝胶网络的条件。接下来，可以将带电物质偶联至该聚合物网络或凝胶网络，从而提供包含带电物质的细胞珠粒。该分区可以经受足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件。足以使聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的条件在本文别处有所描述。例如，铜催化剂可以用于催化点击化学反应，从而产生水凝胶。在一些情况下，将细胞裂解，以释放细胞组分。细胞可以在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之前裂解、在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝的同时裂解，或者在聚合物前体或凝胶前体聚合或胶凝之后裂解。
如本文所述，聚合物网络或凝胶网络可以是可降解的聚合物网络或凝胶网络，使得细胞珠粒是可降解的细胞珠粒。可以通过产生多个分区来产生任何数量的细胞珠粒。在一些情况下，产生约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约10个、约50个、约100个、约500个、约1000个、约5000个、约10000个、约20000个、约50000个、约100000个或更多个细胞珠粒，从而产生多个细胞珠粒。细胞珠粒可以连同条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)一起分隔，用于分析细胞或其组分。
E.点击化学
如本文所用，术语“点击化学”通常是指这样的反应：它们是模块化的，范围宽、产率高、仅产生无害的副产物(诸如可以通过非色谱方法除去的那些)，并且具有立体专一性(但不一定具有对映选择性)。参见例如美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)、美国专利公开2019/0233878，以及Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40(11):2004-2021，这些文献全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些情况下，点击化学可以描述在温和的水性条件下可以选择性地相互反应的成对官能团。点击化学反应的一个实例可以是叠氮化物和炔烃的Huisgen 1,3-偶极环加成反应，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应，其形成称为1,2,3-三唑的5元杂原子环。该反应还可以称为Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。用于点击化学的催化剂可以是Cu(I)盐，或者通过用还原剂将Cu(II)试剂还原为Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(Pharm Res.2008,25(10):2216-2230)。用于点击化学的已知Cu(II)试剂可以包括但不限于Cu(II)-(TBTA)络合物和Cu(II)(THPTA)络合物。TBTA，即三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)盐的稳定配体。THPTA，即三-(羟丙基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)稳定剂的另一个实例。也可以实现其他条件，以使用无铜点击化学由叠氮化物和炔烃来构建1,2,3-三唑环，诸如通过应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学反应(SPAAC，参见例如Chem.Commun.,2011,47:6257-6259；以及Nature,2015,519(7544):486-90)，这些文献中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些情况下，本公开还设想使用点击化学反应，产生不是1,2,3-三唑的化学键。参见例如美国专利公开2019/0233878，其全文以引用方式并入本文。可用于制备生物相容性凝胶的一系列这样的点击化学反应在本领域中是众所周知的。参见例如，Madl和Heilshorn，“Bioorthogonal Strategies for Engineering Extracellular Matrices,”Adv.Funct.Mater.2018,28:1706046，该文献据此以引用方式并入本文。
可用于本公开的组合物和方法的无铜且不产生1,2,3-三唑键的点击化学反应的一个实例是逆电子需求迪尔斯-阿尔德(IED-DA)反应。(参见例如，Madl和Heilshorn2018)。如本文别处所述，在IED-DA点击化学反应中，这对点击化学官能团包括四嗪基团和反式环辛烯(TCO)基团，或者四嗪基团和降冰片烯基团。该反应不含铜，并产生包含二氢哒嗪基团而不是1,2,3-三唑的键合。
可用于本公开的组合物和方法但产生不同于1,2,3-三唑的化学键的其他特定双正交点击化学反应包括一对呋喃官能团与马来酰亚胺官能团之间的迪尔斯-阿尔德反应、施陶丁格连接和氧化腈环加成反应。这些点击化学反应和其他反应在本领域中是众所周知的，并且在例如Madl和Heilshorn 2018中有所描述。
因此，在一些实施方案中，可用于形成本公开的交联聚合物的无铜点击化学可以选自：(a)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学；(b)逆电子需求迪尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式环辛烯(TCO)点击化学；(c)逆电子需求迪尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学；(d)迪尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学；(e)施陶丁格连接；和(f)氧化腈/降冰片烯环加成反应点击化学。
IV.报告剂
分析物(例如，本文所公开的分泌型抗体)可以如本文和图8中所述由报告剂来标记(例如，由条形码标记的抗原)。报告剂可以包含条形码，例如报告条形码序列(图8的816)，和/或UMI。条形码序列可以在寡核苷酸序列内包含6个至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。报告剂还可以包含可用于加工来自共同分隔细胞的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，以用于扩增来自分区内单独细胞的基因组DNA，同时连接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴定这些序列的存在或用于下拉条形码化核酸或许多其他潜在功能序列中的任何一个。
本文所述的方法和系统可以包括使用一种或多种加条形码的组分或分子(例如，捕获剂或其部分)，以在单细胞基础上分析生物样品(例如免疫细胞群体，例如B细胞或浆细胞群体)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用能够与从细胞分泌的分析物(例如，抗体)偶联的报告剂。可以将报告剂(参见例如810)添加到细胞或细胞珠粒，其中该报告剂可以包含：(i)能够结合与捕获剂偶联的分泌型分析物分子(例如，分泌型抗体)的第二多肽(例如抗体结合分子，例如抗原814)；以及(ii)包含第一分析物特异性条形码序列(例如，816)的核酸分子，从而为与捕获剂偶联的分析物分子(例如，抗体)加标签。报告剂可以与分析物偶联，而分析物与偶联至细胞表面的捕获剂偶联。报告剂可以是抗体结合剂(例如抗原、抗体或片段，例如抗原结合片段)或其衍生物。报告剂可以包括能够与偶联至捕获剂的分析物偶联的抗原。在一些情况下，可以从细胞或含有细胞的细胞珠粒中去除未与分析物(例如，抗原)偶联的任何报告剂分子(例如，通过进行清洗步骤以去除未结合的报告剂分子)。报告剂可以包含条形码(即，报告条形码序列)，例如包含条形码序列的寡核苷酸序列，并且可以为分析物加条形码。因此，分析物(例如分泌型分子，例如分泌型抗体)可以在偶联至报告剂时加条形码，该报告剂进而可以偶联至分泌所述分析物的细胞(例如，通过捕获剂偶联)。在使用例如采用Illumina测序仪产生的测序读段分析条形码时，如本文所述的条形码可以用于将一种或多种分析物(例如，分泌型分子或细胞核苷酸序列，诸如mRNA)与细胞和/或分区(例如，液滴或孔)相关联。
参见图8中的操作800，在分泌型抗体或其他分析物结合至捕获剂的第一部分以形成第一复合物之后，将细胞(例如，B细胞或浆细胞)或其他类型的细胞进一步与包含多种报告剂810的溶液一起孵育。每个报告剂810与包含条形码序列(即，报告条形码序列)的核酸分子816偶联。在某些实施方案中，报告剂810包含蛋白质，诸如抗原814。在某些实施方案中，抗原814选择性地结合到至少一种抗体，例如分泌型抗体。在其他实施方案中，抗原814选择性地结合到其他感兴趣的分泌型分析物。另外，在一些实施方案中，报告剂810除包含条形码816之外，还包含荧光团、发色团、重金属，或它们的任何组合(例如，作为富集靶标812)。此处可以利用的荧光团的实例是异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、ALexa Four、DyLight等。报告剂810连同报告条形码816一起结合到分泌型抗体，这些分泌型抗体被捕获剂804捕获以形成第二复合物。在一个示例性实施方案中，条形码(包括条形码816)是DNA寡核苷酸。因此，在一些情况下，将细胞特异性条形码(例如，在分区(诸如液滴)中，参见图3)附接到含有抗原条形码(例如，报告条形码816)的分子，并且如果存在的话，该条形码允许分泌型抗体分子和抗原两者与同一单细胞相关联。任选地，可以使用选择剂/富集剂来选择和/或富集包含以下细胞的细胞珠粒：该细胞已分泌的抗体与该细胞上的捕获剂和报告剂810结合。选择剂/富集剂包括缀合至磁性珠粒的抗体，并且该抗体可以包含标签，诸如荧光标签。
参见图10A中的操作1000，在分泌型抗体或其他分析物结合至细胞珠粒1002的基质中的捕获剂的第一部分之后，将细胞(例如，B细胞或浆细胞)或其他类型的细胞进一步与包含多种报告剂810的溶液一起孵育。每个报告剂810与包含条形码序列(即，报告条形码序列)的核酸分子816偶联。在某些实施方案中，报告剂810包含蛋白质，诸如抗原814。在某些实施方案中，抗原814选择性地结合到至少一种抗体，例如分泌型抗体。在其他实施方案中，抗原814选择性地结合到其他感兴趣的分泌型分析物。另外，在一些实施方案中，报告剂810除包含条形码816之外，还包含荧光团、发色团、重金属，或它们的任何组合(例如，812)。此处可以利用的荧光团的实例是异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、ALexa Four、DyLight等。报告剂810连同例如报告条形码816一起结合到分泌型抗体，这些分泌型抗体被捕获剂804捕获以形成第二复合物。在一个示例性实施方案中，条形码(包括条形码816)是DNA寡核苷酸。因此，在一些情况下，将细胞特异性条形码(例如，在分区(诸如液滴)中，参见图3)附接到含有抗原条形码(例如，报告条形码816)的分子，并且如果存在的话，该条形码允许分泌型抗体分子和抗原两者与同一单细胞相关联。任选地，可以使用选择剂/富集剂1004来选择和/或富集包含以下细胞的细胞珠粒：该细胞已分泌的抗体1012与细胞珠粒1002上的捕获剂(例如，图10B中的1014；图10A中未示出)以及与报告剂810结合，例如偶联。选择剂/富集剂包括缀合至磁性珠粒1010的抗体1006，并且抗体1006可以包含标签1008，诸如荧光标签。在一些实施方案中，捕获剂包含抗Fc抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，捕获剂包含抗ID抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，捕获剂包含被分泌型抗体分析物识别的抗原或表位。
图10B示出分析物(例如，分泌型抗体1012)与偶联至细胞珠粒1002的捕获剂1014结合或偶联，从而形成复合物1016。将包含分析物特异性抗原的报告剂和包含条形码序列(即，报告条形码序列)的核酸分子与该复合物接触，以形成标记的细胞珠粒。
在一些实施方案中，在从细胞中分泌感兴趣的分析物或分子(例如，抗体)并且将该分析物偶联(例如结合，诸如共价或非共价地结合)至一种或多种结合剂(例如，捕获剂和报告剂)之后，将细胞共同分隔到分区中。在其他情况下，共同分隔发生在分析物从细胞分泌以及分析物与一种或多种结合剂偶联之前。在一些实施方案中，至少一些分区可以最多包含一个细胞。在一些情况下，一个分区至少包含一个细胞。如本文所述的分区可以包括液滴或孔(例如，在微孔阵列中)。液滴可以是乳液液滴。液滴(例如，乳液液滴)可以通过使第一相与第二相发生接触而形成，其中第二相与第一相不可混溶。在其他情况下，分区可以是作为多个孔的一部分的一个孔。在还有其他情况下，分区可以是作为多个室的一部分的一个室。分区可以彼此流体隔离或彼此物理隔离。在一些情况下，分区(例如，液滴或孔)可以包含细胞、捕获剂和报告剂，其中捕获剂和报告剂可以与分析物偶联，并且直接和/或间接地与细胞偶联(参见例如，图8和图10A)。在一些情况下，报告剂包含(例如，偶联或连接至)具有分析物特异性条形码(即，报告条形码序列)的核酸分子，从而对细胞或细胞珠粒进行标记，以便随后分隔。
V.标记的细胞或细胞珠粒
感兴趣的分泌型分析物(例如，分泌型抗体)或其抗原片段可以使用包被能够“抓住”(例如，捕获)所述分析物的细胞的复合物来分离。然后可以检测分析物包被的细胞(例如，使用报告剂，包括抗体结合剂，例如抗原)，并且/或者通过允许将分析物包被的细胞与未包被的细胞区分开的机制来将这些细胞分离。示例性方法包括但不限于荧光激活细胞分选术(FACS)、磁激活细胞分选术(MACS)或浮力激活细胞分选术(BACS)。
在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过使用荧光激活细胞分选术(FACS)来检测和/或选择。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别细胞结合抗体的荧光染料标记的抗体来检测。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别细胞结合抗体的Fc区的荧光染料标记的抗体来检测，随后使用FACS来分析。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别与细胞结合抗体偶联的报告剂(例如，识别报告剂1010的标签812)的抗体(例如，荧光染料标记的抗体、磁性珠粒标记的抗体、微泡标记的抗体，或者它们的组合)来检测，随后进行分析。
在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过使用磁激活细胞分选术(MACS)来检测和/或选择。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过与识别细胞结合抗体的磁性珠粒结合的抗体来检测。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别细胞结合抗体的Fc区的磁性珠粒标记的抗体来检测，随后使用MACS来分析。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别与细胞结合抗体偶联的报告剂(例如，识别报告剂1010的标签812)的抗体(例如，荧光染料标记的抗体、磁性珠粒标记的抗体、微泡标记的抗体，或者它们的组合)来检测，随后进行分析。
在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过使用浮力激活细胞分选术(BACS)来检测和/或选择。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别细胞结合抗体的微泡标记的抗体来检测。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以被微泡标记的抗体结合，从而导致浮力分离中的较低密度。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别细胞结合抗体的Fc区的微泡标记的抗体来检测，随后使用BACS来分析。在一些实施方案中，抗体包被的细胞可以通过识别与细胞结合抗体偶联的报告剂(例如，识别报告剂810的标签812)的抗体(例如，荧光染料标记的抗体、磁性珠粒标记的抗体、微泡标记的抗体，或者它们的组合)来检测，随后进行分析。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含偶联至细胞表面的复合物的标记细胞。在一些实施方案中，该复合物包含：(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，以及(iii)包含报告核酸分子的报告剂，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，例如报告条形码序列。参见图8的说明中的描述，例如段落166。
在一些实施方案中，本文提供了多个标记细胞，其中每个细胞均包含与细胞表面偶联的复合物。在一些实施方案中，每种复合物均包含：(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，以及(iii)包含报告核酸分子的报告剂，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，例如报告条形码序列。捕获剂、分泌型抗原结合分子、报告剂、报告核酸分子和/或报告序列(例如，报告条形码序列)在多个标记细胞之中可以相同，也可以不同。
在一些实施方案中，本文提供了一种标记细胞珠粒，其包含基质中的细胞以及处于该细胞珠粒之中或之上的复合物。在一些实施方案中，该复合物包含：(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，以及(iii)包含报告核酸分子的报告剂，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，例如报告条形码序列。参见图10A的说明中的描述，例如段落167。
在一些实施方案中，本文提供了多个标记细胞珠粒，其中每个细胞珠粒均包含基质中的细胞以及处于该细胞珠粒之中或之上的复合物。在一些实施方案中，每种复合物均包含：(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，以及(iii)包含报告核酸分子的报告剂，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，例如报告条形码序列。基质、捕获剂、分泌型抗原结合分子、报告剂、报告核酸分子和/或报告序列(例如，报告条形码序列)在多个标记细胞珠粒之中可以相同，也可以不同。
在一些实施方案中，标记细胞、标记细胞珠粒、多个标记细胞或多个标记细胞珠粒被分隔开。在一些实施方案中，分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列。如针对图4(例如，段落320)所述，这些分区条形码序列可以是该分区所共用的分区特异性序列(410)。
在一些实施方案中，在分区中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列(例如，报告条形码序列)或其互补序列，以及分区条形码序列或其互补序列。
VI.细胞加工和分隔
在一个方面，本文所述的方法和系统提供了将来自包含细胞的样品材料的单独细胞(例如B细胞谱系的细胞，例如浆细胞)隔室化、沉积或分隔到离散的隔室或分区(本文可互换地称为分区)中，其中每个分区保持其自身的内容物与其他分区的内容物分离。在一个方面，本文所述的方法包括将来自包含细胞的样品材料的一个或多个单独细胞的核酸分子(例如，直接或间接地附接到细胞表面的基因组DNA和/或核酸条形码)隔室化、沉积或分隔到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其他分区的内容物分离。
在另一个方面，本文所述的方法和系统提供了在至少一种标记剂或报告剂已经结合到细胞的细胞表面特征之后，将来自包含细胞的样品材料的单独细胞隔室化、沉积或分隔到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其他分区的内容物分离。包括独特标识符和共同或通用标签(例如，条形码)在内的标识符可以预先、随后或同时递送到容纳隔室化或分隔细胞的分区，以便允许后来将单独细胞的特征归属于一个或多个特定的隔室。另外，包括独特标识符和共同或通用标签(例如，条形码)在内的标识符可以与标记剂偶联，并且预先、随后或同时递送到容纳隔室化或分隔细胞的分区，以便允许后来将单独细胞的特征归属于一个或多个特定的隔室。包括独特标识符和共同或通用标签(例如，条形码)在内的标识符可以经由任何合适的机制例如在寡核苷酸上递送到分区。
在一些实施方案中，本文的分区包括可以适于容纳一种或多种物质或者进行一种或多种反应的空间或容积。分区可以是物理隔室，诸如液滴或孔。分区可以将空间或体积与另一个空间或体积隔离。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。分区可以包括一个或多个其他(内部)分区。在一些情况下，分区可以是虚拟隔室，其可以由跨越多个和/或远程物理隔室的索引(例如，索引文库)定义且鉴定。例如，物理隔室可以包括多个虚拟隔室。
A.用于隔室化的系统和方法
在一个方面，本文所述的系统和方法提供了将一个或多个颗粒(例如，生物颗粒、生物颗粒的大分子成分、珠粒、试剂等)隔室化、沉积或分隔到离散的隔室或分区(本文可互换地称为分区)中，其中每个分区保持其自身内容物与其他分区的内容物分开。在一些实例中，分隔颗粒是B细胞谱系(例如，分泌抗体的浆细胞)的标记细胞。在其他实例中，分隔颗粒可以是经工程化以分泌抗体的标记细胞。分区可以是乳液或孔中的液滴。分区可以包括一个或多个其他分区。
分区可以包括一个或多个颗粒。分区可以包括一种或多种类型的颗粒。例如，本公开的分区可以包括一个或多个生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)，和/或其大分子成分。分区可以包括一个或多个珠粒。分区可以包括一个或多个凝胶珠粒。分区可以包括一个或多个细胞珠粒。分区可以包括单个凝胶珠粒、单个细胞珠粒或单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒两者。分区可以包括一种或多种试剂。另选地，分区可以是未被占据的。例如，分区可以不包括珠粒。细胞珠粒可以是生物颗粒，例如标记的B细胞或浆细胞，以及/或者其一种或多种大分子成分，例如分泌型抗体或其抗原结合片段，其被包裹在凝胶或聚合物基质内部(例如，经由与基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联的捕获剂)，诸如经由包含生物颗粒和能够聚合或胶凝的前体的液滴的聚合。可以在液滴生成之前、之后或同时，将诸如条形码之类的独特标识符诸如经由微胶囊(例如，珠粒)注入液滴中，如本文其他地方所述。微流体通道网络(例如，在芯片上)可以用于生成分区，如本文所述。在单独生物颗粒的分隔中还可以采用替代机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物通过所述多孔膜被挤出成非水性流体。
本公开的方法和系统可以包括用于产生一个或多个分区(诸如液滴)的方法和系统。液滴可以包括乳液中的多个液滴。在一些实例中，液滴可以包括胶体中的液滴。在一些情况下，乳液可以包括微乳液或纳米乳液。在一些实例中，液滴可以借助于微流体装置和/或通过使不混溶相的混合物经受搅拌(例如，在容器中)来产生。在一些情况下，所提及方法的组合可以用于形成液滴和/或乳液。
可以通过混合和/或搅拌不混溶相产生乳液来形成液滴。混合或搅拌可以包括各种搅拌技术，诸如涡旋、移液、轻轻弹管，或其他搅拌技术。在一些情况下，混合或搅拌可以在不使用微流体装置的情况下进行。在一些实例中，液滴可以通过将混合物暴露于超声波或超声处理来形成。在国际申请号PCT/US2015/025197、PCT/US2020/017785和PCT/US2020/020486中描述了通过搅拌产生液滴和/或乳液的系统和方法，这些国际申请均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
包括微流体通道网络(例如，在芯片上)的微流体装置或平台可以用于产生如本文所述的分区(诸如液滴和/或乳液)。在美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173中描述了用于产生分区(诸如液滴)的方法和系统、包封生物颗粒和/或分区中的生物颗粒(或者分析物载体和/或分区中的分析物载体)的方法、增加液滴产生通量的方法，以及微流体装置和通道的各种几何形状、架构和构造，这些专利公开中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实例中，通过将水性流体中的颗粒的流动料流引入非水性流体的流动料流或储器中，使得可以在两个料流/储器的汇合部处(诸如在本文别处所提供的微流体装置的汇合部处)产生液滴，可以将单独的颗粒分隔为离散分区。
本公开的方法可以包括产生分区和/或包封颗粒，诸如生物颗粒，在一些情况下为单独的生物颗粒，诸如单细胞。在一些实例中，试剂可以被包封和/或分隔(例如，与生物颗粒共同分隔)在分区中。在分隔单独的颗粒时可以采用各种机制。一个实例可以包括多孔膜，细胞的水性混合物可以穿过该多孔膜被挤压到流体(例如，非水性流体)中。
分区在流体流中可以是可流动的。分区可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊。在一些情况下，这些分区可以包含多孔基质，该多孔基质能够在其基质内夹带和/或保留物质(例如，分泌型分析物，即，分泌型抗体或其抗原结合片段)(例如，经由被配置为与基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联的捕获剂)。分区可以是第二相内的第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如，油相)内的水性流体的液滴。在另一个实例中，分区可以是水相内的非水性流体的液滴。在一些实例中，分区可以以油包水乳液或水包油乳液的形式提供。在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述了多种不同的容器，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在例如美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水性或油连续相中产生稳定的液滴的乳液体系，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
就乳液中的液滴而言，在一个非限制性实例中，通过将水性流体中的颗粒的流动料流引入非水性流体的流动料流中，使得在两个料流的汇合部处产生液滴，可以实现将单独的颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)分配到离散分区中。可以调节流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如，体积分数、粒度、颗粒浓度等)、微流体体系结构(例如，通道几何形状等)以及其他参数以控制所得分区的占据率(例如，每个分区的生物颗粒的数量、每个分区的珠粒的数量等)。例如，可以通过以颗粒的一定浓度和/或流速提供水流来控制分区占据率。为了生成单生物颗粒分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得分区中的每个分区平均可以包含少于一个生物颗粒，以确保被占据的那些分区主要是单占据的。在一些情况下，多个分区中的分区可以最多包含一个生物颗粒(例如，珠粒、DNA、细胞(诸如标记的B细胞或浆细胞)，或细胞物质)。在一些实施方案中，可以选择或调节各种参数(例如，流体特性、颗粒特性、微流体体系结构等)，使得占据大部分区，例如仅允许小百分比的未被占据的分区。可以控制流动和通道体系结构，以确保给定数量的单占据分区小于一定水平的未被占据的分区和/或小于一定水平的多重占据的分区。
图1示出了用于分隔单独生物颗粒的微流体通道结构100的实例。通道结构100可以包括在通道连接部110处连通的通道段102、104、106和108。在操作中，可以将包含悬浮的生物颗粒(例如细胞，即标记的B细胞或浆细胞)114的第一水性流体112沿通道段102输送到汇合部110中，而将与水性流体112不可混溶的第二流体116从通道段104和106中的每一者递送到汇合部110，以产生第一水性流体112的离散液滴118、120，这些离散液滴流入通道段108，并背离汇合部110流动。通道段108可以流体联接至出口储库，在该出口储库中可以储存和/或收获离散液滴。所生成的离散液滴可以包括单独生物颗粒114(诸如液滴118)。所产生的离散液滴可以包括多于一个单独的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)114(图1中未示出)。离散液滴可以不含有生物颗粒114(诸如液滴120)。每个离散分区可以保持其自身内容物(例如，单独生物颗粒114)与其他分区的内容物分开。
第二流体116可以包含油，诸如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴118、120的后续聚结)的氟表面活性剂。在例如美国专利申请公开号2010/0105112中描述了特别有用的分隔流体和含氟表面活性剂的实例，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
应当理解，本文所述的微流体装置的通道段可以联接到多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管，或者其他系统的流体部件。应当理解，微流体通道结构100可以具有其他几何形状和/或构造。例如，微流体通道结构可以具有超过一个通道连接部。例如，微流体通道结构可以具有各自携带颗粒(例如，生物颗粒、细胞珠粒和/或凝胶珠粒)的2、3、4或5个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
所产生的液滴可以包括液滴的两个子组：(1)包含一个或多个生物颗粒114(例如，标记的B细胞或浆细胞)的已被占据的液滴118，以及(2)不包含任何生物颗粒114的未被占据的液滴120。已被占据的液滴118可以包括被单独占据的液滴(具有一个生物颗粒，诸如一个B细胞或浆细胞)和被多重占据的液滴(具有多于一个生物颗粒，诸如多个B细胞或浆细胞)。如本文别处所述，在一些情况下，大多数被占据分区中的每个被占据分区可以包括不超过一个生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)，并且一些所产生的分区可以是未被(任何生物颗粒，或者标记的B细胞或浆细胞)占据的。然而，在一些情况下，一些被占据分区可以包括多于一个生物颗粒，例如，标记的B细胞或浆细胞。在一些情况下，可以控制分隔过程，使得少于约25％的被占据的分区包含超过一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的被占据的分区具有超过一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的被占据的分区的每个分区包括超过一个生物颗粒。
在一些情况下，可能期望使过多数量的空分区的生成最小化，以便降低成本和/或提高效率。虽然可以通过在分隔汇合部110处提供足够数量的生物颗粒(例如生物颗粒(诸如标记的B细胞或浆细胞)114)来实现这种最小化，以便确保至少一个生物颗粒被包封在一个分区中，但是泊松分布可能预期会增加包括多个生物颗粒的分区的数量。因此，在将要获得被单独占据的分区的情况下，所产生的分区中最多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更小百分比可以是未被占据的。
在一些情况下，可以控制一个或多个生物颗粒(诸如B细胞或浆细胞)(例如，在通道段102中)或者被引导进入分隔汇合部的其他流体(例如，在通道段104、106中)的流动，使得在许多情况下，不超过约50％的所产生的分区、不超过约25％的所产生的分区或者不超过约10％的所产生的分区未被占据。可以控制这些流动，以便呈现单占据分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的分区。可以实现未被占据的分区的上述范围，同时仍然提供上述任何一个单占据率。例如，在许多情况下，使用本文所述的系统和方法得到的分区可以具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％并且在许多情况下小于约5％的多重占据率，同时未被占据的分区少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或更小百分比。
应当理解，上述占据率也适用于包括生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)和附加试剂两者的分区，其中附加试剂包括但不限于携带条形码核酸分子(例如，寡核苷酸)的微胶囊或珠粒(例如，凝胶珠粒)(关于图1和图2描述)。被占据的分区(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的被占据的分区)可以同时包括含有条形码核酸分子的微胶囊(例如，珠粒)和生物颗粒。
在另一个方面，作为基于液滴的分隔的补充或替代，生物颗粒可以被包封在微胶囊内，该微胶囊包括其中夹带了一个或多个单独生物颗粒或小群生物颗粒的外壳、层或多孔基质。微胶囊可以包括其他试剂。包封生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)可以通过多种方法来进行。此类过程可以将含有生物颗粒的水性流体与聚合物前体材料组合，在向聚合物前体施加特定的刺激时该聚合物前体材料可能能够形成为凝胶或其他固体或半固体基质。此类刺激可以包括例如热刺激(例如，加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过添加的引发剂))、机械刺激或它们的组合。
制备包含生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的微胶囊可以通过多种方法来进行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分散到胶凝溶液中，以便形成包括单独的生物颗粒或小群生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的微胶囊。同样，基于膜的包封系统可以用于产生包含如本文所述的包封生物颗粒(例如，B细胞或浆细胞)的微胶囊。诸如图1所示的本公开的微流体系统可以容易地用于包封如本文所述的细胞。特别地，并且参考图1，包含(i)生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的水性流体112流入通道汇合部110，在此处通过非水性流体116的流动而被分隔到液滴118、120中。在包封方法的情况下，非水性流体116还可以包括引发剂(未示出)，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，从而形成包括所夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例包括在美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
例如，在聚合物前体材料包括线性聚合物材料诸如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线性聚合物材料的情况下，活化剂可以包括交联剂，或活化所形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包括可聚合单体的聚合物前体，活化剂可以包括聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包括丙烯酰胺单体与N,N’-双-(丙烯酰)胱胺(BAC)共聚单体的混合物时，可以在通道段104和106中的第二流体流116内提供试剂诸如四乙基甲二胺(TEMED)，该试剂可以引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联的聚合物网络或水凝胶。
在液滴形成期间第二流体料流116与第一流体料流112在汇合部110处接触时，TEMED可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性流体112中，这将激活液滴118、120内的聚丙烯酰胺的交联，导致形成夹带细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)114的固体或半固体珠粒或颗粒形式的凝胶(例如，水凝胶)微胶囊。尽管就聚丙烯酰胺包封进行了描述，但是在本文所述的方法和组合物的上下文中也可以采用其他“可激活的”包封组合物。例如，藻酸盐液滴形成及随后暴露于二价金属离子(例如，Ca2+离子)可以用作使用所述过程进行的包封过程。同样，还可以通过基于温度的胶凝(例如，在冷却后等)，将琼脂糖液滴转化成胶囊。
在一些情况下，包封的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放出来，诸如通过时间的流逝或在施加特定刺激时，这使微胶囊充分地降解以允许生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)或它的其他内容物从微胶囊中释放出来，诸如释放到分区(例如，液滴)中。例如，在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下，微胶囊的降解可以通过引入合适的还原剂诸如DTT等来实现，以裂解使聚合物基质交联的二硫键。参见例如美国专利申请公开No.2014/0378345，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)可以经受足以使前体聚合或胶凝的其他条件。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。在聚合或胶凝之后，可以在生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学试剂或生化试剂而言可以是扩散渗透性的。聚合物或凝胶对于生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的大分子成分(例如，分泌型抗体或其抗原结合片段)可以是通过扩散不可渗透的。这样，聚合物或凝胶可以起到让生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)经受化学或生化操作的作用，同时将大分子成分在空间上限制于由聚合物或凝胶限定的液滴的区域。聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-巯基、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被官能化(例如，与捕获剂偶联)，以结合到目标分析物(例如，分泌型抗体或其抗原结合片段)，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以经由被动机理聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件或升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有与珠粒的机械特性类似的机械特性。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以维持对外源化学品(诸如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学品(诸如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以通过热、化学、酶和/或光学方式聚合和/或解聚。
该聚合物可以包括通过二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可以包括两步反应。在第一活化步骤中，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化成酯。例如，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。可以将聚丙烯酰胺-共-丙烯酸暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中，可以将在第一步骤中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可以将该酯暴露于胱胺(2,2'-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒可以被通过二硫桥连接在一起的聚丙烯酰胺链围绕。这样，生物颗粒可以被包封在凝胶或基质(例如，聚合物基质)内部或包含该凝胶或基质以形成“细胞珠粒”。细胞珠粒可以包含生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段等)。细胞珠粒可以包括单个细胞或多个细胞，或单个细胞或多个细胞的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞之后，可以将细胞裂解物中的抑制组分洗掉，并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文所公开的系统和方法可以适用于包含生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)和包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)。
包封的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)可以提供比基于液滴的分隔生物颗粒更易于储存和更便携的某些潜在的优势。此外，在一些情况下，可能希望在分析之前允许将生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)孵育选定的一段时间，诸如以便在存在或不存在不同刺激(例如，细胞因子、抗原等)的情况下表征此类生物颗粒随时间推移的变化。在此类情况下，包封可以允许比在乳液液滴中的分隔有更长的温育时间，但在一些情况下，也可以将液滴分隔的生物颗粒温育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。包封生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)可以构成其他试剂被共同分隔到其中的对生物颗粒的分隔。另选地或此外，包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上所述的其他分区(例如，液滴)中。
B.样品和细胞加工
可以在分隔之前、期间和/或之后对样品进行加工，例如包含分析物(诸如核酸、蛋白质和/或细胞)的样品。
样品可以源自任何有用的来源，包括任何受试者，诸如人类受试者。样品可以包含来自一个或多个不同来源，诸如一个或多个不同受试者的物质(例如，一个或多个细胞)。可以获得多个样品，诸如来自单个受试者的多个样品(例如，以相同或不同方式从相同或不同身体部位获得的以及/或者在相同或不同时间(例如，相隔数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或数年)获得的多个样品)，或者来自不同受试者的多个样品，以供如本文所述进行分析。例如，可以在第一时间从受试者获得第一样品，并且可以在晚于第一时间的第二时间从受试者获得第二样品。第一时间可以在受试者经历治疗方案或程序(例如，以解决疾病或病症)之前，第二时间可以在受试者经历该治疗方案或程序期间或之后。在另一个实例中，可以从受试者的第一身体部位或系统获得第一样品(例如，使用第一收集技术)，并且可以从受试者的第二身体部位或系统获得第二样品(例如，使用第二收集技术)，该第二身体部位或系统可以不同于第一身体部位或系统。在另一个实例中，可以同时从受试者相同或不同的身体部位获得多个样品。不同的样品，诸如在不同时间从同一受试者的不同身体部位、从多个不同受试者以及/或者使用不同收集技术收集的不同样品，可以经历相同或不同的加工(例如，如本文所述)。例如，第一样品可以经历第一加工方案，第二样品可以经历第二加工方案。
样品可以是生物样品，诸如细胞样品(例如，如本文所述)。样品可以包括一个或多个生物颗粒(或分析物载体)，诸如一个或多个细胞珠粒、细胞和/或细胞成分，诸如一个或多个细胞核。例如，样品可以包括多个细胞和/或细胞成分。样品的组分(例如细胞或细胞成分，诸如细胞核)可以是单一类型或多种不同类型。例如，样品的细胞可以包括一种或多种不同类型的血细胞。
生物样品可以包括多个具有不同尺寸和特征的细胞。在一些情况下，对生物样品的加工，诸如细胞分离和分选(例如，如本文所述)，可以通过耗尽具有某些特征和尺寸的细胞以及/或者分离具有某些特征和尺寸的细胞来影响样品中所包含的尺寸和细胞特征的分布。
样品可以经历一个或多个为分析做准备的过程(例如，如本文所述)，包括但不限于过滤、选择性沉淀、纯化、离心、透化、分离、搅拌、加热和/或其他过程。例如，可以过滤样品以去除污染物或其他物质。在一个实例中，过滤过程可以包括使用微流体(例如，以分离具有不同的尺寸、类型、电荷或其他特征的生物颗粒或分析物载体)。
在一个实例中，可以加工包含一个或多个细胞的样品，以将一个或多个细胞与样品中的其他材料分离(例如，使用离心法和/或另一种方法)。在一些情况下，可以对样品的细胞和/或细胞成分进行加工，以分离和/或分选出成群的细胞和/或细胞成分，以便分离和/或分选出不同类型的细胞和/或细胞成分。细胞分离的实例包括但不限于从其他血细胞和组分中分离出白细胞或免疫细胞、从血液中分离出循环肿瘤细胞，以及从身体细胞和/或环境物质中分离出细菌。分离过程可以包括正向选择过程(例如，靶向感兴趣的细胞类型以保留用于随后的下游分析，诸如通过使用靶向感兴趣的细胞类型的表面标志物的单克隆抗体)、负向选择过程(例如，去除一种或多种细胞类型并保留一种或多种其他感兴趣的细胞类型)，以及/或者消耗过程(例如，从样品中去除单一细胞类型，诸如从外周血单核细胞中去除红细胞)。
将一种或多种不同类型的细胞分离可以包括(例如)离心、过滤、基于微流体的分选术、流式细胞术、荧光激活细胞分选术(FACS)、磁激活细胞分选术(MACS)、浮力激活细胞分选术(BACS)，或任何其他有用的方法。例如，流式细胞术可以用于基于诸如尺寸、形态或蛋白质表达等参数来检测细胞和/或细胞成分。基于流式细胞术的细胞分选可以包括将样品注入鞘液中，该鞘液一次一个地将样品的细胞和/或细胞成分传送到测量区域中。在该测量区域中，光源(诸如激光)可以询问细胞和/或细胞成分，并且可以检测散射光和/或荧光并将其转换为数字信号。喷嘴系统(例如，振动喷嘴系统)可以用于产生包含单独的细胞和/或细胞成分的液滴(例如，水性液滴)。包括感兴趣的细胞和/或细胞成分(例如，如经由光学检测确定的)的液滴可以用电荷标记(例如，使用充电环)，该电荷可以用于将此类液滴与包括其他细胞和/或细胞成分的液滴分离。例如，FACS可以包括用荧光标志物(例如，使用内部生物标志物和/或外部生物标志物)来标记细胞和/或细胞成分。然后可以逐个测量和鉴定细胞和/或细胞成分，并且基于标志物的发射荧光或不存在该发射荧光来分类。MAC可以使用微米级或纳米级磁性颗粒来结合细胞和/或细胞成分(例如，经由抗体与细胞表面标志物的相互作用)，以促进感兴趣的细胞和/或细胞成分与样品的其他组分的磁分离(例如，使用基于柱的分析)。BACS可以使用标记有抗体的微泡(例如，玻璃微泡)来靶向感兴趣的细胞。与微泡偶联的细胞和/或细胞组分可以漂浮到溶液表面，从而将靶细胞和/或细胞组分与样品的其他组分分离。细胞分离技术可以用于富集感兴趣的细胞群体(例如，在分隔之前，如本文所述)。例如，包含多个细胞(包括多个给定类型的细胞)的样品可以经受正向分离过程。给定类型的多个细胞可以用荧光标志物(例如，基于表达的细胞表面标志物或另一种标志物)来标记，并且经受FACS过程以将这些细胞与多个细胞中的其他细胞分离。然后，可以对所选择的细胞进行后续的基于分区的分析(例如，如本文所述)或其他下游分析。荧光标志物可以在这种分析之前去除，也可以保留下来。荧光标志物可以包含识别特征，诸如核酸条形码序列和/或独特分子标识符。
在另一个实例中，包含第一组多个细胞(包括给定类型的第一组多个细胞(例如，表达特定标志物或标志物组合的免疫细胞))的第一样品和包含第二组多个细胞(包括给定类型的第二组多个细胞)的第二样品可以经受正向分离过程。可以使用相同或不同的收集技术，从相同或不同的受试者以相同或不同的类型从相同或不同的身体部位或系统收集第一样品和第二样品。例如，第一样品可以来自第一受试者，第二样品可以来自不同于第一受试者的第二受试者。第一样品的第一组多个细胞可以被提供第一组多个荧光标志物，这些荧光标志物被配置为标记给定类型的第一组多个细胞。第二样品的第二组多个细胞可以被提供第二组多个荧光标志物，这些荧光标志物被配置为标记给定类型的第二组多个细胞。第一组多个荧光标志物可以包含第一识别特征，诸如第一条形码，而第二组多个荧光标志物可以包含不同于第一识别特征的第二识别特征，诸如第二条形码。第一组多个荧光标志物和第二组多个荧光标志物在用相同激发源(例如光源，诸如激光器)激发时，可以发出相同强度和在相同波长范围内的荧光。然后可以将第一样品和第二样品结合，并进行FACS处理，以基于标记给定类型的第一组多个细胞的第一组多个荧光标志物和标记给定类型的第二组多个细胞的第二组多个荧光标志物，将给定类型的细胞与其他细胞分离。替代性地，第一样品和第二样品可以经历单独的FACS过程，然后可以将从第一样品中正向选择的给定类型的细胞和从第二样品中正向选择的给定类型的细胞结合，用于随后的分析。不同荧光标志物的编码识别特征可以用于识别源自第一样品的细胞和源自第二样品的细胞。例如，第一识别特征和第二识别特征可以被配置为与核酸条形码分子(例如，如本文所述)相互作用(例如，如本文所述，在分区中)，以产生使用例如核酸测序可检测的加条形码的核酸产物。
C.珠粒
分区可以包括一个或多个独特标识符，诸如条形码(例如，包含多个分区条形码序列的多个条形码核酸分子，其可以包括共同的(例如，分区特异性的)序列，如对于图4例如在段落321中参考(410)以及对于图3例如在段落318中参考元件(310)所述)。条形码可以预先、随后或同时递送到容纳隔室化或分隔生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的分区。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入到液滴中。将条形码递送到特定的分区允许稍后将单独的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的特征归属于特定的分区。条形码可以经由任何合适的机制例如在核酸分子(例如，寡核苷酸)上递送至分区。条形码核酸分子可以经由微胶囊递送到分区。在一些情况下，微胶囊可以包括珠粒。下文进一步详细描述珠粒。
在一些情况下，条形码核酸分子最初可以与微胶囊缔合，然后从微胶囊中释放。条形码核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。除此之外或替代性地，从微胶囊中释放可以是在施加刺激后发生的，该刺激允许条形码核酸分子解离或从微胶囊中释放。这种刺激可以破坏微胶囊，即，将条形码核酸分子偶联至微胶囊或偶联在微胶囊内或两者兼有的相互作用。这种刺激可以包括例如热刺激、光刺激、化学刺激(例如，pH变化或使用还原剂)、机械刺激、辐射刺激；生物刺激(例如，酶)或它们的任何组合。在以下专利中提供了用于将携带条形码的珠粒分隔到液滴中的方法和系统：美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173，以及国际申请号PCT/US2015/025197、PCT/US2020/017785和PCT/US2020/020486，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实例中，珠粒、生物颗粒和液滴可以沿通道(例如，微流体装置的通道)流动。在一些实例中，珠粒、生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)和液滴可以沿通道(例如，微流体装置的通道)流动，在一些情况下，以基本上规则的流动剖面(例如，以规则的流速)流动。此类规则流型可以允许液滴包括单个珠粒和单个生物颗粒。此类规则流型可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠粒和生物颗粒的液滴)。在例如美国专利公开号2015/0292988中提供了此类规则流型和可以用于提供此类规则流型的装置，该美国专利公开全文以引用方式并入本文。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或它们的任何组合。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的、可破坏的或可降解的。在一些情况下，珠粒可以不是可降解的。在一些情况下，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(诸如聚合物或单体物类)形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其他情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。
珠粒可以具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形的、圆形、圆柱形以及它们的变型。
珠粒可以具有一致的尺寸或非均一的尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可以为至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠粒可以具有小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠粒可以具有约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些方面，珠粒可以以具有相对单分散的尺寸分布的珠粒群体或多个珠粒的形式提供。在可能期望在分区内提供相对一致的量的试剂的情况下，维持相对一致的珠粒特性(诸如尺寸)可以有助于总体的一致性。具体地讲，本文所述的珠粒可以具有这样的尺寸分布，所述尺寸分布具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的珠粒横截面尺寸的变异系数。
珠粒可以包含天然的和/或合成的材料。例如，珠粒可以包含天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，诸如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、蚕丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、琼脂糖、藻酸、藻酸盐或它们的天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶(spandex)、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)，和/或它们的组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由除聚合物之外的材料形成，所述材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，珠粒可以含有分子前体(例如，单体或聚合物)，所述分子前体可以经由分子前体的聚合来形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经历进一步聚合(例如，经由化学交联键)的已经聚合的物类。在一些情况下，前体可以包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、寡聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可以包含预聚物，所述预聚物是能够进一步聚合的寡聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些情况下，珠粒可以含有可以进一步聚合在一起的单独聚合物。在一些情况下，可以经由不同前体的聚合来生成珠粒，使得它们包含混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，珠粒可以在聚合物前体(例如，单体、寡聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间包含共价键或离子键。在一些情况下，共价键可为碳-碳键、硫醚键或碳-杂原子键。
取决于所使用的特定交联剂，交联可以是永久的或可逆的。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联也可以允许结合于珠粒表面的材料的可逆连接。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键联的化学交联剂可以是胱胺或改性胱胺。
在一些情况下，二硫键联可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线型聚合物)或并入到珠中的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成。胱胺(包括经修饰的胱胺)例如是包含二硫键的有机剂，其可以用作珠粒的单独单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在存在胱胺或包含胱胺的物类(例如，经修饰的胱胺)的情况下聚合，以生成包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原的交联剂的可化学降解的珠粒)。二硫键可以在珠粒暴露于还原剂时允许珠粒被降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖(一种线性多糖聚合物)可以经由亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠粒可以包含acrydite部分，其在某些方面可以用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)连接至珠粒。在一些情况下，acrydite部分可以指由acrydite与一种或多种物类反应(诸如，在聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应)生成的acrydite类似物。可以修饰acrydite部分以与待连接的物类诸如核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)形成化学键。Acrydite部分可以用能够形成二硫键的巯基基团修饰，或者可以用已经包含二硫键的基团修饰。巯基或二硫键(通过二硫键交换)可以用作待连接的物类的锚定点，或者acrydite部分的另一部分可以用于连接。在一些情况下，连接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在存在还原剂的情况下)，连接的物类从珠粒释放。在其他情况下，acrydite部分可以包含可以用于连接的反应性羟基基团。
为连接核酸分子(例如，寡核苷酸)而对珠粒的功能化可以通过多种不同的方法来实现，包括聚合物内化学基团的活化、聚合物结构中活性或可激活的官能团的掺入，或者在珠粒产生的预聚物或单体阶段的连接。
例如，聚合以形成珠粒的前体(例如，单体、交联剂)可以包含acrydite部分，使得当生成珠粒时，该珠粒还包含acrydite部分。可以将acrydite部分连接至核酸分子(例如，寡核苷酸)，该核酸分子可以包括引物序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。一个或多个条形码序列可以包括对于偶联至给定珠粒的所有核酸分子而言相同的序列和/或在偶联至给定珠粒的所有核酸分子中不同的序列。可以将核酸分子掺入到珠粒中。
在一些情况下，核酸分子可以包含功能序列(例如用于连接至测序流通池)，例如用于测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，从核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一功能序列，例如用于连接至测序流通池以进行Illumina测序的P7序列。在一些情况下，核酸分子可以包含条形码序列。在一些情况下，引物还可以包含独特分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可以包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可以包含用于Illumina测序的R2引物序列。可以与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例提供于美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中，这些美国专利公开中的每一篇全文以引用方式并入本文。本文描述了加条形码的序列的产生过程，参见例如图3。
在一些情况下，可以将包含反应性的或能够被活化以使其变为反应性的官能团的前体与其他前体聚合，以生成包含活化或可活化的官能团的凝胶珠粒。然后，该官能团可以用于将附加物类(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)连接至凝胶珠粒。例如，一些包含羧酸(COOH)基团的前体可以与其他前体共聚，以形成还包含COOH官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物类)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可以共聚在一起以生成包含游离COOH基团的凝胶珠粒。可以活化凝胶珠粒的COOH基团(例如，经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM))，使得其是反应性的(例如，在EDC/NHS或DMTMM用于激活的情况下，对胺官能团是反应性的)。然后，活化的COOH基团可以与包含将要连接至珠粒的部分的适当物类(例如，在羧酸基团被活化而对胺官能团具有反应性的情况下，包含胺官能团的物类)反应。
可以通过使一些二硫键还原为游离巯基，将在其聚合物网络中包含二硫键的珠粒用附加物类功能化。可以通过例如还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用使二硫键还原以生成游离的巯基基团，而不溶解珠粒。然后，珠粒的游离巯基可以与物类的游离巯基或者与包含另一个二硫键的物类反应(例如，通过巯基-二硫键交换)，使得该物类可以连接至珠粒(例如，通过生成的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离巯基可以与任何其他合适的基团反应。例如，珠粒的游离巯基可以与包含acrydite部分的物类反应。珠粒的游离巯基基团可以通过迈克尔加成化学来与acrydite反应，使得包含acrydite的物类连接至珠粒。在一些情况下，可以通过加入巯基封端剂诸如N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmalieamide)和碘乙酸盐来防止不受控制的反应。
可以控制珠粒内的二硫键的活化，使得只有少量的二硫键被活化。可以例如通过控制用于生成游离巯基基团的还原剂的浓度和/或控制用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些情况下，低浓度(例如，还原剂:凝胶珠粒的分子比率小于或等于约1:100,000,000,000、小于或等于约1:10,000,000,000、小于或等于约1:1,000,000,000、小于或等于约1:100,000,000、小于或等于约1:10,000,000、小于或等于约1:1,000,000、小于或等于约1:100,000、小于或等于约1:10,000)的还原剂可以用于还原。控制被还原成游离巯基的二硫键的数量对于确保在功能化期间珠粒结构完整性可能是有用的。在一些情况下，光活性剂诸如荧光染料可以经由珠粒的游离巯基偶联至珠粒，并且用于定量珠粒中存在的游离巯基的数量和/或跟踪珠粒。
在一些情况下，在凝胶珠粒形成之后向凝胶珠粒添加部分可能是有利的。例如，在凝胶珠粒形成后添加寡核苷酸(例如加条形码的寡核苷酸，诸如加条形码的核酸分子)可以避免在聚合期间可能发生的链转移终止过程中的物质损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接的部分的单体或交联剂)可以用于聚合，并且可以最低限度地因粘滞效应而被阻碍生长链末端。在一些情况下，在凝胶珠粒合成之后的功能化可以使待负载的物类(例如，寡核苷酸)在潜在的损伤剂(例如，自由基)和/或化学环境中的暴露最小化。在一些情况下，所生成的凝胶可以具有上临界溶解温度(UCST)，该温度可以允许珠粒的温度驱动溶胀和塌缩。这种功能性可以在随后用寡核苷酸对珠粒的功能化期间帮助寡核苷酸(例如，引物)渗透到珠粒中。产生后的功能化还可以用于控制珠粒中物类的负载比，使得例如负载比的变异性最小化。物类负载还可以在分批过程中进行，使得多个珠粒可以在单批中用该物类功能化。
注入或以其他方式引入分区中的珠粒可以包含可释放地、可裂解地或可逆地附接的条形码(例如，分区条形码序列)。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以包含可活化的条形码。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以是可降解的、可破坏的或可溶解的珠粒。
条形码可以可释放地、可切割地或可逆地附着到珠，使得条形码可通过条形码分子与珠之间的键联的切割而释放或可释放，或通过下面的珠本身的降解而释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近或两者。在非限制性实例中，可以通过二硫键的还原、限制性酶的使用、光活化切割或经由其他类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶促等)切割和/或反应来实现切割，如本文中别处所述。可释放条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦被释放就可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
作为珠粒和缔合的分子诸如含有条形码的核酸分子(例如，条形码寡核苷酸)之间的可裂解的键的补充或替代，珠粒可以是自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物类或化学相、暴露于光、还原剂等)时可降解的、可破坏的或可溶解的。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，使得当暴露于特定化学物类或环境变化(诸如温度变化或pH变化)时，珠粒的材料组分溶解。在一些情况下，凝胶珠粒可以在升高的温度和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，热)时，珠粒降解。与物类(例如，核酸分子，例如条形码寡核苷酸)结合的珠粒的降解或溶解可以导致该物类从珠粒释放。
根据上述公开内容将会知道，珠粒的降解可以指结合的物质(例如，被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联的捕获剂)或夹带的物质(例如，标记的B细胞或浆细胞，或者分泌型抗体或其抗原结合片段)从珠粒上离解，伴随和不伴随物理珠粒自身的结构降解。例如，珠粒的降解可以涉及经由本文其他地方描述的一种或多种物类和/或方法使可裂解的键的裂解。在另一个实例中，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从珠粒释放。举例来说，通常可能在珠粒自身没有结构降解的情况下发生因渗透压差引起的珠粒孔径的改变。在一些情况下，因珠粒的渗透性溶胀引起的孔径的增加可以允许珠粒内夹带的物类释放。在其他情况下，由于孔径缩小，珠粒的渗透性收缩可以使珠粒更好地保持夹带的物类。
可以将可降解的珠粒引入到分区(诸如乳液的液滴或孔)中，使得当施加适当的刺激时，珠粒在分区内降解并且任何缔合的物类(例如，寡核苷酸)均被释放到液滴内。游离物类(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。例如，可以将包含胱胺且经由二硫键连接至条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒与还原剂在油包水乳液的液滴内组合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠粒降解并且将物质(例如，寡核苷酸、核酸分子、条形码序列)释放到液滴的水性内部环境中。在另一个实例中，将包含珠粒结合的条形码序列的液滴在碱性溶液中加热也可以导致珠粒降解和所附接的物质(例如，寡核苷酸、核酸分子、条形码序列)释放到液滴的水性内部环境中。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码寡核苷酸)都可以与珠粒缔合，使得从珠粒释放后，分子标签分子(例如，引物，例如条形码寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择这种预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以通过产生带有核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的过程来限制。
在一些情况下，珠粒可以非共价地负载有一种或多种试剂。可以通过例如以下方式非共价地负载珠粒：使珠粒经受足以溶胀珠粒的条件，使试剂有足够的时间扩散到珠粒内部中，以及使珠粒经受足以去溶胀珠粒的条件。珠粒的溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒置于热力学上有利的溶剂中，使珠粒经受较高或较低的温度，使珠粒经受较高或较低的离子浓度，和/或使珠粒经受电场。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法完成。珠粒的去溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒转移到热力学上不利的溶剂中，使珠粒经受较低或较高的温度，使珠粒经受较低或较高的离子浓度，和/或去除电场。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀方法完成。转移珠粒可能会导致珠粒中的孔收缩。然后，收缩可能会阻碍珠粒内的试剂扩散出珠粒的内部。该阻碍可能是由于试剂与珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以通过微流体完成。例如，转移可以通过将珠粒从一种协流溶剂流移动至不同协流溶剂流来实现。珠粒的可溶胀性和/或孔径可以通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
在一些情况下，连接至前体的acrydite部分、连接至前体的另一物类或前体自身可以包含不稳定键，诸如化学、热或光敏感的键，例如二硫键、UV敏感的键等。一旦acrydite部分或包含不稳定键的其他部分被掺入到珠粒中，该珠粒也可以包含该不稳定键。不稳定键可以例如在将物类(例如，条形码、引物等)可逆地连接(共价连接)至珠粒时是有用的。在一些情况下，热不稳定的键可以包括基于核酸杂交的连接(例如，在寡核苷酸与连接至珠粒的互补序列杂交的情况下)，使得杂交体的热解链从珠粒或微胶囊释放寡核苷酸，例如，含有条形码的序列。
向凝胶珠粒添加多种类型的不稳定键可以使得生成能够响应于不同刺激的珠粒。每种类型的不稳定键可能对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度、酶促等)敏感，使得可以通过施加适当的刺激来控制经由每种不稳定键连接至珠粒的物类的释放。这种功能性可能对物类从凝胶珠粒上的受控释放是有用的。在一些情况下，可以在凝胶珠粒形成后经由例如如上文所述的凝胶珠粒的活化官能团将包含不稳定键的另一物类连接至凝胶珠粒。应当理解，可释放地、可裂解地或可逆地连接至本文所述的珠粒的条形码包括通过条形码分子与珠粒之间的键的裂解而被释放或可释放的条形码，或通过基础珠粒自身的降解而被释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或两者。
如本文所述的可释放的条形码有时可以称为可活化的，因为其一旦被释放即可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
除了热可裂解的键、二硫键和UV敏感的键之外，可以偶联至前体或珠粒的不稳定键的其他非限制性实例还包括酯键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解的)、邻二醇键(例如，可经由高碘酸钠裂解的)、狄尔斯–阿尔德(Diels-Alder)键(例如，可经由热裂解的)、砜键(例如，可经由碱裂解的)、甲硅烷基醚键(例如，可经由酸裂解的)、糖苷键(例如，可经由淀粉酶裂解的)、肽键(例如，可经由蛋白酶裂解的)或磷酸二酯键(例如，可经由核酸酶(例如，DNA酶)裂解的)。可以经由其他核酸分子靶向酶诸如限制性酶(例如，限制性核酸内切酶)来裂解键，如下文进一步描述。
可以在珠粒产生期间(例如，在前体聚合期间)将物质包封在珠粒中(例如，捕获剂)。此类物类可以参与或可以不参与聚合。此类物类可以进入聚合反应混合物中，使得在珠粒形成时所生成的珠粒包含该物类。在一些情况下，此类物类可以在凝胶珠粒形成后添加至凝胶珠粒。此类物类可以包括例如核酸分子(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲液)(包括本文所述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于核酸修饰反应(诸如聚合、连接或消化)的试剂和/或用于一种或多种测序平台(例如，的/>)的模板制备(例如，标签片段化(tagmentation))的试剂。此类物类可以包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。此类物类可以包括本文其他地方所述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、灭活剂、螯合剂、刺激物)。此类物类的俘获可以通过在前体聚合期间生成的聚合物网络密度、凝胶珠粒内离子电荷的控制(例如，经由连接至聚合的物类的离子型物类)或通过其他物类的释放来控制。包封的物类可以在珠粒降解时和/或通过施加能够使物类从珠粒释放的刺激而从珠粒释放。另选地或此外，可以在分区形成期间或之后将物类分隔在分区(例如，液滴)中。此类物类可以包括但不限于也可以包封在珠粒中的上述物类。
可降解的珠粒可以包含一种或多种具有不稳定键的物类，使得当珠粒/物类暴露于适当的刺激时，该键被破坏并且珠粒降解。该不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)，或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于生成珠粒的交联剂可以包含不稳定键。在暴露于适当的条件时，不稳定键可以被破坏并且珠粒降解。例如，在包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可以被破坏并且珠粒降解。
当向珠粒施加适当的刺激时，与不降解的珠粒相比，可降解的珠粒可以用于更快地从珠粒释放连接的物类(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合于多孔珠粒内表面的物类或在包封的物类的情况下，在珠粒降解时，该物类可以具有更高的迁移性和对溶液中其他物类的易接近性。在一些情况下，还可以通过可降解的接头(例如，二硫化物接头)将物类连接至可降解的珠粒。可降解的接头可以与可降解的珠粒响应于相同的刺激，或者这两种可降解的物类可以响应于不同的刺激。例如，物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)可以经由二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠粒。在加条形码的珠粒暴露于还原剂时，一旦条形码序列与珠粒之间的二硫键以及珠粒中胱胺的二硫键均断裂，珠粒便降解，并且物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物)释出。
从上述公开内容将会理解，虽然称为珠粒的降解，但在许多上文提到的情况下，该降解可以指结合的或夹带的物类从珠粒上的离解，伴随和不伴随物理珠粒自身的结构降解。例如，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从珠粒释放。举例来说，通常可能在珠粒自身没有结构降解的情况下发生因渗透压差引起的珠粒孔径的改变。在一些情况下，因珠粒的渗透性溶胀引起的孔径的增加可以允许珠粒内夹带的物类释放。在其他情况下，由于孔径缩小，珠粒的渗透性收缩可以使珠粒更好地保持夹带的物类。
在提供可降解的珠粒的情况下，可能有利的是避免在给定时间之前将此类珠粒暴露于导致这种降解的一种或多种刺激，以便例如避免珠粒过早降解以及由这种降解所引发的问题，包括例如流动特性差和聚集。举例来说，在珠粒包含可还原的交联基团诸如二硫化物基团的情况下，将期望避免使此类珠粒与还原剂(例如，DTT或其他二硫键裂解试剂)接触。在此类情况下，对本文所述珠粒的处理在一些情况下将在无还原剂(诸如DTT)时提供。由于还原剂通常在商业酶制剂中提供，因此可能期望在处理本文所述的珠粒时提供无还原剂(或无DDT)的酶制剂。此类酶的实例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及许多其他可以用于处理本文所述的珠粒的酶制剂。术语“无还原剂的”或“无DTT的”制剂可以指具有在降解珠粒中使用的此类材料的下限范围的小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的制剂。例如，对于DTT，无还原剂的制剂可以具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可能是检测不到的。
许多化学触发物可以用于触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠粒内组分完整性变化、经由交联键的裂解发生的珠粒组分的降解以及珠粒组分的解聚。
在一些实施方案中，珠粒可以由包含可降解化学交联剂(诸如BAC或胱胺)的材料形成。此类可降解交联剂的降解可以通过多种机制实现。在一些实例中，可以使珠粒与可诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的附加实例可以包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或它们的组合。还原剂可以降解在形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，因此降解珠粒。在其他情况下，溶液pH的变化(诸如pH增加)可以触发珠粒的降解。在其他情况下，暴露于水溶液(诸如水)可以触发水解降解，因此降解珠粒。在一些情况下，刺激的任何组合都可以触发珠粒的降解。例如，pH的改变可以使化学剂(例如，DTT)能够成为有效的还原剂。
当施加热刺激时，也可以诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可以引起珠粒的多种变化。例如，热可以引起固体珠粒液化。热的变化可以引起珠粒的熔化，使得珠粒的一部分降解。在其他情况下，热可以增加珠粒组分的内部压力，使得珠粒破裂或爆炸。热还可以作用于用作构建珠粒的材料的热敏性聚合物。
任何合适的试剂都可以降解珠粒。在一些实施方案中，温度或pH的变化可以用于降解珠粒内的热敏的或pH敏感的键。在一些实施方案中，化学降解剂可以用于通过氧化、还原或其他化学变化来降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如DTT，其中DTT可以降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在一些实施方案中，可以添加还原剂以降解珠粒，这可以引起或可以不引起珠粒释放其内容物。还原剂的实例可以包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或它们的组合。还原剂可以以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码寡核苷酸)都可以与珠粒缔合，使得从珠粒释放后，分子标签分子(例如，引物，例如条形码寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择这种预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以通过产生带有寡核苷酸的珠粒的过程来限制。
尽管上文已经在提供基本上被单独占据的分区方面描述了图1和图2，但是在某些情况下，可能期望提供被多重占据的分区，例如，其在单个分区内含有两个、三个、四个或更多个包含条形码核酸分子(例如，寡核苷酸)的细胞和/或微胶囊(例如，珠粒)(例如，本文别处描述的多组学方法)。因此，如上所述，可以控制含有生物颗粒和/或珠粒的流体和分隔流体的流动特性，以提供此类多重占据的分区。具体地讲，可以控制流动参数，以提供大于约50％、大于约75％并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高百分比的分区的给定占据率。
在一些情况下，可以使用附加微胶囊将附加试剂递送到分区。在此类情况下，可能有利的是从不同的珠粒来源(例如，含有不同的相关试剂)通过进入共同通道或液滴产生汇合部的不同通道入口，将不同的珠粒引入这种共同通道或液滴产生汇合部中。在此类情况下，可以控制不同珠粒进入该通道或连接部中的流动和频率，以提供特定比率的来自每个来源的微胶囊，同时确保此类珠粒的给定配对和组合与给定数量的生物颗粒一起进入分区(例如，每个分区有一个生物颗粒和一个珠粒)。
本文所述的分区可以具有小体积，例如，小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小的体积。
例如，在基于液滴的分区的情况下，液滴的总体积可以小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更少。在与微胶囊共同分隔的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积(例如，包括共同分隔的生物颗粒和/或珠粒)可以小于上述体积的约90％、小于上述体积的约80％、小于上述体积的约70％、小于上述体积的约60％、小于上述体积的约50％、小于上述体积的约40％、小于上述体积的约30％、小于上述体积的约20％，或小于上述体积的约10％。
如本文其他地方所描述的，分隔的物类可以生成群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其他方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，所述多个分区可以包括未被占据的分区(例如，空的分区)和被占据的分区。
D.试剂
根据某些方面，可以将生物颗粒连同裂解试剂一起分隔，以释放该分区内的生物颗粒的内容物。参见例如美国专利公开2018/0216162(现为美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，以及美国专利公开2019/0233878，这些专利公开全文以引用方式并入本文。细胞珠粒可以连同核酸条形码分子一起分隔，并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子(例如，mRNA、cDNA、gDNA、分泌型抗体或其抗原结合片段等)可以如本文别处所述加条形码。在一些实施方案中，细胞珠粒与携带条形码的珠粒(例如，凝胶珠粒)共同分隔，并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子如本文别处所述加条形码。在此类情况下，裂解剂可以在诸如通过通道汇合部上游的一个或多个附加通道将生物颗粒引入分隔汇合部/液滴生成区中的同时或即将发生该引入之前与生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)悬液接触。根据其他方面，附加地或另选地，生物颗粒可以连同其他试剂一起分隔，如将在下文进一步描述。
有益地，当裂解试剂和生物颗粒被共分隔时，裂解试剂可促进隔室内生物颗粒的内容物的释放。分区中释放的内容物可以与其他分区的内容物保持离散。
应当理解，本文所述的通道段可以联接至多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。应当理解，微流体通道结构可以具有其他几何形状和/或构造。例如，微流体通道结构可以具有超过两个通道连接部。例如，微流体通道结构可以具有各自携带相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒的2、3、4、5个或更多个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。可以控制每个通道段中的流体流动，以控制将不同元素分隔到液滴中。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(StLouis,MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。其他裂解剂可以附加地或另选地与生物颗粒共同分隔，以引起生物颗粒的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液将细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)裂解，但是对于其中表面活性剂可能干扰稳定乳液的基于乳液的体系而言，这些溶液可能不太理想。在某些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，诸如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破坏也可以用于某些情况，例如基于非乳液的分隔，诸如生物颗粒的包封，其可以作为液滴分隔的补充或替代，其中在细胞破坏后包封物的任何孔径足够小到保留给定大小的核酸片段。
作为与上述生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)共同分隔的裂解剂的替代或补充，其他试剂也可以与生物颗粒共同分隔，包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂，诸如蛋白酶K、螯合剂(诸如EDTA)，以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对后续核酸加工的负活性或影响的其他试剂。此外，就包封的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)而言，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激，以从共同分隔的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以与包封的生物颗粒一起被共同分隔以允许微胶囊降解以及细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，该刺激可以与本文其他地方所述的用于从其相应微胶囊(例如，珠粒)释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在另选方面，这可以是不同且不重叠的刺激，以便允许包封的生物颗粒在与将核酸分子释放到相同分区中的不同时间释放到分区中。
附加试剂(诸如核酸内切酶)也可以与生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)共同分隔，以使生物颗粒的DNA、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段的dNTP片段化，并且将条形码分子标签附接到扩增的片段。可以共同分隔其他酶，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。附加试剂还可以包括逆转录酶(包括具有末端转移酶活性的酶)、引物和寡核苷酸以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(本文也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可以用于将预定义的核酸序列补加至cDNA。在模板转换的实例中，cDNA可以由模板(例如细胞mRNA)的逆转录生成，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以不依赖模板的方式向cDNA添加附加核苷酸，例如多聚C。转换寡核苷酸可以包括与附加核苷酸互补的序列，例如多聚G。cDNA上的附加核苷酸(例如，多聚C)可以与转换寡核苷酸上的附加核苷酸(例如，多聚G)杂交，由此逆转录酶可以将转换寡核苷酸用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可以包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所述，杂交区包含一系列G碱基，以与cDNA分子的3’末端的悬垂C碱基互补。该系列G碱基可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或超过5个G碱基。模板序列可以包含要掺入到cDNA中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；经修饰的核酸，包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、倒位dT、5-甲基dC、2’-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2’氟代碱基(例如，氟代C、氟代U、氟代A和氟代G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)的内容物释放到它们各自的分区中，就可以在分区内进一步加工其中包含的大分子组分(例如生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA、蛋白质，或者分泌型抗体或其抗原结合片段)。根据本文所述的方法和系统，可以为单独的生物颗粒的大分子组分内容物(例如，标记的B细胞或浆细胞)提供独特标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可以被归属为源自一个或多个相同的生物颗粒。通过将独特标识符特异性地分配给单独生物颗粒或生物颗粒群来提供将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒群的能力。可以为单独生物颗粒或生物颗粒群分配或关联例如核酸条形码形式的独特标识符，以便用独特标识符加标签于或标记生物颗粒的大分子组分(及因此其特征)。然后，这些独特标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独的生物颗粒或成群的生物颗粒。
在一些方面，这是通过将单独的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)或成群的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)与独特标识符(诸如如上所述(参考图1和图2))共同分隔来进行的。在一些方面，以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供独特标识符，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以与单独生物颗粒的核酸内容物连接或以其他方式相关联，或与生物颗粒的其他组分连接，特别是与这些核酸的片段连接。核酸分子被分隔，使得在给定分区中的核酸分子之间时，包含在其中的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分区之间时，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表在给定分析中所有分区中的大量不同的条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可以与给定分区相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包含约6至约20个或更多个核苷酸。核酸条形码序列可以包含约6至约20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共同分隔的核酸分子还可以包含可用于加工来自共同分隔的生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，以用于扩增来自分区内单独生物颗粒的基因组DNA，同时连接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴定这些序列的存在或用于下拉条形码化核酸或许多其他潜在功能序列中的任何一个。也可以采用共同分隔寡核苷酸的其他机制，包括例如使两个或更多个液滴(其中一个液滴包含寡核苷酸)聚结，或将寡核苷酸微分散到分区(例如微流体系统内的液滴)中。
在一个实例中，提供了微胶囊(诸如珠粒)，其各自包括大量可释放地连接至珠粒的上述条形码核酸分子(例如，条形码寡核苷酸)，其中连接至特定珠粒的所有核酸分子将包括相同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中代表了大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质的水凝胶珠粒用作核酸分子进入分区的固相支持物和递送媒介，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以被构造为在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子，如本文其他地方所述。在一些情况下，珠的群提供包括至少约1,000个不同条形码序列、至少约5,000个不同条形码序列、至少约10,000个不同条形码序列、至少约50,000个不同条形码序列、至少约100,000个不同条形码序列、至少约1,000,000个不同条形码序列、至少约5,000,000个不同条形码序列、或至少约10,000,000个不同条形码序列或更多的多样化条形码序列文库。另外，每个珠可提供有附着的大量核酸(例如，寡核苷酸)分子。特别地，单独的珠上包含条形码序列的核酸分子的分子数量可为至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠的核酸分子可包括相同(或共有)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可以包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可以包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可以不同于另一组核酸分子的条形码序列。
此外，当对珠粒群体进行分隔时，所得的分区群体也可以包括多样的条形码文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，该群体的每个分区可以包括至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子，并且在一些情况下，至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码掺入到给定分区中，这些条形码连接至分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在后续处理中提供更大的鉴别保证，例如，通过提供条形码至给定分区的更强地址或归属，作为给定分区的输出的重复确认或独立确认。
在向珠粒施加特定刺激时，核酸分子(例如，寡核苷酸)可从珠粒释放。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放核酸分子。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将使得核酸分子从珠粒发生键的裂解或其他释放。在其他情况下，可以使用化学刺激，该化学刺激裂解核酸分子与珠粒的键，或以其他方式使得核酸分子从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如DTT)而降解以释放连接的核酸分子。
在一些方面，提供了用于受控分隔的系统和方法。可以通过调节通道体系结构(例如，微流体通道体系结构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的扩展角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图2示出了用于将珠粒受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构200可以包括通道段202，该通道段在通道连接部206(或相交处)处与储库204连通。储库204可以是室。如本文所用，对“储库”的任何引用也可以指“室”。在操作中，包含悬浮珠粒212的水性流体208可以沿着通道段202运输到连接部206中，以遇到与储库204中的水性流体208不混溶的第二流体210，从而产生流入储库204中的水性流体208的液滴216、218。在水性流体208和第二流体210相遇的连接部206，可以基于诸如在连接部206的流体动力、两种流体208、210的流速、流体特性和通道结构200的某些几何参数(例如，w、h0、α等)来形成液滴。通过从通道段202经连接部206连续地注入水性流体208，可以在储库204中收集多个液滴。
所生成的离散液滴可以包括珠粒(例如，如在被占据的液滴216中一样)。另选地，所生成的离散液滴可以包括超过一个珠粒。另选地，所生成的离散液滴可以不包括任何珠粒(例如，如在未被占据的液滴218中一样)。在一些情况下，所生成的离散液滴可以含有一个或多个生物颗粒，如本文其他地方所述。在一些情况下，所生成的离散液滴可以包含一种或多种试剂，如本文其他地方所述。
在一些情况下，水性流体208可以具有基本上一致的浓度或频率的珠粒212。珠粒212可以从单独的通道(图2中未示出)引入到通道段202中。可以通过控制将珠粒212引入到通道段202中的频率和/或通道段202和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段202中的珠粒212的频率。在一些情况下，可以将珠粒从多个不同的通道引入到通道段202中，并且相应地控制频率。
在一些情况下，通道段202中的水性流体208可以包含生物颗粒(例如，参照图1所描述)。在一些情况下，水性流体208可以具有基本上一致的浓度或频率的生物颗粒。与珠粒一样，可以将生物颗粒(例如，标记的B细胞或浆细胞)从单独的通道引入通道段202中。可以通过控制将生物颗粒引入到通道段202中的频率和/或通道段202和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段202中的水性流体208中的生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下，可以将生物颗粒从多个不同的通道引入到通道段202中，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可以将珠粒引入到通道段202中，并且第二单独通道可以将生物颗粒引入到该通道段中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体210可以包含油，诸如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴的后续聚结)的氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体210可以不经受和/或不被引导至流入或流出储库204的任何流动。例如，第二流体210可以在储库204中基本上静止。在一些情况下，第二流体210可以诸如通过向储库204施加压力和/或受连接部206处的水性流体208的来流影响而经受在储库204内流动，但不流入或流出储库204。另选地，第二流体210可以经受和/或被引导至流入或流出储库204。例如，储库204可以是将第二流体210从上游引导到下游的通道，从而运输所生成的液滴。
在连接部206处或附近的通道结构200可以具有某些几何特征，其至少部分地确定由通道结构200形成的液滴的尺寸。通道段202可以在连接部206处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说，通道段202可以具有矩形横截面，该矩形横截面通向具有较宽横截面(诸如在宽度或直径上)的储库204。另选地，通道段202的横截面可以是其他形状，例如圆形形状、梯形形状、多边形形状或任何其他形状。在连接部206处或附近的储库204的顶壁和底壁可以以扩展角α倾斜。扩展角α允许舌状物(在连接部206处离开通道段202并在液滴形成之前进入储库204的水性流体208的部分)增加深度并且促进减小中间形成的液滴的曲率。液滴尺寸可能会随着扩展角的增加而减小。可以通过上述h0、w和α几何参数的以下方程预测最终的液滴半径Rd：
举例来说，对于w＝21μm、h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm、h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测的液滴尺寸为123μm。在另一个实例中，对于w＝28μm、h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测的液滴尺寸为124μm。
在一些情况下，扩展角α可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围内。例如，扩展角可以为至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩展角可以为至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可以在约100微米(μm)至约500μm的范围内。在一些情况下，宽度w可以在约10μm至约200μm的范围内。另选地，宽度可以小于约10μm。另选地，宽度可以大于约500μm。在一些情况下，进入连接部206的水性流体208的流速可以介于约0.04微升(μL)/分钟(min)与约40μL/min之间。在一些情况下，进入连接部206的水性流体208的流速可以介于约0.01微升(μL)/分钟(min)与约100μL/min之间。另选地，进入连接部206的水性流体208的流速可以小于约0.01μL/min。另选地，进入连接部206的水性流体208的流速可以大于约40μL/min，诸如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速(诸如约小于或等于10微升/分钟的流速)下，液滴半径可能不取决于进入连接部206的水性流体208的流速。
在一些情况下，所生成的至少约50％的液滴可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的液滴可以具有一致的尺寸。另选地，所生成的小于约50％的液滴可以具有一致的尺寸。
液滴生成的通量可以通过增加生成点来增加，例如增加水性流体208的通道段(例如，通道段202)和储库204之间的连接部(例如，连接部206)的数量。另选地或此外，液滴生成的通量可以通过增加通道段202中的水性流体208的流速来增加。
本文所述的方法和系统可以用于极大地提高单细胞应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。例如，在分选被占据的细胞和/或适当大小的细胞之后，可以执行的后续操作可以包括生成扩增产物、纯化(例如，经由固相可逆固定化(SPRI))、进一步的处理(例如，功能序列的剪切、连接以及随后的扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的液滴的情况下，乳液可以被破坏并且液滴的内容物被合并以用于附加操作。可以与带有条形码的珠粒一起共同分隔的附加试剂可以包括用于封闭核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和用于消化细胞中的基因组DNA的核酸酶。另选地，可以在附加处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这种方法生成的构建体的构型可以帮助在测序期间最小化(或避免)多聚T序列的测序和/或对多核苷酸序列的5’端进行测序。可以对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用部分发夹式测序扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全性测试、例如在污染物溯源中的流行病学分析等。
包含与条形码分子缔合的条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)和包封细胞成分(诸如细胞核酸)的珠粒(例如，细胞珠粒)的分区可以用于成分分析，如美国专利公开号2018/0216162中所述，该专利公开全文以引用方式并入本文用于所有目的。
E.微孔
如本文所述，一个或多个过程可以在分区中执行，该分区可以是孔。孔可以是基底的多个孔中的孔，例如微孔阵列或板的微孔，或者孔可以是包含基底的装置(例如，微流体装置)的微孔或微腔室。孔可以是孔阵列或板的孔，或者孔可以是装置(例如，流体装置)的孔或腔室。相应地，孔或微孔可以采取“开放”配置，其中孔或微孔暴露于环境(例如，含有开放表面)，并且在基底的一个平面表面上是可接近的，或者孔或微孔可以采取“关闭”或“密封”配置，其中微孔在基底的平面表面上是不可接近的。在一些情况下，孔或微孔可以配置为在“开放”和“关闭”配置之间切换。例如，一个“开放”微孔或一组微孔可以使用膜(例如，半透膜)、油(例如，覆盖水溶液的氟化油)或盖子进行“关闭”或“密封”，如本文其它地方所述。孔或微孔最初可以以“关闭”或“密封”配置提供，其中如果没有外力，它们在基底的平面表面上是不可接近的。例如，“关闭”或“密封”配置可以包括基底例如密封膜或箔，其可通过移液管吸头刺穿或穿透。用于基底的合适材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯基和铝箔。
该孔可以具有小于1毫升(mL)的体积。例如，孔可以配置为容纳最多1000微升(μL)、最多100μL、最多10μL、最多1μL、最多100纳升(nL)、最多10nL、最多1nL、最多100皮升(pL)、最多10(pL)或更少的体积。孔可以配置为容纳约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等的体积。孔可以配置为容纳至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更多的体积。孔可以配置为容纳在本文中列出的体积范围内的体积，例如，约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。孔可以是具有不同体积的多个孔，并且可以配置为容纳适合容纳本文所述的任何隔室体积的体积。
在一些情况下，微孔阵列或板包括单一种类的微孔。在一些情况下，微孔阵列或板包括各种各样的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括在单个微孔阵列或板内的一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同的尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、长宽比或其它物理特性。微孔阵列或板可以包括任何数量的不同类型的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其它多边形等)、长宽比或本文关于任何孔描述的其它物理特性。
在某些情况下，微孔阵列或板包括在阵列或板内彼此相邻定位的不同类型的微孔。例如，具有一组尺寸的微孔可以与具有一组不同尺寸的另一个微孔相邻并接触定位。类似地，不同几何形状的微孔可以彼此相邻或接触放置。相邻的微孔可以被配置为容纳不同的物品；例如，一个微孔可以用于容纳细胞、细胞珠粒或其他样品(例如，细胞组分、核酸分子等)，而相邻微孔可以用于容纳微胶囊、液滴、珠粒或其他试剂。在一些情况下，相邻的微孔可以被配置为例如在施加刺激时或自发地在接触每个微孔中的物品时将保持在其中的内容物融合。
如本文中别处所述，在本文描述的系统、组合物和方法中可使用多个隔室。例如，可以生成或以其它方式提供任何合适数目的分隔(例如，孔或液滴)。例如，在使用孔时的情况下，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多个孔。此外，多个孔可以包括未被占据的孔(例如，空孔)和占据的孔两者。
孔可以包括本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子，以及它们的组合。试剂可以与置于孔中的样品(例如细胞、细胞珠粒或细胞组分，例如蛋白质、核酸分子等)物理分离。这种物理分离可以通过将试剂包含在置于孔内的微胶囊或珠粒内或者与置于孔内的微胶囊或珠粒偶联来实现。这种物理分离也可以通过在孔中分配试剂并且在将多核苷酸样品引入孔中之前用例如可溶解、可融化或可渗透的层覆盖试剂来实现。该层可以是例如油、蜡、膜(例如，半透膜)等。孔可以在任何时间点密封，例如，在添加微胶囊或珠粒之后、在添加试剂之后，或者在添加这些组分中的任一种之后。孔的密封可以用于多种目的，包括防止珠粒或装载的试剂从孔中逸出、允许选择性递送某些试剂(例如，经由使用半透膜)、在进一步加工之前或之后将孔储存好，等等。
孔可以包含游离试剂，以及/或者包封在微胶囊、珠粒或液滴中，或以其他方式与微胶囊、珠粒或液滴偶联或缔合的试剂。本公开中所述的任何试剂可以与任何化学物质、颗粒和适用于涉及生物分子的样品加工反应的元素一起包封在微胶囊、液滴或珠粒中或者以其他方式与微胶囊、液滴或珠粒偶联，其中生物分子诸如但不限于核酸分子和蛋白质。例如，在用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠粒或液滴可以包含一种或多种以下试剂：酶、限制性酶(例如，多重切割酶)、连接酶、聚合酶、荧光团、报告条形码序列、衔接子、缓冲剂、核苷酸(例如，dNTP、ddNTP)等等。
试剂的附加实例包括但不限于：缓冲剂、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏感酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲剂、温和缓冲剂、离子缓冲剂、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖类、脂质、油、盐、离子、去污剂、离子去污剂、非离子去污剂、寡核苷酸、核苷酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、双脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微RNA、dsRNA、核酶、核糖开关和病毒RNA、聚合酶、连接酶、限制酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、荧光团、探针、发色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、小分子、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适体和药品化合物。如本文所述，孔中的一种或多种试剂可以用于进行一种或多种反应，包括但不限于：细胞裂解、细胞固定、透化、核酸反应(例如核酸延伸反应)、扩增、逆转录、转座酶反应(例如，标签片段化)等。
孔可以作为套件的一部分提供。例如，套件可以包括使用说明、微孔阵列或装置，以及试剂(例如，珠粒)。该套件可以包括用于进行本文所述过程的任何有用的试剂，这些过程例如核酸反应、为核酸分子加条形码、样品加工(例如，用于细胞裂解、固定和/或透化)。
在一些情况下，孔包括微胶囊、珠粒或液滴，该微胶囊、珠粒或液滴包含具有相似属性的一组试剂(例如，一组酶、一组矿物质、一组寡核苷酸、不同条形码分子的混合物、相同条形码分子的混合物)。在其他情况下，微胶囊、珠粒或液滴包含试剂的非均质混合物。在一些情况下，试剂的非均质混合物可以包含进行反应所必需的所有组分。在一些情况下，这样的混合物可以包含进行反应所必需的所有组分，但进行反应所必需的1、2、3、4、5种或更多种组分除外。在一些情况下，此类附加组分包含在不同的微胶囊、液滴或珠粒内或者以其他方式与不同的微胶囊、液滴或珠粒偶联，或者包含在系统的分区(例如，微孔)内的溶液中。
图5示意性地展示了微孔阵列的一个实例。该阵列可以容纳在基板500内。基板500包括多个孔502。孔1002可以具有任何尺寸或形状，并且孔之间的间距、每个基板中孔的数量以及基板500上的孔密度可以根据具体应用而改变。在一个这样的示例应用中，可以包含细胞或细胞组分(例如，核酸分子)的样品分子506与珠粒504共同分隔，该珠粒可以包括与其偶联的核酸条形码分子。孔502可以使用重力或其他装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电子器件等)来装载。在一些情况下，至少一个孔502包含单个样品分子506(例如，细胞)和单个珠粒504。
试剂可以依次或同时装载到孔中。在一些情况下，试剂在特定操作之前或之后被引入装置中。在一些情况下，试剂(在某些情况下，能够以微胶囊、液滴或珠粒的形式提供)被依次引入，使得不同的反应或操作在不同的步骤发生。试剂(或微胶囊、液滴或珠粒)也可以在穿插有反应或操作步骤的操作中装载。例如，可以将包含用于使多核苷酸片段化的试剂(例如，限制性酶)和/或其他酶(例如，转座酶、连接酶、聚合酶等)的微胶囊(或者液滴或珠粒)装载到一个或多个孔中，随后装载包含用于将核酸条形码分子附接到样品核酸分子的试剂的微胶囊、液滴或珠粒。试剂可以与样品例如细胞或细胞组分(例如，细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等)同时或依次提供。因此，在进行多步操作或反应时，使用孔可能是有用的。
如本文别处所述，核酸条形码分子和其他试剂可以包含在微胶囊、珠粒或液滴内。这些微胶囊、珠粒或液滴可以在装载细胞之前、之后或装载细胞的同时装载到分区(例如，微孔)中，使得每个细胞与不同的微胶囊、珠粒或液滴接触。该技术可以用于将独特的核酸条形码分子附接到从每个细胞获得的核酸分子上。替代性地或除此之外，样品核酸分子可以附接到支持物。例如，分隔(例如微孔)可以包括珠，其具有与之联接的多个核酸条形码分子。样品核酸分子或其衍生物可以联接或附着到支持物上的核酸条形码分子。然后可以将所得加有条形码的核酸分子从隔室取出，并且在一些情况下，合并并测序。在此类情况下，核酸条形码序列可以用于追踪样品核酸分子的来源。例如，具有相同条形码的多核苷酸可以被确定来源于相同的细胞或分区，而具有不同条形码的多核苷酸可以被确定来源于不同的细胞或分区。
可以使用多种方法将样品或试剂装载到孔或微孔中。样品(例如，细胞、细胞珠粒或细胞组分)或试剂(如本文所述)可以使用外力(例如，重力、电力、磁力)或使用驱动样品或试剂进入孔中的机构(例如，经由压力驱动流动、离心、光电子器件、声学装载、动电泵送、真空、毛细流动等)装载到孔或微孔中。在某些情况下，可以使用流体处理系统将样品或试剂装载到孔中。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松的。可以修改微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和大小以适应有用的样品或试剂分布；例如，可以调节微孔的大小和间距，使得样品或试剂能够以超泊松方式分布。
在一个特定的非限制性实例中，微孔阵列或微孔板包括成对的微孔，其中每对微孔被配置为容纳液滴(例如，包含单细胞)和单个珠粒(诸如本文所述的那些，其在一些情况下也可以被包封在液滴中)。液滴和珠粒(或包含珠粒的液滴)可以同时或依次装载，并且液滴和珠粒可以融合，例如，在液滴与珠粒接触时，或者在施加刺激(例如，外力、搅拌、热、光、磁力或电力等)时。在一些情况下，液滴和珠的装载是超泊松的。在微孔对的其他实例中，孔配置为容纳包含不同试剂和/或样品的两个液滴，其在接触时或在施加刺激时融合。在这样的情况下，该对中的一个微孔的液滴可包含可以与该对中的另一个微孔的液滴中的剂反应的试剂。例如，一个液滴可包含配置为释放位于相邻微孔中的另一个液滴中包含的珠的核酸条形码分子的试剂。在液滴融合时，核酸条形码分子可以从珠粒释放到分区(例如，微孔或接触的微孔对)中，并且可以进行进一步的加工(例如，加条形码、核酸反应等)。在完整细胞或活细胞被装载于微孔中的情况下，其中一个液滴可以包含用于在液滴融合时将细胞裂解的裂解试剂。
液滴或微胶囊可以被分隔到一个孔中。液滴可以在装载到孔中之前进行选择或经受预处理。例如，液滴可以包含细胞，并且只有某些液滴(诸如包含单细胞(或至少一个细胞)的那些液滴)可以被选择用于装载孔。这种预选过程可以用于有效装载单细胞，诸如以获得非泊松分布，或者在孔中进一步分隔之前预过滤具有选定特征的细胞。此外，该技术可以用于在装载微孔之前或期间获得细胞双联体或多重体，或者防止形成细胞双联体或多重体。
在一些情况下，孔可以包含附接到其上的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以附着到孔的表面(例如，孔的壁)。一个孔的核酸条形码分子(例如，隔室条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，这可允许单个隔室或孔内所含内容物的鉴定。在一些情况下，核酸条形码分子可包含空间条形码序列，其可鉴定孔例如在孔阵列或孔板内的空间坐标。在一些情况下，核酸条形码分子可以包括用于识别个体分子的独特分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以被配置为附接到或捕获分布在孔中的样品或细胞内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可以包含捕获序列，该捕获序列可以用于捕获样品内的核酸分子(例如，RNA、DNA)或者与该核酸分子杂交。在一些情况下，核酸条形码分子可以从微孔释放。例如，核酸条形码分子可以包含化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光刺激、磁刺激、化学刺激、生物刺激)时被切割。可以将释放的核酸条形码分子(其可以与样品核酸分子杂交或被配置为与样品核酸分子杂交)收集起来合并用于进一步的加工，该进一步的加工可以包括核酸加工(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在此类情况下，独特的分区条形码序列可以用于识别核酸分子来源的细胞或分区。
可以对孔内的样品进行表征。在非限制性实例中，这种表征可以包括对样品(例如，细胞、细胞珠粒或细胞组分)或其衍生物成像。表征技术(诸如显微镜法或成像)可以用于测量固定空间位置中的样品剖面。例如，当细胞被分隔时，任选地与珠粒一起分隔时，对每个微孔和其中容纳的内容物成像可以提供关于以下各项的有用信息：细胞双联体形成(例如，频率、空间位置等)、细胞-珠粒对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态、生物标志物(例如，表面标志物、其中的荧光标记分子等)的表达水平、细胞或珠粒装载速率、细胞-珠粒对的数量，等等。在一些情况下，成像可以用于表征孔中的活细胞，包括但不限于：动态活细胞追踪、细胞-细胞相互作用(当两个或更多个细胞被共同分隔时)、细胞增殖，等等。可替代地或另外，成像可以用于表征孔中的大量扩增产物。
在操作中，孔可以同时或依次装载样品和试剂。在装载细胞或细胞珠粒时，可以对孔进行清洗，例如以从孔、微孔阵列或微孔板中去除过量的细胞。类似地，可以进行清洗以从孔、微孔阵列或微孔板中去除多余的珠粒或其他试剂。在使用活细胞的情况下，这些细胞可以在各个分区中裂解，以释放细胞内组分或细胞分析物。替代性地，细胞可以在各个分区中固定或透化。细胞内组分或细胞分析物可以与支持物偶联，例如在微孔的表面上、在固体支持物(例如，珠粒)上，或者它们可以被收集用于进一步的下游加工。例如，在细胞裂解后，可以将细胞内组分或细胞分析物转移到各个液滴或其他隔室以便加条形码。或者或另外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以与包含核酸条形码分子的珠联接；随后，可以收集珠并进一步加工，例如经受核酸反应如逆转录、扩增或延伸，并且可以例如经由测序来进一步表征其上的核酸分子。或者或另外，可以在孔中对细胞内组分或细胞分析物加条形码(例如，使用包含可释放的核酸条形码分子的珠或在包含核酸条形码分子的微孔的表面上)。加有条形码的核酸分子或分析物可以在孔中进一步加工，或者加有条形码的核酸分子或分析物可以从各个隔室收集并在隔室外经受进一步加工。进一步加工可以包括核酸加工(例如，执行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何方便或有用的步骤中，可以将孔(或者微孔阵列或微孔板)密封(例如，使用油、膜、蜡等)，这使得能够储存测定或选择性地引入附加试剂。
孔一旦被密封，就可以经受进一步加工孔中的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的条件。例如，孔中的试剂可以允许对生物颗粒进行进一步的加工，例如将细胞或细胞核裂解，如本文进一步描述的。替代性地，包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的孔(或多个孔，诸如基于孔的阵列中的那些孔)可以经受冷冻-解冻循环以对生物颗粒进行加工，例如将细胞或细胞核裂解。含有生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的孔可以经受冷冻温度(例如，0℃、低于0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-80℃，或者-85℃)。冷冻能够以合适的方式进行，例如零度以下的冷冻器或干冰/乙醇浴。在初始冷冻后，可以使包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、一个或多个细胞核)的孔(或多个孔)经受冷冻-解冻循环，以将生物颗粒裂解。在一个实施方案中，将最初冷冻的孔(或多个孔)解冻至高于冷冻温度的温度(例如，室温或25℃)。在另一个实施方案中，冷冻时间少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)，之后在室温下的解冻时间少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)。该冷冻-解冻循环可以重复多次，例如2、3或4次，以在孔(或多个孔)中获得生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、一个或多个细胞核)的裂解物。在一个实施方案中，冷冻、解冻和/或冷冻/解冻循环在没有裂解缓冲液的情况下进行。WO2019165181A1中提供了与冷冻-解冻循环有关的附加公开内容，该专利全文以引用方式并入本文。
图6示意性地示出了用于加工样品内的核酸分子的示例工作流程。可以提供包括多个微孔602的基板600。可以包含细胞、细胞珠粒、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品606可以在多个微孔602中与包含核酸条形码分子的多个珠粒604一起被共同分隔。在过程610期间，样品606可以在分区内加工。例如，就活细胞而言，细胞可以经受足以使细胞裂解并释放其中所包含的分析物的条件。在过程620中，珠粒604可以被进一步加工。举例来说，过程620a和620b示意性地展示了不同的工作流程，具体取决于珠粒604的特性。
在620a中，珠粒包括附接到其上的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由连接杂交而附接到核酸条形码分子。这种附接可以发生在珠粒上。此类珠粒可以是实心珠粒或磁性珠粒，以允许从微孔阵列中移除。在过程630中，可以从多个孔602收集珠粒604加以合并。可以在过程640中执行进一步加工。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些实施方案中，使用经由珠粒上的核酸条形码分子在珠粒上捕获的样品核酸分子(例如，与珠粒上的核酸条形码分子的互补序列杂交的样品核酸分子)，在珠粒上发生一个或多个反应。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文中别处所述。例如，测序引物序列可以补加到核酸分子的每一端。在过程650中，可以进行进一步的表征(诸如测序)，以产生测序读段。这些测序读段可以产生关于单独的细胞或细胞群体的信息，该信息可以例如在图655中以视觉或图形方式呈现。
在620b中，珠粒包含可释放地附接到其上的核酸条形码分子，如下文所述。珠粒可以降解或以其他方式将核酸条形码分子释放到孔602中；然后，核酸条形码分子可以用于对孔602内的核酸分子加条形码。进一步的加工可以在分区内部或分区外部执行。例如，可以进行一种或多种核酸反应，如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文中别处所述。例如，测序引物序列可以补加到核酸分子的每一端。在过程650中，可以进行进一步的表征(诸如测序)，以产生测序读段。这些测序读段可以产生关于单独的细胞或细胞群体的信息，该信息可以例如在图655中以视觉或图形方式呈现。
VII.检测和分析
A.产生加条形码的分子
在使用例如采用Illumina测序仪产生的测序读段分析条形码时，如本文所述的条形码可以用于将一种或多种分析物(例如，分泌型分子或细胞核苷酸序列，诸如mRNA)与细胞和/或分区(例如，液滴或孔)相关联。
本文描述的方法可以包括使用多个条形码来分析多种分析物和细胞分子，诸如抗体和/或mRNA分子。条形码可以是核酸序列(条形码序列)。第一条形码可以不同于第二条形码。例如，第一条形码序列的核酸序列可以不同于第二条形码序列的核酸序列。如本文所述，包含条形码序列的核酸分子可以与其他分子、聚合物或颗粒偶联。例如，包含条形码序列的核酸分子可以偶联到MHC分子(例如，包含条形码序列的四聚体MHC-肽复合物)、二级结合剂(例如，与条形码序列偶联的抗体)、聚合物(例如，右旋糖酐或能够形成水凝胶的聚合物)，和/或珠粒(例如，乳液液滴中或微孔阵列的孔中的珠粒)。使用一个或多个条形码可以允许测量和分析细胞的一种或多种分析物，并且可以允许将该一种或多种分析物与相应的细胞相关联。在测量和分析来自单个细胞或来自多个细胞(诸如一个或多个细胞群体(例如，免疫细胞))的多种分析物(例如，分泌型分子和/或mRNA)时，这可能特别有利。在此类情况下，第一条形码可以用于测量细胞的第一分析物(例如分泌型分子，诸如抗体，例如，如图8和图10A所描绘和描述的报告条形码)，第二条形码(例如，第二报告条形码)可以用于测量细胞的第二分析物(例如，mRNA分子)，诸如此类。在这些情况下，可以利用分区或细胞特异性条形码(例如附接到珠粒，诸如凝胶珠粒)来连接第一条形码和第二条形码，以将一种或多种分析物归属于单个细胞。对免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、浆细胞或树突细胞)的分析例如可以包括测量一种或多种可以在细胞受到刺激(例如，通过使用刺激分子)时分泌的信号分子(例如，抗体)，以及一种或多种可以在细胞裂解时从细胞中释放的mRNA分子，用于分析例如免疫细胞受体基因节段(例如，T细胞受体(TCR)的V(D)J序列)。参见例如美国专利公开2018/0105808，其全文以引用方式并入本文，旨在提供使用核酸条形码分子来分析单细胞的V(D)J序列的示例性分子和方法。
图3示出了携带条形码的珠粒的实例。核酸分子302(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键合306(诸如二硫化物接头)与珠粒304偶联。相同的珠粒304可以(例如，经由可释放的键)偶联至一个或多个其他核酸分子318、320。核酸分子302可以是或包含条形码。如本文其他地方所述，条形码的结构可以包含多个序列元件。核酸分子302可以包含可以在后续处理中使用的功能序列308。例如，功能序列308可以包括测序仪特异性流通池连接序列(例如，用于测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如，用于/>测序系统的R1引物)中的一者或多者。核酸分子302可以包含用于为样品(例如，DNA、RNA、蛋白质、抗体等)加条形码的条形码序列310。在一些情况下，条形码序列310可以是珠粒特异性的，使得条形码序列310对于偶联至相同珠粒304的所有核酸分子(例如，包括核酸分子302)是共有的。另选地或此外，条形码序列310可以是分区特异性的，使得条形码序列310对于与一个或多个被分隔到相同分区中的珠粒偶联的所有核酸分子是共有的。核酸分子302可以包含特异性引物序列312，诸如mRNA特异性引物序列(例如，多聚T序列)、靶向引物序列和/或随机引物序列。核酸分子302可以包含锚定序列314，以确保特异性引物序列312在(例如，mRNA的)序列末端杂交。例如，锚定序列314可以包括核苷酸的随机短序列，诸如1-mer、2-mer、3-mer或更长的序列，其可以确保多聚T片段更可能在mRNA的多聚A尾的序列末端杂交。
核酸分子302可以包含独特分子鉴定序列316(例如，独特分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特分子鉴定序列316可以包含约5至约8个核苷酸。另选地，独特分子鉴定序列316可以压缩少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子鉴定序列316可以是在偶联至单个珠粒(例如，珠粒304)的单独核酸分子(例如，302、318、320等)之间变化的独特序列。在一些情况下，独特分子鉴定序列316可以是随机序列(例如，诸如随机N-mer序列)。例如，UMI可以提供被捕获的起始mRNA分子的独特标识符，以便允许定量初始表达的RNA的数量。应当理解，尽管图3示出了偶联至珠粒304的表面的三个核酸分子302、318、320，但是单独珠粒可以偶联至任何数量的单独核酸分子，例如，从一个到数十个到数十万个或甚至数百万个单独核酸分子。单独核酸分子的相应条形码可以包含在偶联至相同珠粒的不同单独核酸分子之间的共同序列片段或相对共同的序列片段(例如308、310、312等)和可变或独特的序列片段(例如316)。
可以将生物颗粒(例如，细胞、DNA、RNA等)连同带有条形码的珠粒304一起共同分隔。可以从分区中的珠粒304释放条形码核酸分子302、318、320。举例来说，在分析样品RNA的上下文中，释放的核酸分子之一(例如，302)的多聚T片段(例如，312)可以与mRNA分子的多聚A尾杂交。逆转录可以产生mRNA的cDNA转录物，但是该转录物包括核酸分子302的每个序列片段308、310、316。由于核酸分子302包含锚定序列314，因此其更可能与mRNA的多聚A尾的序列末端杂交并引发逆转录。在任何给定的分区内，单独mRNA分子的所有cDNA转录物都可以包含一个共同的条形码序列片段310。然而，由给定分区内的不同mRNA分子制备的转录物可能会在独特分子鉴定序列312片段(例如，UMI片段)处发生变化。有利的是，即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后，不同UMI的数量也可以指示源自给定分区的mRNA的量，并因此指示源自生物颗粒(例如，细胞)的mRNA的量。如上所述，可以对转录物进行扩增、净化和测序以鉴别mRNA的cDNA转录物的序列，以及对条形码片段和UMI片段进行测序。虽然描述了多聚T引物序列，但其他靶向或随机引物序列也可以用于引发逆转录反应。同样，尽管描述为将条形码寡核苷酸释放到分区中，但是在一些情况下，结合于珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠粒固相上的mRNA，例如，以促进RNA与其他细胞内容物的分离。在此类情况下，可以在分区中或在分区外(例如，批量地)进行进一步的加工。例如，珠粒上的RNA分子可以经受逆转录或其他核酸加工，可以将附加的衔接子序列添加到条形码核酸分子，或者可以进行其他核酸反应(例如，扩增、核酸延伸)。珠粒或其产物(例如，加条形码的核酸分子)可以从分区收集，以及/或者合并在一起，随后经受清理和进一步表征(例如，测序)。
图4展示了携带条形码的珠粒的另一个实例。核酸分子405(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键合406(诸如二硫化物接头)与珠粒404偶联。核酸分子405可以包含第一捕获序列460。相同的珠粒404可以偶联(例如，经由可释放的键合)到一个或多个包含其他捕获序列的其他核酸分子403、407。核酸分子405可以是或包含条形码。如本文别处所指出的，条形码的结构可以包括许多序列元件，诸如功能序列408(例如，流动池附接序列、测序引物序列等)、条形码序列410(例如，珠粒共有的珠粒特异性序列、分区共有的分区特异性序列等)，以及独特分子标识符412(例如，附接到珠粒的不同分子内的独特序列)，或者它们的部分序列。捕获序列460可以被配置为附接到相应的捕获序列465。在一些情况下，相应的捕获序列465可以与另一个分子偶联，该另一个分子可以是分析物或中间载体。例如，如图4所展示，相应的捕获序列465与包含靶序列464的向导RNA分子462偶联，其中该靶序列464被配置为附接到分析物。附接到珠粒404的另一个寡核苷酸分子407包含第二捕获序列480，该第二捕获序列被配置为附接到第二相应的捕获序列485。如图4所展示，第二相应的捕获序列485与抗体482偶联。在一些情况下，抗体482可以对分析物(例如，表面蛋白)具有结合特异性。替代性地，抗体482可以不具有结合特异性。附接到珠粒404的另一个寡核苷酸分子403包含第三捕获序列470，该第三捕获序列被配置为附接到第二相应的捕获序列475。如图4所展示，第三相应的捕获序列475与分子472偶联。分子472可以被配置为或可以不被配置为靶向分析物。其他寡核苷酸分子403、407可以包含关于寡核苷酸分子405描述的其他序列(例如，功能序列、条形码序列、UMI等)。虽然图4展示了包含每个捕获序列的单个寡核苷酸分子，但是应当理解，对于每个捕获序列，珠粒可以包含一组一个或多个寡核苷酸分子，其中每个寡核苷酸分子均包含捕获序列。例如，珠粒可以包含任何数量的具有一个或多个不同的捕获序列的集合。替代性地或除此之外，珠粒404可以包含其他捕获序列。替代性地或除此之外，珠粒404可以包含更少类型的捕获序列(例如，两种捕获序列)。替代性地或除此之外，珠粒404可以包含寡核苷酸分子，该寡核苷酸分子包含启动序列，诸如特异性启动序列，诸如mRNA特异性启动序列(例如，poly-T序列)，靶向启动序列，和/或随机启动序列，例如以便于对基因表达进行测定。
在一个方面，如本文进一步描述的，核酸条形码分子被提供为与一个或多个珠粒偶联。在一个实施方案中，珠粒可以具有与之偶联的多个核酸条形码分子(例如，图3中的302或图4中的405)，其中多个核酸条形码分子的子集包括条形码序列(例如，图3中的310或图4中的410)。在这种情况下，核酸条形码分子的子集中的条形码序列是共同的条形码序列。
本文所述的操作可以在任何有用或方便的步骤中执行。例如，包含核酸条形码分子的珠粒可以在将样品引入分区(例如，孔或液滴)之前、期间或之后引入该分区中。可以为样品的核酸分子加条形码，这可以发生在珠粒上(在核酸分子保持与珠粒偶联的情况下)或者发生在核酸条形码分子释放到分区中之后。在来自样品的核酸分子保持附接到珠粒的情况下，可以收集、合并来自各种分区的珠粒，然后经受进一步加工(例如，逆转录、附接衔接子、扩增、清除、测序)。在其他情况下，该加工可以发生在分区中。例如，可以在分区中提供足以进行加条形码、附接衔接子、逆转录或其他核酸加工操作的条件，并且在清理和测序之前进行这些操作。
利用捕获剂或细胞珠粒的示例性分泌型分析物加条形码过程分别在图8和图10A中描述。在某些实施方案中，微流体通道结构(例如，图1至图2)可以用于将细胞(例如，单细胞)包封到液滴中。参见例如美国专利公开2018/0216162(现为美国专利10,428,326)，以及美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，这些专利公开全文以引用方式并入本文，旨在提供示例性的细胞珠粒产生系统和方法。在某些实施方案中，液滴包含细胞(例如单细胞，例如单个B细胞或浆细胞)以及含有聚合物前体和/或交联前体的水性溶液。为了将细胞包封到液滴中，在一些实施方案中，微流体通道结构包括含有悬浮的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的第一水性流体，该第一水性流体可以沿第一通道段输送，并且同与第一水性流体不可混溶的第二流体接触，以产生第一水性流体的离散液滴。在一些情况下，第一水性流体包括如本文别处所述的其他试剂，包括用于产生细胞珠粒的聚合物前体和/或交联前体。在其他情况下，在液滴产生之前或在液滴产生的同时，使含有其他试剂(包括聚合物前体和/或交联前体)的第二水性流体与第一水性流体发生接触。在还有其他情况下，包含第一水性流体(例如，包含细胞)和第二水性流体(例如，包含试剂，诸如聚合物前体和/或交联前体)的两个离散液滴可以融合成聚结的液滴。在一些情况下，所产生的离散液滴最多包含单个生物颗粒(诸如单个细胞或单个细胞核)。
另外，包封例如细胞的液滴可以经受合适的条件，使得聚合物前体和/或交联前体可以聚合/交联以产生细胞外基质。细胞珠粒可以具有均匀的尺寸或非均匀的尺寸。在一些情况下，细胞珠粒的直径可以为至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，细胞珠粒可以具有小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠粒可以具有约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在一些实施方案中，珠粒可以包含聚合物前体(例如单体、低聚物、线型聚合物)、寡核苷酸、引物与其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键包括碳-碳键或硫醚键。在一些情况下，珠粒可以包含acrydite部分或点击化学部分，在某些方面，前述部分可以用于附接一种或多种第一捕获剂(例如，包含抗体的捕获剂)。参见例如美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)，其全文以引用方式并入本文，旨在提供示例性的细胞珠粒聚合物和官能化策略。在一些情况下，如本文所述，利用化学缀合方法将分子(例如，捕获剂)附接到细胞珠粒水凝胶基质。
在一些实施方案中，在形成包含抗体特异性捕获剂的细胞珠粒之后，使用刺激剂(诸如抗原)来刺激细胞(例如，T细胞)分泌抗体或其他感兴趣的分析物。在某些实施方案中，抗原与加条形码的肽-主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如MHC多聚体，诸如四聚体或右旋聚体)偶联。可以使用任何合适浓度的抗原以允许从细胞珠粒中充分分泌抗体。此外，采用足够长的孵育时间来确保抗体从细胞珠粒中分泌。在感兴趣的抗体或其他分析物从细胞分泌之后，多个第一捕获剂可以偶联到(例如，共价或非共价地结合到)该分泌型抗体或其他分析物。因此，捕获剂可以与“捕获的”或结合的抗体或分析物形成复合物。
随后，在一些情况下，包含分析物(例如，抗体)特异性抗原的报告剂可以偶联到(例如，共价或非共价地结合到)分泌型抗体或与捕获剂偶联的其他分析物，前述分析物特异性抗原包含具有第一条形码序列(即，报告条形码序列)的核酸分子。对报告剂和/或核酸分子的进一步加工(例如，偶联细胞和/或分区条形码，以及测序)可以允许识别分泌型分析物的存在和/或量。
此外，细胞珠粒的细胞外基质(ECM)可以被酶部分消化。在一些情况下，酶可以是胶原酶，其有助于破坏胶原蛋白中的肽键。在其他情况下，酶可以是分散酶，它是将纤连蛋白、IV型胶原蛋白裂解并且将I型胶原蛋白以较小程度裂解的蛋白酶。在其他情况下，可以在此使用能够部分消化ECM的合适的酶。此外，ECM可以包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等。如本文所述，细胞珠粒可以被分隔到乳液液滴中。
本文所公开的方法和系统可以进一步包括将细胞珠粒与包含细胞特异性条形码序列(参见例如，图3中描述的条形码分子)的多个核酸分子一起分隔到多个分区中。在一些情况下，细胞特异性条形码(或分区特异性条形码，如310的说明所述)附接到珠粒，诸如凝胶珠粒。如本文别处所述，这些细胞条形码可以可释放地附接到珠粒。细胞珠粒和细胞条形码(例如，附接到珠粒，诸如凝胶珠粒)可以被分隔在液滴或孔中。该液滴可以是乳液液滴，并且可以包含细胞珠粒。乳液液滴可以如本文别处所述形成或产生，例如，通过使不可混溶的两个相(例如，第一相和第二相)(例如，水相和油)接触。可以溶解形成细胞珠粒的水凝胶基质，从而释放包含分析物(例如，细胞因子)、捕获剂和具有第一条形码的报告剂的分析物缀合物。可以使用一种或多种刺激来溶解细胞珠粒，诸如pH、温度或分区内离子浓度的变化。在一些情况下，将细胞裂解，从而释放细胞分子，诸如核酸分子(例如，mRNA)。细胞可以在分隔分析物以及为分析物加条形码之前裂解，或者在分区中裂解。可以使用包含第二条形码序列的核酸分子对细胞mRNA分子进行逆转录，从而将第二条形码附接到逆转录的核酸分子(以及例如，将分析物与细胞相关联)。
替代性地，可以首先将细胞mRNA分子逆转录成cDNA(例如，使用含poly-T的引物)，然后使用例如本文别处所述的模板转换反应来附接第二细胞特异性条形码序列(例如，附接到mRNA/cDNA分子的5’末端)。参见例如美国专利公开2018/0105808，其全文以引用方式并入本文，旨在提供使用模板转换反应和模板转换寡核苷酸来分析单细胞mRNA并为该单细胞mRNA加条形码的示例性分子和方法。在一些情况下，将细胞条形码(例如，细胞特异性条形码)从例如珠粒(诸如，凝胶珠粒)释放到如本文别处所述的分区中(例如使用刺激物，诸如还原剂)。类似地，包含第一分析物特异性条形码序列(例如，816)的核酸分子可以用于产生包含第一分析物特异性条形码和第二细胞特异性条形码的分子。附接到分析物特异性结合剂即报告剂(例如，814)的核酸分子(例如，816)除了包含分析物特异性条形码序列之外，还可以包含一个或多个功能序列。例如，附接到分析物特异性结合剂(例如，814)的核酸分子(例如，816)可以包含以下一项或多项：独特分子标识符(UMI)、引物序列或引物结合序列(例如，测序引物序列(或部分测序引物序列)，诸如R1序列和/或R2序列)、被配置为附接到测序仪的流动池的序列(例如，P5和/或P7)，或者与核酸条形码分子上的序列互补的序列(例如，附接到珠粒，诸如图3中描述的那些)。因此，加条形码的分子(例如，包含分析物特异性和细胞特异性条形码)也可以包含这些功能序列。
B.多路使用方法
一旦细胞的内容物释放到它们各自的分区中，其中所包含的核酸就可以在这些分区内进一步加工。根据本文所述的方法和系统，可以为单独细胞的核酸内容物提供独特标识符，使得在对那些核酸进行表征时，它们可以被归属为源自一个或多个相同的细胞(或者细胞核或细胞珠粒)。将特征归属于单独的细胞或成群的细胞的能力是通过将独特标识符专门分配给单独的细胞或成群的细胞来提供的。可以为单独的细胞或细胞群体分配或关联例如核酸条形码形式的独特标识符，以便用这些独特标识符为细胞的组分(以及因此其特征)加标签或加标记。然后，这些独特标识符可以用于将细胞的组分和特征归属于单独的细胞或成群的细胞。在一些方面，这是通过将单独的细胞或成群的细胞与独特标识符共同分隔来实现的。在一些方面，以包含核酸条形码序列的寡核苷酸(在本文中也称为锚定寡核苷酸)的形式提供独特标识符，这些核酸条形码序列可以与单独的细胞的核酸内容物附接或以其他方式缔合，或者与细胞的其他组分附接，特别是与这些核酸的片段附接。可以将寡核苷酸分隔开，使得在给定分区中的寡核苷酸之间，其中所含有的核酸条形码序列相同，但在不同分区之间，寡核苷酸可以具有并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表给定分析中所有分区上的大量不同条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可以与给定分区相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
在完成一个或多个加条形码、逆转录和/或核酸加工步骤(例如，取决于细胞的多少种不同的分析物正在加条形码)之后，可以将分区(例如，液滴或孔)的内容物合并，然后使核酸分子经受进一步的批量加工和测序。因此，目前描述的方法和系统允许将多种分析物(例如，分泌型抗体或其抗原结合片段)与单个细胞(例如，标记的B细胞或浆细胞)相关联，从而使得能够在单细胞水平上测量、分析和/或表征多个细胞。如本文所述，能够以有效且同时的方式分析和表征多个细胞(例如一个或多个细胞群体，诸如免疫细胞群体，即B细胞或浆细胞)。本文所公开的方法不仅允许在细胞裂解后分析细胞分子，而且还允许在分析细胞核酸分子(例如，用于分析BCR或抗体序列的mRNA，参见例如操作1204)、细胞表面蛋白(例如，受体或配体等，参见例如操作1201)、抗原呈递(例如，由B细胞进行的抗原呈递)、单细胞的抗原特异性(参见例如操作1202)等(例如，如图12所示)之外和/或同时分析可能由细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、浆细胞或树突细胞)分泌的分子，诸如分泌型蛋白、抗体、其抗原结合片段或细胞因子(参见例如操作1203)。WO2019/157529中公开了用于对多种分析物进行单细胞分析的示例性方法和组合物，该专利全文以引用方式并入本文用于所有目的。在一些实施方案中，本文公开了一种方法，包括例如同时、平行或依次分析来自B谱系细胞(例如，浆细胞)的分泌型抗体(例如，识别来自病原体的抗原的抗体，或者抗ID抗体，诸如抗抗体药物抗体)或其抗原结合片段，以及一种或多种其他分析物，包括由B谱系细胞分泌的细胞因子分子。
在其中细胞内分析物(例如，mRNA)与分泌型抗体或其抗原结合片段平行加工的实施方案中，在任选地溶解(例如，通过溶解聚合物基质)细胞珠粒之后，将容纳在分区(例如，液滴或孔)中的细胞和容纳在分区(例如，液滴或孔)中的细胞珠粒与裂解试剂接触，以便释放与细胞珠粒相关联的细胞或病毒的内容物。在一些情况下，裂解剂可以在细胞珠粒形成后与大量细胞珠粒悬液接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如，革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、Labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(St Louis,MO)获得的多种其他裂解酶，例如，基于表面活性剂的裂解溶液(例如，TritonX-100、Tween 20、十二烷基硫酸钠(SDS))，以及其他可商购获得的裂解酶。在某些情况下也可以使用电穿孔、热、声或机械方式来破坏细胞。在一些情况下，细胞珠粒基质可以被配置为产生足够小的孔径，以便在细胞破坏后保留特定大小的核酸片段。在其他情况下，细胞珠粒基质可以用核酸分子(例如，含有poly-T序列)来官能化(例如，与之共价结合)，这些核酸分子被配置为捕获释放的分析物(例如mRNA，其任选地可以在分隔之前被加工成cDNA)。
其他试剂也可以与细胞接触，包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂，诸如蛋白酶K、螯合剂(诸如EDTA)，以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对后续核酸加工的负活性或影响的其他试剂。此外，就包封的细胞珠粒而言，这些细胞珠粒可以暴露于适当的刺激，以将细胞珠粒或其内容物释放到例如分区中。例如，在一些情况下，化学刺激物可以连同包封的细胞珠粒一起被共同分隔，以允许微胶囊降解，以及细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，该刺激物可以与本文别处描述的用于从其相应的微胶囊(例如，珠粒)释放寡核苷酸的刺激物相同。在替代性方面，这可以是不同且不重叠的刺激物，以便允许包封的细胞珠粒在与将寡核苷酸释放到相同分区中的不同时间将其内容物释放到分区中。
在释放细胞大分子成分后，细胞mRNA分子与其他类型的逆转录引物进行逆转录反应，从而从mRNA产生cDNA。在一些情况下，与此同时，分区特异性(例如细胞特异性，诸如图3中描述的那些)条形码分子在cDNA产生期间附接。在某些实施方案中，分区特异性(例如，细胞特异性)条形码序列是DNA寡核苷酸。分区特异性(例如，细胞特异性)条形码序列可以是不同于第一条形码序列(例如，分析物特异性条形码)的第二条形码序列，该第二条形码序列附接到或偶联到用于为从细胞(例如免疫细胞，诸如B细胞)分泌的分析物加条形码的第二结合报告剂。
替代性地，可以首先将细胞mRNA分子逆转录成cDNA(例如，使用含poly-T的引物)，然后使用例如本文别处所述的模板转换反应来附接第二细胞特异性条形码序列(例如，附接到mRNA/cDNA分子的5’末端)。参见例如美国专利公开2018/0105808，其全文以引用方式并入本文，旨在提供使用模板转换反应和模板转换寡核苷酸来分析单细胞mRNA并为该单细胞mRNA加条形码的示例性分子和方法。
在某些实施方案中，核酸分子，例如分区特异性(例如，细胞特异性)条形码分子(例如，寡核苷酸)在对珠粒施加特定刺激时能够从珠粒释放，如本文别处所述。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放核酸分子。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将使得核酸分子从珠粒发生键的裂解或其他释放。在其他情况下，可以使用化学刺激，该化学刺激裂解核酸分子与珠粒的键，或以其他方式使得核酸分子从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如DTT)而降解以释放连接的核酸分子。
在一些实施方案中，附接到与分析物结合的报告剂(例如分析物特异性多肽，诸如抗原)的条形码分子可以被释放(例如，通过如本文别处所述的可释放的键合/不稳定键)。类似地，在一些实施方案中，附接到MHC多聚体、附接到蛋白质或多肽(例如，抗原或潜在抗原)以及/或者附接到细胞表面蛋白特异性抗体的条形码分子也可以被释放(例如，通过如本文别处所述的可释放的键合/不稳定键)。分区特异性(例如，液滴特异性或二级)条形码序列可以附接到这些释放的条形码分子(或其衍生物)中的任一个或全部上。例如，包含分区特异性条形码序列的加条形码的珠粒可以用于分区(诸如液滴)中，以将条形码(例如，分区特异性条形码)与单细胞的一种或多种分析物(例如，分泌型细胞因子、分泌型抗体、mRNA等)偶联，从而将所述一种或多种分析物与单细胞相关联。这些条形码用作RNA、DNA、蛋白质、分泌型抗体或其抗原结合片段以及/或者用于刺激细胞的抗原的细胞和/或分区特异性标识符。将独特的条形码专门分配给单独的生物颗粒或成群的生物颗粒可以将特征归属于单独的生物颗粒或成群的生物颗粒。为单独的生物颗粒或生物颗粒群体分配或关联独特标识符(即，核酸条形码形式)，以便用这些独特标识符为生物颗粒的大分子组分(以及因此其特征)加标签或加标记。然后，这些独特标识符(即，条形码)可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独的生物颗粒或成群的生物颗粒。此外，如本文别处所述，除了细胞和/或分区特异性条形码之外，还可以将独特分子标识符(UMI)添加到细胞分析物(例如，mRNA分子)和报告核酸分子(例如，附接到结合剂，或者MHC分子/多聚体和/或抗体，诸如细胞表面抗体)中，以提供用于对单独的分子进行定量的独特标识符。
将加条形码的分区内容物合并成本体溶液，然后如本文别处所述进一步加工，以产生测序文库(参见例如图11)。例如，在分隔到乳液包凝胶珠粒(GEM)中之后，每个液滴中的细胞可以裂解，然后可以进行逆转录(GEM-RT)。在cDNA扩增之后，上清液和洗脱液经受固相可逆固定化(SPRI)，之后分别进行富集和文库构建。参见图12，有关分泌型抗体、细胞因子以及其他分析物(诸如mRNA、细胞表面蛋白和抗原结合特异性)的信息都可以使用细胞特异性条形码来分析并归属于同一细胞(参见例如图3)。
本公开提供了用于多路使用以及用其他方式增加用于分析的样品的通量的方法和系统。例如，单个或集成的处理工作流程可以允许处理、识别和/或分析更多或多种分析物、更多或多种类型的分析物，以及/或者更多或多种类型的分析物表征。例如，在本文所述的方法和系统中，能够结合到或以其他方式偶联到一个或多个细胞或细胞特征的一种或多种标记剂可以用于表征细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。细胞表面特征可以包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用、蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴定标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同的细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同的报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一个具体的实例中，可以提供潜在的细胞特征标记剂的文库，其中相应的细胞特征标记剂与核酸报告分子相关联，使得不同的报告寡核苷酸序列与能够结合到特定细胞特征的每个标记剂相关联。在其他方面，该文库的不同成员可以通过不同寡核苷酸序列标签的存在来表征。例如，能够结合到第一蛋白质的抗体可能具有与之相关联的第一报告寡核苷酸序列，而能够结合到第二蛋白质的抗体可能具有与之相关联的不同的报告寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗体或可以被特定抗体识别或结合的细胞特征的存在。
能够与一个或多个细胞结合或以其他方式偶联的标记剂可以用于将细胞表征为属于特定的细胞组。例如，标记剂可以用于对细胞样品或一组细胞进行标记。以此方式，一组细胞可以被标记为不同于另一组细胞。在一个实例中，第一组细胞可以来源于第一样品，第二组细胞可以来源于第二样品。标记剂可以允许第一组和第二组具有不同的标记剂(或与标记剂相关联的报告寡核苷酸)。这可以例如促进多路使用，其中第一组的细胞和第二组的细胞可以分别标记，然后合并到一起用于下游分析。标签的下游检测可以指示分析物属于特定的组。
例如，报告寡核苷酸可以与抗体或其表位结合片段连接，对细胞进行标记可以包括使与报告寡核苷酸连接的抗体(例如，抗体连接的条形码分子)或与报告寡核苷酸连接的表位结合片段(例如，表位结合片段-条形码分子)经受适于将抗体与细胞表面上存在的分子结合的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在期望的范围内，以确保抗体或其表位结合片段保持与分子结合。例如，结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段在各种样品加工步骤(例如分隔和/或核酸扩增或延伸)期间保持与分子结合。抗体或其表位结合片段和它与之结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如，该解离常数可以小于约10μM。
在另一个实例中，报告寡核苷酸可以与细胞穿透肽(CPP)偶联，并且对细胞进行标记可以包括将CPP偶联的报告寡核苷酸递送到生物颗粒(或分析物载体)诸如细胞、细胞核或细胞珠粒中。对生物颗粒(或分析物载体)进行标记可以包括通过细胞穿透肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞和/或细胞珠粒中。可以用于本文所提供的方法中的CPP可以包含至少一个非官能半胱氨酸残基，其可以是游离的或衍生的，用于与寡核苷酸形成二硫键，该寡核苷酸已针对这种键合进行过修饰。可以用于本文实施例中的CPP的非限制性例子包括渗透素、转运素、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿透肽可以具有诱导细胞群体的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％细胞的细胞穿透的能力。CPP可以是富含精氨酸的肽转运载体。CPP可以是渗透素或Tat肽。在另一个实例中，报告寡核苷酸可以与荧光团或染料偶联，并且对细胞进行标记可以包括使与报告寡核苷酸偶联的荧光团(例如，荧光团连接的条形码分子)经受适于将荧光团与细胞表面结合的条件。
在一些情况下，荧光团可以与脂质双层强烈地相互作用，并且对细胞进行标记可以包括使与报告寡核苷酸偶联的荧光团(例如，荧光团连接的条形码分子)经受使得荧光团结合到细胞膜或插入细胞膜中的条件。在一些情况下，荧光团是水溶性的有机荧光团。在一些情况下，荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、磺基-Cy3马来酰亚胺、Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 565生物素、磺基罗丹明B、Alexa 594马来酰亚胺、Texas Red马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、AbberiorSTAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto 647 SE，或者磺基-Cy5马来酰亚胺。参见例如，Hughes L D等人，PLoS One.2014年2月4日；9(2):e87649，该文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的，旨在说明有机荧光团。
报告寡核苷酸可以与亲脂性分子偶联，并且对细胞进行标记可以包括通过该亲脂性分子将与该亲脂性分子偶联的报告寡核苷酸递送到细胞膜或细胞核膜。亲脂性分子可以与脂质膜(诸如细胞膜和细胞核膜)缔合并且/或者插入脂质膜中。在一些情况下，插入可以是可逆的。在一些情况下，亲脂性分子与细胞膜或核膜之间的结合可以是这样的，使得膜在后续加工(例如，分隔、细胞渗透化、扩增、合并等)期间保留亲脂性分子(例如，以及其结合的组分，例如核酸条形码分子)。报告寡核苷酸可以进入细胞内空间和/或细胞核中。在一个实施方案中，与亲脂性分子偶联的报告寡核苷酸将经由该亲脂性分子保持与脂质膜(如本文所述)缔合以及/或者插入该脂质膜中，直到细胞发生裂解，例如在分区内部。
报告寡核苷酸可以是核酸分子的一部分，该核酸分子包含任何数目的如本文别处所述的功能序列，诸如靶标捕获序列、随机引物序列等，并且与另一个核酸分子偶联，该另一个核酸分子是分析物或源自分析物。
在分隔之前，可以将细胞与标记剂的文库一起孵育，这些标记剂可以是用于一组广泛的不同细胞特征(例如，受体、蛋白质等)的标记剂，并且包括其相关联的报告寡核苷酸。可以将未结合的标记剂从细胞洗去，然后可以如本文别处所述将这些细胞连同分区特异性条形码寡核苷酸(例如，附接到支持物，诸如珠粒或凝胶珠粒)一起共同分隔(例如，共同分隔到液滴或孔中)。因此，分区可以包括一个或多个细胞以及结合的标记剂及其已知的相关联的报告寡核苷酸。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。例如，第一组多种标记剂和第二组多种标记剂可以与不同的细胞、细胞群体或样品相互作用，从而允许特定的报告寡核苷酸指示特定的细胞群体(或者细胞或样品)和细胞特征。这样，可以对不同样品或群组进行独立处理并且随后组合在一起以进行合并分析(例如，如本文其他地方所述的基于分区的条形码化)。参见例如美国专利公开20190323088，该专利据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
如本文别处所述，标记剂文库可以与特定的细胞特征相关联，也可以用于鉴定分析物源自特定的细胞群体或样品。细胞群体可以与多个文库一起孵育，使得一个或多个细胞包含多种标记剂。例如，细胞可以包含与之偶联的亲脂性标记剂和抗体。该亲脂性标记剂可以指示细胞是特定细胞样品的成员，而该抗体可以指示细胞含有特定的分析物。这样，报告寡核苷酸和标记剂可以允许对多分析物进行多重分析。
在一些情况下，这些报告寡核苷酸可以包含这样的核酸条形码序列：这些核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。使用寡核苷酸作为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还可易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且易于进行检测(例如，使用测序或阵列技术)。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，该文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，该专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。此外，点击反应化学诸如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等可以用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接地(例如，经由杂交)偶联到报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴定该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。在一些情况下，本文所述的报告寡核苷酸可以包括可用于后续处理的一个或多个功能序列，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(例如，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合到与报告寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许该寡核苷酸与报告寡核苷酸杂交。
图13描述了包含与之连接的报告寡核苷酸(1340)的示例性标记剂(1310、1320、1330)。标记剂1310(例如，本文所述的任何标记剂)连接(要么直接连接(例如，共价连接)，要么间接连接)至报告寡核苷酸1340。报告寡核苷酸1340可以包含鉴定标记剂1310的条形码序列1342。报告寡核苷酸1340还可以包含可用于后续处理的一个或多个功能序列1343，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
参见图13，在一些情况下，缀合至标记剂(例如，1310、1320、1330)的报告寡核苷酸1340包含引物序列1341、鉴定标记剂(例如，1310、1320、1330)的条形码序列1342和功能序列1343。功能序列1343可以被构造为杂交于互补序列，诸如存在于核酸条形码分子1390(未示出)上的互补序列，诸如本文其他地方所述的那些。在一些情况下，核酸条形码分子1390连接至支持物(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)，诸如本文其他地方所述的那些。例如，核酸条形码分子1390可以经由可释放键(例如，包括不稳定键)(诸如本文其他地方所述的那些)连接至支持物。在一些情况下，报告寡核苷酸1340包含一个或多个附加功能序列，诸如上文所述的那些。
在一些情况下，标记剂1310是包含报告寡核苷酸1340的蛋白质或多肽(例如，抗原或预期抗原)。报告寡核苷酸1340包含条形码序列1342，该条形码序列鉴定多肽1310并且可以用于推断分析物(例如，多肽1310的结合伴侣(即，多肽1310可以与之结合的分子或化合物)的存在。在一些情况下，标记剂1310是包含报告寡核苷酸1340的亲脂部分(例如，胆固醇)，其中选择该亲脂部分，使得标记剂1310整合到细胞膜或细胞核中。报告寡核苷酸1340包含鉴定亲脂部分1310的条形码序列1342，该亲脂部分在一些情况下用于为细胞(例如，成群的细胞、细胞样品等)加标签并且可以如本文别处所述用于进行多重分析。在一些情况下，标记剂是包含报告寡核苷酸1340的抗体1320(或其表位结合片段)。报告寡核苷酸1340包含条形码序列1342，该条形码序列鉴定抗体1320并且可以用于推断例如抗体1320的靶标(即，抗体1320结合的分子或化合物)的存在。在其他实施方案中，标记剂1330包含具有肽1332的MHC分子1331和鉴定肽1332的报告寡核苷酸1340。在一些情况下，MHC分子偶联至支持物1333。在一些情况下，支持物1333可以是多肽(诸如链霉亲和素)，或多糖(诸如葡聚糖)。在一些情况下，报告寡核苷酸1340能够以任何合适的方式直接或间接地偶联到MHC标记剂1330。例如，报告寡核苷酸1340可以与MHC分子1331、支持物1333或肽1332偶联。在一些实施方案中，标记剂1330包含多个MHC分子(例如是MHC多聚体，其可以偶联到支持物(例如，1333))。可以与本文所公开的组合物、方法和系统一起使用的I类和/或II类MHC多聚体有许多可能构型，例如MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC，例如MHCI类五聚体(ProImmune,Ltd.))、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC装饰的葡聚糖分子(例如，MHC(Immudex))等。关于示例性标记剂(包括基于抗体和MHC的标记剂)、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429以及美国专利公开20190367969，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一个方面，如本文进一步描述的，本公开提供了以下报告剂：其包括图13中描绘的标记剂的一些或全部相同的结构特征，包括功能序列1343、条形码序列1343和引物序列1341中的一者或多者。在一个实施方案中，报告剂可以是蛋白质或多肽(例如，抗原或潜在抗原)。
图14展示了携带条形码的珠粒的另一个实例。在一些实施方案中，对多种分析物(例如，RNA和一种或多种分析物，使用本文所述的标记剂)的分析可以包括核酸条形码分子，如图14中所大致描绘的。在一些实施方案中，核酸条形码分子1410和1420经由如本文其他地方所述的可释放键1440(例如，包括不稳定键)连接至支持物1430。核酸条形码分子1410可以包含衔接子序列1411、条形码序列1412和衔接子序列1413。核酸条形码分子1420可以包含衔接子序列1421、条形码序列1412和衔接子序列1423，其中衔接子序列1423包含与衔接子序列1413不同的序列。在一些情况下，衔接子1411和衔接子1421包含相同序列。在一些情况下，衔接子1411和衔接子1421包含不同序列。尽管支持物1430被示出为包含核酸条形码分子1410和1420，但是本文设想了包含共同条形码序列1412的任何合适数量的条形码分子。例如，在一些实施方案中，支持物1430还包含核酸条形码分子1450。核酸条形码分子1450可以包含衔接子序列1451、条形码序列1412和衔接子序列1453，其中衔接子序列1453包含与衔接子序列1413和1423不同的序列。在一些情况下，核酸条形码分子(例如，1410、1420、1450)包含一个或多个附加功能序列，诸如本文所述的UMI或其他序列。核酸条形码分子1410、1420或1450可以与如本文别处所述的分析物相互作用，例如，如图15A至图15C中所描绘的。
参见图15A，在用标记剂对细胞进行标记的情况下，序列1523可以与报告寡核苷酸的衔接子序列互补。细胞可以与一种或多种报告寡核苷酸1510缀合的标记剂1520(例如，多肽、抗体或本文别处所述的其他标记剂)接触。在一个实施方案中，序列1523与作为报告剂的一部分提供的报告寡核苷酸的序列互补，如本文进一步描述的。报告剂可以具有图13中所描绘的标记剂的一些或全部结构元件，包括功能序列1343。在一些情况下，细胞可以在加条形码之前被进一步加工。例如，此类加工步骤可以包括一个或多个清洗步骤和/或细胞分选步骤。在一些情况下，将与缀合到寡核苷酸1510的标记剂1520结合的细胞和包含核酸条形码分子1590的支持物1530(例如珠粒，诸如凝胶珠粒)分隔到多个分区之中的一个分区(例如，液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中。在一些情况下，该分区至多包含结合于标记剂1520的单细胞。在一些情况下，缀合至标记剂1520(例如，多肽、抗体、pMHC分子诸如MHC多聚体等)的报告寡核苷酸1510包含第一衔接子序列1511(例如，引物序列)、鉴定标记剂1520(例如，多肽、抗体或者pMHC分子或复合物的肽)的条形码序列1512和衔接子序列1513。衔接子序列1513可以被配置为与互补序列杂交，该互补序列诸如存在于核酸条形码分子1590上的序列1523。在一些情况下，寡核苷酸1510包含一个或多个附加功能序列，诸如本文别处所述的那些。
加条形码的核酸分子可以从图15A至图15C中描述的构建体产生(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸或连接)。例如，然后可以将序列1513与互补序列1523杂交，以产生(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸或连接)包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1522(或其反向互补序列)和报告序列1512(或其反向互补序列)的加条形码的核酸分子。然后可以任选地如本文其他地方所述的那样处理条形码化核酸分子，例如以扩增所述分子和/或将测序平台特异性序列补加至所述片段。参见例如美国专利公开2018/0105808，该专利据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。然后可以在合适的测序平台上对条形码化核酸分子或由其生成的衍生物进行测序。
在一些实施方案中，可以对多种分析物(例如，核酸和一种或多种分析物，使用本文所述的标记剂)进行分析。例如，工作流程可以包括在图15A至图15C的任一者中大致描绘的工作流程，或者如本文别处所述的针对单独分析物的工作流程的组合。例如，通过使用在图15A至图15C中大致描绘的工作流程的组合，可以对多种分析物进行分析。
在一些情况下，对分析物(例如，核酸、多肽、碳水化合物、脂质等)的分析包括在图15A和/或图15B中大致描绘的工作流程。核酸条形码分子1590可以与一种或多种分析物共同分隔。在一些情况下，核酸条形码分子1590附接到支持物1530(例如珠粒，诸如凝胶珠粒或固体珠粒，例如磁性珠粒)，诸如本文别处所述的那些。例如，核酸条形码分子1590可以经由可释放的键合1540(例如，包括不稳定键)或接头(诸如不可释放的接头)附接到支持物1530，诸如本文别处所述的那些。在一个实施方案中，支持物1530可以是经由接头(诸如不可释放的接头)附接有核酸条形码分子1590的固体珠粒(例如，磁性珠粒)。核酸条形码分子1590可以包含条形码序列1521，并且任选地包含其他附加序列，例如UMI序列1522(或本文别处描述的其他功能序列)。核酸条形码分子1590可以包含序列1523，该序列可以与另一核酸序列互补，使得其可以与特定序列杂交。
例如，序列1523可以包含poly-T序列，并且可以用于与mRNA杂交。参见图15C，在一些实施方案中，核酸条形码分子1590包含与来自细胞的RNA分子1560的序列互补的序列1523。在一些情况下，序列1523包含对RNA分子具有特异性的序列。序列1523可以包含已知序列或靶向序列，或者随机序列。在一些情况下，可以进行核酸延伸反应，从而产生包含序列1523、条形码序列1521、UMI序列1522、任何其他功能序列和对应于RNA分子1560的序列的加条形码的核酸产物。
在另一个实例中，序列1523可以与已经补加到分析物上的突出端序列或衔接子序列互补。例如，参见图15B，在一些实施方案中，引物1550包含与来自生物颗粒(或分析物载体)诸如细胞、细胞核或细胞珠粒的核酸分子1560(诸如编码BCR序列的RNA)的序列互补的序列。在一些情况下，引物1550包含不与RNA分子1560互补的一个或多个序列1551。序列1551可以是如本文别处所述的功能序列，例如，衔接子序列、测序引物序列，或者便于与测序仪的流动池偶联的序列。在一些情况下，引物1550包含多聚T序列。在一些情况下，引物1550包含与RNA分子中的靶序列互补的序列。在一些情况下，引物1550包含与免疫分子的区域(诸如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。引物1550与核酸分子1560杂交，产生互补分子1570。例如，互补分子1570可以是在逆转录反应中产生的cDNA。在一些情况下，可以将附加序列补加到互补分子1570上。例如，可以选择逆转录酶，使得几个非模板碱基1580(例如，poly-C序列)补加到cDNA上。在另一个实例中，末端转移酶也可以用于补加该附加序列。核酸条形码分子1590包含与非模板碱基互补的序列1524，并且逆转录酶对核酸条形码分子1590执行模板转换反应，以产生包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1522(或其反向互补序列)和互补分子1570序列(或其一部分)的加条形码的核酸分子。在一些情况下，序列1523包含与免疫分子的区域(诸如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。序列1523与核酸分子1560杂交，产生互补分子1570。例如，互补分子1570可以在逆转录反应中产生，该逆转录反应产生包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列1522(或其反向互补序列)和互补分子1570序列(或其一部分)的加条形码的核酸分子。适用于为由mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区的那些)产生的cDNA加条形码的附加方法和组合物以及/或者包括模板转换寡核苷酸的加条形码方法和组合物在以下专利中有所描述：国际专利申请WO2018/075693、美国专利公开号2018/0105808、2015年6月26日提交的美国专利公开号2015/0376609，以及美国专利公开号2019/0367969，这些专利申请中的每一者均全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些情况下，对分泌型抗体的分析包括如图15D中所描绘的工作流程。细胞可以与一种或多种包含报告寡核苷酸1510的报告剂(如本文进一步描述的)接触。核酸条形码分子1590可以与包含偶联到细胞表面的复合物的细胞(例如，血浆B细胞)共同分隔。该复合物可以包含捕获剂、分泌型抗体或其抗原结合片段，以及报告剂。在一些情况下，将与缀合到寡核苷酸1510的标记剂1520结合的分泌型抗体1595(来自偶联到细胞表面的复合物，其未在图15D中示出)和包含核酸条形码分子1590的支持物1530(例如珠粒，诸如凝胶珠粒或固体珠粒)分隔到多个分区之中的一个分区(例如，液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中。在一些情况下，该分区最多包含单个细胞，且复合物与该细胞的表面偶联。该复合物包含与分泌型抗体1595偶联的捕获剂(如本文进一步描述的，但未在图15D中示出)，该分泌型抗体与标记剂1520偶联。在一些情况下，与标记剂1520(例如蛋白质或多肽，诸如抗原或潜在抗原)缀合的报告寡核苷酸1510包含第一衔接子序列1511(例如，引物序列)、鉴定标记剂1520的条形码序列1512(例如蛋白质或多肽，诸如抗原或潜在抗原)，以及衔接子序列1513。衔接子序列1513可以被配置为与互补序列杂交，该互补序列诸如存在于核酸条形码分子1590上的序列1523。图15D中针对分泌型抗体描绘的工作流程可以与图15B中(例如，针对mRNA加工)描绘的工作流程同时进行，如本文进一步描述的。在一个实施方案中，该组合的工作流程在单细胞水平上提供分泌型抗体和mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区的那些)信息。在这种情况下，核酸条形码分子1590的序列1523被配置为与如图15B中所描绘那样产生的互补分子1570(例如，经由序列1524)和衔接子序列1513两者偶联。
在另一个方面，如本文进一步描述的，核酸条形码分子被提供为与一个或多个珠粒偶联。在一个实施方案中，珠粒可以具有与之偶联的多个核酸条形码分子(例如，图14中的1420或图15A至图15D中的1590)，其中多个核酸条形码分子的子集包括条形码序列(例如，图14中的1412或图15A至图15D中的1522)。在这种情况下，核酸条形码分子的子集中的条形码序列是共同的条形码序列。
C.计算机系统
本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机系统。图16示出了计算机系统1601，其被编程或以其他方式被配置为：(i)控制微流体系统(例如，流体流动)，(ii)从未被占据的液滴中分选出已被占据的液滴，(iii)使液滴聚合，(iv)将细胞珠粒或细胞分隔到分区(例如，液滴或孔)中，(v)将细胞和细胞珠粒裂解，(vi)执行测序应用，(vii)分别产生和维护以下各项的文库：细胞因子或其他分析物特异性抗体条形码序列、MHC多聚体条形码序列、细胞表面蛋白条形码序列和由mRNA产生的cDNA，以及(vi)分析此类文库。计算机系统1601可以调节本公开的各个方面，诸如调节微流体结构中的一个或多个通道内的流体流速、调节聚合应用单元、调节序列应用单元，等等。计算机系统1601可以是用户的电子设备或相对于该电子设备位于远程位置的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1601包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)1605，该中央处理单元可以是单核处理器或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统1601还包括存储器或存储器位置1610(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1615(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1620(例如，网络适配器)，以及外围设备1625，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储装置和/或电子显示适配器。存储器1610、存储单元1615、接口1620和外围设备1625通过诸如母板的通信总线(实线)与CPU 1605通信。存储单元1615可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1601可以借助于通信接口1620来可操作地耦接到计算机网络(“网络”)1630。网络1630可以是互联网、互联网和/或外联网，或者与互联网通信的内联网和/或外联网。网络1630在一些情况下是电信网络和/或数据网络。网络1630可以包括一个或多个计算机服务器，所述一个或多个计算机服务器可以支持分布式计算，诸如云计算。网络1630在一些情况下可以借助于计算机系统1601实现点对点网络，这可以使耦接到计算机系统1601的设备能够起到客户端或服务器的作用。
CPU 1605可以执行机器可读指令序列，该机器可读指令序列可以体现在程序或软件中。指令可以存储在诸如存储器1610的存储器位置中。指令可以指向CPU 1605，其可以随后编程或以其他方式配置CPU 1605以实现本公开的方法。由CPU 1605执行的操作的实例可以包括取回、解码、执行和写回。
CPU 1605可以是电路(诸如集成电路)的一部分。系统1601的一个或多个其他部件可以包括在该电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1615可以存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元1615可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1601可以包括位于计算机系统1601外部(诸如位于通过内联网或互联网与计算机系统1601通信的远程服务器上)的一个或多个附加数据存储单元。
计算机系统1601可以通过网络1630来与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1601可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板型PC或平板PC(例如，iPad、/>Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>iPhone、支持Android的设备、/>)或个人数字助理。用户可以经由网络1630访问计算机系统1601。
如本文所述的方法可以通过存储在计算机系统1601的电子存储位置上(诸如，存储器1610或电子存储单元1615上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可以由处理器1605执行。在一些情况下，可以从存储单元1615检索代码并将其存储在存储器1610上，以供处理器1605随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元1615，并且将机器可执行指令存储在存储器1610上。
代码可以被预编译并且被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间编译。代码可以以可被选择以使该代码能够以预编译或已编译的方式执行的编程语言来提供。
本文所提供的系统和方法的各方面(诸如计算机系统1601)可以在编程中体现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其通常为在一种类型的机器可读介质上携带或在该介质中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联的数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过互联网或各种其他电信网络来通信。此类通信例如可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆上通信线网络以及通过各种空中链路而使用的光波、电波和电磁波。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限制于非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如附图中所示的可用于实现数据库的那些介质等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、打孔卡、纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这种载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。
计算机系统1601可以包括电子显示器1635或与之通信，该电子显示器包括用户界面(UI)1640，用于提供例如测序分析结果等。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于Web的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法实现。算法可以通过软件在由中央处理单元1605执行时实现。该算法可以例如执行核苷酸序列扩增、基于条形码大小的测序分选、对扩增的条形码序列进行测序、分析测序数据等。
本公开的装置、系统、组合物和方法可以用于各种应用，诸如处理来自单个细胞的单种分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质或RNA、DNA和蛋白质)。例如，将生物颗粒(例如，细胞或细胞珠粒)分隔在分区(例如，液滴)中，并且处理来自该生物颗粒的多种分析物以供后续处理。多种分析物(例如，分泌型抗体或其抗原片段)可以来自单细胞(例如免疫细胞，例如B细胞)。这可以实现例如细胞同时进行蛋白质组学、转录组学和基因组分析。
X.定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有专门术语、符号以及其他技术和科学术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为清楚起见和/或供及时参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文包括此类定义不应当被解释为代表与本领域通常理解的含义具有实质性区别。
如本文所用，术语“条形码”一般是指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是连接至分析物(例如，核酸分子)的标签或该标签加上分析物的内在特性(例如，分析物或末端序列的大小)的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码能够以可逆或不可逆方式附接到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段。
术语“衔接物”、“衔接子”和“标签”可以同义地使用。可以通过任何方法(包括连接、杂交或其他方法)将衔接物或标签偶联到要“加标签”的多核苷酸序列。
“测序”、“序列测定”等意指测定与核酸的核苷酸碱基序列相关的信息。这种信息可以包括对核酸的部分以及全部序列信息的鉴定或测定。序列信息可以用不同程度的统计可靠性或置信度来确定。在一个方面，该术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的同一性和排序。“高通量数字测序”或“下一代测序”意指使用以本质上平行的方式测定许多(通常数千个至数十亿个)核酸序列的方法进行的序列测定，即其中DNA模板不是一次一个地制备用于测序，而是以批量方法制备，并且其中优选平行地读出许多序列，或替代性地使用本身可以并行化的超高通量串行方法。此类方法包括但不限于：焦磷酸测序(例如，由454LifeSciences,Inc.(Branford,Conn.)商业化)；连接法测序(例如，由Life Technologies,Inc.(Carlsbad,Calif.)以SOLiDTM技术商业化)；使用经修饰的核苷酸边合成边测序(诸如由Illumina,Inc.(San Diego,Calif.)以TruSeqTM和HiSeqTM技术商业化；由HelicosBiosciences Corporation(Cambridge,Ma.)以HeliScopeTM商业化；以及由PacificBiosciences of California,Inc.(Menlo Park,Calif.)以PacBio RS商业化)、通过离子检测技术(诸如Life Technologies(Carlsbad,Calif.)的Ion TorrentTM技术)来测序；DNA纳米球测序(Complete Genomics,Inc.(Mountain View,Calif.))；基于纳米孔的测序技术(例如，由Oxford Nanopore Technologies,LTD(Oxford,UK)开发)，以及类似的高度并行的测序方法。
如本文所用，术语“珠粒”一般是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是随机排列的，例如在随机共聚物中，和/或具有有序结构，例如在嵌段共聚物中。交联可以经由共价、离子或诱导相互作用或者物理缠结实现。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
如本文所用，术语“加条形码的核酸分子”通常是指由例如用核酸序列(例如，与核酸条形码分子所包含的核酸引物序列互补的核酸序列)加工核酸条形码分子而产生的核酸分子。核酸序列可以是靶向序列或非靶向序列。核酸条形码分子可以偶联或附接到包含核酸序列的核酸分子。例如，在本文所述的方法和系统中，细胞的核酸分子(例如，信使RNA(mRNA)分子)与核酸条形码分子(例如，含有条形码序列和与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)杂交和逆转录产生具有对应于mRNA的核酸序列的序列和条形码序列(或其反向互补序列)的加条形码的核酸分子。对包含核酸序列、核酸条形码分子或这两者的核酸分子进行加工可以包括核酸反应，诸如，在非限制性实例中，为逆转录、核酸延伸、连接等。核酸反应可以在为核酸序列加条形码之前、期间或之后进行，以产生加条形码的核酸分子。例如，包含核酸序列的核酸分子可以经受逆转录，然后附接到核酸条形码分子以产生加条形码的核酸分子，或者包含核酸序列的核酸分子可以附接到核酸条形码分子，然后经受核酸反应(例如，延伸、连接)以产生加条形码的核酸分子。加条形码的核酸分子可以充当模板，诸如模板多核苷酸，其可以被进一步加工(例如，扩增)和测序以获得靶核酸序列。例如，在本文所述的方法和系统中，加条形码的核酸分子可以被进一步加工(例如，扩增)和测序，以获得核酸分子的核酸序列(例如，mRNA)。
如本文所用，术语“生物颗粒”一般是指来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞群体的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或无论从单细胞生物体还是多细胞生物体衍生的任何其他细胞类型。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如，凝胶或聚合物基质)，该基质包含细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如，细胞珠粒)，诸如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以获自受试者的组织。生物颗粒可以是硬化的细胞。此类硬化的细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分，但是可以不包括细胞的其他成分。此类成分的实例是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以能够进行培养，例如，当被包封在凝胶或聚合物基质中时能够进行培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时能够进行培养。
如本文所用，术语“偶联”、“连接”、“缀合”、“缔合”、“附接”或“融合”在本文中可以互换使用，并且通常是指一个分子(例如，多肽、受体、分析物等)附接或连接(例如，以化学方式结合)到另一个分子(例如，多肽、受体、分析物等)。
如本文所用，术语“结合剂”通常是指能够结合到一个或多个其他分子(例如，分析物、受体、其他结合剂等)并且包含一个或多个部分的分子。在一些情况下，结合剂包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个部分。每个部分可以包含一种多肽。特定部分的多肽可以能够结合一个或多个分子。例如，特定部分的多肽可以与位于细胞表面上的分子结合，该分子诸如细胞表面蛋白或受体(例如CD表面标志物，诸如CD45)。结合剂的另一部分的多肽能够结合可以从细胞(例如，T细胞、B细胞、树突细胞等)分泌的分子。结合剂的一个或多个部分可以直接或间接地彼此连接、缀合或融合。例如，结合剂的第一部分可以直接或间接地连接、缀合或融合至结合剂的第二部分。此外，术语“结合剂”、“多肽”和“抗体”在本文中可以互换使用。
如本文所用，术语“细胞珠粒”通常是指包含(例如，包封、含有等)生物颗粒(例如，细胞、细胞核、固定细胞、交联细胞)、病毒、细胞或病毒的组分或大分子成分，或者源自细胞或病毒的组分或大分子成分的水凝胶材料、聚合物材料或交联材料。例如，细胞珠粒可以包含病毒和/或细胞。在一些情况下，细胞珠粒包含单个细胞。在一些情况下，细胞珠粒可以包含附着在一起的多个细胞。细胞珠粒可以包括任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞，细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型，支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞、免疫细胞，例如T细胞(例如，CD4 T细胞、包含人类免疫缺陷病毒(HIV)休眠拷贝的CD4 T细胞)、B细胞或树突细胞、固定细胞、交联细胞、来自细胞群体的罕见细胞，或者任何其他细胞类型，无论是源自单细胞生物体还是多细胞生物体。此外，细胞珠粒可以包含活细胞，诸如可以能够被培养的细胞。此外，在一些实例中，细胞珠粒可以包含细胞的衍生物，诸如细胞的一种或多种组分(例如，细胞器、细胞蛋白质、细胞核酸、基因组核酸、信使核糖核酸、核糖体、细胞酶等)。在一些实例中，细胞珠粒可以包含从生物组织获得的材料，诸如从受试者获得的材料。在一些情况下，细胞、病毒或其大分子成分被包封在细胞珠粒内。可以在形成细胞珠粒结构组分的聚合物基质或凝胶基质内进行包封。在一些情况下，细胞珠粒是通过将细胞固定在固定介质中或者通过细胞的交联元件(诸如细胞膜、细胞骨架等)产生的。
如本文所用，术语“大分子成分”一般是指包含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子成分可以包含核酸。在一些情况下，生物颗粒可以是大分子。大分子成分可以包含DNA。大分子成分可以包含RNA。RNA可以是编码的或非编码的。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子成分可以包含蛋白质。大分子成分可以包含肽。大分子成分可以包含多肽。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“表位结合片段”或“抗体片段”可以互换使用，通常是指完整抗体的这样一部分(例如，分别包含轻链和重链的每个结构域)：其能够与完整抗体结合相同的表位/抗原，尽管不一定达到相同的程度。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但是表位结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
如本文所用，术语“分子标签”一般是指能够结合于大分子成分的分子。分子标签可以以高亲和力结合于大分子成分。分子标签可以以高特异性结合于大分子成分。分子标签可以包含核苷酸序列。分子标签可以包含核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可以包含DNA适体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可以包含多肽。分子标签可以是条形码。
如本文所用，术语“分区”一般是指可以适合于包含一种或多种物类或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理隔室，诸如液滴或孔。分区可以将空间或体积与另一个空间或体积隔离。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。分区可以包括一个或多个其他(内部)分区。在一些情况下，分区可以是虚拟隔室，其可以由跨越多个和/或远程物理隔室的索引(例如，索引文库)定义且鉴定。例如，物理隔室可以包括多个虚拟隔室。
如本文所用，术语“分析物”通常是指感兴趣的检测物质。分析物可以是生物分析物，诸如核酸分子或蛋白质。分析物可以是原子或分子。分析物可以是较大单位的亚单位，诸如多核苷酸序列的给定序列或作为较大序列的一部分的序列。本公开的分析物包括分泌型分析物、可溶性分析物和/或细胞外分析物。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
在整个本公开中，要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：使用捕获剂用报告条形码序列来标记分泌型抗体
该实施例说明了使用捕获剂来研究浆细胞抗体，这在图7中进行了概述。图8示出了该过程的视觉表示。
通过流式细胞术、用与表面结合的抗原进行磁富集、BACS或另一种替代方法来分离感兴趣的细胞群体(例如，抗原特异性记忆B细胞、免疫或接种后的浆细胞，或者与感兴趣的抗原共同孵育的记忆B细胞)。将分离的B细胞分隔成液滴，以产生单细胞悬液。
然后将分离的B细胞单细胞悬液与抗原捕获剂(例如，捕获抗体)一起孵育。抗原捕获剂可以是识别B细胞表面上的共同抗原和分泌型抗体的恒定区的任何双特异性分子。抗原捕获剂可以是scFv或纳米抗体试剂、核酸适配体(apatamer)、双特异性抗体、F(ab’)2试剂，或者识别分泌型抗体的Fc区和B细胞表面抗原两者的其他生物分子，包括但不限于CD19、CD20、CD45或CD22。在其他实例中，抗原捕获剂也可以是被束缚至脂质的Fc结合生物分子，使得生物分子能够插入细胞膜中，在那里，它起到将分泌型抗体束缚至细胞表面的作用。捕获剂任选地与寡核苷酸条形码序列缀合，其中寡核苷酸条形码序列是可以在下游扩增的独特寡核苷酸。
然后将捕获剂孵育的细胞暴露于一种或多种用报告剂加条形码的抗原(即，报告剂)。抗原可以缀合至荧光团。在一些实例中，通过针对抗原的二次富集(例如，靶向荧光团或抗原的另一部分，以产生用于分隔的单细胞悬液)，或者通过以选择性方式形成替代性分区(例如，细胞珠粒)来进一步富集抗原特异性浆细胞。当抗原具有缀合的辣根过氧化物酶或类似结构域时，通过添加过氧化氢来形成细胞珠粒的聚合物基质，从而仅仅围绕与感兴趣抗原结合的细胞产生分区。
捕获感兴趣的单细胞悬液，随后进行加条形码和V(D)J扩增(例如，使用10×Genomics ChromiumTM系统的免疫图谱分析解决方案)。这为每个所捕获的B细胞产生了针对每种抗原的抗原特异性计数的向量，使得能够鉴定该细胞的抗原特异性。
实施例2：使用细胞珠粒用报告条形码序列来标记分泌型抗体
该实施例说明了使用细胞珠粒来研究浆细胞抗体，这在图9中进行了概述。图10A和图10B示出了该过程的视觉表示。
通过流式细胞术、用与表面结合的抗原进行磁富集、BACS或另一种替代方法来分离感兴趣的细胞群体(例如，抗原特异性记忆B细胞、免疫或接种后的浆细胞，或者与感兴趣的抗原共同孵育的记忆B细胞)。将分离的B细胞分隔成液滴，从而形成单细胞悬液，随后胶凝为水凝胶基质(例如，细胞珠粒)。来自包封的B细胞的分泌型抗体(即，IgG)分泌并从细胞表面排出，参见图10A，在被细胞珠粒的水凝胶基质捕获后保持束缚至水凝胶基质，例如图10B。
然后将具有束缚抗体的细胞珠粒暴露于一种或多种用报告剂加条形码的抗原(即，报告剂)，其中用报告剂加条形码的抗原的报告条形码序列是可以在下游扩增的独特寡核苷酸。抗原可以缀合至荧光团。在一些实例中，通过针对抗原的二次富集(即，靶向荧光团或抗原的另一部分，以产生用于分隔的单细胞悬液)，或者通过以选择性方式形成替代性分区(例如，细胞珠粒-凝胶珠粒)来进一步富集抗原特异性浆细胞。当抗原具有缀合的辣根过氧化物酶或类似结构域时，通过添加过氧化氢来形成细胞珠粒-凝胶珠粒的聚合物基质，从而仅仅围绕与感兴趣抗原结合的细胞产生分区。
然后将具有束缚抗体的细胞珠粒暴露于一种或多种用报告剂加条形码的抗原(即，报告剂)，其中用报告剂加条形码的抗原的报告条形码序列是可以在下游扩增的独特寡核苷酸。抗原可以缀合至荧光团。在一些实例中，通过针对抗原的二次富集(即，靶向荧光团或抗原的另一部分，以产生用于分隔的单细胞悬液)，或者通过以选择性方式形成替代性分区(例如，细胞珠粒-凝胶珠粒)来进一步富集抗原特异性浆细胞。当抗原具有缀合的辣根过氧化物酶或类似结构域时，通过添加过氧化氢来形成细胞珠粒-凝胶珠粒的聚合物基质，从而仅仅围绕与感兴趣抗原结合的细胞产生分区。
在一些实例中，将磁性珠粒上任选地具有不同于抗原的报告条形码序列的抗荧光团或抗富集抗体添加到细胞珠粒中。捕获感兴趣的细胞珠粒，随后进行加条形码和VDJ扩增(例如，使用10×Genomics ChromiumTM系统的免疫图谱分析解决方案)。这为每个所捕获的B细胞产生了针对每种抗原的抗原特异性计数的向量，使得能够使用本领域技术人员可预见的计数变换和插补方法来鉴定该细胞的抗原特异性。
实施例3：对分泌型抗体进行检测和分析
鉴定了来自实施例1和实施例2的具有合理数量的抗原结合计数的细胞。在该组中，鉴定了还具有额外的多组学计数的细胞(例如，细胞RNA或表面蛋白)。通过减去在空液滴中检测到的每种抗原的中值或平均背景来转换抗原结合计数分布。将结合感兴趣抗原和对照抗原或者仅结合对照抗原的细胞从进一步分析中排除。然后，使用任意数量的方法(例如，中心对数比、PCA、GLMPCA，或者更复杂的机器学习模型或神经网络)来转换抗原计数向量。最后，选择具有抗原指纹图谱的抗体用于治疗评价。
通过使用与给定的感兴趣细胞条形码或细胞以及重链恒定区和轻链恒定区杂交的引物，可以使用cDNA文库来选择性地扩增编码感兴趣的分泌型抗体的浆细胞序列。分别进行重链扩增和轻链扩增，随后进行重叠延伸PCR，以将它们结合为单个连续分子。重链和轻链直接配对，使得具有理想抗原特异性的抗体能够被快速克隆并转化为适于治疗性开发和检测的形式。
本发明的范围并非旨在限于所公开的特定实施方案，这些实施方案是例如为了举例说明本发明的各方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (54)

1.一种单细胞分析方法，包括：
a)将抗体分泌细胞与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞，其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列，其中所述标记细胞包括与所述细胞的表面偶联的复合物，并且其中所述复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)所述报告剂；
b)将所述标记细胞分隔在分区中，其中所述分区包含多个条形码核酸分子，所述多个条形码核酸分子包含共同的分区特异性条形码序列；以及
c)在所述分区中，从所述多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中所述加条形码的核酸分子包含所述报告序列或其互补序列，以及所述共同的分区特异性条形码序列或其互补序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体分泌细胞属于B细胞谱系，例如浆细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与细胞表面分子偶联。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞表面分子是细胞表面蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与所述分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与所述细胞表面蛋白和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是第一抗体结合剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述报告剂被配置为与所述分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述报告剂是第二抗体结合剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子还包含被配置为与所述条形码核酸分子偶联的序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述标记细胞还包含第二报告剂，所述第二报告剂包括第二报告核酸分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二报告剂被配置为与所述细胞的第二细胞表面蛋白偶联。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述第二报告核酸分子包含对应于所述第二报告剂的第二报告序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子，其中所述多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子包含所述共同的分区特异性条形码序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二报告核酸分子包含被配置为与所述第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中步骤(c)还包括从所述多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和所述第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中所述第二加条形码的核酸分子包含来自所述第二报告核酸分子的所述第二报告序列和来自所述第二条形码核酸分子的所述共同的分区特异性条形码，或者它们的互补序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述标记细胞还包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物包含核酸分析物序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个第三条形码核酸分子，所述多个第三条形码核酸分子包含所述共同的分区特异性条形码序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子包含被配置为与所述核酸分析物序列偶联的第三序列。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中步骤(c)还包括从所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和所述核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中所述第三加条形码的核酸分子包含来自所述核酸分析物的序列和来自所述第三条形码核酸分子的所述共同的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述分区包括其中包含所述多个条形码核酸分子的支持物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述支持物是珠粒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述珠粒是凝胶珠粒。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述多个条形码核酸分子可释放地附接到所述支持物。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述分区来自多个分区。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述分区是液滴或微孔。
27.一种单细胞分析方法，包括：
a)将细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞珠粒，其中所述细胞珠粒在基质中包含抗体分泌细胞，其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列，其中所述标记细胞珠粒在所述细胞珠粒之中或之上包含复合物，并且其中所述复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)所述报告剂；
b)将所述标记细胞珠粒分隔在分区中，其中所述分区包含多个条形码核酸分子，所述多个条形码核酸分子包含共同的分区特异性条形码序列；以及
c)在所述分区中，从所述多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中所述加条形码的核酸分子包含所述报告序列或其互补序列，以及所述共同的分区特异性条形码序列或其互补序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体分泌细胞属于B细胞谱系，例如浆细胞。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与所述细胞珠粒的所述基质偶联。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述基质是可降解的聚合物基质。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与所述分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述捕获剂被配置为与所述基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是第一抗体结合剂。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中所述报告剂被配置为与所述抗体或其抗原结合片段偶联。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述报告剂是第二抗体结合剂。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子还包含被配置为与所述条形码核酸分子偶联的序列。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述细胞或所述标记细胞珠粒还包含第二报告剂，所述第二报告剂包括第二报告核酸分子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二报告剂被配置为与所述细胞的细胞表面蛋白偶联。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述第二报告核酸分子包含对应于所述第二报告剂的第二报告序列。
40.根据权利要求27至39中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子，其中所述多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子包含所述共同的分区特异性条形码序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第二报告核酸分子包含被配置为与所述第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中步骤(c)还包括从所述多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和所述第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中所述第二加条形码的核酸分子包含来自所述第二报告核酸分子的所述第二报告序列和来自所述第二条形码核酸分子的所述共同的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物包含核酸分析物序列。
44.根据权利要求27至43中任一项所述的方法，其中所述分区还包含多个第三条形码核酸分子，所述多个第三条形码核酸分子包含所述共同的分区特异性条形码序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子包含被配置为与所述核酸分析物序列偶联的第三序列。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中步骤(c)还包括从所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和所述核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中所述第三加条形码的核酸分子包含来自所述核酸分析物的序列和来自所述第三条形码核酸分子的所述共同的分区特异性条形码序列，或者它们的互补序列。
47.根据权利要求27至46中任一项所述的方法，其中所述分区包括其中包含所述多个条形码核酸分子的支持物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述支持物是珠粒。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述珠粒是凝胶珠粒。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述多个条形码核酸分子可释放地附接到所述支持物。
51.根据权利要求27至50中任一项所述的方法，其中所述分区来自多个分区。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述分区是液滴或微孔。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，还包括：
d)对所述加条形码的核酸分子进行测序，其中所述抗体分泌细胞经由检测到所述报告序列而被分析为分泌能够结合所述报告剂的抗体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中在d)之前，对所述加条形码的核酸进行扩增。
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